WO2006078059A1

WO2006078059A1 - 希釈用乳化組成物および癌ワクチン組成物

Info

Publication number: WO2006078059A1
Application number: PCT/JP2006/301171
Authority: WO
Inventors: Koichi Saito; Yusuke Okawa
Original assignee: Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.; Nof Corporation
Priority date: 2005-01-19
Filing date: 2006-01-19
Publication date: 2006-07-27
Also published as: EP1844789B1; CA2595063C; ES2507097T3; AU2006206973C1; AU2006206973A1; KR20070104610A; US8178102B2; EP1844789B8; CA2595063A1; JPWO2006078059A1; AU2006206973B2; EP1844789A4; CN101111258B; KR101322586B1; US20090136572A1; EP2687203A1; CN101111258A; US20120237569A1; EP1844789A1; JP5084268B2

Abstract

癌抗原ペプチドまたはそのダイマー希釈用の乳化組成物を提供する。さらに、その希釈用乳化組成物と癌抗原ペプチドまたはそのダイマーを含む水相とを混合することにより、癌抗原ペプチドの種類によらず、効率的にＣＴＬを誘導する新たな癌ワクチン組成物または特異的ＣＴＬ誘導剤を提供する。　特定のエステル、特定の界面活性剤、特定の乳化剤、および水相を含む、癌抗原ペプチドまたはそのダイマー希釈用乳化組成物に関する。また、その希釈用乳化組成物で癌抗原ペプチドまたはそのダイマーを含む水相を用時に希釈、混合することにより得られる、癌ワクチン組成物または特異的ＣＴＬ誘導剤に関する。

Description

明細書

希釈用乳化組成物および癌ヮクチン糸且成物

技術分野

本発明は、癌免疫療法の分野に属し、細胞傷害性 T細胞誘導活性を有する癌抗原ペプチドまたはそのダイマー希釈用の乳化組成物に関する。さらに詳細には、特定のエステル、界面活性剤、乳化剤、および水相を含有し、安定な W/Oエマルシヨンの形態を有する、癌抗原べプチドまたはそのダイマー希釈用乳化組成物に関する。また、本発明は、特定のエステル、界面活性剤、乳化剤、および特定のァミノ酸組成よりなる癌抗原ぺプチドまたはそのダイマーを含む水相を含有し、安定な W/Oエマルシヨンの形態を有する、癌ワクチン組成物または特異的細胞傷害性 τ細胞誘導剤に関する。

背景技術

生体による癌細胞やウィルス感染細胞等の排除には細胞性免疫、特に細胞傷害性 T細胞（以下、 CTLと称する）が重要な働きをしている。 CTLは、癌抗原タンパク質由来の抗原ペプチド（癌抗原ペプチド）と MHC (Ma j o r H i s t o c omp a t i b i 1 i t y Comp l e x) クラス I抗原 (ヒトの場合は HLA抗原と称する）とにより、癌細胞上に形成される複合体を認識し、癌細胞を攻撃■破壊する。

癌抗原タンパク質は、ィムニティ（Immun i t y) 、第 10巻、第 281 頁、 1999年の表中に記載のものが代表例として挙げられる。具体的には、メラノサイト組織特異的タンパク質である g P 100、 MART— 1、およぴチロシナーゼなどのメラノソームタンパク質が挙げられる。また、メラノーマ以外の癌抗原タンパク質として、 CEA、 PSA、および HER 2 η e uなどの癌マ一力一が挙げられる。また、癌で発現が増加している TERTなどがある。さらに、多くの癌種で高発現している WT 1も白血病および固形癌における新しい癌抗原タンパク質として知られている。癌抗原べプチドは、癌抗原タンパク質が細胞内プロテアーゼによりプロセシングされて生成されるペプチドである。前記のように、この生成された癌抗原ぺプチドと MH Cクラス I抗原（H L A抗原）との複合体が細胞表面に提示され、 C T Lにより認識される。しかし、 C T Lによる癌細胞破壊を利用する癌免疫療法剤（癌ワクチン）を開発する場合、癌抗原ペプチドのみでは、一般に免疫原性が低いために C T Lを効率良く誘導することが困難であった。従って、 C T Lの誘導を活性化できる製剤の開発が望まれている。

そのため、 C T Lの誘導を活性化する製剤について、これまで多くの検討がなされてき。特に、エマルシヨン型製剤については多くの検討がなされてきた。一般に、エマルション製剤としては、 O/Wエマルシヨンと WZOエマルションがある。

このうち、 oZwエマルションでは抗原となるぺプチドを内相に保持できず、治療上有効な特異的 C T L誘導活性を示さなかった。

—方、水相が内相となる wzoエマルシヨンは、抗原となるペプチドを内相に保持しやすいことから、優れた C T L誘導活性が期待できるが、実用化するには多くの課題がある。

例えば、癌抗原ぺプチドのキヤリァのための W/Oエマルションとしては、フロイントの不完全アジュバントが知られている力安定性が十分でないために有効な活性が得られない場合がある。また、粘稠度が高いため、投与し難いこと等の問題があった。

フロイントの不完全ァジュバントは、不活化細菌や不活化ウィルスを包含させ、抗体産生を誘導する免疫賦活アジュバントとして古くから知られており、これに代わる W/O乳化型ワクチン組成物が検討され、例えば、特表平 7— 5 0 9 7 3 3号公報、国際公開第 9 4ダ2 0 0 7 1号パンフレット、及び特開平 9一 2 6 8 1 3 0号公報に記載されるような組成物が提案されている。また、フロイントの不完全アジュバントに代わるものとして、特開 2 0 0 1〜 1 3 1 0 8 7号公報には複合エマルシヨンのワクチンに対する応用が提案されている。

し力し、フロイントの不完全アジュバントに代わる癌抗原べプチドのキャリアとして、 C T Lの誘導を治療上有効に活性化できる W/Oエマルションは知られていない。

一般に、癌抗原ペプチドは低分子であることから、 w/oエマルシヨン中で安定に保持させることは容易でない。さらに乳化する際のエネルギーで癌抗原ぺプチドが分解や凝集等を起こす懸念がある。さらに、癌抗原ペプチドは、アミノ酸組成により水溶性の高いものから難溶性のものまである。したがって、癌抗原ぺプチドの物性によらず、 C T Lの誘導を治療上有効に活性化する汎用性の高レ、 W /Oエマルションの癌ワクチンの開発が望まれている。

本発明の課題は、さまざまな癌抗原ペプチドにおいて、イン ·ビポで有効な C T L誘導活†生を示し、更に、低粘度で、カゝっ安定性に優れた、癌ワクチン組成物を調製するための、希釈用乳化組成物を提供することにある。また、本発明の課題は、上記の希釈用乳化組成物を用いて、含有する癌抗原ペプチドに応じてィソ 'ビポで特異的に C T L誘導を活性化する、新たな癌ワクチンの調製方法およびその組成物を提供することにある。

発明の開示

本発明者らは、癌抗原として知られている種々のペプチドを、特定のエステノレと特定の界面活性剤とを含有する特定の乳化組成物で希釈することによって、ぺプチドの種類や物性によらず、それぞれの抗原に特異的な C T Lの誘導活性を示すことを見出し、更に鋭意検討を加えた結果、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明は、以下の態様を包含する。

[ 1 ] A) 炭素数 8〜2 2の脂肪酸と炭素数 2〜2 4のアルコールとのエステルであり、該エステルの凝固点が 1 0 °C以下であるエステルを 5 0〜9 0重量⁰ /₀； B) エチレンォキサイド 5〜20モル付加ヒドロキシ脂肪酸トリグリセライドからなる非ィオン性界面活性剤を 0. 5〜 20重量％；

D) 水を 5〜20重量％；

を含有する、アミノ酸数 8から 1 2の癌抗原ペプチドまたはそのダイマー希釈用乳化組成物。

[2] A) 炭素数 8〜 22の脂肪酸と炭素数 2〜 24のアルコールとのエステルであり、該エステルの凝固点が 10°C以下であるエステルを 50~90重量⁰ /₀； B) エチレンォキサイド 5〜20モル付加ヒドロキシ脂肪酸トリグリセライドからなる非イオン性界面活性剤を 0. 5〜20重量％；

C) 多価アルコールと脂肪酸との部分エステルであり、該部分エステルが 40°C で液体である乳化剤を 0〜 20重量％；および

D) 水を 5〜20重量％；

を含有する、アミノ酸数 8から 1 2の癌抗原ぺプチドまたはそのダイマー希釈用乳化組成物。

[3] A) 成分を 60〜80重量％；

B) 成分を 1〜10重量％；

C) 成分を 5〜1 5重量％；および

D) 成分を 5〜20重量。/。；

を含有する、 [2] に記載の希釈用乳化組成物。

[4] 希釈用乳化組成物の分散相の平均粒子径が 50〜 500 n mである [ 1 ] 〜 [3] のいずれかに記載の希釈用乳化組成物。

[5] A) 成分を構成する脂肪酸がォレイン酸、ミリスチン酸または 2—ェチルへキサン酸である [1] 〜 [4] のいずれかに記載の希釈用乳化組成物。

[6] A) 成分のエステルが、ォレイン酸ェチル、ミリスチン酸オタチルドデシルまたは 2—ェチルへキサン酸セチルである [1] 〜 [5] のいずれかに記載の希釈用乳化,袓成物。 [7] B) 成分の非イオン性界面活性剤を構成するヒドロキシ脂肪酸トリグリセライドがヒマシ油または硬化ヒマシ油である [1] 〜 [6] のいずれかに記載の希釈用乳化組成物。

[8] [1：] 〜 [7] のいずれかに記載の希釈用乳化組成物 1容量部で、ァミノ酸数 8力ら 1 2の癌抗原ぺプチドまたはそのダイマーを含有する水相 0. 25〜 1容量部を希釈する癌ワクチン組成物の調製方法。

[9] A) 炭素数 8〜22の脂肪酸と炭素数 2〜24のアルコールとのエステルであり、該エステルの凝固点が 10°C以下であるエステルを 30〜80重量％；

B ) ェチレンォキサイド 5〜 20モル付加ヒドロキシ脂肪酸トリグリセライドからなる非ィォン性界面活性剤を 0. 5〜 20重量⁰ /₀；

C) 多価アルコールと脂肪酸との部分エステルであり、該部分エステルが 40°C で液体である乳化剤を 0〜 20重量％；およぴ

E) アミノ酸数 8から 1 2の癌抗原ペプチドまたはそのダイマーを含む水相を 1 0〜60重量％；

を含有し、当該組成物が WZOエマルシヨンである、癌ワクチン組成物。

[1 0] A) 成分を 40〜60重量％；

B) 成分を 1. 0〜5. 0重量％ ;

C) 成分を 5. 0〜： L O. 0重量。/。；および

E) 成分を 30〜 50重量％；

を含有する、 [9] に記載の癌ワクチン組成物。

[1 1] A) 炭素数 8〜22の脂肪酸と炭素数 2〜24のアルコールとのエステルであり、該エステルの凝固点が 10°C以下であるエステルを 30〜80重量⁰ /₀；

B ) ェチレンォキサイド 5〜 20モル付加ヒドロキシ脂肪酸トリグリセライドからなる非ィォン性界面活性剤を 0. 5〜 20重量％；

C) 多価アルコールと脂肪酸との部分エステルであり、該部分エステルが 40°C で液体である乳化剤を 0〜 20重量％；および E) アミノ酸数 8から 1 2の癌抗原ペプチドまたはそのダイマーを含む水相を 1 0〜 60重量％；

を含有し、当該組成物が W/Oエマルシヨンである、特異的 C T L誘導剤。

[1 2] A) 成分を 40〜60重量⁰ /₀；

B) 成分を 1. 0〜5. 0重量％；

C) 成分を 5. 0-10. 0重量⁰/。；および

E) 成分を 30〜50重量％；

を含有する、 [1 1] に記載の特異的 CTL誘導剤。

[1 3] アミノ酸数 8から 1 2の癌抗原ペプチドまたはそのダイマーを含有する水相と、前記水相を希釈するための [1] 〜 [7] のいずれかに記載の希釈用乳化組成物とを含む、癌ワクチン組成物または特異的 C T L誘導剤を用時調製するためのキット。

[14] アミノ酸数 8から 1 2の癌抗原ペプチドまたはそのダイマーを含有する水相と、 [1] 〜 [7] のいずれかに記載の希釈用乳化組成物と、上記水相を希釈用乳化組成物で希釈して得られる WZOエマルションを癌の治療または予防に使用しうるカまたは使用すべきであることを記載した書類とを含む、商業用パッケージ。

図面の簡単な説明

図 1は、 T E R Tぺプチド含有癌ヮクチン組成物の特異的 C T L誘導の結果を示すグラフである。

図 2は、 MAG E— 1ぺプチド含有癌ワクチン組成物の特異的 C T L誘導の結果を示すグラフである。

図 3は、 P S Aぺプチド含有癌ワクチン組成物の特異的 C T L誘導の結果を示すグラフである。

図 4は、 PS Aペプチド含有癌ワクチン組成物の特異的 CTL誘導の結果を示すグラフである。図 5は、 C E Aぺプチド含有癌ワクチン組成物の特異的 C T L誘導の結果を示すグラフである。

図 6は、各種癌抗原ぺプチドを含有させた癌ワクチン組成物の特異的 C T L誘導の結果を示すグラフである。

図 7は、希釈用乳化組成物 8の粒度分布を示す。

図 8は、希釈用乳化組成物 2 9の粒度分布を示す。

図 9は、癌抗原ぺプチド 2種を混合含有させた癌ワクチン組成物のそれぞれのぺプチドに対する特異的 C T L誘導の結果を示すグラフである。

発明を実施するための最良の形態

以下、本発明の希釈用乳化組成物について詳細に説明する。

本発明の「希釈用乳化組成物」とは、癌抗原ペプチドまたはそのダイマーを希釈するために用いられる組成物をいう。本宪明の「癌ワクチン組成物」とは、本発明の希釈用組成物で癌抗原ぺプチドまたはそのダイマーを希釈した組成物をい

5 o

本発明の希釈用乳化組成物は WZO型に予備乳化されたエマルションである。また、本発明の希釈用乳化組成物は、アミノ酸数 8〜 1 2の癌抗原ぺプチドまたはそのダイマーを含む水相を希釈するための組成物であり、そのように希釈することにより、それぞれの癌抗原べプチドに特異的な C T L誘導を活性化する癌ヮクチン組成物を調製することができる。

本発明の希釈用乳化組成物において、 A成分は脂肪酸とアルコールとのエステルであり、好ましくは、炭素数 8〜2 2の脂肪酸と炭素数 2〜2 4のアルコールとのエステルであって、かつ該エステルの凝固点が 1 0 °C以下であるエステルである。

A成分として用いる脂肪酸とアルコールとのエステルは、凝固点が 1 0 °C以下となるものを選択すればよい。 A成分の凝固点が 1 0 °Cを超えると、希釈用乳化組成物の安定性、特に低温下での安定性が低下するおそれがあり好ましくない。炭素数 8〜 2 2の脂肪酸としては、例えば、炭素数 8〜 2 2の飽和または不飽和脂肪酸が挙げられ、具体的には、力プリル酸、 2—ェチルへキサン酸、ノナン酸、力プリン酸、ゥンデカン酸、ラウリン酸、トリデカン酸、ミリスチン酸、ミリストレイン酸、ペンタデカン酸、ノヽレミチン酸、イソパルミチン酸、パノレミトレイン酸、イソステアリン酸、ステアリン酸、ォレイン酸、リノール酸、ネルボニン酸などが挙げられる。炭素数 2〜 2 4のアルコールとしては、例えば、炭素数 2〜 2 4のアル力ノール、炭素数 2〜 2 4のァルケノールが挙げられ、具体的には、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、エチレングリコール、ブタノール、へキサノール、ォクタノール、 2—ェチルへキサノール、デカノール、ドデカノール、ミリスチルアルコール、セチルアルコール、イソセチルアルコール（2—へキシルデカノーノレ）、イソステアリルアルコール、ォレイルアルコール、ィコセノール、ドコセノール、テトラコセノール、 2—オタチルドデカノールなどといったアルコールなどが挙げられる。

本宪明で用いる A成分としては、具体的には、例えば、 2—ェチルへキサン酸セチル、ラウリン酸へキシル、ミリスチン酸プチル、ミリスチン酸ィソプロピル、ミリスチン酸ィソセチル、ミリスチン酸オタチルドデシル、ノノレミチン酸 2—ェチルへキシル、パルミチン酸ィソステアリル、イソステアリン酸ィソプロピル、イソステアリン酸イソセチル、ステアリン酸 2—ェチルへキシル、ォレイン酸ェチル、ォレイン酸デシル、ォレイン酸ォレイル、ォレイン酸ォクチルドデシル、リノ一ル酸ェチル、リノ一ル酸ィソプロピルなどが挙げられる。

本発明で用いる A成分は、エステルとして合成されたものでもよいし、天然油脂から抽出 '精製されたものでもよい。天然由来のエステル油としては、例えば、ホホパ油ゃォレンジラフィー油などが挙げられる。' これらのエステルは一般に巿販されており、目的に応じて、医薬品用途に適したものを選択すればよい。

本発明で用いる A成分は、好ましくはォレイン酸エステル、ミリスチン酸エステルまたは 2—ェチノレへキサン酸エステルであり、より好ましくはォレイン酸ェチノレ、ミリスチン酸オタチノレドデシル、または 2—ェチノレへキサン酸セチノレであり、さらに好ましくはォレイン酸ェチルである。

本発明の希釈用乳化組成物において、 A成分の含有量は 5 0〜 9 0重量％であり、好ましくは 5 5〜8 5重量％であり、より好ましくは 6 0〜8 0重量％である。 A成分の含有量が 5 0重量％未満であると、癌抗原ぺプチドを希釈して得られる最終的な癌ワクチン組成物が不安定になる可能性があるため好ましくない。本発明の希釈用乳化組成物において、 B成分はヒドロキシ脂肪酸トリグリセラィドのエチレンォキサイド 5〜2 0モル付加物からなる非イオン性界面活性剤で 3 る。

ヒドロキシ脂肪酸トリグリセライドのエチレンォキサイド付加物は、乳化や可溶化等に広く用いられている界面活性剤の一つであり、エチレンォキサイド 5〜 1 0 0モル付加物が市販されている。 5モル未満のエチレンォキサイド付加物からなる界面活性剤は、界面活性作用が低すぎて、良好な乳化状態を呈する希釈用乳化組成物が形成できなくなる可能性があり、好ましくない。 2 0モル超のェチレンォキサイド付加物からなる界面活性剤は、親水性が高いため、？ W匕組成物を希釈して得られる癌ワクチン組成物において、水相粒子の凝集等により乳化安定性が低下するおそれがあるだけでなく、癌ワクチン組成物としての C T L誘導活性が低下する可能性があり、好ましくない。

B成分として用いる非イオン性界面活性剤は、好ましくは、ヒマシ油または硬化ヒマシ油のエチレンオキサイド 5〜2 0モル付加物から構成される。そのような非ィオン性界面活性剤を使用することにより、安定性に優れた希釈用乳化組成物を得ることができ、さらに、該希釈用乳化組成物で癌抗原ペプチドを希釈した場合に優れた安定性と高い C T L誘導活性を発揮する癌ヮクチン組成物を調製することができる。ヒマシ油または硬化ヒマシ油のエチレンォキサイド 5〜2 0モル付加物から構成される非イオン性界面活性剤を使用することにより、投与局所への安全性に優れた癌ワクチン組成物を最終的に調製することができる。このうち、本発明の B成分として好ましいのは、硬化ヒマシ油のエチレンオキサイド 1 0〜 2 0モノレ付加物である。さらに本発明においては、これらのうち、硬化ヒマシ油のエチレンォキサイド 1 0モル付加物を用いることが最も好ましい。

本発明の希釈用乳化組成物において、 B成分の含有量は 0 . 5〜2 0重量％であり、好ましくは 1〜1 5重量％であり、より好ましくは 1 ~ 1 0重量％である。 B成分の含有量が 0 . 5重量％未満であると、界面活性作用が低くなりすぎる結果、安定な希釈用乳化組成物が得られなくなる可能性があり、好ましくない。逆に 2 0重量％を超えると、癌抗原ペプチドを希釈したときに転相して、良好な癌ワクチン組成物が最終的に得られなくなるだけでなく、投与局所に対する癌ワクチン組成物の安全性が低下するおそれがあるため、やはり好ましくない。

本発明の希釈用乳化組成物が任意的に含む C成分は、多価アルコールと脂肪酸との部分エステノレであって、力っ該部分エステルが 4 0 °Cで液状を呈する乳化剤である。

本発明においては、上記の B成分に加えて、 C成分を含有させることにより、癌抗原ぺプチドを希釈した場合に、乳化状態がさらに良好であり、かつ安定性に優れた癌ワクチン組成物を調製でき、その結果、優れた C T L誘導活性を広い範囲のぺプチドで発揮する癌ワクチン組成物とすることができる。

本宪明の C成分を構成する多価アルコールとしては、例えば、グリセリン、ジグリセリン、ソノレビタン、ソルビトール、ソルバイト、マンニタン、マンニトール、スクロースなどが挙げられる。 C成分を構成する脂肪酸としては、例えば、ラウリン酸、ミリスチン酸、イソステアリン酸、ォレイン酸、リノール酸などが挙げられる。本発明の C成分としては、これらの多価アルコールと脂肪酸との部分エステルから、 4 0 °Cで液状を呈するものを選択すればよい。

好適な C成分の具体例としては、グリセリンモノォレート、グリセリンジォレート、ジグリセリンモノォレート、ジグリセリンジォレート、ソノレビタンモノォレート、ソルビタンセスキォレート、ソルビタンジォレート、ソルビタントリオレート、またはこれらの混合物などが挙げられる。その中でも特に好適なものは、グリセリンモノォレート、グリセリンジォレート、ソルビタンモノォレート、ソノレビタンセスキォレート、ソルビタンジォレート、またはこれらの混合物である, これらは一般に広く販売されており、医薬用途に適したものから選択することができる。

本発明の希釈用乳化組成物において、 C成分の含有量は 0〜 2 0重量％の範囲から選択される。その中でも 1〜 2 0重量％の範囲が好ましく、さらに好ましい範囲は 5〜 1 5重量％である。このとき、 2 0重量％を超えると、希釈用乳化糸且成物としての粘度が高くなり、本発明の癌抗原ぺプチドを希釈する場合に良好な癌ワクチン組成物が得られなくなるだけでなく、投与局所に対する癌ワクチン組成物の安全†生が低下するおそれがあるため、好ましくない。また、 C成分の含有量が 1重量％以上であれば十分な添加効果を呈するので好ましい。

本発明の希釈用乳化組成物を構成する D成分は、乳化型を形成するための水相である。本明の D成分としては、一般的に医薬品に使用される水成分から選択すればよく、例えば、精製水、注射用水、リン酸緩衝水溶液、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水などが挙げられる。本発明の希釈用乳化組成物における D成分の含有量は、 5〜 2 0重量％、好ましくは 8〜 1 6重量％である。

本発明の希釈用乳化組成物においては、上記の各成分に加えて、乳化安定性に影響しない範囲で、抗酸化剤や安定剤などを添加することもできる。

抗酸化剤としては、例えば、 α—トコフエ口ールゃ δ—トコフエ口ール等のトコフエロール類、没食子酸エステル類、ジブチルヒドロキシトルェンなどが挙げられる。

安定剤としては、グリセリンゃプロピレンダリコーノレ、 1 ， 3一プチレングリコール、ポリエチレングリコール等のアルコール類などが挙げられる。

本発明の希釈用乳化組成物は、一般的な乳化組成物の製造方法を適宜取り入れて製造することができる。通常は、 Α成分、 B成分および C成分をあらかじめ混合し、これを攪拌しながら、徐々に D成分を加えていき、最終的にホモジナイザ一等の乳化装置によつて攪拌、乳化する方法が選択される。本発明の希釈用乳化組成物は、好ましくは、非常に低粘度でかつ微細な粒子径を有する WZOエマルションの形態として得られる。

本発明の希釈用乳化組成物の分散相の平均粒子径は、好ましくは 1000 nm 以下であり、より好ましくは 500 nm以下であり、さらに好ましくは 50〜5 OOnmであり、特に好ましくは 50〜 300 n mである。

本発明では、希釈用乳化組成物の分散相の平均粒子径を、動的光散乱法により測定される全粒子（分散相）の粒子径の平均値で表現する。具体的には、測定対象の乳化組成物を A成分で適宜希釈して得られるサンプルを、例えば、 MALV ERN I NSTRUMENT S社製の ZETAS I ZER NANO— S等に供することより測定することができる。

分散相の平均粒子径が 1000 nmを超えると、希釈用乳化組成物としての安定性が低下するだけでなく、癌抗原ぺプチドを含む水相を希釈して最終的に得られる癌ヮクチン組成物の均一性、安定性、さらには C T L誘導活性が低下するおそれがあり、好ましくない。分散相の平均粒子径が 50〜 300 n mであれば、乳化組成物を W/Oエマルションの状態でろ過滅菌することもできる。ろ過滅菌を行う場合のフィルターには、油性液体のろ過に適したものを選択すればよい。具体的には、 0. 2 zmの孔径の疎水性フィルター（ポリテトラフルォロェチレン製）などが挙げられる。

本発明の希釈用乳化組成物は、アミノ酸数 8から 12の癌抗原ペプチドまたはそのダイマーと組み合わせることにより、それぞれの抗原に特異的な CTLの誘導を活性化する癌ワクチンまたは特異的 CTL誘導剤を得るために使用される。そのように癌ワクチン組成物または特異的 CTL誘導剤を調製する際には、希釈用乳化組成物 1容量部で、アミノ酸数 8から 12の癌抗原ペプチドまたはそのダイマ一を含有する水相 0. 25〜： L容量部を希釈すればよい。このとき、癌抗原ペプチドまたはそのダイマーは水相中に溶解していてもよいし、分散していてもよい。本発明の希釈用乳化組成物は、水粒子が微細に分散してレ、る wZoエマルションであり、しかも非常に低粘度である。よって、この希釈用乳化組成物でぺプチドを含む水相を希釈すると、速やかに安定な wZoエマルションを得ることができる。本発明の乳化組成物は、それ自体が安定な wzo'エマルシヨンである。そして、癌抗原べプチドを含有する水相を本発明の乳化組成物で上記のように希釈して得られる癌ワクチン組成物または特異的 C T L誘導剤もまた、安定な WZO エマノレションである。

したがって、本発明の希釈用乳化組成物で癌抗原ぺプチドを含む水相を希釈する際の攪拌手段としては、ホモジナイザ一やホモミキサ一等の一般的な乳化装置を用いてもよいし、乳化には通常用いられないような簡便な攪拌装置、例えば、試験管ミキサーなどを用いてもよい。また、実験室で簡便に操作できるシリンジ連結法により上記の希釈を行うこともできる。そのため、目的に応じて投与直前に用時調製することも可能である。

好ましくは、希釈用乳化組成物と癌抗原べプチドまたはそのダイマーを含有する水相とを容量比 1 ： 0 . 2 5〜1 ： 1で加えた後、試験管ミキサーを用い、攪拌速度に応じて 3 0秒〜 3分程度攪拌することにより、安定で良好な癌ワクチン組成物または特異的 C T L誘導剤を得ることができる。このとき、希釈用乳化組成物を試験管ミキサ一で攪拌しながら癌抗原ぺプチドを含む水相を徐々に加えていき、加えるべき全 ¾を加えた後、さらに 3 0秒以上攪拌するのが好ましい。本発明における癌ワクチン組成物、または特異的 C T L誘導剤とは、このように、アミノ酸数 8から 1 2の癌抗原ペプチドまたはそのダイマーを含む水相を、本発明の希釈用乳化組成物で希釈、混合して得られるものであり、前述のとおり、安定な W/Oエマルションの形態を有している。

ぺプチドは一般に熱に弱く、さらに水中で長期間安定に保つことが困難な場合が多い。上述したように、本発明では簡便な手段で用時調製を行うことも可能であるから、熱や水中での安定性が比較的低いぺプチドを用いる場合であっても、乳化操作中や保存中の該ペプチドの分解や凝集を低減する。つまり、本発明の希釈用乳化組成物を用いることにより、アミノ酸数 8力ら 12の癌抗原ペプチドまたはそのダイマーの好ましくない変質を伴うことがないため、その種類や物性を問わず、種々のペプチド（そのダイマーを含む）を安定に保持した癌ワクチン組成物または特異的 CTL誘導剤を調製することが可能になる。

本発明において、癌抗原ペプチドとは、アミノ酸数 8から 12の癌抗原べプチドまたはそのダイマーであり、 MHCクラス I抗原に提示され、かつ CTLにより抗原認識されるペプチドを含有するものである。

本発明において、アミノ酸数 8から 12の癌抗原ペプチドとしては、公知のものから選択することができる。例えば、メラノサイト組織特異的タンパク質である g p i 00、 MART- 1_N およぴチロシナーゼなどのメラノソームタンパク質由来の部分ペプチドが挙げられる。また、他の癌抗原ペプチドとして、 CEA、 PSA、 HER 2Zn e uなどの癌マーカー由来の部分ペプチド、 MAGE— 1、 MAGE— 2、 MAGE— 3、 N Y— E S O— 1などの癌'精巣抗原由来の部分ぺプチド、 MU C— 1や SART—1、 SART— 3などの上皮性癌細胞タンパク質由来の部分ペプチド等が挙げられる。さらに、癌で発現が増加している TE R T由来の部分べプチドゃ、 WT 1由来の部分ぺプチド、 Su r v i v i n— 2 B由来の部分ぺプチド等も好適な癌抗原べプチドとして挙げられる。

これらは、最終的に得られる癌ヮクチン組成物または特異的 C T L誘導剤において、それぞれの癌抗原に対する、治療上有効な特異的 CTLの誘導を妨げない限り、天然体でも一部のアミノ酸が改変された改変体であってもよい。

また、これら癌抗原のペプチドは、癌ワクチン組成物または特異的 CTL誘導剤にぉレ、て、一種のみならず二種以上を含有していてもよい。

これらの癌抗原ペプチドは、 Fmo c法等による固相合成法やその他公知の方法により得ることができる。

各癌抗原ぺプチドのァミノ酸配列の具体例としては、以下のものが挙げられる。尚、以下に列挙するァミノ酸配列をもつ癌抗原ぺプチドは公知である。 (1) g p 100由来ペプチドであれば、 KTWGQYWQV (配列番号 1) 、 AMLGTHTMEV (配列番号 2) 、 MLGTHTMEV (配列番号 3) 、 I TDQVPF SV (配列番号 4) 、 YLEPGP VTA (配列番号 5) 、 LLD GTATLRL (配列番号 6) 、 VLYRYGSFSV (配列番号 7) 、 SLA DTNSLAV (配列番号 8) 、 RLMKQDF SV (配列番号 9) 、 RLPR I FCSC (配列番号 10) 、 VYFFLPDHL (配列番号 1 1) など；

(2) MART- 1由来ペプチドであれば、 A AG I G I LTV (配列番号 1 2) 、 EAAG I G I LTV (配列番号 13) 、 I LTV I LGVL (配列番号 14) など；

(3) チロシナーゼ由来ペプチドであれば、 MLLAVLYCL (配列番号 1

5) 、 YMDGTMSQV (配列番号 16) 、 AFLPWHRLF (配列番号 1 7) 、 AFLPWHRLF L (配列番号 18 ) など；

(4) CE A由来ペプチドであれば、 YLSGANLNL (配列番号 19) 、 I MI GVLVGV (配列番号 20) 、 LLTFWNPPT (配列番号 21) 、 Q YSWFVNGTF (配列番号 22) 、 TYACFVSNL (配列番号 23) など；

(5) P S A由来ペプチドであれば、 FLTPKKLQCV (配列番号 24) 、 VSHSFPHPLY (配列番号 25) 、 V I SNDVCAQV (配列番号 2

6) 、 CYASGWGS I (配列番号 27) など；

(6) MUC— 1由来ペプチドであれば、 STAPPVHNV (配列番号 28) など；

(7) HER 2/n e u由来べプチドであれば、 Q I I SAVVG I L (配列番号 29) 、 QLFEDNYAL (配列番号 30) 、 KI FGSLAFL (配列番号 31) 、 CLTSVQLV (配列番号 32) 、 VMAGVGSPYV (配列番号 33) 、 RLLQETELV (配列番号 34) 、 PYVSRLLG I (配列番号 35) 、 TYLPTNASL (配列番号 36) など； (8) MAGE-1由来ぺプチドであれば、 NYKHCFPE I (配列番号 3

7) など；

(9) MAGE— 3由来ペプチドであれば、 FLWGPRALV (配列番号 3

8) 、 KVAELVHFL (配列番号 39) 、 IMPKAGLL I (配列番号 4 0) 、 TFPDLESEF (配列番号 41 ) など；

(10) NY—ESO— 1由来ペプチドであれば、 SLLMWI TQC (配列番号 42) 、 S LLMWI TQCFL (配列番号 43) 、 QLSLLMWI T (配列番号 44) など；

(1 1) SART— 1由来ペプチドであれば、 EYRGFTQDF (配列番号 4 5) など；

(1 2) SART— 3由来ペプチドであれば、 VYDYNCHVDL (配列番号

46) など；

(1 3) TERT由来ペプチドであれば、 I LAKFLHWL (配列番号 47) . VYAETKHF L (配列番号 48) 、 VYGF VRACL (配列番号 49) など；

(14) WT 1由来ペプチドであれば、 RMFPNAPYL (配列番号 50) 、 CMTWNQMNL (配列番号 5 1) 、 RWP S CQKKF (配列番号 52) など； .

(1 5) S u r V i V i n— 2 B由来ペプチドであれば、 AYACNTSTL (配列番号 53). など：

本明細書において、上記のペプチドは左側が N末端であり、各アミノ酸記号はそれぞれ以下のァミノ酸残基であることを示している。

A：ァラニン残基

G：グリシン残基

M :メチォニン残基

5 ：セリン残基

C ：システィン残基 H：ヒスチジン残基

N：ァスパラギン残基

T ：スレオニン残基

D ：ァスパラギン酸残基

I ：イソロイシン残基

P：プロリン残基

V：バリン残基

E：グルタミン酸残基

K：リジン残基

Q：グルタミン残基

W: トリプトファン残基

F ：フエニノレアラニン残基

L：ロイシン残基

R ：アルギニン残基

Y :チロシン残基

これらの癌抗原ぺプチドは癌抗原タンパク質の部分べプチドであるが、そのァミノ酸配列中、 N末端がシスティンであるものも存在する。このような癌抗原べプチド.は、水中でダイマー化しやすく、投与する際に、その含量の一部またはそのほとんどがダイマー化している場合がある。本宪明においては、そのようにァミノ酸数 8力ら 1 2のペプチドがダイマー化した場合においても同様の CTL誘導活性を示すため、癌抗原ペプチドとしては、アミノ酸数 8から 1 2の癌抗原ぺプチドまたはそのダイマーから目的に応じて選択することができる。本発明における癌抗原ペプチドとしては、イン'ビボで効率的に CTLを誘導させるため、アミノ酸数 8から 1 2の癌抗原ペプチドのうちでも、 HLA— A2402 (単に HLA—A24ともいう）または HLA— AO 20 1 (単に HLA— A2ともいう）拘束性のェピトープ配列であるものが好ましい。そのような癌抗原べプチドを用いることにより、最終的にイン'ビボで細胞傷害性 T細胞を誘導、活性化する、有効な癌ワクチン組成物を調製することができる。

本発明の希釈用乳化組成物と混合する場合の水相中の癌抗原ぺプチド（そのダイマ一も含む。以下同じ）の濃度は、最終的に得られる癌ワクチン組成物中の含有量が CTLの誘導を活性化するために適切な範囲の量となるように、用いるぺプチドの種類に応じて選択すればよい。本発明の癌ワクチン組成物または特異的 CTL誘導剤（以下、単に癌ワクチン組成物ともいう）は、希釈用乳化糸且成物を用いることにより、ぺプチドの種類や物性によらず安定に保持することが可能であるため、含有させるペプチド濃度は広い範囲で設定することができる。具体的には、投与経路や投与手段によって異なるものの、通常、最終的に得られる癌ヮクチン組成物中のペプチド濃度は 0. 01〜： I 0 Omg/mLである。

本発明の癌ワクチン組成物の投与経路としては、用いる癌抗原ペプチドに特異的な C T L誘導の活性化が可能な限り、通常用いられる投与方法を選択すればよい。その投与経路の例としては、例えば、皮下、皮内、筋肉内などが挙げられる。また、癌抗原ペプチドの投与量としては、治療目的の疾患、患者の症状、年齢、体重、性別等によって適宜調整することができるが、 0. 001〜： L 00mg、より好ましくは 0. 01〜10mgであり、これを数日ないし数ケ月に 1回投与するのが好ましい。

本発明の癌ワクチン組成物は、 W/Oエルシヨンである。本発明の癌ヮクチン組成物は、 A成分を 30〜80重量％、 B成分を 0. 5〜20重量％、 C成分を 0〜20重量％、 E成分を 10〜60重量％含有し、好ましくは、 A成分を 4 0〜60重量％、 B成分を 1. 0〜5. 0重量。/。、 C成分を 5. 0〜10. 0重量⁰ /₀、 E成分を 30〜50重量％含有する W/Oエマルシヨンである。保存や注射用シリンジによる投与を考慮すると、本努明の癌ワクチン組成物は、好ましくは 5 °Cで液状を呈し、かつ 25 °Cにおける粘度が 300 m P a · s以下であり、より好ましくは 25°Cにおける粘度が 20 OmP a · s以下である。本発明の E成分である水相中には、癌抗原ペプチドの物性に応じて、最終的に得られる癌ワクチン組成物の安定性に影響を与えない範囲で、安定剤、溶剤、溶解補助剤、分散剤、賦形剤、緩衝剤、等張剤、 p H調節剤などが含まれていてもよい。したがって、希釈用乳化組成物で、抗原ペプチドを含む水相を希釈する場合には、抗原ペプチドの物性に応じて、上述の各成分を適宜選択すればよい。本発明の癌ワクチン組成物は、含有する癌抗原べプチドに特異的な C T Lの誘導を活性化し、癌細胞を攻撃する。

C T L誘導活性は、 H L Aテトラマー法（Int. J. Cancer： 100, 565-570

(2002) ) または限界希釈法（Nat. Med. ： 4, 321-327 (1998) ) により C T Lの数を測定することにより確認、することができる。あるいは、例えば H L A— A 2

4拘束性の C T L誘導活性は、国際公開第 0 2 Z 4 7 4 7 4号パンフレットおよぴ Int. J. Cancer: 100， 565 - 570 (2002)に記述された H L A— A 2 4モデルマウスを用いることなどにより確認、することができる。

本発明の癌ワクチン組成物は、含有させる癌抗原ペプチドに応じて、特異的な C T Lの誘導能を有していて、誘導された C T Lは、細胞傷害作用やリンフォカインの産生を介して抗癌作用を示す。従って、本発明の癌ワクチン組成物は、癌の治療または予防のための癌免疫療法製剤として使用することができる。

実施例

以下、実施例を用いて本発明をより詳しく説明するが、これらの例は本発明を何ら限定するものではない。

〈希釈用乳化組成物の調製〉

〔実施例 1〕

A成分としてォレイン酸ェチル（医薬品添加物規格適合品）、 B成分としてポリォキシェチレン硬化ヒマシ油 1 0 (医薬品添加物規格適合品；ェチレンォキサイド 1 0モル付加）、 C成分としてセスキォレイン酸ソルビタン（日本薬局方適合品）をそれぞれ表 1に記載の量で混合した。次に、これを攪抨しながら、 D成分として、表 1に示した量の注射用水（日本薬局方適合品）を徐々に加えた。乳化は、 CLEARMI X 1. 5 S ( (株）ェムテクニック製）を用いて、 1 0， 00 O r pmで 5分間、室温下で攪拌することにより行った。これにより、希釈用乳化組成物 1を得た。この乳化組成物を調製後 24時間室温下で静置したところ、上の変化は認められなかった。

〔実施例 2〜3 5〕

実施例 1と同様に、あらかじめ D成分以外の成分を混合した。この混合物を攪拌しながら、 D成分を徐々〖こ加えて乳化を行った。乳化は、全て CLEARMIX 1.5S ( (株）ェムテクニック製）を用いて、 10， O O O r pmで 5分間、室温下で攪拌することにより行った。 D成分としては、注射用水、 1 0mMリン酸緩衝液 (pH7. 4) 、 10 mMリン酸緩衝生理食塩水 (pH7. 4) をそれぞれ表 1 〜7にしたがって用いた。また、表 1〜7に記載した各成分は日本薬局方、医薬品添加物規格、または化粧品原料基準に適合したものを用いた。これにより、乳化組成物 2〜 3 5を得た。得られた希釈用乳化組成物 2~ 3 5について、調製後 24時間室温下で静置した際の外観上の変化を調べた結果、いずれの乳化組成物も分離等の変化は認められなかった。

〔比較例 1〜 25〕

実施例 1と同様に、ォレイン酸ェチル（医薬品添加物規格適合品）、表 8〜1 2の各種ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（医薬品添加物規格適合品）、セスキォレイン酸ソルビタン（日本薬局方適合品）をそれぞれ表 8〜1 2に記載の量となるように混合した。ポリォキシェチレン硬化ヒマシ油 40ゃポリォキシェチレン硬化ヒマシ油 60等は 50°Cに加温し、溶融させたものを混合した。なお、乳化組成物 46 (比較例 1 1) の調製に用いたポリオキシエチレン（160) ポリォキシプロピレン（30) グリコールについては、混合が容易でないため、あらカゝじめ水相に溶解して乳化時に混合した。次に、これを攪拌しながら、注射用水、 10mMリン酸緩衝液 (pH7. 4) 、 10 mMリン酸緩衝生理食塩水 (pH7. 4) をそれぞれ表 8〜 1 2にしたがって徐々に加えた。乳化は、 CLEARMI X 1. 5 S ( (株）ェムテクニック製）を用いて、 10， O O O r pmで 5分間、室温下で攪拌することにより行った。これにより、希釈用乳化組成物 36〜 60を得た。なお、表に記載した各成分は日本薬局方、医薬品添加物規格、または化粧品原料基準に適合したものを用いた。いずれの公定書にも収載されていないものは医薬用途に準じたグレードを使用した。得られた乳化組成物を調製後 2 4時間静置したところ、？ Li匕,袓成物 36〜39、および 56、 57については分離等の変化は認められなかったが、乳化組成物 40〜55、および 58〜60については、油相と水相の分離（クリーミングを含む）が認められた。

表 1

実施例

1 2 3 4 5 乳化組成物番号 1 2 3 4 5 ォレイン酸ェチノレ 70.0 70.0 ― 70.0 70.0

2—ェチルへキサン酸セチル ― ― 70.0 ― ― ポリォキシェチレン硬ィヒヒマシ油 10 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 セスキォレイン酸ソ /レビタン 12.0 ― ― 12.0 ― モノォレイン酸ソノレビタン ― 12.0 12.0 ― 12.0 歸用水 15.0 15.0 15.0 ― . ― リン酸锾衝生理塩水 (pH7.4) ― ― ― 15.0 15.0 室温 24時間静置後の状態変ィ匕なしなしなしなしなし

表 2

実施例

6 7 8 9 10 乳化組成物番号 6 7 8 9 10 ォレイン酸ェチル 70.0 70.0 70.0 70.0 70.0 ポリオキシェチレン硬化ヒマシ油 5 ― 3.0 一一 ― ポリオキシエチレン硬ィ匕ヒマシ油 10 3.0 一 3.0 一 ― ポリオキシエチレンヒマシ油 10 ― ― ― 3.0 ― ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油 20 ― 一 ― 一 3.0 セスキォレイン酸ソノレビタン ― 6.0 6.0 6.0 6.0 モノォレイン酸グリセリン 12.0 6.0 6.0 6.0 6.0 リン隨赚 (pH7.4) 」 15.0 15.0 15.0 15.0 15.0 室温 24時間静置後の状態変ィ匕なしなしなしなしなし表 3

表 4

実施例

16 17 18 19 20 乳化組成物番号 16 17 18 19 20

2ーェチルへキサン酸セチル 70.0 70.0 一 ― ― ォレイン酸ェチル一 ― 70.0 70.0 ミリスチン酸ォクチルドデシル ― ― ― ― 70.0 ポリォキシエチレン硬化ヒマシ油 10 3.0 ― 2.0 5.0 3.0 ポリォキシェチレン硬化ヒマシ油 20 ― 3.0 1.0 ― ― セスキォレイン酸ソノレビタン 6.0 12.0 6.0 6.0 .11.0 モノォレイン酸グリセリン 5.0 ― 5.0 5.0 ― グリセリン 1.0 ― 1.0 1.0 1.0 リン,衝液 (pH7.4) 15.0 15.0 15.0 15.0 15.0 室温 24時間静置後の状態変化なしなしなしなしなし表 5

実施例

21 22 23 24 25 乳化組成物番号 21 22 23 24 25 ォレイン酸ェチル 70.0 ― ― 70.0 70.0

2—ェチノレへキサン酸セチノレ ■― 70.0 ― ― ' ― ミリスチン酸ォクチルドデシル ― ― 70.0 ― ― ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油 10 15.0 15.0 15.0 15.0 15.0 注射用水 15.0 15.0 15.0 ― ― リン!^衝水 (pH7.4) ― ― ― 15.0 15.0 室温 24時間静置後の状態変化なしなしなしなしなし

表 6

表 7

実施例

31 32 33 34 35 乳化組成物番号 31 32 33 34 35 ォレイン酸ェチル 72.0 78.0 80.0 74.0 ― ホホパ油 ― ― 一 ― ' 70.0 ポリォキシエチレン硬ィヒヒマシ油 10 3.0 3.5 3.0 3.0 3.0 セスキォレイン酸ソルビタン 15.0 7.5 5.0 15.0 12.0 グリセリン 1.0 1.0 一 1.0 ― リン薩衝水 (pH7.4) 10.0 10.0 . 12.0 7.0 =15.0 _ 室温 24時間静置後の状態変ィ匕なしなしなしなしなし

表 8

比較例

1 2 3 4 5 乳化組成物番号 36 37 38 39 40 ォレイン酸ェチル 70.0 70.0 一 70.0 70.0

2—ェチルへキサン酸セチル ― ― 70.0 ― ― ポリォキシェチレン硬ィヒヒマシ油 30 ― 3.0 一一 ― ポリォキシェチレン硬化ヒマシ油 40 3.0 ― 3.0 ― ― ポリォキシェチレン硬ィ匕ヒマシ油 60 ― ― 一 3.0 ― セスキォレイン酸ソ /レビタン 12.0 6.0 6.0 6.0 7.5 モノォレイン酸グリセリン ― 6.0 6.0 6.0 7.5 歸用水 15.0 15.0 15.0 15.0 15.0 室温 24時間静置後の状態変化 ¹ なしなしなしなし分離表 9

比較例

6 7 8 9 10 乳化組成物番号 41 42 43 44 45

2一ェチルへキサン酸セチル 70.0 ― ― ― 一セパシン酸ジェチル一 70.0 ― ― ― 精製ダイズ油 ― ― 70.0 ― ' ― スクヮラン一 ― ― 70.0 ― 軽質流動ノラフィン ― ― ― ― 70.0 ポリォキシェチレン硬化ヒマシ油 10 ― 3.0 3.0 3.0 3.0 セスキォレイン酸ソノレビタン 7.5 6.0 6.0 6.0 6.0 モノォレイン酸グリセリン 7.5 6.0 6.0 6.0 6.0 歸用水 15.0 15.0 15.0 15.0 15.0 わずか室温 24時間静置後の状態変ィ匕分離分離分離分離

に分離

表 1 0

表 12

〔試験例 1〕

〈癌ワクチン組成物の調製〉

実施例で得られた各希釈用乳化組成物のうち、調製後 24時間静置により外観上分離が見られなかったものを用いて、各種の癌抗原ペプチドを含有する癌ワクチン組成物を調製した。調製に用いた癌抗原ペプチドを表 13に示す。これらのペプチドはいずれも HLA— A 24拘束性である。

表 13

表 13に記載の癌抗原ペプチドのうち、 TERT、 MAGE— 1、 CEAについては、 1. 2mgの合成ペプチドを 10. 8 μ Lの DMSOに溶解した後、注射用水 349. に希釈し、析出物が無いことを目視で確認した（DM SO 濃度 3%) 。また、 PS Aについては、 1. 2m gの合成ペプチドを注射用水で 360 /z Lに希釈し、析出物が無いことを目視で確認した。別途、実施例で得られた乳化組成物を試験管ミキサー（タツチミキサー MT— 51、ャマト科学製）にて充分混合した（使用前に十分に攪拌し均一化した）。

次に、乳化組成物 700 ^ 1^を Ι Ο Ο Ο μ L用ェッペンドルフピぺットを用いて、 5mL容セラムチューブ（住友ベークライト社製）に採取した。次いで、そのチューブを試験管ミキサーで攪拌しながら、上記のぺプチド含有水相 300 Lを滴下し、混合した。試験管ミキサーの攪拌速度は最大に設定した。ペプチド含有水相を滴下後、さらに 2分間試験管ミキサーにて攪拌し、癌ワクチン組成物を得た。

以下の試験では、調製した癌ワクチン組成物を用いて実際に CTL誘導活性を評価するが、特に記載のない限り、評価に用いた癌ワクチン組成物は上記方法に従って調製されたものである。

〔試験例 2〕

<TER Tぺプチド含有癌ヮクチン組成物による C T L誘導〉

試験例 1にて調製した T E R Tぺプチド含有癌ヮクチン組成物の特異的 C T L 誘導能を HLA— A24トランスジエニックマウス（Int， J. Cancer： 100, 565: 2002) を用いて評価した。

癌ワクチン組成物の調製には、乳化組成物 7、 8、 37、 38、 39、 45を用いた。調製した癌ワクチン組成物には乳化組成物と同じ番号を付与した。評価に際しては、試験例 1と別に、フロイント不完全アジュバント（I FA、和光純薬工業製）を用いて調製した TERTペプチド含有乳濁液、およびペプチド水相のみを投与液とする群を設定し、癌ワクチン組成物を投与液とする群と比較した (いずれの投与群もペプチド投与量が同じになるように調整した）。各投与液 2 00 μ L (それぞれペプチド投与量 200 /1 g ) を HLA— A 2 !^トランスジエニックマウスの尾根部皮下に投与した。マウスは各群 3匹用いた。投与 7 〜8日後に脾臓を摘出し、脾細胞を調製した。脾細胞の一部を 100 g/mL のペプチドで 1時間ノヽ。ルスした。ノ、。ルスとは、ペプチドを脾細胞に添加し、細胞表面上の HL Aに抗原べプチドを結合させることを言う。ぺプチドをパルスしていない脾細胞を 24穴プレートに 7X 10⁶個 Zwe 1 1で播種し、更に上記のぺプチドをノ、。ルスした脾細胞を 7X 1 0⁵個 e 1 1添加して培養した。培養液には、 RPMI 1640培地に 10%FCS、 1 OmM HEPES、 20m M L—グルタミン、 1 mM ピルビン酸ナトリウム、 1 mM MEM非必須ァミノ酸、 1% MEMビタミン、 55 μΜ 2—メルカプトエタノールを含ませ. 5 ~ 6日間培養した。培養した脾細胞中の投与ぺプチド特異的な C T Lの活性を ⁵¹C rリリースアツセィひ. Immunol.： 159， 4753, 1997) により測定した。標的細胞としては、 HLA— A24と H— 2K^bのキメラの MHCクラス I分子

(Int. J. Cancer: 100, 565, 2002) を安定的に発現するように、マウスリンパ腫由来細胞株 EL-4細胞 (ATCC株番号 T I B-39) に遺伝子導入して作製した細胞株 E L4— A2402/K^bを用いた。標的細胞は 3. 7Mb q/1 0⁶個で⁵¹ C rラベル後、前記ペプチドを 100 g/mLになるように添加して更に 1時間パルスした。またペプチドをノ、。ルスしない（非パルスの）標的細胞を 2時間⁵¹ C rラベルしてコント口 ^"ル標的細胞とした。これらのラベルされた標的細胞と先に調製された脾細胞を 1 ： 80の割合で混合して 4時間培養し、傷害を受けた標的細胞の割合より C T L活性を求めた。結果を図 1に示す。

図 1に示すように、 .本発明の癌ワクチン組成物を投与した群では、ぺプチドをパルスした標的細胞を強く傷害したが、コントロールのペプチドをパルスしていない標的細胞に対する傷害性は弱かったことから、ぺプチド特異的 C T Lが誘導されていることが明らかとなった。一方、癌ワクチン 37、 38、 39、 45を投与した群、 I F Aより調製したペプチド乳濁液を投与した群、およびペプチドのみを投与した群では細胞傷害性が低く、 CTLの誘導活性は低かった。このこと力ゝら、本発明の希釈用乳化組成物は、癌抗原ペプチドと組み合わせることにより、イン 'ビポにお!/、て C T Lの誘導を活性化することは明らかである。また、本発明の A成分の種類と B成分のェチレンォキサイド付加モル数が C T L誘導活性に影響していることがわかる。

〔試験例 3〕

<MA GE-1ぺプチド含有癌ヮクチン組成物による C T L誘導〉

試験例 1にて調製した M A GE- 1ぺプチド含有癌ヮクチン組成物の特異的 C T L誘導能を試験例 2と同様に評価した。

癌ワクチン組成物の調製には、乳化組成物 8、 37、 38、 45を用いた。調製した癌ヮクチン組成物には乳化組成物と同じ番号を付与した。評価に際しては、試験例 1と別に、フロイント不完全アジュバント (I FA、和光純薬工業製）を用いて調製した MAGE— 1ペプチド含有乳濁液、およびペプチド水相のみを投与液とする群を設定し、癌ワクチン組成物を投与液とする群と比較した。結果を図 2に示す。

図 2に示すように、本発明の癌ワクチン組成物を投与した群では、ぺプチドをパルスした標的細胞を強く傷害したが、コント口一ノレのぺプチドをパルスしてヽない標的細胞に対する傷害性は弱かったことから、ぺプチド特異的 CT Lが誘導されていることが明らかとなった。一方、癌ワクチン 37、 38、 45を投与した群、 I F Aより調製したペプチド乳濁液を投与した群、およびペプチドのみを投与した群では細胞傷害性が低く、 CTLの誘導活性は低かった。以上の結果は試験例 2の結果と同様であり、本発明の希釈用乳化組成物の有用性がわかる。〔試験例 4〕

く P SAペプチド含有癌ワクチン組成物による CTL誘導（1) 〉

試験例 1にて調製した P S Aぺプチド含有癌ヮクチン組成物の特異的 C T L誘導能を試験例 2と同様に評価した。

癌ワクチン組成物の調製には、乳化組成物 2、 7、 1 0、 29、 38を用いた。調製した癌ワクチン組成物には乳化組成物と同じ番号を付与した。また、乳化,組成物 7を用いて、乳化組成物 700 μ Lと注射用水 300 / Lとを試験例 1に従つて混合し、ペプチドを含まない組成物を調製し、比較を行った。結果を図 3に示す。

図 3に示すように、本発明の癌ワクチン組成物（2、 7、 1 0、 2 9 ) を投与した群では、ぺプチドをパルスした標的細胞を強く傷害したが、コント口ールのぺプチドをノ、。ルスしていない標的細胞に対する傷害性は弱かったことから、ぺプチド特異的 C T Lが誘導されていることが明らかとなった。一方、癌ワクチン 3 8を投与した群では細胞傷害性が低く、 C T Lの誘導活性は低かった。また、ぺプチドを含まない組成物を投与した群では細胞傷害性が全く認められなかったこと力ら、乳化組成物のみでは C T Lを誘導する活性を有しないことがわかる。以上の結果は試験例 2の結果と同様であり、本発明の希釈用乳化組成物の有用性がわかる。

〔試験例 5〕

く P S Aペプチド含有癌ワクチン組成物による C T L誘導（2 ) 〉

試験例 1にて調製した P S Aぺプチド含有癌ヮクチン組成物の特異的 C T L誘導能を試験例 4と同様に評価した。

癌ワクチン組成物の調製には、乳化組成物 1 6、 1 7、 2 0を用いた。調製した癌ワクチン組成物には乳化組成物と同じ番号を付与した。評価に際しては、試験例 1と別に、フロイント不完全アジュバント ( I F A、和光純薬工業製）を用いて調製した P S Aぺプチド含有乳濁液を投与液とする群を設定し、癌ワクチン組成物を投与液とする群と比較した。結果を図 4に示す。

図 4に示すように、本発明の癌ワクチン組成物を投与した群では、ペプチドをノ、。ルスした標的細胞を強く傷害したが、コント口一ルのぺプチドをパルスしていない標的細胞に対する傷害性は弱かったことから、ぺプチド特異的 C T Lが誘導されていることが明らかとなった。また、 P S Aペプチドを用いた場合は、 I F Aより調製したべプチド乳濁液を投与した群でもべプチド特異的 C T Lが誘導された。この結果およひ験例 2、 3の結果から、従来より知られている I F Aは一部の癌抗原ぺプチドでは C T L誘導を活性ィヒするものの、ぺプチドの種類に大きく影響し、汎用性の面で不十分であることが示された。

〔試験例 6〕

{ C E Aぺプチド含有癌ヮクチン組成物による C T L誘導〉

試験例 1にて調製した CE A含有癌ワクチン組成物の特異的 CTL誘導能を試験例 2と同様に評価した。

癌ワクチン組成物の調製には、乳化組成物 12、 13、 28、 29、 30、 3 7、 38を用いた。調製した癌ワクチン組成物には乳化組成物と同じ番号を付与した。結果を図 5に示す。図 5に示すように、本発明の乳化組成物を用いて調製した癌ワクチン糸且成物を投与した群（12、 13、 28、 29) では、ペプチドをパルスした標的細胞を強く傷害したが、コント口一ルのぺプチドをパルスしていない標的細胞に対する傷害性は弱かったことから、ぺプチド特異的 CT Lが誘導されていることが明らかとなった。一方、癌ワクチン 37、 38を投与した群では細胞傷害性が低く、 CTLの誘導活性は低かった。以上の結果は試験例 2の結果と同様であり、本発明の希釈用乳化組成物の有用性がわかる。

〔試験例 7〕

〈各種癌抗原ぺプチドを含有させた癌ワクチン組成物による CT L誘導〉乳化組成物 21を用いて、試験例 1に従って調製した TERT、 MAGE— 1、 C E Aの各ぺプチド含有癌ヮクチン組成物の特異的 C T L誘導能を試験例 2と同様に評価した。結果を図 6に示す。図 6によれば、本発明の乳化組成物を用いて調製した癌ワクチン組成物を投与した群では、ぺプチドをパルスした標的細胞を強く傷害したが、コント口一ルのぺプチドをパルスしていない標的細胞に対する傷害性は弱かつたことから、ぺプチド特異的 C T Lが誘導されていることが明らかとなつた。

以上の結果、本発明の希釈用乳化組成物は、種々の癌抗原ペプチドと組み合わせることにより、イン'ビポにおいてそれぞれの癌抗原に特異的な CT Lの誘導を活性ィ匕することがわかる。〔試験例 8〕

〈希釈用乳化 ,袓成物の安定 '性評価〉

実施例にて調製した希釈用轧化組成物について、安定性試験を行った。試験には、調製後 24時間静置により舰上分離が見られなかつた乳化組成物 1-3 9, 56、 57を用いた。具体的には、各乳化組成物 2 mLを 4 mL容のガラス製バィアルに充填、密栓し、 2 5 °Cで 1ヶ月、 3ヶ月、 6ヶ月保存後の外観上の変化を観察した。その結果、いずれの乳化組成物も外観上の変ィ匕は認められなかった。〔試験例 9〕

〈希釈用乳化 ,袓成物の顕微鏡観察〉

試験例 8と同様に、調製後 24時間静置により^上分離が見られなかった乳化組成物（1〜3 9、 56、 57) を用いて、希釈前後の乳化状態を顕微鏡下で観察した。まず、各乳化組成物の乳化状態を位相差顕微鏡により 200倍で観察した。その結果、いずれの乳化組成物も微細で良好な乳化状態であった。そこで、各乳化組成物 700 μ Lと注射用水 300 / Lとを 5mL容セラムチューブ（住友ベークライト社製）にとり、試験管ミキサー（タツチミキサー MT—5 1、ャマト科学製）を用いて 2分間攪拌した後の乳化状態を上記と同様に顕微鏡下で観察した。その結果、乳化 ,袓成物 1〜 35については、いずれも微細で良好な乳化状態.を示したが、？ W匕組成物 36-3 9、および 56、 5 7では明らかに水相粒子の凝集が認められた。

〔試験例 10〕

〈希釈用乳化組成物の平均粒子径評価〉

実施例および比較例で得られた希釈用乳化組成物のうち、乳化組成物 1、 2、 4、 6、 7、 8、 10、 2 1、 29、 36、 39の平均粒子径を測定した。測定は、粒度分布測定装置（ZETA— S I ZER NANO— S、 MALVERN I NSTRUMENTS社製）を用いて、動的光散乱法により行った。なお、測定を適切に行うために、測定時にはそれぞれの乳化組成物を連続相であるォレイン酸ェチルで適宜希釈した。結果を表 14に示す。平均粒子径は光散乱強度から算出された全粒子径の平均値である。また、測定結果の例として、乳化組成物 8 および 2 9の調製時（イニシャル）の粒度分布をそれぞれ図 7、 8に示す。

表 1 4

測定の結果、調製時にはいずれの乳化組成物も 5 0〜5 0 0 n mの範囲であつた。このことから、癌抗原ペプチドの希釈用として用いるためには、良好な乳化状態を示すだけでは不十分であることがわかる。すなわち、本宪明の希釈用乳化組成物による C T L誘導能に必須であるのは、『良好な乳化組成物が調製できる』ことではなく、 B成分である非イオン性界面活性剤のエチレンオキサイド付加モル数が特定の範囲である、ということが本データで示された。

また、上記の希釈用乳化糸且成物のうち、乳化組成物 1、 2、 4、 6、 7、 8、 1 0、 2 1、 2 9については、 5 °Cで 3ヶ月間保存後の平均粒子径を同様に測定した。その結果、いずれの乳化組成物も平均粒子径'に大きな変化が認められなかつたことから、本発明の希釈用乳化組成物は低温安定性にも優れることがわかる。〔試験例 1 1〕

〈癌抗原ぺプチド 2種を混合含有させた癌ヮクチン組成物による C T L誘導〉表 1 3に記載の癌抗原ペプチドのうち、 MA G E—1と C E A、 T E R Tと C E A、 C E Aと P S Aをそれぞれ混合したべプチド 2種含有癌ワクチン組成物を調製し、その特異的 C T L誘導能を評価した。各癌ワクチン組成物の調製には乳化組成物 4を用い、具体的には以下のように行った。

まず、 MAGE— 1、 CEA、 TERT、 P S Aの各ペプチドについて、 10 Omg/mLになるように DMSO溶液を調製した。次に、 MAGE— 1と CE A、 TERTと CEA、 C E Aと P S Aの各 DMS O溶液をそれぞれ混合し、さらに注射用水を用いて、各ぺプチドが 2 m g Z 600 μ Lになるように希釈し、ペプチド混合溶液を調製した（ペプチド合計量として 4πι_§/600 μ υ 。各溶液は調製後、析出物が無いことを目視で確認した。別途、実施例で得られた乳化糸且成物を試験管ミキサー（タツチミキサー ΜΤ— 5 1、ャマト科学製）にて充分混合した（使用前に十分に攪拌し均一化した）。

次に、乳化組成物 700 /^ Lを 1 000^ L用ェッペンドルフピぺットを用いて、 5mL容セラムチューブ（住友ベークライト社製）に採取した。次いで、そのチューブを試験管ミキサ一で攪拌しながら、上記のぺプチド混合溶液 300 μ Lを滴下し、混合した。試験管ミキサーの攪拌速度は最大に設定した。ペプチド混合溶液を滴下後、さらに 2分間試験管ミキサーにて攪拌し、癌ワクチン組成物 3種（MAGE— 1/CEA混合、 TERT/CEA混合、 CEA/P SA混合）を得た。

調製した癌ワクチン組成物 3種の特異的 CTL誘導能を HLA— A24トランスジエニックマウス（Int. J. Cancer： 100, 565， 2002) を用いて評価した。各投与液 20 O μ L (それぞれぺプチド投与量 200 μ g X 2種）を HLA— A24/K^bトランスジエニックマウスの尾根部皮下に投与した。マウスは各群 1匹を用いた。投与 7日後に脾臓を摘出し、脾細胞を調製した。脾細胞の一部を各 50 μ g/mLの対象ペプチド 2種（計 l O O ^u g/mL) で 1時間パルスした。ぺプチドをパルスしていない脾細胞を 24穴プレートに 7 X 1 0⁶個/ w e 1 1で播種し、更に上記のぺプチドをパルスした脾細胞を 7 X 10⁵個/ w e 1 1添加して培養した。培養液には、 R PM I 1640培地に 10 % F C S、 10 mM HEPE S、 2 OmM L—グルタミン、 1 mM ピルビン酸ナトリウム ImM MEM非必須アミノ酸、 1% MEMビタミン、 55 2—メズレカプトエタノールを含ませ、 5日間培養した。培養した脾細胞中の投与ペプチド特異的な C T Lの活性を⁵¹ C rリリースアツセィ（J. Immunol.： 159, 4753, 1997) により測定した。標的細胞としては、 HLA—A24と H— 2K^bのキメラの MHCクラス I分子 (Int. J. Cancer: 100, 565, 2002) を安定的に発現するように、マウスリンパ腫由来細胞株 EL— 4細胞（ATCC株番号 T I B— 3 9) に遺伝子導入して作製した細胞株 EL4— A2402/K^bを用いた。標的細胞は 3. 7Mb 0⁶個で⁵¹ C rヲベル後、各ペプチドを 100 μ g Zm

Lになるように添加して更に 1時間パルスした。またぺプチドをパルスしない (非パルスの）標的細胞を 2時間 ⁵¹ C rラベルしてコントロール標的細胞とした。これらのラベノレされた標的細胞と先に調製された脾細胞を 1 : 80の割合で混合して 4時間培養し、傷害を受けた標的細胞の割合より C T L活性を求めた。結果を図 9に示す。

図 9に示すように、本宪明の希釈用乳化組成物を用いて調製した癌ワクチン組成物を投与した群では、ぺプチドをパルスした標的細胞を強く傷害した。一方、コントロールのぺプチドをパルスしていない標的細胞に対する傷害性は弱かったことから、癌抗原ペプチドを 2種混合させた場合、それぞれのペプチド特異的 C TLが同時に誘導されていることが明らかとなった。このこと力ら、本発明の希釈用乳化組成物は、さまざまな癌抗原ペプチドと組み合わせることにより、ィン'ビポにおいて CTLの誘導を活性化することが明らかとなった。

産業上の利用可能性

本宪明の希釈用乳ィ匕組成物は、それ自体が安定な w/oエマルションである。本発明の希釈用乳化組成物で癌抗原ぺプチドまたはそのダイマーを簡便な操作により希釈することで、イン 'ビボにおいて、それぞれの癌抗原に特異的な CTL 誘導活性を示し、かつ安定な W/Oエマルシヨンである癌ワクチン組成物が提供される。また本発明により、特異的 CTLの誘導を目的とした、癌抗原ペプチドまたはそのダイマー希釈用の乳化組成物が提供される。さらに、この希釈用乳化組成物により、イン.ビポにおいて、さまざまな癌抗原に特異的な CTL誘導活性を有する癌ワクチン組成物が提供される。本努明は、多くの癌患者の病態改善に有効であると考えられる。

本出願は、日本で出願された特願 2005-012140 (出願 0 : 2005 年 1月 19日）を基礎としており、それらの内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims

請求の範囲

1 . A) 炭素数 8〜2 2の脂肪酸と炭素数 2〜2 4のアルコールとのエステルであり、該エステルの凝固点が 1 0 °C以下であるエステルを 5 0〜 9 0重量⁰ /₀；

B ) ェチレンォキサイド 5〜 2 0モル付加ヒドロキシ脂肪酸トリグリセライドからなる非ィォン性界面活性剤を 0 . 5〜 2 0重量％；

C) 多価アルコールと脂肪酸との部分エステルであり、該部分エステルが 4 0 °C で液体である乳化剤を 0〜 2 0重量％；および

D) 水を 5〜2 0重量％；

2 . 希釈用乳化組成物の分散相の平均粒子径が 5 0〜 5 0 0 n mである請求項 1に記載の希釈用乳化 ,袓成物。

3 . 請求項 1または 2に記載の希釈用乳化組成物 1容量部で、アミノ酸数 8力ら 1 2の癌抗原べプチドまたはそのダイマーを含有する水相 0 . 2 5 ~ 1容量部を希釈する、癌ワクチン,钽成物の調製方法。

4 . A) 成分を構成する脂肪酸がォレイン酸、ミリスチン酸または 2—ェチルへキサン酸である請求項 1記載の希釈用乳化組成物。

5 . A) 成分のエステルが、ォレイン酸ェチル、ミリスチン酸オタチルドデシルまたは 2—ェチルへキサン酸セチルである請求項 1記載の希釈用乳化組成物。

6 . B ) 成分の非イオン性界面活性剤を構成するヒドロキシ脂肪酸トリグリセライドがヒマシ油または硬化ヒマシ油である請求項 1記載の希釈用乳化組成物。

7 . A) 炭素数 8〜 2 2の脂肪酸と炭素数 2〜 2 4のアルコールとのエステルであり、該エステルの凝固点が 1 0 °C以下であるエステルを 3 0〜8 0重量％；

B ) ェチレンォキサイド 5〜 2 0モル付加ヒドロキシ脂肪酸トリグリセライドからなる非ィオン性界面活性剤を 0 . 5〜 2 0重量。 /₀；

C) 多価アルコールと脂肪酸との部分エステルであり、該部分エステルが 4 0 °C で液体である乳化剤を 0〜2 0重量％；および E) アミノ酸数 8から 1 2の癌抗原ペプチドまたはそのダイマーを含む水相を 1 0~60重量％；

を含有し、当該組成物力エマルシヨンである、癌ワクチン糸且成物。

8. A) 成分を 40〜60重量％；

B) 成分を 1. 0~5. 0重量％ ;

C) 成分を 5. 0〜： L O. 0重量％；および

E) 成分を 30〜50重量％；

を含有する請求項 7に記載の癌ワクチン組成物。

9. A) 炭素数 8〜 22の脂肪酸と炭素数 2〜 24のアルコールとのエステルであり、該エステルの凝固点が 10°C以下であるエステルを 30〜80重量％；

B ) エチレンォキサイド 5〜 20モル付加ヒドロキシ脂肪酸トリグリセライドからなる非ィォン性界面活'【生剤を 0. 5〜 20重量％；

E) アミノ酸数 8から 1 2の癌抗原ペプチドまたはそのダイマーを含む水相を 1 0〜 60重量％；

を含有し、当該組成物が W/Oエマルシヨンである、特異的細胞傷害性 T細胞誘導剤。 .

10. A) 成分を 40 ~ 60重量％；

B) 成分を 1. 0〜5. 0重量％ ;

C) 成分を 5. 0〜； L O. 0重量⁰/。；および

E) 成分を 30〜 50重量％；

を含有する請求項 9に記載の特異的細胞傷害性 T細胞誘導剤。

1 1. アミノ酸数 8から 1 2の癌抗原ペプチドまたはそのダイマーを含有する水相と、前記水相を希釈するための請求項 1に記載の希釈用乳化組成物とを含む、癌ヮクチン組成物または特異的 C T L誘導剤を用 B 調製するためのキット。