WO2006046584A1

WO2006046584A1 - 視細胞障害治療剤

Info

Publication number: WO2006046584A1
Application number: PCT/JP2005/019654
Authority: WO
Inventors: Noriyuki Kuno; Fumihiko Takamatsu
Original assignee: Santen Pharmaceutical Co., Ltd.
Priority date: 2004-10-26
Filing date: 2005-10-26
Publication date: 2006-05-04

Abstract

本発明は、網膜色素変性、錐体ジストロフィー、加齢黄斑変性、加齢黄斑症、黄斑浮腫、網膜剥離などの視細胞障害を惹起する難治性疾患に対して有効な治療剤を探索すること、および視細胞若しくはその機能を再生させるために有用な材料を提供する。肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）または網膜色素上皮由来の神経栄養因子（ＰＥＤＦ）を架橋ゼラチンヒドロゲルに含浸させた徐放性組成物は、いずれも優れた視細胞変性抑制効果を奏する。また、これらの徐放性組成物と脂肪由来間質細胞を組み合わせて網膜下に投与すると、視細胞またはその機能が再生し、視細胞変性抑制効果が増強・持続する。

Description

明細書

視細胞障害治療剤

技術分野

[0001] 本発明は、肝実質細胞増殖因子 (HGF)、脳由来神経栄養因子 (BDNF)または網膜色素上皮由来の神経栄養因子 (PEDF)を架橋ゼラチンヒドロゲルに含浸させた徐放性組成物からなる視細胞障害を惹起する疾患の治療剤に関する。また、本発明は、 HGF、 BDNFまたは PEDFを架橋ゼラチンヒドロゲルに含浸させた徐放性組成物と、視細胞またはその機能を再生若しくは補完する役割を有する細胞からなる視細胞またはその機能を再生させるための材料に関する。

背景技術

[0002] 視細胞は、網膜への光刺激を電気信号に変換する細胞であり、光覚、視覚に関わる重要な機能を司るので、視細胞に障害が生ずると、視力や視野などに対して深刻な影響を及ぼす。視細胞障害を惹起する疾患としては、例えば網膜色素変性、錐体ジストロフィー、加齢黄斑変性、黄斑浮腫、網膜剥離、癌関連網膜症、網膜静脈閉塞症、網膜色素上皮剥離などが挙げられる。これらの疾患は、難治性で既存の薬物を投与しても容易には治癒されず、一旦変性'脱落した視細胞の機能を取り戻すことはできないので、視細胞の変性を抑制'遅延させること、さらには視細胞の機能を再生させることが望まれている。新しい治療方法として、自家及び他家の細胞や組織を移植し、機能不全に陥った細胞、組織や臓器を置換、再生させる再生医療が試みられている。

[0003] ところで、肝実質細胞増殖因子 (HGF;hepatocyte growth factor)は、成熟肝細胞に対する強力な増殖促進因子であり、肝再生因子として肝臓の修復 '再生に作用するだけでなぐ血管新生作用も併せもつことが知られている (特許文献 1、非特許文献 1 )。特許文献 2は HGF徐放性製剤に関する発明を記載し、 HGFと特定の物性を有するゼラチンヒドロゲルを組み合わせることにより得られる HGF徐放性製剤は、血管新生促進剤や動脈疾患治療剤として利用できることが述べられている。

[0004] 月由来神経栄養因子（BDNF； brain derived neurotrophic factor)は、視細胞障害の進行を遅らせたり、改善することが知られており、特許文献 3には、 BDNFを含有する点眼液又は眼軟膏が加齢黄斑変性や網膜色素変性の治療に有効であることが記載されている。特許文献 4には、網膜色素上皮由来の神経栄養因子 (PEDF ; pig ment epithelium derived factor)力網膜疾患の治療に有効であることが記載されている。特許文献 5は、ヒドロゲルカゝらなる細胞移植療法用材料に関する発明を記載し、肝実質細胞増殖因子 (HGF)などの細胞増殖因子を含有するヒドロゲルは、心不全の治療剤として有効であることが述べられている。また、特許文献 6は、細胞と細胞増殖因子とからなる組織器官を再生するための治療剤に関する発明を記載し、脂肪前駆細胞と bFGF (塩基性線維芽細胞増殖因子)を組み合わせた治療剤を皮膚下に埋殖すると、脂肪組織が再生することが報告されている。

[0005] し力し、 HGF、 BDNFまたは PEDFを架橋ゼラチンヒドロゲルに含浸させた徐放性組成物に関して、視細胞障害に対する薬理作用を検討する報告はない。

特許文献 1：特公平 4— 72840号公報

特許文献 2：国際公開第 03Z007982号パンフレット

特許文献 3 :特開 2003— 48851号公報

特許文献 4:米国特許第 6451763号明細書

特許文献 5 :特開 2002— 145797号公報

特許文献 6 :特開 2001— 316285号公報

非特許文献 l : Proc. Natl. Acad. Sci., 90, 1937-1941(1993)

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0006] 網膜色素変性、錐体ジストロフィー、加齢黄斑変性、加齢黄斑症、黄斑浮腫、網膜剥離などの視細胞障害を惹起する難治性疾患に対して有効な治療剤を見出すことは重要な課題である。また、視細胞またはその機能を再生させるために有用な材料を提供できれば、視細胞障害を惹起する難治性網膜疾患の根本的な治療に貢献できるところが大きい。

課題を解決するための手段

[0007] 本発明者等は、肝実質細胞増殖因子 (HGF)、脳由来神経栄養因子 (BDNF)または網膜色素上皮由来の神経栄養因子 (PEDF)を架橋ゼラチンヒドロゲルに含浸させた徐放性組成物の医薬用途を探索すべく鋭意研究を行ったところ、自然発症網膜色素変性症モデルラット (RCSラット）を用いた薬理試験において、 HGF、 BDNFまたは PEDFを架橋ゼラチンヒドロゲルに含浸させた徐放性組成物はいずれも優れた視細胞変性抑制効果を発揮すること、また、これらの徐放性組成物と脂肪由来間質細胞を組み合わせると、視細胞またはその機能が再生し、視細胞変性抑制効果が増強'持続することを見出し、本発明に至った。

すなわち、本発明は、

(1)下記成分 1)〜3)の少なくとも 1つを架橋ゼラチンヒドロゲルに含浸させた徐放性組成物からなる視細胞障害を惹起する疾患の治療剤、

1)肝実質細胞増殖因子 (HGF)

2)脳由来神経栄養因子（BDNF)

3)網膜色素上皮由来の神経栄養因子 (PEDF)

(2)下記成分 1)〜3)の少なくとも 1つを架橋ゼラチンヒドロゲルに含浸させた徐放性組成物と下記成分 4)からなる視細胞障害を惹起する疾患の治療剤、

1)肝実質細胞増殖因子 (HGF)

2)脳由来神経栄養因子（BDNF)

3)網膜色素上皮由来の神経栄養因子 (PEDF)

4)視細胞またはその機能を再生若しくは補完する役割を有する細胞

(3)視細胞障害を惹起する疾患が網膜変性疾患である前（1)または（2)記載の治療剤、

(4)網膜変性疾患が、網膜色素変性、錐体ジストロフィー、加齢黄斑変性、加齢黄斑症、黄斑浮腫、網膜剥離、癌関連網膜症、網膜静脈閉塞症または網膜色素上皮剥離である前（1)〜（3)記載の治療剤、

(5)視細胞またはその機能を再生若しくは補完する役割を有する細胞が、間質細胞である前（2)記載の治療剤、

(6)間質細胞が、脂肪由来間質細胞である前 (5)記載の治療剤、および

(7)下記成分 1)〜3)の少なくとも 1つを架橋ゼラチンヒドロゲルに含浸させた徐放性組成物と下記成分 4)からなる視細胞またはその機能を再生させるための材料、

1)肝実質細胞増殖因子 (HGF)

2)脳由来神経栄養因子（BDNF)

3)網膜色素上皮由来の神経栄養因子 (PEDF)

4)視細胞またはその機能を再生若しくは補完する役割を有する細胞、

に関する。

[0009] 第一の発明は、肝実質細胞増殖因子 (HGF)、脳由来神経栄養因子 (BDNF)または網膜色素上皮由来の神経栄養因子 (PEDF)を架橋ゼラチンヒドロゲルに含浸させた徐放性組成物力もなる視細胞障害を惹起する疾患の治療剤である。後述する薬理試験の結果より明らかなように、 HGF徐放性組成物、 BDNF徐放性組成物および PEDF徐放性組成物はいずれも、 HGF、 BDNF, PEDFを安定化すると共に長期に渡ってこれらの薬物を活性を保持した状態で徐放する効果があり、視細胞障害部位またはその周辺組織 (網膜下、網膜内、硝子体内など）に投与すると、一回の投与で長期に渡って網膜変性抑制効果を持続する。

[0010] 本発明における肝実質細胞増殖因子 (HGF)、脳由来神経栄養因子 (BDNF)および網膜色素上皮由来の神経栄養因子 (PEDF)は、いずれも医薬として使用できる程度に精製されたものであれば特に制限されず、天然型のものでも組替え型のものでもよい。

[0011] 天然型 HGFとしては、例えば肝臓、肺、腎臓、脾臓、血漿、血小板力の抽出物や線維芽細胞、血管内皮細胞、マクロファージなどの間葉系細胞の初代培養および株化細胞の培養上清並びにこれら細胞抽出物由来のものが挙げられる。また、糸且換え型 HGFは、天然型 HGFと実質的に同じ作用を有する限り、糸且換え型 HGFのァミノ酸配列中の 1つ若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加されたものでもよぐまた、組換え型 HGFのアミノ酸配列中の 1つ若しくは複数の糖鎖が置換、欠失、付加されたものでもよい。さらに、 HGFは天然型 HGFあるいは組換え型 HGFの修飾体（例えば、ポリエチレングリコールやレシチンなどの高分子材料との複合体)であってもよヽ

[0012] 天然型 BDNFとしては、例えば脳、脊髄、心臓、肺、骨格筋力の抽出物が挙げられる。また、組換え型 BDNFは、天然型 BDNFと実質的に同じ作用を有する限り、組換え型 BDNFのアミノ酸配列中の 1つ若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加されたものでもよぐまた、組換え型 BDNFのアミノ酸配列中の 1つ若しくは複数の糖鎖が置換、欠失、付加されたものでもよい。さらに、 BDNFは天然型 BDNFあるいは組換え型 BDNFの修飾体（例えば、ポリエチレングリコールやレシチンなどの高分子材料との複合体)であってもよ、。

[0013] また、天然型 PEDFとしては、例えば網膜からの抽出物や網膜色素上皮細胞の初代培養細胞および株化細胞の培養上清並びにこれら細胞抽出物が挙げられる。また、組換え型 PEDFは、天然型 PEDFと実質的に同じ作用を有する限り、組換え型 P EDFのアミノ酸配列中の 1つ若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加されたものでもよぐまた、組換え型 PEDFのアミノ酸配列中の 1つ若しくは複数の糖鎖が置換、欠失、付加されたものでもよい。さらに、 PDEDFは天然型 PEDFあるいは組換え型 PEDFの修飾体（例えば、ポリエチレングリコールやレシチンなどの高分子材料との複合体)であってもよい。

[0014] 本発明において、「視細胞障害」とは、種々の要因により視細胞が損傷を受けた状態にあるものをいい、「視細胞障害を惹起する疾患」としては、例えば網膜色素変性、錐体ジストロフィー、加齢黄斑変性、加齢黄斑症、黄斑浮腫、網膜剥離、癌関連網膜症、網膜静脈閉塞症、網膜色素上皮剥離などの網膜変性疾患が挙げられる。

[0015] 本発明にお、て、「架橋ゼラチンヒドロゲル」とは、ゼラチンを架橋化して得られるヒド口ゲルのことをヽ、ゼラチンを架橋して得られるヒドロゲルであれば特に制限されず、好ましくは以下 1)〜4)の少なくとも 1つの物性を有するものが挙げられる。

[0016] 1)架橋ゼラチンヒドロゲルを構成するゼラチンが酸性ゼラチンまたは塩基性ゼラチンであるもの。

[0017] 2)架橋ゼラチンヒドロゲルを構成するゼラチンの分子量が SDS— PAGEの非還元条件下で 0. 5〜20万ダノレトンであるもの。

[0018] 3)架橋ゼラチンヒドロゲルを構成するゼラチンの等電点が 4. 5〜9. 5であるもの。

[0019] 4)架橋ゼラチンヒドロゲルの含水率力 0〜99%であるもの。

[0020] 本発明の HGF徐放性組成物、 BDNF徐放性組成物または PEDF徐放性組成物は、 HGF、 BDNFまたは PEDFと架橋ゼラチンヒドロゲルが複合体を形成しており、生体内に投与された場合、タンパク分解酵素によりヒドロゲルが加水分解を受け、徐々にゼラチンが水溶化して、 HGF、 BDNFまたは PEDFを徐放化することに寄与していると考えられる。

[0021] ゼラチンは特に制限されないが、例えば牛をはじめとする動物の皮膚や腱あるいはコラーゲンからのアルカリ加水分解処理や酸加水分解処理により得られる。 HGFや BDNFを用いる場合には、ゥシの骨由来の I型コラーゲンをアルカリ処理して得られる酸性ゼラチンが好ましぐ市販のゼラチンとしては、例えば新田ゼラチン社製の S— 4などが挙げられる。また、 PEDFを用いる場合には豚皮由来の I型コラーゲンを酸処理して得られる塩基性ゼラチンが好ましぐ市販のゼラチンとしては、例えば新田ゼラチン社製の AP— 150などが挙げられる。

[0022] 本発明のゼラチンの分子量は、 SDS— PAGEの非還元条件下で 0. 5〜20万ダルトンであることが好ましい。

[0023] 本発明のゼラチンの等電点は、 4. 5〜9. 5であることが好ましぐ BDNFを用いる場合には 4. 5〜5. 5の等電点のものがより好ましぐまた、 PEDFを用いる場合には 7. 0〜9. 5のものがより好ましい。等電点は、 1%ゼラチン水溶液を調製し、この溶液を陽イオンカラム、陰イオンカラムで濾過処理し、濾取された水溶液の pHを測定することにより求められる。

[0024] 本発明の架橋ゼラチンヒドロゲルを得るための架橋方法は特に制限されな、が、例えば熱脱水、紫外線照射、電子線照射、化学的架橋またはこれらの併用によってゼラチンを架橋することができる。好ましい方法は架橋剤を使用しない熱脱水、紫外線照射または電子線照射である。

[0025] 本発明の架橋ゼラチンヒドロゲルの形状は特に制限されないが、例えば粒子状、シート状、ディスク状、円柱状、角柱状のものが挙げられる。本発明の徐放性組成物を注射剤として投与する場合には粒子状のものが好ましぐまた、これを広範な変性部位に移植'埋植する場合にはシート状のものが好ましい。

[0026] 粒子状の架橋ゼラチンヒドロゲルの調製は好ましくは次のように行われる。例えば撹拌用モーターとプロペラを備え付けた三口丸底フラスコにオリーブ油を入れ、 200〜 600rpm程度の回転速度で撹拌し、これにゼラチン水溶液を滴下して WZO型エマルジョンを調製し、冷却後アセトン、酢酸ェチル等を加えて撹拌し、遠心分離を行つてゼラチン粒子を回収する。回収したゼラチン粒子をさらにアセトン、エタノール等で洗浄して乾燥させる。この乾燥ゼラチン粒子を恒温減圧乾燥器などに入れ、熱脱水架橋を行う。さらにこれを紫外線照射装置に入れ、紫外線を照射することにより、架橋を完結する。こうして粒子状の乾燥架橋ゼラチンヒドロゲルが得られる。この乾燥架橋ゼラチンヒドロゲル粒子に HGF、 BDNF、 PEDFの各水溶液を含浸させると、粒子状の HGF徐放性組成物、 BDNF徐放性組成物または PEDF徐放性組成物 (薬物含浸架橋ゼラチンヒドロゲルマイクロスフェアー）が得られる。

[0027] シート状、ディスク状、円柱状、角柱状の架橋ゼラチンヒドロゲルの調製は好ましくは次のように行われる。例えばゼラチン水溶液をシート状に押出成型し、乾燥後、熱脱水架橋あるいは紫外線架橋を行うことにより、シート状の乾燥架橋ゼラチンヒドロゲルを得ることができる。また、適切な形状を有する金型を用いて射出成型後、成型物を乾燥し、熱脱水架橋あるいは紫外線架橋を行うことにより、ディスク状、円柱状、角柱状の乾燥架橋ゼラチンヒドロゲルを得ることができる。これらの乾燥架橋ゼラチンヒドロゲルに HGF、 BDNF, PEDFの各水溶液を含浸させると、シート状、ディスク状、円柱状、角柱状の HGF徐放性組成物、 BDNF徐放性組成物または PEDF徐放性組成物が得られる。

[0028] 粒子状の架橋ゼラチンヒドロゲルの粒子径は、使用目的により適宜選択できるが、 5 00 μ m以下であることが好ましぐより好ましくは 200 μ m以下である。また、シート状の架橋ゼラチンヒドロゲルの場合も、その膜厚は使用目的により適宜選択できるが、 2 00 μ m以下であることが好ましぐより好ましくは 100 μ m以下である。

[0029] 本発明の架橋ゼラチンヒドロゲルの含水率は、使用目的により適宜選択できるが、 3 0〜99wZw%であることが好ましぐより好ましくは 40〜98wZw%である。

[0030] 本発明の HGF徐放性組成物、 BDNF徐放性組成物または PEDF徐放性組成物に対する HGF、 BDNFまたは PEDFとゼラチンの重量比は特に制限されないが、好ましい重量比は HGF (BDNF、 PEDF) Zゼラチン = lZ〇. 2〜： LZ 10000であり、より好ましくは HGF (BDNF、 PEDF) Zゼラチン = lZl〜： LZlOOOである。 [0031] 第二の発明は、肝実質細胞増殖因子 (HGF)、脳由来神経栄養因子 (BDNF)または網膜色素上皮由来の神経栄養因子 (PEDF)を架橋ゼラチンヒドロゲルに含浸させた徐放性組成物と、視細胞またはその機能を再生若しくは補完する役割を有する細胞からなる視細胞障害を惹起する疾患の治療剤並びに視細胞またはその機能を再生させるための材料である。後述する薬理試験の結果より明らかなように、 HGF徐放性組成物、 BDNF徐放性組成物または PEDF徐放性組成物と、視細胞またはその機能を再生若しくは補完する役割を有する細胞を組み合わせて、これらを視細胞障害部位またはその周辺組織 (網膜下、網膜内、硝子体内など）に注入すると、視細胞またはその機能が再生し、網膜変性抑制効果を増強 '持続する。

[0032] 本発明で使用される視細胞またはその機能を再生若しくは補完する役割を有する細胞は、特に限定されないが、例えば脂肪由来間質細胞、骨髄間質細胞などの間質細胞、未分化間葉系細胞、網膜幹 (前駆)細胞、網膜色素上皮細胞、虹彩色素上皮細胞、神経幹細胞、造血幹細胞、皮膚幹細胞、胚性幹細胞 (ES細胞）、胚性生殖幹細胞 (EG細胞）、さらに胚性幹細胞、胚性生殖幹細胞などから分化誘導された上記各細胞などが挙げられ、好ましくは間質細胞であり、より好ましくは脂肪由来間質細胞である。なお、視細胞またはその機能を再生若しくは補完する役割を有する細胞は、視細胞に障害をもつ患者自身の組織力も採取してもよぐまた、患者以外の組織力も採取したものを用いてもょ、。

[0033] 例えば、ヒトの皮下脂肪力採取した脂肪組織塊をノ、サミで細力べし、得られた細片をコラゲナーゼ溶液で振とう処理した後、フィルターで濾別し、遠心分離で細胞群を回収する。つぎに、回収した細胞群力付着性細胞だけを回収しインキュベーターで培養して増殖させることにより、脂肪由来間質細胞が得られる。

[0034] 本発明にお、て、脂肪由来間質細胞には、視細胞特異的ホメォボックス遺伝子や神経保護作用あるいは変性抑制作用を示す因子をコードする遺伝子を導入したものも含まれる。

[0035] 視細胞特異的ホメォボックス遺伝子としては、視細胞の発生過程にお!、て、視細胞の領域特異的な発現様式を有し、かつ領域特異的な形態形成を制御する遺伝子や分化形質の発現に関与する遺伝子などがあり、具体的には、 Crx、 Otx2、 Nrl、 Chx 10等が挙げられる。

[0036] また、神経保護作用あるいは変性抑制効果を示す因子をコードする遺伝子としては、具体的には、脳由来神経栄養因子 (BDNF)、網膜色素上皮由来の神経栄養因子 (PEDF)、肝実質細胞増殖因子 (HGF)等の因子をコードする遺伝子が挙げられる

[0037] 脂肪由来間質細胞への視細胞特異的ホメォボックス遺伝子や神経保護作用ある!/ヽは変性抑制作用を示す因子をコードする遺伝子の導入方法は、特に制限されず、例えば、リポフエクシヨン法、エレクト口ポレーシヨン法、リン酸カルシウム法、遺伝子銃を用いる方法などの物理ィ匕学的な導入法をはじめ、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウィルスベクター、レトロウイルスベクター、センダイウィルスベクター、センダイウイルスエンベロープベクターなどを用いる方法が挙げられる。

[0038] HGF徐放性組成物、 BDNF徐放性組成物または PEDF徐放性組成物と上記方法によって得られる脂肪由来間質細胞を混合することにより、視細胞またはその機能を再生させるための材料が得られる。

[0039] 本発明の HGF徐放性組成物、 BDNF徐放性組成物または PEDF徐放性組成物は、必要に応じて製剤上許容される安定化剤、保存剤、可溶化剤、 pH調整剤、増粘剤、懸濁化剤、緩衝剤、等張化剤、防腐剤、無痛化剤、抗酸化剤などの添加剤を含有してもよく、これらの添加剤は公知のものを使用できる。また、これらの徐放性組成物の徐放期間等を調節するために、アミノ酸、アミノ基、リン酸基、硫酸基、 SH基、カルボキシル基などを有する糖や脂質などを添加することができる。

[0040] 本発明は、また、 HGF、 BDNFおよび PEDFの少なくとも 1つを架橋ゼラチンヒドロゲルに含浸させた徐放性組成物を治療に有効な量患者に投与することからなる視細胞障害を惹起する疾患の治療方法、 HGF、 BDNFおよび PEDFの少なくとも 1つを架橋ゼラチンヒドロゲルに含浸させた徐放性組成物と視細胞またはその機能を再生若しくは補完する役割を有する細胞との組合せを治療に有効な量患者に投与することからなる視細胞障害を惹起する疾患の治療方法、および、 HGF、 BDNFおよび P EDFの少なくとも 1つを架橋ゼラチンヒドロゲルに含浸させた徐放性組成物と視細胞またはその機能を再生若しくは補完する役割を有する細胞との組合せを治療に有効な量患者に投与することからなる視細胞またはその機能を再生させる方法にも関する。

[0041] 本発明の視細胞障害を惹起する疾患の治療剤、および視細胞若しくはその機能を再生させるための材料の投与量は、疾患部位や疾患の程度、患者の年齢や体重などを考慮して適宜調整できるが、 HGF (BDNF、 PEDF)として 0. OOl^lOOO ^ g の範囲が好ましぐより好ましくは 0. 01〜500 ₈の範囲である。投与形態としては、例えば視細胞障害部位またはその周辺組織 (網膜下、網膜内、硝子体内など）に注射剤として注入してもよぐまた、視細胞障害部位またはその周辺組織 (網膜下、網膜内、硝子体内など）に移植 '埋植することもできる。

発明の効果

[0042] 後述する自然発症網膜変性モデルラット (RCSラット)を用いた網膜変性抑制試験の結果から明らかなように、薬物（HGF · BDNF · PEDF)含浸架橋ゼラチンヒドロゲルマイクロスフェアーを網膜下投与すると、、ずれも優れた網膜変性抑制効果を奏し、また、薬物含浸架橋ゼラチンヒドロゲルマイクロスフェアーと脂肪由来間質細胞を組み合わせて網膜下投与すると、視細胞またはその機能が再生し、薬物含浸架橋ゼラチンヒドロゲルマイクロスフェアーを網膜下投与する場合よりもさらに網膜変性抑制効果が増強'持続する。

[0043] したがって、本発明の HGF徐放性組成物、 BDNF徐放性組成物、 PEDF徐放性組成物、およびこれらの徐放性組成物と視細胞またはその機能を再生若しくは補完する役割を有する細胞との併用物は、網膜色素変性、錐体ジストロフィー、加齢黄斑変性、加齢黄斑症、黄斑浮腫、網膜剥離、癌関連網膜症、網膜静脈閉塞症、網膜色素上皮剥離などの視細胞障害を惹起する疾患の治療剤として有用であり、また、視細胞またはその機能を再生させるための優れた材料となる。

発明を実施するための最良の形態

[0044] 以下に、薬理試験の結果および製剤例を示すが、これらの例は本発明をよりよく理解するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。

[0045] 1.薬理試験

(1)薬物含浸架橋ゼラチンヒドロゲルマイクロスフェアーの調製牛由来の酸性ゼラチン (等電点； 5. 0、分子量;約 10万ダルトン、新田ゼラチン社製)を用いて、 10wZv%のゼラチン水溶液 0. 2mlを調製し、これにォリーブオイル 5 mlを滴下し、ボルテックスミキサーを用いて乳化した。水相が固化するまで、乳化液を冷却した。この乳化液に冷アセトン 1. 5mlを添加し、固化したゼラチン滴を脱水させ、ゼラチンマイクロスフェアーを得た。これを冷却下で遠心分離し上清を除き、残渣をアセトンで再分散させ、さらに遠心分離を行った。この操作を 3回行ってゼラチンマイクロスフェアーを洗浄した後、ゼラチンマイクロスフェアーを 4°Cで 24時間乾燥した。乾燥したゼラチンマイクロスフェアーを恒温減圧乾燥器に入れ、 160°Cで 72時間熱脱水架橋を行った。さらにこれを紫外線照射装置に入れ、 30分間紫外線を照射することにより、ゼラチンマイクロスフェアーを架橋した。この架橋ゼラチンマイクロスフエアーを篩い分けし、平均粒子径が 10 /ζ πι、含水率 66%の乾燥架橋ゼラチンヒドロゲルマイクロスフェアーを得た。

[0046] この乾燥架橋ゼラチンヒドロゲルマイクロスフェアー 2. 5mgにヒト組換え型 HGF (1

gZ 1)水溶液 10 μ 1 (PeproTech社製)を含浸させ、 4°Cで 24時間静置した。これにリン酸緩衝生理食塩水 90 Lを加えて、 HGF含浸架橋ゼラチンヒドロゲルマイクロスフェアー懸濁液（HGF^ /z gZmg マイクロスフェアー濃度： 2. 5wZv%)を調製した。

[0047] つぎに、上記調製方法において、「ヒト組換え型 HGF (1 μ gZ 1)水溶液 10 1(Ρ eproTech社製）」の代わりに「ヒト組換え型 BDNF (1 μ & μ \)水溶液 10 μ 1 (Pepr oTech社製)」を用いる以外は、上記方法と同様にして BDNF含浸架橋ゼラチンヒド口ゲルマイクロスフェアー懸濁液（BDNF ;4 gZmg、マイクロスフェアー濃度： 2. 5 wZv%)を調製した。さらに、「牛由来の酸性ゼラチン (等電点； 5. 0、分子量;約 10 万ダルトン、新田ゼラチン社製)」の代わりに「豚由来の塩基性ゼラチン (等電点； 9. 0 、分子量;約 8万ダルトン、新田ゼラチン社製)」を、また「ヒト組換え型 HGF (1 μ gZ μ 1)水溶液 10 μ 1 (PeproTech社製）」の代わりに「ヒト組換え型 PEDF (1 μ &/ μ \) 水溶液 10 1 (Upstate社製)」を用いる以外は、上記方法と同様にして PEDF含浸架橋ゼラチンヒドロゲルマイクロスフェアー懸濁液（PEDF ; 4 μ gZmg、マイクロスフエアー濃度： 2. 5w/v%)を調製した。 [0048] (2)ラット脂肪由来間質細胞の単離，培養

緑色蛍光タンパクトランスジエニックラット（3週齢）をジェチルエーテルの過麻酔により安楽死させ、皮下脂肪を採取した。採取した皮下脂肪をリン酸緩衝生理食塩水（ 5ml)中でハサミを用いて細断し、 5mlのコラゲナーゼ溶液（2mgZml)をカ卩え、 37°C で 15〜20分間振とうした。振とう後、 10mlの 10%ゥシ胎仔血清含有 Mediuml99 (10 ml、 Invitrogen社製）を加え、懸濁液とした。この懸濁液を滅菌した 200 mフィルタ一でろ過して細胞塊を除去した。ろ液を遠心分離 (2000rpm、 5分間）し、上清を除去後、残渣を 10%ゥシ胎仔血清含有 Mediuml99 (10ml)に懸濁させ、この懸濁液を再度遠心分離（1000rpm、 10分間）した。上清を除去後、残渣を 5mlの 10%ゥシ胎仔血清含有 Mediuml99に懸濁させ、培養用フラスコに播種し、 37°C、 5%CO条件

2 下で培養した。播種後、 12〜24時間で、非付着性細胞を除去するために培地交換 (ゥシ胎仔血清（10%)および塩基性線維芽細胞増殖因子（lOOngZml)含有 Mediu ml99)をし、付着性細胞を 37°C、 5%CO条件下でコンフルェントになるまで培養し

2

て、実験用脂肪由来間質細胞を得た。

[0049] (3)網膜変性抑制試験

Jiang LQらの方法（Invest. Ophthalmol. Vis. Sci 35(13):4300- 4309 (1994))に準じて、網膜変性抑制試験を実施した。網膜変性抑制試験では、自然発症網膜変性モデルラットとして、 RCSラット（Royal College of Surgeons Rat)を用い、網膜電図における b波振幅 (投与前および投与 4週間後)を測定して、網膜変性抑制作用を評価した

[0050] i)薬物含浸架橋ゼラチンヒドロゲルマイクロスフェアーの網膜下投与による網膜変性抑制試験

(実験方法）

3週齢の RCSラットの両眼の網膜下に、前記の HGF含浸架橋ゼラチンヒドロゲルマイクロスフェアー懸濁液、 BDNF含浸架橋ゼラチンヒドロゲルマイクロスフェアー懸濁液および PEDF含浸架橋ゼラチンヒドロゲルマイクロスフェアー懸濁液それぞれ 5 μ 1 (HGF, BDNF、 PEDF ;0. 5 g、マイクロスフェアー； 125 g) /眼を注入した。コントロールとしてリン酸緩衝生理食塩水を用いた。 [0051] 網膜下投与後 4週目に網膜電図をとり、 b波の振幅を測定した。網膜下投与後 4週目の b波の残存率を、投与前における b波振幅を基準（100%)にして算出した。試験結果を図 1 [HGF]、図 2 [BDNF]および図 3 [PEDF]に示す (網膜変性抑制効果は、 b波振幅残存率が高いほど大きい。 ) ₀なお、例数は各 8眼であり、残存率はその平均値である。

[0052] (結果）

図 1〜3から明らかなように、 HGF含浸架橋ゼラチンヒドロゲルマイクロスフェアー懸濁液、 BDNF含浸架橋ゼラチンヒドロゲルマイクロスフェアー懸濁液、 PEDF含浸架橋ゼラチンヒドロゲルマイクロスフェアー懸濁液を網膜下に注入すると、 V、ずれも優れた網膜変性抑制効果を奏した。

[0053] ii)薬物含浸架橋ゼラチンヒドロゲルマイクロスフェアーと脂肪由来間質細胞の網膜下投与による網膜変性抑制試験

(実験方法）

前記の HGF含浸架橋ゼラチンヒドロゲルマイクロスフェアー懸濁液、 BDNF含浸架橋ゼラチンヒドロゲルマイクロスフェアー懸濁液、 PEDF含浸架橋ゼラチンヒドロゲルマイクロスフェアー懸濁液にそれぞれ実験用脂肪由来間質細胞を 4 X 10⁴個/ / z 1になるように分散させた。つぎに、これらの実験用脂肪由来間質細胞を分散させた懸濁液 5 /z l (HGF、 BDNF, PEDF;0. 5 /z g、マイクロスフェアー； 125 g、脂肪由来間質細胞； 2 X 10⁵個) /眼をそれぞれ 3週齢の RCSラットの両眼の網膜下に注入した。コントロールとしてリン酸緩衝生理食塩水を用いた。

[0054] 網膜下投与後 4週目に網膜電図をとり、 b波の振幅を測定した。網膜下投与後 4週目の b波の残存率を、投与前における b波振幅を基準（100%)にして算出した。試験結果を図 1 [HGF]、図 2 [BDNF]および図 3 [PEDF]に示す。なお、例数は各 8眼であり、残存率はその平均値である。

[0055] (結果）

図 1〜3から明らかなように、薬物（HGF、 BDNF, PEDF)含浸架橋ゼラチンヒドロゲルマイクロスフェアーと脂肪由来間質細胞を組み合わせて網膜下に注入すると、 V、ずれも視細胞またはその機能が再生し、薬物含浸架橋ゼラチンヒドロゲルマイクロスフエアーを網膜下に注入する場合よりもさらに網膜変性抑制効果が増強した

[0056] 2.製剤例

本発明の代表的な製剤例を以下に示す。

[0057] 注射剤 1( lml)

HGF含浸架橋ゼラチンヒドロゲルマイクロスフェアー

(HGF;100 g) 25mg

濃グリセリン 26mg

ポリソノレべート 80 4mg

滅菌精製氷 2ϋ_

lml

注射剤 2 (lml)

BDNF含浸架橋ゼラチンヒドロゲノレマイクロスフェアー

(BDNFjlOO^g) 25mg

濃グリセリン 26mg

ポリソルベート 80 4mg

my

lml

注射剤 3 (lml)

HGF含浸架橋ゼラチンヒドロゲルマイクロスフェアー

(HGFjlOOMg) 25mg

脂肪由来間質細胞 4X10⁷個

濃グリセリン 26mg

滅菌精製氷

lml

注射剤 4 (lml)

PEDF含浸架橋ゼラチンヒドロゲルマイクロスフェアー

(PEDFjlOO^g) 25mg

脂肪由来間質細胞 4X10⁷個濃グリセリン 2omg

谪量

lml

図面の簡単な説明

[図 1]図 1は、 HGF含浸架橋ゼラチンヒドロゲルマイクロスフェアー懸濁液、およびそれと脂肪由来間質細胞との混合物を用いた網膜変性抑制試験における網膜下投与後 4週目の b波振幅残存率 (平均値)を示すグラフである。

[図 2]図 2は、 BDNF含浸架橋ゼラチンヒドロゲルマイクロスフェアー懸濁液、およびそれと脂肪由来間質細胞との混合物を用いた網膜変性抑制試験における網膜下投与後 4週目の b波振幅残存率 (平均値)を示すグラフである。

[図 3]図 3は、 PEDF含浸架橋ゼラチンヒドロゲルマイクロスフェアー懸濁液、およびそれと脂肪由来間質細胞との混合物を用いた網膜変性抑制試験における網膜下投与後 4週目の b波振幅残存率 (平均値)を示すグラフである。

Claims

請求の範囲

[1] 下記成分 1)〜3)の少なくとも 1つを架橋ゼラチンヒドロゲルに含浸させた徐放性組成物からなる視細胞障害を惹起する疾患の治療剤。

1)肝実質細胞増殖因子 (HGF)

2)脳由来神経栄養因子（BDNF)

3)網膜色素上皮由来の神経栄養因子 (PEDF)

[2] 下記成分 1)〜3)の少なくとも 1つを架橋ゼラチンヒドロゲルに含浸させた徐放性組成物と下記成分 4)とからなる視細胞障害を惹起する疾患の治療剤。

1)肝実質細胞増殖因子 (HGF)

2)脳由来神経栄養因子（BDNF)

3)網膜色素上皮由来の神経栄養因子 (PEDF)

[3] 視細胞障害を惹起する疾患が網膜変性疾患である請求項 1または請求項 2記載の治療剤。

[4] 網膜変性疾患が、網膜色素変性、錐体ジストロフィー、加齢黄斑変性、加齢黄斑症、黄斑浮腫、網膜剥離、癌関連網膜症、網膜静脈閉塞症または網膜色素上皮剥離である請求項 3記載の治療剤。

[5] 視細胞またはその機能を再生若しくは補完する役割を有する細胞が、間質細胞である請求項 2記載の治療剤。

[6] 間質細胞が、脂肪由来間質細胞である請求項 5記載の治療剤。

[7] 下記成分 1)〜3)の少なくとも 1つを架橋ゼラチンヒドロゲルに含浸させた徐放性組成物と下記成分 4)とからなる視細胞またはその機能を再生させるための材料。

1)肝実質細胞増殖因子 (HGF)

2)脳由来神経栄養因子（BDNF)

3)網膜色素上皮由来の神経栄養因子 (PEDF)

[8] 下記成分 1)〜3)の少なくとも 1つを架橋ゼラチンヒドロゲルに含浸させた徐放性組成物を治療に有効な量患者に投与することからなる視細胞障害を惹起する疾患の治療方法。

1)肝実質細胞増殖因子 (HGF)

2)脳由来神経栄養因子（BDNF)

3)網膜色素上皮由来の神経栄養因子 (PEDF)

[9] 下記成分 1)〜3)の少なくとも 1つを架橋ゼラチンヒドロゲルに含浸させた徐放性組成物と下記成分 4)との組合せを治療に有効な量患者に投与することからなる視細胞障害を惹起する疾患の治療方法。

1)肝実質細胞増殖因子 (HGF)

2)脳由来神経栄養因子（BDNF)

3)網膜色素上皮由来の神経栄養因子 (PEDF)

[10] 視細胞障害を惹起する疾患が網膜変性疾患である請求項 8または請求項 9記載の治療方法。

[11] 網膜変性疾患が、網膜色素変性、錐体ジストロフィー、加齢黄斑変性、加齢黄斑症、黄斑浮腫、網膜剥離、癌関連網膜症、網膜静脈閉塞症または網膜色素上皮剥離である請求項 10記載の治療方法。

[12] 視細胞またはその機能を再生若しくは補完する役割を有する細胞が、間質細胞である請求項 9記載の治療方法。

[13] 間質細胞が、脂肪由来間質細胞である請求項 12記載の治療方法。

[14] 下記成分 1)〜3)の少なくとも 1つを架橋ゼラチンヒドロゲルに含浸させた徐放性組成物と下記成分 4)との組合せを治療に有効な量患者に投与することからなる視細胞またはその機能を再生させる方法。

1)肝実質細胞増殖因子 (HGF)

2)脳由来神経栄養因子（BDNF)

3)網膜色素上皮由来の神経栄養因子 (PEDF)

[15] 視細胞障害を惹起する疾患の治療剤を製造するための、下記成分 1)〜3)の少なくとも 1つを架橋ゼラチンヒドロゲルに含浸させた徐放性組成物の使用。 1)肝実質細胞増殖因子 (HGF)

2)脳由来神経栄養因子（BDNF)

3)網膜色素上皮由来の神経栄養因子 (PEDF)

[16] 視細胞障害を惹起する疾患の治療剤を製造するための、下記成分 1)〜3)の少なくとも 1つを架橋ゼラチンヒドロゲルに含浸させた徐放性組成物と下記成分 4)との組合せの使用。

1)肝実質細胞増殖因子 (HGF)

2)脳由来神経栄養因子（BDNF)

3)網膜色素上皮由来の神経栄養因子 (PEDF)

[17] 視細胞障害を惹起する疾患が網膜変性疾患である請求項 15または請求項 16記載の使用。

[18] 網膜変性疾患が、網膜色素変性、錐体ジストロフィー、加齢黄斑変性、加齢黄斑症、黄斑浮腫、網膜剥離、癌関連網膜症、網膜静脈閉塞症または網膜色素上皮剥離である請求項 17記載の使用。

[19] 視細胞またはその機能を再生若しくは補完する役割を有する細胞が、間質細胞である請求項 16記載の使用。

[20] 間質細胞が、脂肪由来間質細胞である請求項 19記載の使用。

[21] 視細胞またはその機能を再生させるための材料を製造するための、下記成分 1)〜3

)の少なくとも 1つを架橋ゼラチンヒドロゲルに含浸させた徐放性組成物と下記成分 4

)との組合せの使用。

1)肝実質細胞増殖因子 (HGF)

2)脳由来神経栄養因子（BDNF)

3)網膜色素上皮由来の神経栄養因子 (PEDF)