WO2006013679A1 - 菌数測定方法、菌数測定装置及びこの装置に用いられるセル - Google Patents

菌数測定方法、菌数測定装置及びこの装置に用いられるセル Download PDF

Info

Publication number
WO2006013679A1
WO2006013679A1 PCT/JP2005/011062 JP2005011062W WO2006013679A1 WO 2006013679 A1 WO2006013679 A1 WO 2006013679A1 JP 2005011062 W JP2005011062 W JP 2005011062W WO 2006013679 A1 WO2006013679 A1 WO 2006013679A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
medium
sample
measuring
current value
predetermined
Prior art date
Application number
PCT/JP2005/011062
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Seiichiro Miyahara
Chiaki Okumura
Naoki Fukui
Megumi Akamatsu
Original Assignee
Daikin Industries, Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Daikin Industries, Ltd. filed Critical Daikin Industries, Ltd.
Priority to EP05751469A priority Critical patent/EP1780286B1/en
Priority to CA2575640A priority patent/CA2575640C/en
Priority to AT05751469T priority patent/ATE491037T1/de
Priority to DE602005025226T priority patent/DE602005025226D1/de
Priority to US11/573,081 priority patent/US7955493B2/en
Priority to DK05751469.7T priority patent/DK1780286T3/da
Publication of WO2006013679A1 publication Critical patent/WO2006013679A1/ja

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/1031—Investigating individual particles by measuring electrical or magnetic effects
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C12Q1/06—Quantitative determination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C12Q1/10—Enterobacteria

Definitions

  • Bacteria count measuring method Bacteria count measuring method, bacteria count measuring apparatus, and cell used in this apparatus
  • the present invention relates to a method for measuring the number of bacteria, a device for measuring the number of bacteria, and a cell used in the apparatus, and in particular, a method for measuring the number of bacteria using an oxygen electrode, and a device for measuring the number of bacteria. And the cell used in this device.
  • the time required for the current flowing in the liquid medium containing the specimen having an unknown initial number of bacteria to decrease to a predetermined threshold can be obtained, and the initial number of bacteria corresponding to this required time can be specified.
  • the initial bacterial count can be accurately measured in a short time.
  • Patent Document 1 Japanese Unexamined Patent Publication No. 2000-287699
  • the oxygen concentration does not decrease sharply by performing normal culture with a low fungal respiration rate. There was a problem that could not be measured accurately.
  • the fungus has a slow growth rate. If it does not grow for about a week, it cannot be determined by the conventional oxygen electrode method.
  • the present invention provides a method for measuring the number of bacteria, a device for measuring the number of bacteria, and a cell used in this device, capable of accurately and reproducibly measuring the initial number of bacteria using the oxygen electrode method.
  • the purpose is to do.
  • the present invention provides a method for measuring the number of bacteria, a device for measuring the number of bacteria, and a cell used in this device, which can measure the initial number of bacteria with respect to fungi with high accuracy and a greatly reduced measurement time. The purpose is to do.
  • the solving means according to claim 1 of the present invention includes the step (a) of adding a sample to be measured containing a predetermined bacterial species to a predetermined medium, a predetermined temperature, and a predetermined constant voltage. Using the oxygen electrode, the step (b) of measuring the current value flowing in the medium to which the sample has been added, and the current value once decreased after starting the measurement in step (b) Measuring a required time until the predetermined threshold value is exceeded, and (d) calculating an initial number of bacterial species included in the sample based on the required time.
  • the method for measuring the number of bacteria according to claim 1 of the present invention includes a step (a) of adding a sample to be measured containing a predetermined bacterial species to a predetermined medium, a predetermined temperature, and a predetermined A step (b) of measuring the current value flowing in the medium to which the sample has been added using an oxygen electrode at a constant voltage, and the current value that has decreased since the measurement in step (b) was started. Then, the step (c) of measuring the time required for the subsequent rise to exceed a predetermined threshold value, and the step (d) of calculating the initial number of bacterial species contained in the sample based on the required time. Therefore, it is possible to improve the accuracy of the initial bacterial count by utilizing the newly discovered phenomenon that the current value rises after a drop. In addition, there is an effect that measurement with reproducibility can be performed.
  • the solving means according to claim 2 of the present invention is the method of measuring the number of bacteria according to claim 1, wherein the current value decreases and then increases after the bacterial species contained in the sample. Caused by metabolic activity.
  • the current value once decreases and then increases because of the metabolic activity of the bacterial species contained in the sample. There is an effect that a good and reproducible measurement can be performed.
  • the solving means according to claim 3 of the present invention is the method of measuring the number of bacteria according to claim 1 or claim 2, wherein the medium is a medium used in the specific enzyme substrate medium method, The species is coliform or coliform.
  • the current value is once This is one of the conditions under which the newly discovered phenomenon of rising after a decrease can be used, and has the effect of making it possible to accurately and reproducibly measure the initial bacterial count.
  • the solution according to claim 4 of the present invention is the method of measuring the number of bacteria according to claim 1 or claim 2, wherein the medium is a PYG medium and the bacterial species is a fungus. .
  • the culture medium is a PYG medium
  • the bacterial species is a fungus. This is one of the conditions in which the phenomenon can be used, and has the effect that the initial number of bacteria can be measured with high accuracy and reproducibility.
  • the method for measuring the number of bacteria according to claim 4 of the present invention can use a newly discovered phenomenon, there is an effect that the measurement time can be greatly shortened as compared with the conventional method.
  • the solution according to claim 5 of the present invention includes a cell containing a sample to be measured containing a predetermined bacterial species and a predetermined medium, an oxygen electrode provided in the cell, and a predetermined temperature.
  • the current measurement unit that measures the current value flowing in the culture medium to which the sample is added using the oxygen electrode at a predetermined constant voltage, and the current value that has once decreased after the measurement in the current measurement unit is started.
  • the required time measurement unit that measures the time required to rise and exceed the predetermined threshold value, and based on the required time, calculate the initial number of bacteria contained in the sample.
  • the bacteria count calculator Is provided.
  • the bacterial count measuring apparatus includes a cell containing a sample to be measured containing a predetermined bacterial species and a predetermined medium, an oxygen electrode provided in the cell, and a predetermined At a predetermined temperature and at a predetermined constant voltage, a current measurement unit for measuring the current value flowing in the medium to which the sample was added using an oxygen electrode, and the measurement at the current measurement unit was started and decreased.
  • the required time measurement unit that measures the time required for the current value to rise and then exceed a predetermined threshold, and the number of bacteria that calculates the initial number of bacterial species contained in the sample based on the required time Since the calculation unit is provided, there is an effect that the initial bacterial count can be measured with high accuracy and reproducibility by using a newly discovered phenomenon that the current value rises after being reduced.
  • the solving means according to claim 6 of the present invention is the bacterial count measuring apparatus according to claim 5, wherein the current value decreases and then increases after the bacterial species contained in the sample. It is characterized by metabolic activity.
  • the current value once decreases and then increases because of the metabolic activity of the bacterial species contained in the sample. There is an effect that a good and reproducible measurement can be performed.
  • the solving means according to claim 7 of the present invention is the bacterial count measuring apparatus according to claim 5 or claim 6, wherein the culture medium is a culture medium used in the specific enzyme substrate culture method, The species is coliform or coliform.
  • the culture medium is a culture medium used in the specific enzyme substrate culture method, and the bacterial species is Escherichia coli or coliforms. This is one of the conditions under which the newly discovered phenomenon of rising after a decrease can be used, and has the effect of making it possible to accurately and reproducibly measure the initial bacterial count.
  • the solution according to claim 8 of the present invention is the bacterial count measuring apparatus according to claim 5 or claim 6, wherein the culture medium is a PYG culture medium and the bacterial species is a fungus. .
  • the bacterial count measuring apparatus according to claim 8 of the present invention has been newly discovered that the current value rises once decreased because the culture medium is a PYG culture medium and the bacterial species is a fungus. This is one of the conditions in which the phenomenon can be used, and the initial number of bacteria can be measured accurately and reproducibly. There is an effect that can be determined. In addition, since the bacterial count measuring apparatus according to claim 8 of the present invention can use a newly discovered phenomenon, there is an effect that the measurement time can be greatly shortened as compared with the conventional method.
  • the solving means according to claim 9 of the present invention is a cell that contains a sample to be measured containing a predetermined bacterial species and a predetermined medium, and an oxygen electrode is provided on the inner wall of the cell. Measure the value of the current flowing in the medium that decreases and then rises at a predetermined temperature and at a predetermined constant voltage.
  • the cell according to claim 9 of the present invention is a cell containing a sample to be measured containing a predetermined bacterial species and a predetermined medium, and an oxygen electrode is provided on the inner wall of the cell, The current value that flows through the medium that decreases and then increases at a predetermined temperature and at a predetermined constant voltage is measured. Therefore, the newly discovered phenomenon that the current value rises once decreases is used. Thus, the initial number of bacteria can be measured with high accuracy and reproducibility.
  • the solving means according to claim 10 of the present invention is the cell according to claim 9, wherein the current value decreases and then increases due to the metabolic activity of the bacterial species contained in the sample. to cause.
  • the current value decreases and decreases, and the subsequent increase is due to the metabolic activity of the bacterial species contained in the sample.
  • the solution according to claim 11 of the present invention is the cell according to claim 9 or claim 10, wherein the medium is a medium used in the specific enzyme substrate medium method, and the bacterial species is Escherichia coli. Or a group of coliforms.
  • the culture medium is a culture medium used in the specific enzyme substrate culture method, and the bacterial species is Escherichia coli or coliforms, the current value rises after once decreasing. This is one of the conditions under which the newly discovered phenomenon can be used, and has the effect of enabling accurate and reproducible measurement of the initial bacterial count.
  • the solving means according to claim 12 of the present invention is the cell according to claim 9 or claim 10, wherein the medium is a PYG medium, and the bacterial species is a fungus.
  • the invention's effect [0031]
  • the cell according to claim 12 of the present invention utilizes a newly discovered phenomenon in which the current value rises once decreased because the medium is a PYG medium and the bacterial species is a fungus. This is one of the conditions that can be used, and has the effect of enabling accurate and reproducible measurement of the initial number of bacteria.
  • the cell according to claim 12 of the present invention can use a newly discovered phenomenon, there is an effect that the measurement time can be greatly shortened as compared with the conventional method.
  • FIG. 1 is a flowchart of a method for measuring the number of bacteria according to the first embodiment.
  • FIG. 2 is a block diagram of the bacterial count measuring apparatus according to the first embodiment.
  • FIG. 3 is a cross-sectional perspective view of a cell according to the first embodiment.
  • FIG. 4 is a diagram showing a change in current value of the bacterial count measuring apparatus according to the first embodiment.
  • FIG. 5 is a diagram showing a change in current value of the bacterial count measuring apparatus according to the first embodiment.
  • FIG. 6 is a diagram showing a calibration curve of the bacterial count measurement apparatus according to the first embodiment.
  • FIG. 7 is a diagram showing a change in current value of the bacterial count measuring apparatus according to the first embodiment.
  • FIG. 8 is a diagram showing changes in current value of the bacterial count measuring apparatus according to the first embodiment.
  • FIG. 9 is a diagram showing a change in current value of the bacterial count measuring apparatus according to the second embodiment.
  • the dissolved oxygen concentration decreases due to the respiration (metabolic activity) of the bacterial species, and the current value flowing between the working electrode and the counter electrode, which is the V-oxygen electrode (hereinafter simply referred to as the current value).
  • the current value which is the V-oxygen electrode (hereinafter simply referred to as the current value).
  • ⁇ ⁇ decreases.
  • the present invention relates to a method for measuring the number of bacteria using the above phenomenon, a device for measuring the number of bacteria, and a cell used in this device in the oxygen electrode method.
  • a medium used in the specific enzyme substrate medium method (hereinafter simply referred to as a specific enzyme substrate medium) is used as the specific medium.
  • the specific enzyme substrate medium include Corilate (registered trademark).
  • Escherichia coli or coliforms are used as the specific bacterial species.
  • stainless steel (SUS) is used as the base material of the oxygen electrode.
  • FIG. 1 is a flowchart showing a method for measuring the number of bacteria according to the present embodiment.
  • a sample (specimen) containing E. coli or coliforms is added to the specific enzyme substrate medium.
  • the specific enzyme substrate medium is a liquid
  • a sample containing Escherichia coli or colon bacteria is added to the liquid medium after pulverizing and stirring with a stocker.
  • FIG. 2 shows a block diagram of the bacterial count measuring apparatus according to the present embodiment.
  • the cell count apparatus is provided with a cell 1 and contains a medium to which a sample is added.
  • an oxygen electrode 2 used for the oxygen electrode method is provided in the cell 1.
  • FIG. 3 shows a perspective sectional view of the cell 1.
  • Three electrodes, a counter electrode 21, a working electrode 22, and a reference electrode 23 constituting the oxygen electrode 2 are provided on the side wall near the bottom surface of the cell 1.
  • the cell 1 is provided with an output terminal 24 electrically connected to the counter electrode 21, the working electrode 22, and the reference electrode 23.
  • the oxygen electrode 2 is connected to the current measuring unit 3 via the output terminal 24.
  • the counter electrode 21, the working electrode 22, and the reference electrode 23 are made of stainless steel as an electrode base material.
  • the surface of the electrode base material is gold plated.
  • the electrode base material of the oxygen electrode 2 used in the present invention is not limited to stainless steel, but may be other metal materials (for example, copper). However, even if the electrode base material is another metal material, the surface thereof is plated with gold.
  • the value of the current flowing through the medium to which the sample is added is measured by the oxygen electrode 2 (step b).
  • the current flowing through the medium is measured at the counter electrode 21 and the working electrode 22.
  • the current flowing through the medium is the current flowing when the dissolved oxygen in the medium is reduced to water at the working electrode 22 as described in the background art. Therefore, the medium When the dissolved oxygen concentration is high, the current value is high, and when the dissolved oxygen concentration is low, the current value is low.
  • the amount of oxygen consumed increases with the growth of E. coli or coliforms contained in the sample.
  • the dissolved oxygen concentration in the medium decreases, and the current value also decreases as the dissolved oxygen concentration decreases. Therefore, in the conventional oxygen electrode method, if the threshold value is set to a current value close to zero (for example, ⁇ ), the time until the current value decreases and the threshold value intersects (hereinafter also referred to as the required time) is determined. We were able to.
  • FIG. 4 is a graph showing changes in the current value according to the present embodiment.
  • coliform bacteria in the specific enzyme substrate medium (collate) are measured with an oxygen electrode.
  • the change in the current value in Fig. 4 shows that the current value of about 1, OOOnA flows and stabilizes until the force is about 400 minutes after the start of measurement, but the dissolved oxygen concentration starts to decrease with the growth of the coliform group after that, The current value drops to about 650nA in about 500 minutes.
  • the threshold is set at 1,500 nA, exceeding the threshold at about 540 minutes. Therefore, the required time shown in Figure 4 is about 540 minutes.
  • the required time is measured at step c2. This required time is measured by the required time measuring unit 4 of the bacterial count measuring apparatus shown in FIG. During step b, step cl, and step c2, E. coli or colon bacteria are cultured at about 30 ° C.
  • step d of FIG. 1 the initial number of bacteria contained in the sample is calculated.
  • Figure 2 In the bacterial count calculation unit 5 of the bacterial count measurement apparatus shown, the initial bacterial count included in the sample is calculated based on the measured required time. In order to calculate the initial number of bacteria, it is necessary to obtain a calibration curve in advance as explained in the background art. Hereinafter, a description will be given based on a specific example.
  • Figure 5 shows the change in the current value of a sample with a known initial bacterial count. In Fig.
  • FIG. 7 and 8 show examples of measurement using the same medium and the same bacterial species but using different electrode base materials. 7 and 8, the horizontal axis is the measurement time (minutes) and the vertical axis is the current value (nA).
  • corilate is used as a specific medium, coliform bacteria as a specific bacterial species, and stainless steel as an electrode base material.
  • corilate is used as a specific medium, coliform bacteria as a specific bacterial species, and copper as an electrode base material.
  • the step (a) of adding the sample to be measured to the medium used for the specific enzyme substrate medium method, and using the oxygen electrode, the sample is added to the medium.
  • the current value is decreased by the metabolic activity of E. coli or coliform contained in the sample after starting the measurement in step (b) and step (b).
  • the threshold value is set to a current value that is higher than that at the start of measurement.
  • the threshold value can be set to a lower current value than at the start of measurement.
  • a PYG (batatopeptone 'yeast stratato' glucose) medium is used as the specific medium, and a fungus is used as the specific bacterial species.
  • fungi Examples include yeast, cocoon, and Candida albicans (IFO 1594).
  • the bacterial count measurement method used in Embodiment 1 is applied to the above combinations. Therefore, the bacterial count measurement method will be described based on the flowchart shown in FIG.
  • the following work is required as a preparation work.
  • the passage of colony powers fungi eg yeast.
  • the adjusted bacterial solution is inoculated into the fruit preparation.
  • step a add lml of the precultured sample to lml of PYG medium.
  • step b the value of the current flowing through the medium to which the sample is added is measured.
  • the bacterial count measuring apparatus according to the present embodiment is also the same as the bacterial count measuring apparatus described in the first embodiment, and FIG. 2 shows a block diagram.
  • This cell counting device is provided with a cell 1 and contains a medium in which a sample is added to the cell 1.
  • an oxygen electrode 2 used for the oxygen electrode method is provided in the cell 1.
  • the cell 1 according to the present embodiment is also the same as the cell 1 described in the first embodiment, and a cross-sectional perspective view of the cell 1 is shown in FIG.
  • Three electrodes, a counter electrode 21, a working electrode 22, and a reference electrode 23 constituting the oxygen electrode 2 are provided on the side wall near the bottom surface of the cell 1.
  • the electrode base material of the counter electrode 21, the working electrode 22, and the reference electrode 23 is made of stainless steel.
  • the surface of the electrode base material is gold plated.
  • the electrode base material of the oxygen electrode 2 used in the present invention is not limited to stainless steel, but may be other metal materials (for example, copper). However, even if the electrode base material is another metal material, the surface thereof is plated with gold.
  • the cell 1 is provided with an output terminal 24 that is electrically connected to the counter electrode 21, the working electrode 22, and the reference electrode 23. Is connected to the current measuring section 3 shown in FIG.
  • the counter electrode 21 and the working electrode 22 are used to measure the current flowing through the culture medium. Also in this embodiment, the current value decreases as fungi consume dissolved oxygen in the medium, but the current value increases thereafter.
  • the phenomenon in which the current value changes in this way is the same as the phenomenon in which the current value of the coliform group shown in Fig. 4 changes. Like the coliform group, the detailed mechanism is unknown at this stage.
  • Figure 9 shows changes in fungal current values. It is a graph which shows conversion.
  • Figure 9 shows changes in current values for three types of fungi: food-separating yeast, Candida albicans, and food-separating rice cake.
  • the horizontal axis in Fig. 9 is the measurement time (time), and the vertical axis is the current value (nA).
  • the food-separated yeast has a current value that hardly decreases and then increases rapidly.
  • the threshold is set to 1500 nA as in the first embodiment
  • the food-isolating yeast crosses the threshold after about 20 minutes (0.33 hours). In other words, the time required for the food-separating yeast is about 20 minutes.
  • Candida albicans rose rapidly after a slight decrease in current.
  • Candida albicans crosses the threshold after about 30 minutes (0.5 hours), and the time required is about 30 minutes.
  • the food material separation basket rises after the current value once decreases. It can be seen that the food separator crosses the threshold after about 135 minutes (2.25 hours), and the required time is about 135 minutes.
  • FIG. 9 also shows the change in the current value measured for a cell that does not contain fungi (blank cell). In the blank cell, the current value gradually decreases with the measurement time, but no sudden change is observed.
  • the required time is measured by the required time measuring unit 4 shown in FIG. In the flow chart shown in FIG. 1, it is determined whether or not the current value has risen and exceeded the threshold value in step cl. If it is determined that the threshold value has been exceeded, the required time is measured in step c2. During step 1), step cl and step c2, fungi are cultured at about 30 ° C.
  • step d the initial number of bacteria contained in the sample is calculated based on the measured required time.
  • the bacterial count measuring apparatus shown in FIG. In order to calculate the initial number of bacteria, it is necessary to obtain a calibration curve in advance as in the first embodiment. The specific description for obtaining the calibration curve has been described in Embodiment 1, and is therefore omitted.
  • the initial number of fungi is calculated from the required time. The time required to obtain the initial number of fungi is about one day, which is the time required to set the sample in the cell plus the time required for measurement. In this embodiment, even if 2 days of pre-culture are added, the initial number of fungi can be obtained in about 3 days, and the time can be greatly shortened compared with the case where it was conventionally required for about 1 week. It is.
  • Step (b) where the current value flowing through the medium to which the sample is added is measured using the oxygen electrode (a) and the step (b) and the measurement in step (b) is started.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

　本発明の菌数測定方法では、ステップ（ａ）からステップ（ｄ）までの工程を備えている。まず、ステップ（ａ）において、所定の菌種（例えば、大腸菌又は大腸菌群）を含む測定対象の試料（検体）を所定の培地（例えば、特定酵素基質培地法に用いられる培地）に添加する。ステップ（ｂ）において、所定の温度下で、且つ所定の定電圧で、酸素電極を用いて、試料を添加した培地に流れる電流値を測定する。ステップ（ｃ）において、ステップ（ｂ）での測定を開始してから、一旦減少した電流値が、その後上昇して所定の閾値を越えるまでの所要時間を計測する。ステップ（ｄ）において、所要時間に基づいて、試料に含まれていた菌種の初期菌数を算出する。

Description

菌数測定方法、菌数測定装置及びこの装置に用いられるセル 技術分野
[0001] 本発明は、菌数測定方法、菌数測定装置及びこの装置に用いられるセルに関する 発明であって、特に酸素電極を用いて菌数を測定する菌数測定方法、菌数測定装 置及びこの装置に用いられるセルである。
背景技術
[0002] 食品の衛生管理などの目的で、食品中に含まれる細菌数を測定することが要求さ れる場合があった。従来、食品などの検体に含まれる細菌を測定する方法として、検 体を段階的に希釈してそれぞれを寒天培地に一定量塗布し、 24時間程度培養し、 派生したコロニー数を目視で計算することで細菌数を測定する方法があった。しかし 、この方法では検体を段階的に希釈する作業が必要であることや、 24時間程度培養 することが必要であることなどの問題点があった。そこで、特許文献 1に示すような、 検体を添加した液体培地中に含まれる溶存酸素濃度を酸素電極で測定することによ り、細菌数を測定する方法 (以下、酸素電極法ともいう）が開発された。
[0003] 特許文献 1に示されて ヽる酸素電極法にお!ヽては、液体培地中に含まれる溶存酸 素の濃度が高いほど、多くの電流が測定される。検体に含まれる細菌は呼吸をするこ とにより、液体培地中の溶存酸素を消費している。この細菌の呼吸による溶存酸素濃 度の低下に伴い、酸素電極に流れる電流も低下することになる。また、溶存酸素の消 費量は、検体に含まれる初期細菌数に依存する。つまり、初期細菌数が多ければ多 いほど、消費される酸素量は多くなり溶存酸素濃度の低下も早くなる。溶存酸素濃度 が短時間で低下すると、測定される電流値も短時間で低下する。つまり、未知の初期 細菌数の検体を含む液体培地に流れる電流が所定の閾値まで減少するまでの所要 時間を求め、この所要時間に対応する初期菌数を特定できる。以上により、酸素電 極法では、初期菌数を短時間に且つ正確に測定することができる。
[0004] 特許文献 1：特開 2000— 287699号公報
[0005] 特許文献 1に示したような酸素電極法では、培地、菌種の組み合わせによっては測 定される電流値が閾値以下に下がらない状態が生じていた。このような状態が生じる と、擬陰性などの誤検出や検出時間のばらつきなどが発生し、測定精度が低下する 問題があった。
[0006] また、真菌類を酸素電極法で測定する場合、真菌類の呼吸速度が小さぐ通常の 培養を行ったのでは酸素濃度が急激に減少しな 、ため、従来の酸素電極法では精 度良く測定することができない問題点があった。さらに、真菌類は増殖速度も遅ぐ 1 週間程度増殖しなければ、従来の酸素電極法では判定することができないため、測 定時間が長くなる問題点があった。
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0007] 本発明は、酸素電極法を用いて初期菌数を精度良ぐ且つ再現性のある測定を行 うことができる菌数測定方法、菌数測定装置及びこの装置に用いられるセルを提供 することを目的とする。また、本発明は、真菌類に対して初期菌数を精度良ぐ且つ 測定時間を大幅に短縮して測定することができる菌数測定方法、菌数測定装置及び この装置に用いられるセルを提供することを目的とする。
[0008] 本発明の請求項 1に係る解決手段は、所定の菌種を含む測定対象の試料を所定 の培地に添加するステップ (a)と、所定の温度下で、且つ所定の定電圧で、酸素電 極を用いて、試料を添加した培地に流れる電流値を測定するステップ (b)と、ステツ プ (b)での測定を開始してから、一旦減少した電流値が、その後上昇して所定の閾 値を越えるまでの所要時間を計測するステップ (c)と、所要時間に基づいて、試料に 含まれて 、た菌種の初期菌数を算出するステップ (d)とを備える。
[0009] 本発明の請求項 1に記載の菌数測定方法は、所定の菌種を含む測定対象の試料 を所定の培地に添加するステップ (a)と、所定の温度下で、且つ所定の定電圧で、酸 素電極を用いて、試料を添加した培地に流れる電流値を測定するステップ (b)と、ス テツプ (b)での測定を開始してから、ー且減少した電流値が、その後上昇して所定の 閾値を越えるまでの所要時間を計測するステップ (c)と、所要時間に基づいて、試料 に含まれていた菌種の初期菌数を算出するステップ (d)とを備えるので、電流値が一 且低下後に上昇するという新たに発見された現象を利用して、初期菌数を精度良ぐ 且つ再現性のある測定を行うことができる効果がある。
[0010] 本発明の請求項 2に係る解決手段は、請求項 1に記載の菌数測定方法であって、 電流値がー且減少し、その後上昇するのは、試料に含まれる菌種の代謝活動に起 因する。
[0011] 本発明の請求項 2に記載の菌数測定方法は、電流値が一旦減少し、その後上昇 するのは、試料に含まれる菌種の代謝活動に起因するので、初期菌数を精度良ぐ 且つ再現性のある測定を行うことができる効果がある。
[0012] 本発明の請求項 3に係る解決手段は、請求項 1又は請求項 2に記載の菌数測定方 法であって、培地は、特定酵素基質培地法に用いられる培地であり、菌種は、大腸 菌又は大腸菌群である。
[0013] 本発明の請求項 3に記載の菌数測定方法は、培地が、特定酵素基質培地法に用 いられる培地であり、菌種が、大腸菌又は大腸菌群であるので、電流値が一旦低下 後に上昇するという新たに発見された現象を利用することができる条件の 1つであり、 初期菌数を精度良ぐ且つ再現性のある測定を行うことができる効果がある。
[0014] 本発明の請求項 4に係る解決手段は、請求項 1又は請求項 2に記載の菌数測定方 法であって、培地は、 PYG培地であり、菌種は、真菌類である。
[0015] 本発明の請求項 4に記載の菌数測定方法は、培地が、 PYG培地であり、菌種が、 真菌類であるので、電流値が一旦低下後に上昇するという新たに発見された現象を 利用することができる条件の 1つであり、初期菌数を精度良ぐ且つ再現性のある測 定を行うことができる効果がある。また、本発明の請求項 4に記載の菌数測定方法は 、新たに発見された現象を利用することができるので、従来の方法に比べ測定時間 を大幅に短縮することができる効果がある。
[0016] 本発明の請求項 5に係る解決手段は、所定の菌種を含む測定対象の試料と所定 の培地とを収容するセルと、セル内に設けられた酸素電極と、所定の温度下で、且つ 所定の定電圧で、酸素電極を用いて試料を添加した培地に流れる電流値を測定す る電流測定部と、電流測定部での測定を開始してから、一旦減少した電流値が、そ の後上昇して所定の閾値を越えるまでの所要時間を計測する所要時間計測部と、所 要時間に基づ 、て、試料に含まれて 、た菌種の初期菌数を算出する菌数算出部と を備える。
[0017] 本発明の請求項 5に記載の菌数測定装置は、所定の菌種を含む測定対象の試料 と所定の培地とを収容するセルと、セル内に設けられた酸素電極と、所定の温度下 で、且つ所定の定電圧で、酸素電極を用いて試料を添加した培地に流れる電流値 を測定する電流測定部と、電流測定部での測定を開始してから、ー且減少した電流 値が、その後上昇して所定の閾値を越えるまでの所要時間を計測する所要時間計 測部と、所要時間に基づいて、試料に含まれていた菌種の初期菌数を算出する菌数 算出部とを備えるので、電流値が一旦低下後に上昇するという新たに発見された現 象を利用して、初期菌数を精度良ぐ且つ再現性のある測定を行うことができる効果 がある。
[0018] 本発明の請求項 6に係る解決手段は、請求項 5に記載の菌数測定装置であって、 電流値がー且減少し、その後上昇するのは、試料に含まれる菌種の代謝活動に起 因することを特徴とする。
[0019] 本発明の請求項 6に記載の菌数測定装置は、電流値が一旦減少し、その後上昇 するのは、試料に含まれる菌種の代謝活動に起因するので、初期菌数を精度良ぐ 且つ再現性のある測定を行うことができる効果がある。
[0020] 本発明の請求項 7に係る解決手段は、請求項 5又は請求項 6に記載の菌数測定装 置であって、培地は、特定酵素基質培地法に用いられる培地であり、菌種は、大腸 菌又は大腸菌群である。
[0021] 本発明の請求項 7に記載の菌数測定装置は、培地が、特定酵素基質培地法に用 いられる培地であり、菌種が、大腸菌又は大腸菌群であるので、電流値が一旦低下 後に上昇するという新たに発見された現象を利用することができる条件の 1つであり、 初期菌数を精度良ぐ且つ再現性のある測定を行うことができる効果がある。
[0022] 本発明の請求項 8に係る解決手段は、請求項 5又は請求項 6に記載の菌数測定装 置であって、培地は、 PYG培地であり、菌種は、真菌類である。
[0023] 本発明の請求項 8に記載の菌数測定装置は、培地が、 PYG培地であり、菌種が、 真菌類であるので、電流値が一旦低下後に上昇するという新たに発見された現象を 利用することができる条件の 1つであり、初期菌数を精度良ぐ且つ再現性のある測 定を行うことができる効果がある。また、本発明の請求項 8に記載の菌数測定装置は 、新たに発見された現象を利用することができるので、従来の方法に比べ測定時間 を大幅に短縮することができる効果がある。
[0024] 本発明の請求項 9に係る解決手段は、所定の菌種を含む測定対象の試料と所定 の培地とを収容するセルであって、セルの内壁に酸素電極を備え、酸素電極は、所 定の温度下で、且つ所定の定電圧で、ー且減少し、その後上昇する培地に流れる電 流値を測定する。
[0025] 本発明の請求項 9に記載のセルは、所定の菌種を含む測定対象の試料と所定の 培地とを収容するセルであって、セルの内壁に酸素電極を備え、酸素電極は、所定 の温度下で、且つ所定の定電圧で、ー且減少し、その後上昇する培地に流れる電流 値を測定するので、電流値が一旦低下後に上昇するという新たに発見された現象を 利用して、初期菌数を精度良ぐ且つ再現性のある測定を行うことができる効果があ る。
[0026] 本発明の請求項 10に係る解決手段は、請求項 9に記載のセルであって、電流値が ー且減少し、その後上昇するのは、試料に含まれる菌種の代謝活動に起因する。
[0027] 本発明の請求項 10に記載のセルは、電流値がー且減少し、その後上昇するのは、 試料に含まれる菌種の代謝活動に起因するので、初期菌数を精度良ぐ且つ再現性 のある測定を行うことができる効果がある。
[0028] 本発明の請求項 11に係る解決手段は、請求項 9又は請求項 10に記載のセルであ つて、培地は、特定酵素基質培地法に用いられる培地であり、菌種は、大腸菌又は 大腸菌群である。
[0029] 本発明の請求項 11に記載のセルは、培地が、特定酵素基質培地法に用いられる 培地であり、菌種が、大腸菌又は大腸菌群であるので、電流値が一旦低下後に上昇 するという新たに発見された現象を利用することができる条件の 1つであり、初期菌数 を精度良ぐ且つ再現性のある測定を行うことができる効果がある。
[0030] 本発明の請求項 12に係る解決手段は、請求項 9又は請求項 10に記載のセルであ つて、培地は、 PYG培地であり、菌種は、真菌類である。
発明の効果 [0031] 本発明の請求項 12に記載のセルは、培地が、 PYG培地であり、菌種が、真菌類で あるので、電流値が一旦低下後に上昇するという新たに発見された現象を利用する ことができる条件の 1つであり、初期菌数を精度良ぐ且つ再現性のある測定を行うこ とができる効果がある。また、本発明の請求項 12に記載のセルは、新たに発見され た現象を利用することができるので、従来の方法に比べ測定時間を大幅に短縮する ことができる効果がある。
[0032] この発明の目的、特徴、局面、および利点は、以下の詳細な説明と添付図面とによ つて、より明白となる。
図面の簡単な説明
[0033] [図 1]本実施の形態 1に係る菌数測定方法のフローチャートである。
[図 2]本実施の形態 1に係る菌数測定装置のブロック図である。
[図 3]本実施の形態 1に係るセルの断面斜視図である。
[図 4]本実施の形態 1に係る菌数測定装置の電流値変化を示す図である。
[図 5]本実施の形態 1に係る菌数測定装置の電流値変化を示す図である。
[図 6]本実施の形態 1に係る菌数測定装置の検量線を示す図である。
[図 7]本実施の形態 1に係る菌数測定装置の電流値変化を示す図である。
[図 8]本実施の形態 1に係る菌数測定装置の電流値変化を示す図である。
[図 9]本実施の形態 2に係る菌数測定装置の電流値変化を示す図である。
発明を実施するための最良の形態
[0034] 酸素電極法では、菌種の呼吸 (代謝活動）により溶存酸素濃度が低下し、それに伴 Vヽ酸素電極である作用極と対極との間に流れる電流値 (以下、単に電流値とも ヽぅ） が低下する。しかし、特定の培地、特定の菌種を組み合わせた場合、測定される電 流値は、代謝活動に伴い一旦低下した後に急激に上昇する現象が新たに発見され た。本発明は、酸素電極法において、上記現象を利用する菌数測定方法、菌数測 定装置及びこの装置に用いられるセルである。
[0035] 以下の実施の形態では、特定の培地、特定の菌種の具体名を上げて説明する。伹 し、本発明は、以下の実施の形態で説明する具体名に限定されるものではない。
[0036] (実施の形態 1) 本実施の形態では、特定の培地として特定酵素基質培地法に用いられる培地 (以 下、単に特定酵素基質培地という）が用いられる。この特定酵素基質培地としては、 例えばコリラート (登録商標)などがある。また、本実施の形態では、特定の菌種として 大腸菌又は大腸菌群が用いられている。なお、本実施の形態では、酸素電極の母 材としてステンレス鋼（SUS)が用いられて!/、る。
[0037] 以上の組み合わせに対して用いられる菌数測定方法について説明する。図 1は、 本実施の形態に係る菌数測定方法を示すフローチャートである。まず、ステップ aに ぉ 、て、大腸菌又は大腸菌群が含まれる試料 (検体)を特定酵素基質培地に添加す る。具体的には、特定酵素基質培地は液体であり、この液体培地に大腸菌又は大腸 菌群が含まれる試料をストマッカ一で粉砕'攪拌して添加する。
[0038] 次に、ステップ bにお 、て、試料を添カ卩した培地に流れる電流値を測定する。なお、 電流値の測定は、温度制御により制御された所定の温度下で、且つ所定の定電圧 で行われる。図 2に、本実施の形態に係る菌数測定装置のブロック図を示す。この菌 数測定装置にはセル 1が設けられており、このセル 1に試料を添加した培地を収容す る。そして、セル 1内には、酸素電極法に用いられる酸素電極 2が設けられている。図 3に、セル 1の断面斜視図を示す。セル 1の底面近傍の側壁に、酸素電極 2を構成す る対極 21、作用極 22、参照極 23の 3つの電極が設けられている。さらにセル 1には、 対極 21、作用極 22、参照極 23と電気的に接続された出力端子 24が設けられており 、酸素電極 2は出力端子 24を介して電流測定部 3と接続されて 、る。
[0039] 次に、対極 21、作用極 22、参照極 23の構造について説明する。対極 21、作用極 22、参照極 23は、電極母材にステンレス鋼が使用されている。そして、この電極母材 の表面には、金メッキが施されている。なお、本発明で利用される酸素電極 2の電極 母材は、ステンレス鋼に限らず、他の金属材料 (例えば銅など）であっても良い。但し 、電極母材が他の金属材料であっても、その表面には金メッキが施される。
[0040] 図 2の電流測定部 3では、試料を添加した培地に流れる電流値を酸素電極 2で測 定している (ステップ b)。特に、対極 21と作用極 22とで培地に流れる電流を測定して いる。ここで、培地に流れる電流とは、背景技術でも説明したように、培地の溶存酸素 が作用極 22において、水に還元されることにより流れる電流である。そのため、培地 の溶存酸素濃度が高いときには、電流値も高ぐ溶存酸素濃度が低いときには、電 流値も低くなる。一方、試料に含まれる大腸菌又は大腸菌群は、増殖に伴い酸素消 費量も増加する。そのため、培地の溶存酸素濃度は低下し、電流値も溶存酸素濃度 の低下にともない低下する。よって、従来の酸素電極法では、閾値をゼロに近い電流 値 (例えば ΙΟΟηΑ)に設定していれば、低下する電流値と閾値とが交差するまでの 時間 (以下、所要時間ともいう）を判定することができた。
[0041] しかし、特定の培地と特定の菌種の組み合わせである特定酵素基質培地中の大腸 菌又は大腸菌群を酸素電極で測定すると、背景技術とは異なる現象が生じることが 新たに発見された。図 4は、本実施の形態に係る電流値の変化を示すグラフである。 図 4では、特定酵素基質培地 (コリラート）中の大腸菌群を酸素電極で測定している。 図 4の電流値の変化は、測定を開始して力 約 400分までは約 1, OOOnAの電流値 が流れ安定しているが、その後大腸菌群の増殖に伴い溶存酸素濃度が低下し始め 、測定時間が約 500分で電流値が約 650nAまで低下する。その後電流値は急激に 上昇し始め、測定時間が約 580分で電流値が約 2, OOOnAまで上昇している。なお 、測定開始時に培地に含まれる酸素は飽和状態であるため、外部からの酸素流入に よる電流値の上昇への影響は小さい。図 4に示すように電流値が変化する場合、従 来のような電流値ゼロに近い閾値 (例えば ΙΟΟηΑ)を設定して!/、ても、所要時間を計 測することができない。
[0042] そこで、本実施の形態では、測定開始時より高い電流値を閾値に設定することで、 電流値が一旦減少しその後上昇するような場合であっても、所要時間を測定すること 力 Sできる。図 4では、 1, 500nAに閾値を設定しており、約 540分に閾値を越えている 。そのため、図 4に示す所要時間は約 540分となる。図 1のフローチャートでは、ステ ップ clで電流値が上昇し閾値を越えたかどうか判定し、閾値を越えたとステップ clで 判定された場合には、ステップ c2において所要時間を計測している。また、この所要 時間は、図 2に示す菌数測定装置の所要時間計測部 4において測定される。なお、 ステップ b、ステップ cl及びステップ c2を行っている間は、約 30°Cで大腸菌又は大腸 菌群を培養している。
[0043] 次に、図 1のステップ dにおいて、試料に含まれていた初期菌数を算出する。図 2に 示す菌数測定装置の菌数算出部 5において、計測された所要時間に基づいて試料 に含まれていた初期菌数を算出する。なお、初期菌数を算出するためには、背景技 術でも説明したように検量線を事前に求めておく必要がある。以下、具体例に基づい て説明する。まず、初期菌数が既知の試料について、その電流値の変化を測定する 。図 5に、初期菌数が既知の試料の電流値変化を示す。図 5では、初期菌数がなし、 101、 103、 105、 107 (単位： CFU/g)の 5種類について各 3個ずつ試料を測定して いる。そして、閾値を 1, 500nAとして図 5から所要時間を計測しプロットすると、図 6 に示す検量線のグラフが得られる。図 6では、横軸を初期菌数 (LogCFUZg)とし、 縦軸を測定時間（所要時間）としている。図 6にプロットした所要時間のデータに対し て最小自乗法を適用すると、測定時間 (y) =— 74. 65 X初期菌数 (x) +668. 23の 検量線を得ることができる。
[0044] 上記のように求めた検量線を用いて、未知の初期菌数が含まれる試料を測定する 。まず、未知の初期菌数が含まれる試料の電流値の変化を測定し所要時間を得る。 次に、得られた所要時間を、図 6で得た検量線に適用し初期菌数を算出する。図 4に 示したグラフから求められる所要時間は約 540分であるため、変数 yに 540を代入し て変数 Xを求めると Xは約 1. 72となり、初期菌数は 101·72 (CFU/g)であることが分か る。ステップ dで初期菌数を測定するには検量線を事前に求めておく必要があるが、 この検量線は菌種等が異なると使用することができない。そのため、必要となる菌種 等ごとに検量線を用意しておく必要がある。図 5は大腸菌群についての測定であり、 図 6は大腸菌群につ 、ての検量線である。
[0045] 上記で説明したように、特定の培地と特定の菌種の組み合わせである特定酵素基 質培地中の大腸菌又は大腸菌群を酸素電極法で測定すると、背景技術とは異なる 現象が生じることを新たに発見した。つまり、大腸菌又は大腸菌群の呼吸により培地 中の溶存酸素濃度が低下し、それに伴い電流値も低下し始めるが、その後電流値が 上昇する現象である。しかし、この現象については、現段階では詳細なメカニズムに ついては不明である。但し、特定の培地 (特定酵素基質培地)と特定の菌種 (大腸菌 又は大腸菌群）とを組み合わせて測定すると再現性を有することは確認されて 、る。
[0046] 上述の現象については、詳細なメカニズムについては不明である力 たとえ電極母 材を変更した場合であっても、特定の培地と特定の菌種とを組み合わせた場合には 同じ現象が生じる。同じ培地と同じ菌種であるが異なる電極母材を用いて測定した例 を図 7と図 8に示す。なお、図 7及び図 8では、横軸を測定時間 (分)とし、縦軸を電流 値 (nA)としている。図 7では、特定の培地としてコリラート、特定の菌種として大腸菌 群、電極母材としてステンレス鋼がそれぞれ用いられている。一方、図 8では、特定の 培地としてコリラート、特定の菌種として大腸菌群、電極母材として銅がそれぞれ用い られている。そして、図 7及び図 8では、初期菌数がなし、 102、 104、 106(単位: CFU /g)の 4種類について各 3個ずつ試料を測定している。その結果、図 7及び図 8から 分力るように、コリラートの培地と大腸菌群の菌種との組み合わせであれば、電極母 材がステンレス鋼力銅かの違いに関係なぐ電流値がー且減少し、その後上昇する 現象が現れる。但し、図 7と図 8を比較すると、図 7の方が明らかに電流の立ち上がり は急峻で、ばらつきが少ないことが分かる。つまり、銅を電極母材に用いるよりもステ ンレス鋼を電極母材に用いた方が、測定時間を短縮でき、且つ測定ばらつきを軽減 できる。
[0047] 以上のように、本実施の形態では、測定対象の試料を特定酵素基質培地法に用い られる培地に添加するステップ (a)と、酸素電極を用いて、試料を添加した培地に流 れる電流値を測定するステップ (b)と、ステップ (b)での測定を開始してから、電流値 力 試料に含まれる大腸菌又は大腸菌群の代謝活動により一旦減少し、その後上昇 して所定の閾値を越えるまでの所要時間を計測するステップ (c)と、所要時間に基づ V、て、試料に含まれて 、た大腸菌又は大腸菌群の初期菌数を算出するステップ (d) とを備えるので、電流値がー且低下後に上昇するという新たに発見された現象を利 用して、初期菌数を精度良ぐ且つ再現性のある測定を行うことができる。
[0048] なお、本実施の形態では、閾値を測定開始時より高 、電流値に設定して 、るが、 本発明では、電流値が一旦低下し、その後上昇する局面で閾値と交差する時点を計 測できるのであれば、閾値を測定開始時より低 、電流値に設定しても良 、。
[0049] (実施の形態 2)
本実施の形態では、特定の培地として PYG (バタトペプトン 'イーストェクストラタト' グルコース)培地、特定の菌種として真菌類が用いられている。ここで、真菌類として は、例えば酵母、黴、 Candida albicans (IFO 1594)などがある。
[0050] 以上の組み合わせに対して実施の形態 1で用いた菌数測定方法を適用する。その ため、図 1に示すフローチャートに基づいて菌数測定方法を説明する。但し、真菌類 は増殖速度は大腸菌等に比べて遅いため、例えば準備作業として以下の作業が必 要になる。まず、継代したコロニー力も真菌類 (例えば酵母)を釣菌する。次に、顕微 鏡で確認しながら、 1 X 102CFUZmlの菌液に調整する。そして、調整された菌液を 果実調整品に接種する。さらに、接種した試料 (検体)を 30°Cの恒温槽に入れ、 2日 間前培養を行う。その後、ステップ aにおいて、前培養後の試料 lmlを PYG培地 lml に添カ卩する。
[0051] 次に、ステップ bにお 、て、試料を添加した培地に流れる電流値を測定する。本実 施の形態に係る菌数測定装置も、実施の形態 1で説明した菌数測定装置と同じであ り、図 2にブロック図を示す。この菌数測定装置にはセル 1が設けられており、このセ ル 1に試料を添加した培地を収容する。そして、セル 1内には、酸素電極法に用いら れる酸素電極 2が設けられている。本実施の形態に係るセル 1も、実施の形態 1で説 明したセル 1と同じであり、図 3にセル 1の断面斜視図を示す。セル 1の底面近傍の側 壁に、酸素電極 2を構成する対極 21、作用極 22、参照極 23の 3つの電極が設けら れている。そして、対極 21、作用極 22、参照極 23の電極母材には、ステンレス鋼が 使用されている。そして、この電極母材の表面には、金メッキが施されている。なお、 本発明で利用される酸素電極 2の電極母材は、ステンレス鋼に限らず、他の金属材 料 (例えば銅など）であっても良い。但し、電極母材が他の金属材料であっても、その 表面には金メッキが施される。さらにセル 1には、対極 21、作用極 22、参照極 23と電 気的に接続された出力端子 24が設けられおり、この出力端子 24を介して、対極 21、 作用極 22、参照極 23は、図 2に示す電流測定部 3に接続されている。
[0052] 図 2の電流測定部 3では、対極 21と作用極 22とを用いて培地に流れる電流を測定 している。本実施の形態においても、真菌類が培地の溶存酸素を消費することにより 電流値が低下するが、その後電流値は上昇する。このように電流値が変化する現象 は、図 4に示した大腸菌群の電流値が変化する現象と同じであり、大腸菌群と同様、 現段階では詳細なメカニズムについては不明である。図 9は、真菌類の電流値の変 化を示すグラフである。図 9では、真菌類として食材分離酵母、 Candida albicans,食 材分離黴の 3種類について電流値の変化が記載されている。なお、図 9の横軸は測 定時間（時間）で、縦軸は電流値 (nA)である。
[0053] まず、食材分離酵母は、電流値がほとんど低下せずに、その後急激に上昇して ヽ る。閾値を実施の形態 1と同様 1500nAに設定すると、食材分離酵母は、約 20分 (0 . 33時間)後に閾値と交差している。つまり、食材分離酵母の所要時間は約 20分で あることが分かる。次に、 Candida albicansは、電流値がわずかに低下した後に急激 に上昇している。 Candida albicansは、約 30分（0. 5時間）後に閾値と交差しており、 所要時間は約 30分であることが分かる。次に、食材分離黴は、電流値が一旦低下し た後に上昇している。食材分離黴は、約 135分 (2. 25時間)後に閾値と交差しており 、所要時間は約 135分であることが分かる。なお、図 9には、真菌類が含まれていな いセル (ブランクセル)を測定した電流値の変ィ匕も示されている。ブランクセルは、測 定時間とともに電流値が緩やかに低下しているが、急激な変化は見られない。
[0054] 所要時間の測定は、図 2に示した所要時間計測部 4で行われる。図 1に示すフロー チャートでは、ステップ clで電流値が上昇し閾値を越えたか否かを判定し、閾値を越 えたと判定された場合には、ステップ c2において所要時間を計測する。なお、ステツ プ1)、ステップ cl及びステップ c2を行っている間は、約 30°Cで真菌類を培養している
[0055] 次に、ステップ dにおいて、計測された所要時間に基づいて試料に含まれていた初 期菌数を算出する。図 2に示した菌数測定装置では、菌数算出部 5において行われ ている。初期菌数を算出するためには、実施の形態 1と同様検量線を事前に求めて おく必要がある。検量線を求める具体的な説明については、実施の形態 1で説明し ているため省略する。事前に得た検量線を利用して、得られた所要時間から真菌類 の初期菌数を算出する。なお、真菌類の初期菌数を得るために必要な時間は、セル に試料をセットする時間に測定の所要時間を加えた 1日程度である。本実施の形態 では、前培養の 2日間を加えても 3日程度あれば真菌類の初期菌数を得ることができ 、従来 1週間程度必要であったことと比べると大幅な時間短縮が可能である。
[0056] 以上のように、本実施の形態では、測定対象の試料を PYG培地に添加するステツ プ (a)と、酸素電極を用いて、試料を添加した培地に流れる電流値を測定するステツ プ (b)と、ステップ (b)での測定を開始してから、電流値が、試料に含まれる真菌類の 代謝活動により一旦減少し、その後上昇して所定の閾値を越えるまでの所要時間を 計測するステップ (c)と、所要時間に基づいて、試料に含まれていた真菌類の初期 菌数を算出するステップ (d)とを備えるので、電流値が一旦低下後に上昇するという 新たに発見された現象を利用して、初期菌数を精度良ぐ且つ再現性のある測定を 行うことができる。
また、本実施の形態では、上記のような適切な組み合わせを選択することで、電流 値が上昇するという新たに発見された現象を利用して、従来の精度良く測定できなか つた真菌類の測定を可能にできる。さらに、本実施の形態では、従来、 1週間程度真 菌類を増殖しなければ判定することができな力つた点を、 2日程度の前培養を含めて も 3日以内に判定を行うことができる。

Claims

請求の範囲
[1] (a)所定の菌種を含む測定対象の試料を所定の培地に添加するステップと、
(b)所定の温度下で、且つ所定の定電圧で、酸素電極を用いて、前記試料を添加 した前記培地に流れる電流値を測定するステップと、
(c)前記ステップ (b)での測定を開始してから、ー且減少した前記電流値が、その 後上昇して所定の閾値を越えるまでの所要時間を計測するステップと、
(d)前記所要時間に基づ!/、て、前記試料に含まれて!/、た前記菌種の初期菌数を 算出するステップとを備える菌数測定方法。
[2] 請求項 1に記載の菌数測定方法であって、
前記電流値がー且減少し、その後上昇するのは、前記試料に含まれる前記菌種の 代謝活動に起因することを特徴とする菌数測定方法。
[3] 請求項 1又は請求項 2に記載の菌数測定方法であって、
前記培地は、特定酵素基質培地法に用いられる培地であり、
前記菌種は、大腸菌又は大腸菌群であることを特徴とする菌数測定方法。
[4] 請求項 1又は請求項 2に記載の菌数測定方法であって、
前記培地は、 PYG培地であり、
前記菌種は、真菌類であることを特徴とする菌数測定方法。
[5] 所定の菌種を含む測定対象の試料と所定の培地とを収容するセルと、
前記セル内に設けられた酸素電極と、
所定の温度下で、且つ所定の定電圧で、前記酸素電極を用いて前記試料を添カロ した前記培地に流れる電流値を測定する電流測定部と、
前記電流測定部での測定を開始してから、ー且減少した前記電流値が、その後上 昇して所定の閾値を越えるまでの所要時間を計測する所要時間計測部と、
前記所要時間に基づ!、て、前記試料に含まれて!/、た前記菌種の初期菌数を算出 する菌数算出部とを備える菌数測定装置。
[6] 請求項 5に記載の菌数測定装置であって、
前記電流値がー且減少し、その後上昇するのは、前記試料に含まれる前記菌種の 代謝活動に起因することを特徴とする菌数測定装置。
[7] 請求項 5又は請求項 6に記載の菌数測定装置であって、
前記培地は、特定酵素基質培地法に用いられる培地であり、
前記菌種は、大腸菌又は大腸菌群であることを特徴とする菌数測定装置。
[8] 請求項 5又は請求項 6に記載の菌数測定装置であって、
前記培地は、 PYG培地であり、
前記菌種は、真菌類であることを特徴とする菌数測定装置。
[9] 所定の菌種を含む測定対象の試料と所定の培地とを収容するセルであって、 前記セルの内壁に酸素電極を備え、
前記酸素電極は、所定の温度下で、且つ所定の定電圧で、ー且減少し、その後上 昇する前記培地に流れる電流値を測定することができることを特徴とするセル。
[10] 請求項 9に記載のセルであって、
前記電流値がー且減少し、その後上昇するのは、前記試料に含まれる前記菌種の 代謝活動に起因することを特徴とするセル。
[11] 請求項 9又は請求項 10に記載のセルであって、
前記培地は、特定酵素基質培地法に用いられる培地であり、
前記菌種は、大腸菌又は大腸菌群であることを特徴とするセル。
[12] 請求項 9又は請求項 10に記載のセルであって、
前記培地は、 PYG培地であり、
前記菌種は、真菌類であることを特徴とするセル。
PCT/JP2005/011062 2004-08-02 2005-06-16 菌数測定方法、菌数測定装置及びこの装置に用いられるセル WO2006013679A1 (ja)

Priority Applications (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP05751469A EP1780286B1 (en) 2004-08-02 2005-06-16 Bacterium counting method, bacterium counter, and cell used for the counter
CA2575640A CA2575640C (en) 2004-08-02 2005-06-16 Method of measuring the number of bacteria, device of measuring the number of bacteria and cell used in the device
AT05751469T ATE491037T1 (de) 2004-08-02 2005-06-16 Verfahren zum zählen von bakterien, bakterienzählgerät und für das zählgerät vewendete zelle
DE602005025226T DE602005025226D1 (de) 2004-08-02 2005-06-16 Verfahren zum zählen von bakterien, bakterienzählgerät und für das zählgerät vewendete zelle
US11/573,081 US7955493B2 (en) 2004-08-02 2005-06-16 Method of measuring the number of bacteria, device of measuring the number of bacteria and cell used in the device
DK05751469.7T DK1780286T3 (da) 2004-08-02 2005-06-16 Bakterietællingsmetode, bakterietæller og celle anvendt til tælleren

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2004225765 2004-08-02
JP2004-225765 2004-08-02

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2006013679A1 true WO2006013679A1 (ja) 2006-02-09

Family

ID=35786978

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2005/011062 WO2006013679A1 (ja) 2004-08-02 2005-06-16 菌数測定方法、菌数測定装置及びこの装置に用いられるセル

Country Status (9)

Country Link
US (1) US7955493B2 (ja)
EP (1) EP1780286B1 (ja)
KR (1) KR100892624B1 (ja)
CN (1) CN100455672C (ja)
AT (1) ATE491037T1 (ja)
CA (1) CA2575640C (ja)
DE (1) DE602005025226D1 (ja)
DK (1) DK1780286T3 (ja)
WO (1) WO2006013679A1 (ja)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1816210A1 (en) * 2004-11-24 2007-08-08 Daikin Industries, Ltd. Microbe counting method and microbe counting device
JP2007289004A (ja) * 2006-04-20 2007-11-08 Nisshin Kagaku Kenkyusho:Kk 生菌数測定方法、生菌数測定装置、スライムモニター方法およびスライムコントロール剤添加システム
JP2014068613A (ja) * 2012-09-28 2014-04-21 Daikin Ind Ltd 細菌数測定装置

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101339153B (zh) * 2008-07-28 2013-03-13 浙江工商大学 一种示踪食品致病性细菌生长的检测方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6315150A (ja) * 1986-07-08 1988-01-22 Terumo Corp 生菌数測定装置
JPH05123186A (ja) * 1991-10-31 1993-05-21 Shimadzu Corp 好気性微生物の測定法および測定装置
JP2000287699A (ja) 1999-04-07 2000-10-17 Daikin Ind Ltd 細菌数測定方法およびその装置

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2712677B2 (ja) 1989-12-27 1998-02-16 株式会社島津製作所 好気性微生物の測定法及び測定装置
JP3240953B2 (ja) 1997-04-10 2001-12-25 ダイキン工業株式会社 生理活性測定方法およびその装置
EP1775579A4 (en) * 2004-08-02 2009-07-15 Daikin Ind Ltd OXYGEN ELECTRODE

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6315150A (ja) * 1986-07-08 1988-01-22 Terumo Corp 生菌数測定装置
JPH05123186A (ja) * 1991-10-31 1993-05-21 Shimadzu Corp 好気性微生物の測定法および測定装置
JP2000287699A (ja) 1999-04-07 2000-10-17 Daikin Ind Ltd 細菌数測定方法およびその装置

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1816210A1 (en) * 2004-11-24 2007-08-08 Daikin Industries, Ltd. Microbe counting method and microbe counting device
EP1816210A4 (en) * 2004-11-24 2008-10-29 Daikin Ind Ltd METHOD AND DEVICE FOR COUNTING MICROBES
JP2007289004A (ja) * 2006-04-20 2007-11-08 Nisshin Kagaku Kenkyusho:Kk 生菌数測定方法、生菌数測定装置、スライムモニター方法およびスライムコントロール剤添加システム
JP2014068613A (ja) * 2012-09-28 2014-04-21 Daikin Ind Ltd 細菌数測定装置

Also Published As

Publication number Publication date
DK1780286T3 (da) 2011-03-14
CN100455672C (zh) 2009-01-28
EP1780286A4 (en) 2008-03-26
KR100892624B1 (ko) 2009-04-09
EP1780286B1 (en) 2010-12-08
ATE491037T1 (de) 2010-12-15
CN1898393A (zh) 2007-01-17
US7955493B2 (en) 2011-06-07
CA2575640A1 (en) 2006-02-09
EP1780286A1 (en) 2007-05-02
US20080197023A1 (en) 2008-08-21
DE602005025226D1 (de) 2011-01-20
KR20070027577A (ko) 2007-03-09
CA2575640C (en) 2010-06-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107091870B (zh) 确定分析物浓度的测量装置、生物传感器***和方法
US4005002A (en) Apparatus for measuring substrate concentrations
CN109884150B (zh) 一种红细胞积压校正方法及存储介质
US20130048512A1 (en) System and method for determining the concentration of an analyte in a sample fluid
JP2002189015A (ja) 酵素電極による反応電流測定方法
WO2006013679A1 (ja) 菌数測定方法、菌数測定装置及びこの装置に用いられるセル
CN1841059A (zh) 检查传感器功能的方法
Čížková et al. Verification of applicability of mercury meniscus modified silver solid amalgam electrode for determination of heavy metals in plant matrices
JP2003000224A (ja) 微生物活性測定装置及び微生物活性の測定方法
US7729866B2 (en) Method of determining level of specified component in blood sample and apparatus for level determination
CN106645325B (zh) 检测食品中日落黄的电化学方法
CN104937402A (zh) 包括原位校准装置的pH值测量设备
CN107314999B (zh) 基于多元线性回归法的液体阴极辉光放电光谱分析方法
JP3753153B1 (ja) 菌数測定方法及び菌数測定装置
DK159861B (da) Referenceelektrode med inaktiv polymermembran og fremgangsmaade til fremstilling heraf
US20040254744A1 (en) Locating system of oxidation/reduction potential of electrolysis water and the constant output method of calibration and compensation thereof
TW523602B (en) Measuring method and measuring device
Bett et al. An automatic coulometric titrimeter
JP4576505B2 (ja) 血液試料における特定成分の濃度測定方法および濃度測定装置
Goh et al. Impedance spectroscopy for in situ biomass measurements in microbioreactor
CN110249225A (zh) 用于电化学传感器的电极
KR101291310B1 (ko) 알루미늄 산화물 박막이 부착된 금속 전극을 이용한 미생물 측정 방법
JP2018518681A (ja) カルシウム阻害に関するｃｒｅａセンサの補正方法
Seitz et al. Metrological Traceability Concept for Electrolytic Conductivity and pH
US10191009B2 (en) Electrochemical determination of heavy metals

Legal Events

Date Code Title Description
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 200580001345.8

Country of ref document: CN

AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BW BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS KE KG KM KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NA NG NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SM SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): BW GH GM KE LS MW MZ NA SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IS IT LT LU MC NL PL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1020067026019

Country of ref document: KR

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2575640

Country of ref document: CA

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2005751469

Country of ref document: EP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 1020067026019

Country of ref document: KR

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2005751469

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 11573081

Country of ref document: US