WO2005095575A2 - Dispositif d’incubation pour lames de serologie et d’histologie - Google Patents

Dispositif d’incubation pour lames de serologie et d’histologie Download PDF

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WO2005095575A2
WO2005095575A2 PCT/FR2005/000770 FR2005000770W WO2005095575A2 WO 2005095575 A2 WO2005095575 A2 WO 2005095575A2 FR 2005000770 W FR2005000770 W FR 2005000770W WO 2005095575 A2 WO2005095575 A2 WO 2005095575A2
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Gilles Nicolai
Georges Szekeres
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Inodiag
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    • G01N1/30—Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis
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    • G01N1/312—Apparatus therefor for samples mounted on planar substrates
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Definitions

  • the present application relates to an incubation device for serology or histology supports. It also relates to any device comprising such a device, as well as the use of these devices and / or devices in methods of analysis or diagnosis.
  • a flat and solid surface typically a microscope slide
  • a liquid phase typically a liquid phase
  • the biological sample to be tested is contained in the liquid phase, and reacts with a slide carrying reactive elements, for example proteins, cells, DNA sequences, bacteria , viruses, etc., previously deposited on the slide.
  • the slide is brought into contact with a developing reagent.
  • the biological sample to be tested is deposited on the slide, the reactive elements (antibodies, DNA or RNA probes, etc.) and developers then being in the liquid phase. This is the case, for example, in histological tests where the sample is a section of tissue (s) from the body of a patient.
  • a random access blade incubator which can treat a blade in a short time (typically in less than an hour), and respond to emergency diagnoses in terms of infectious diseases.
  • the present invention provides a solution to these needs.
  • the present application relates to a new incubation device for serology or histology slides. It also relates to any device comprising such a device, as well as the use of these devices and / or devices in methods of analysis or diagnosis.
  • the object of the present invention is in particular to provide an incubation device for serology or histology slides which avoids the disadvantages mentioned above, ensuring contacting of the reactive elements in a reliable and automatic manner.
  • a first object of the invention lies more particularly in an incubation device for serology or histology slides having a reactive zone, characterized in that: - it comprises a solid support (1) having a flat surface on its face upper, in which is arranged at least one alvélole (2) open on the surface of the support, the opening having an area greater than that of the reactive zone of the blade and less than that of the surface of the blade, - the bottom of the cell comprises at least two orifices (4) allowing the circulation of fluid (s) in the cell, - the contour of the opening of the cell is advantageously provided with a means making it possible to ensure a seal, preferably a seal (5); and - the device also comprises means for placing and / or blocking a serology or histology slide (6) so that the reactive area of the slide is opposite the opening of the cell to the surface of the support, the blade and the support thus cooperating to form a sealed incubation chamber.
  • the device also comprises means for supplying fluid (s) to the cell (or the incubation chamber), and / or - the support comprises a plurality of cells as defined above, allowing the incubation in parallel of several samples, arranged on the same slide or on separate slides, and / or - the device further comprises means for automatic feeding of slides and, optionally, a blade identifier reader, and / or - the device further comprises blade transfer means towards a signal reading device, and / or - the bottom of the cell comprises three orifices, one for the fluid outlet, one for the inlet of liquids and one for the inlet of gases.
  • the object-slide (6) constitutes the removable upper face of an incubation chamber, said chamber being sealed and provided with orifices (4) allowing the circulation of the various fluids necessary for the development of serology or histology reactions.
  • the placing of the sample (in serological mode) or of the reagents (in histological mode) is not done on the slide but directly in the device at a location provided for this purpose, - the successive reagents are brought into contact with the slide by a laminar sweep strictly limiting the shearing, - the operations follow one another "with lost reagent", after each reaction the reagent used (or the excess of the reagent) is removed, and n is not reused.
  • Another subject of the invention relates to a method of serological analysis comprising the incubation of a serology slide comprising a reactive zone comprising a series of deposits of infectious agents, pathogens, allergens or autoantigens with a serum sample of a patient, or a dilution thereof, then the revelation of the antibodies of the sample fixed on the deposits by means of labeled reagents, characterized in that the incubation is carried out in a device as defined above.
  • the sample to be tested can be introduced into a cell before the positioning of the slide, then the slide is applied to the surface of the support so as to form the sealed incubation chamber in which the reactive area of the slide is at sample contact.
  • the sample to be tested can be introduced (pumped) into the incubation chamber formed by the blade placed on the cell.
  • Another subject of the invention relates to a method of histological analysis comprising the incubation of a histology slide comprising a reactive zone comprising a tissue sample from a patient with a solution of specific antibodies, then the revelation of the antibodies of the solution fixed on the sample by means of labeled reagents, characterized in that the incubation is carried out in a device as defined above.
  • the invention also relates to the use of a device as defined above for serological or histological analysis.
  • kits in particular biological analysis kits, comprising a device as defined above.
  • the invention is applicable in numerous fields, in particular for histological or serological analysis in a medical, veterinary, environmental, food-processing, etc. context.
  • the invention relates to a device suitable for the analysis of serology or histology slides.
  • the device advantageously comprises a solid support (1) having a flat surface on its upper face in which is arranged at least one alvélole (2) open on the surface of the support, the support cooperating with the surface of the blade to form, at the level of the cell, a sealed incubation chamber whose blade represents the removable upper face, the bottom (that is to say the entire wall constituting the cell) of the cell further comprising at least two orifices (4) allowing the circulation of fluid (s) (liquids, gases) in the incubation chamber thus formed.
  • the support used can be of various shapes and sizes, insofar as it has a flat surface, preferably on the upper face.
  • the support is typically rectangular in shape, adapted to the usual shape of the serology or histology slides, even if any other shape can be envisaged (square, circular, triangular, etc.).
  • the support of the cell can be of size limited to the contour of the surface ensuring the seal, typically a joint limiting the cell.
  • the thickness of the support must be sufficient to accommodate the cell (a cavity), of a suitable volume to form an incubation chamber.
  • the incubation chamber and therefore the cell
  • the support has a volume of between 5 and 500 ⁇ l, for example between 10 and 350 ⁇ l, and the support should have a thickness greater than 3 mm, for example between 0, 5 and 3 cm.
  • the solid support can be produced from various materials, possibly mixed. It can in particular be composed (or based on) plastic material, metal and / or any rigid material resistant to saline solutions and to temperatures greater than or equal to 37 ° C.
  • the solid support is composed (or based, that is to say comprises) of polymethacrylate, polyester, polycarbonate, nylon (delrin, rilsan) or stainless steel, alone or in mixtures.
  • the cell formed in the support can take different forms, depending on the applications envisaged and / or according to the type of support used. A priori, there is no specific constraint as to the shape of the cell, provided that the opening has an area greater than that of the reactive zone of the blade and less than that of the surface of the blade, to allow the formation of the incubation chamber. Furthermore, as described in the following text, the support may include a plurality of cells, allowing the separate analysis of several samples. In preferred implementation variants, the cell (and its opening) has a circular or elongated shape, with radii of curvature as large as possible. It is understood that other shapes can be envisaged (rectangular, elliptical, etc.).
  • the contour of the opening of the cell is preferably provided with a seal (5), making it possible to seal the incubation chamber.
  • the seal can be produced, for example, in or from any flexible material, preferably latex, synthetic rubber or silicone.
  • the seal can be flat or O-shaped. It can have a variable diameter or thickness, typically between 0.5 and 5 mm.
  • the orifices (4) provided in the bottom of the cell preferably have a small diameter, since they are essentially intended to ensure the circulation of liquids and / or gases. Typically, their diameter is between 0.1 and 3 mm, preferably between 0.3 and 2 mm, more preferably between 0.5 and 2 mm.
  • the orifices are advantageously arranged on either side of the cell, that is to say typically diametrically opposite. Thus, when the incubation chamber is formed by placing the blade, the orifices are located on either side of the reactive zone, and allow scanning of the latter.
  • the cell comprises two diametrically opposite orifices, one for the inlet of the fluids, the other for the outlet of the fluids.
  • the bottom of the cell comprises three ports: one outlet port and two inlet ports, one for liquids and the other for gases, especially for drying air.
  • the outlet orifice is arranged on one side of the bottom of the cell and the two inlet orifices are arranged on the diametrically opposite side, typically close to one another. (see Figure 8A).
  • the device further comprises means for placing and / or blocking a serology or histology slide so that the reactive area of the slide (6) is in face of the opening of the cell on the surface of the support, the blade and the support thus cooperating to form a sealed incubation chamber.
  • the means for placing and / or blocking the blade on the support may consist, for example, of a countersink, a shoulder or pins. Such means make it possible to force a correct positioning of the blade so that the reactive zone is located opposite the opening of the cell.
  • a recess (13) is provided in the support, at one end of the location of the blade, to facilitate disengagement by simple pressure, and / or a movable and articulated cover (7) makes it possible to block the blade (support and hold), once in position.
  • the means for arranging and / or blocking the blade comprise an articulated frame (14), in particular with a slide and, possibly, locking means.
  • the articulated frame advantageously comprises an articulation or a hinge allowing the easy and guided positioning of the blade (and thus the opening and closing of the incubation chamber), as well as, optionally, a cover (141).
  • the locking means may comprise, for example, a thumb wheel (142) actuating a locking cam, or even an electromagnet.
  • the means for placing and / or blocking the blade consist of a fixed cover (7) provided with a location (71) allowing the blade to be put in place (6), the support block of the cell being movable relative to said cover.
  • the support of the cell which can be moved in the vertical direction so as to close the incubation chamber when the blade is in place.
  • the blades are advantageously slid into a location (71) (for example a groove) formed in the cover, and the mounting of the support closes the incubation chamber (and places the reactive zone in contact with liquids before or after introduced in it).
  • the support and the fixed cover are linked by means for guiding the movement of the support and advantageously comprises means for controlling this movement, for example electrical or mechanical.
  • the cover is advantageously pierced with an opening (3) perpendicular to the incubation cell, so as to allow the introduction of the sample into said cell before placing in place of the blade, if applicable.
  • Figure 4 shows this arrangement in perspective.
  • a particular object of the present invention relates to a device for incubating serology or histology slides presenting a reactive zone, characterized in that it comprises: - a solid support (1) movable having a flat surface on its upper face, in which is arranged at least one cell (2) open on the surface of the support, the opening having an area greater than that of the reactive zone of the blade and less than that of the surface of the blade, in which the bottom of the cell comprises at least two orifices (4) allowing the circulation of fluid (s) in the cell and the contour of the opening of the cell is provided with a means making it possible to ensure a seal; - a fixed cover (7) provided with a location (71) allowing the positioning of the blade, and with an opening (3); and - means for guiding the essentially vertical movement of the movable support (1) towards the fixed cover (7) to allow forming a sealed incubation chamber between the cell and the blade, when the latter is in place, the reactive area of the slide being contained in said incubation chamber.
  • the means for guiding the vertical movement of the support comprise a hinge, preferably consisting of a steel blade, placed at a sufficient distance from the reactive zone of the blade when the latter is in place to ensure essentially uniform pressure on the cell seal, typically at least 5, 6, or 7 cm, 10 cm for example, and fixed to both the cover and the cell support (see Figure 8B) .
  • the mounting of the support, of the order of 3 mm, can be ensured manually, for example a cam lever, or mechanically by an electric motor or a jack.
  • the device of the invention further comprises means for ensuring a supply of fluid (s) to the incubation chamber.
  • supply means typically comprise at least one fluid supply reservoir (8) connected to a first orifice of the cell, called the inlet orifice, by a tubing system for the introduction of fluid (s) into the alveolus, and a fluid recovery tank (9) connected to a second orifice of the alveolus, said outlet orifice, by a system of tubing, for the elimination of fluids, said systems being connected to one or more pumps (10, 11).
  • a single pump preferably a suction pump
  • the device of the invention further comprises means for ensuring a supply of fluid (s) to the incubation chamber.
  • the pressurization of the tanks is used to move the fluids, each supply channel is then provided not only with a valve but also with a flow adjustment element such as a needle.
  • the device comprises several (eg 2 to 6) fluid supply reservoirs (8) connected to the inlet orifice, each reservoir being connected to a valve (12).
  • the presence of several supply tanks allows the introduction of different reagents (liquids, gases) in the incubation chamber, according to kinetics, doses and / or suitable programs.
  • the presence of valves makes it possible to individually regulate the supply of each of the fluids (or from each of the supply tanks present).
  • a pump of the peristaltic type is used, preferably with reversible movement, ensuring the successive placement of the liquids by suction, each liquid being under the control of a valve.
  • the pump flow can vary for example from 0.1 to 10 ml / min.
  • a syringe-type pump can be used, with the same flow rates.
  • the device further comprises an additional pump (11) for drying the blade or for cleaning the device. It is advantageously a non-volumetric air pump, with a flow rate of, for example, between 100 and 3000 ml / min. It is understood that these figures are provided for information only, and that certain embodiments may go beyond these limits and be adapted by those skilled in the art.
  • Both pumps can be connected to the same outlet tubing, each controlled by a valve.
  • the valve In the case of a peristaltic pump the valve is not necessary.
  • the air pump for drying can be either suction, in which case it is connected on the same side as the liquid suction pump, or of the blowing type, in which case it is connected on the other side (as it is shown in Figure 5).
  • the valves used are advantageously electrically controlled.
  • valves control the arrival of the reagents
  • 0 to 3 valves control the suction pumps.
  • one of the valves is used to ensure the atmospheric pressure, facilitating the opening and closing of the incubation chamber.
  • the suction circuit can be switched directly to one or the other fluid supply tanks (8) by a three-way valve ( Figure 9).
  • the presence of this auxiliary circuit eliminates bubbles which can enter the system when changing or filling the tank.
  • the device can be limited to a single slide but, in an advantageous embodiment, several slides are incubated in parallel.
  • several cells are advantageously provided in the support (or several supports are used), each cell comprising its set of solenoid valves (12).
  • the solenoid valves are controlled synchronously and a multi-channel preristaltic pump ensures the transfer of the reagents simultaneously into the different cells.
  • An auxiliary contact may be provided to prevent the opening of the valves on an unused cell.
  • a particular object of the invention resides in a device in which the support comprises a plurality of cells as defined above, allowing the incubation in parallel of several serology or histology slides.
  • each cell is provided with fluid supply means and the cell-supply system units thus formed are arranged to operate in parallel, using the same fluids, according to synchronous or offset sequences.
  • the liquid transfer pump is suction
  • the air pump is blower and connected to the inlet port of the cell, so that the fluids always circulate in the same direction and s 'discharge into a single receptacle (9).
  • the device of the invention further comprises means for automatically feeding blades and, optionally, a blade identifier reader.
  • the blade can be identified by a bar code or, preferably, by an electronic label.
  • the device of the invention further comprises means for transferring the blade to a signal reading device, in particular an optical reader in order to carry out observations and measurements of the biological characteristics of the samples.
  • the signal reading device is integrated in the support and / or the cover of the incubation device according to the invention.
  • the support material is transparent and the bottom of the cell is polished so that the optical observation device can be integrated into the incubation device.
  • the incubation device of FIG. 4 can be provided with a fluorescence detection optic with a light-emitting diode integrated in the support and a retractable objective coming into contact with the blade.
  • the bottom of the cell in line with the reactive zone of the blade consists of the plane side of a plano-convex lens, the first lens of an objective for collecting the light emitted by the sample.
  • the excitation source is placed above the slide.
  • the term "blade” means any rigid object-carrying element which can be used to immobilize a biological deposit, thus delimiting a reactive zone. It can be for example a solid coverslip, a membrane, a filter, etc.
  • the blade can be made of (or based on) any known and conventional material, such as plastic, glass, nylon, ceramic, metal, biological polymers, silica, etc.
  • Preferred slides are glass microscope slides. Their dimensions are generally standard, about 25mm x 75mm.
  • the blades are provided with a polarizing device, for example in the form of a notch in a corner.
  • FIG. 1 is a top view of the incubation cell in serology version. Scale drawing. (1): hollowed out support for the incubation cell (2) and a blade imprint. (4): inlet and outlet ports for liquids and gases. (5): seal. (13): release of the blade.
  • Figure 2 is a top view of the incubation cell in histology version. Scale drawing.
  • Figure 3 shows a block carrying the incubation cell according to the invention with fixed support and movable cover.
  • FIG. 4 represents a device according to the invention with fixed cover (7) and mobile cell support (1), provided with means for guiding and positioning the blade; (3) opening of the cover, allowing the introduction of the sample into the cell.
  • the mechanism for raising and lowering the block is not shown.
  • Figure 5 represents a schematic section of principle of circulation in serology version.
  • the solenoid valve block (12) consists of a methacrylate base pierced with fine pipes and on which the valves are bolted.
  • FIG. 6 is a block diagram of the circulation in histology version. There is no drying device, considered optional in histology.
  • Figure 7 shows an arrangement of a four-slide incubator according to the invention, seen from above on a 1 / 2- scale. The slide locking devices are shown in gray. Each device consists of a hinged (metal) frame (14) carrying a transparent cover (141), as well as a thumb wheel (142) actuating the locking cam (not shown). The large circles are the locations of the buffer and water bottles, the small shaded circles are the locations of the restricted use reagents, such as the staining agents.
  • FIG. 8A represents a diagram of a cell with three orifices, two for the entry of fluids and one for their exit;
  • Figure 8B shows a device according to the invention provided with means for guiding and positioning the blade (6), consisting of a hinge comprising a steel blade (foil) fixed to the cover (7) and to the support of the socket (1).
  • the support is mounted manually by a cam lever.
  • FIG. 9 represents a hydraulic assembly diagram (fluid wiring) of a device of the invention comprising three-way valves (symbol Y) making it possible to switch a suction circuit directly to one or the other of the tanks. supply of liquids (8) by an auxiliary circuit.
  • FIG. 10 represents an arrangement of an incubator with four blades according to the invention, seen in perspective perspective. The incubation units correspond to the block diagrams in Figure 8.
  • the invention can be implemented for the analysis of serology slides.
  • the slide carries a series of biological deposits ("spots"), for example of infectious, pathogenic agents, autoantigens or allergens. Deposits are carefully identified, this identification constituting an identification code.
  • the liquid sample to be tested is a patient serum, generally diluted in an appropriate buffer.
  • the reagents used are: 1) The agents for revealing the antibodies of the patient possibly attached to the slide and, preferably, antibodies of animal origin coupled to marker molecules, for example fluorescent.
  • Antibodies of animal origin (goat, mouse, rat, rabbit) are preferably of two types: some recognize type M immunoglobulin, others type G immunoglobulin. Each type of antibody is coupled to a specific marker.
  • the former are coupled to fluorescein and the latter to rhodamine.
  • dyes and / or markers are possible, such as the fluorochromes Alexa Fluor 488 and Alexa Fluor 594, provided that the excitation or emission spectra differ.
  • dyes and / or markers can be found commercially, for example from Sigma (Saint-Louis, Mo, USA), Molecular Probes (Euzzo, Oregon, USA) or FluoProbes, including in form conjugated to anti IgG antibodies and anti IgM. In the invention they are preferably used in diluted mixtures so as to carry out rapid and specific labeling, according to the procedures known to those skilled in the art.
  • Incubations can be carried out at laboratory temperature, or at 37 ° C if an accelerating effect is sought. They proceed in successive phases: the first step is the placing in the cell (2) or in the incubation chamber of the liquid sample to be tested, generally between 10 and 100 ⁇ l.
  • the sample can be introduced automatically by means of the pumping system or, in a preferred mode, by pipetting into the open cell, before the application of the blade.
  • the blade (6) is put in place, ensuring that the reactive zone is brought into contact with the liquid sample to be tested.
  • the blade is applied to the contour of the cell so as to provide a seal.
  • the device rinses the slide with a rinsing solution, then supplies the labeled development reagents (eg, fluorescent antibody conjugates). After a new incubation, the incubation chamber is rinsed again. In a preferred mode, the last operation is air sweep drying. During the automatic incubation process, the reagents are therefore successively introduced by pumping and come into contact with the reactive area of the slide, with pause times allowing the reaction-diffusion coupling. At the end of the process, the blade may or may not be dried by a gas stream. To ensure high sensitivity, each reaction must be as complete as possible, with the exception of the first, which can be "controlled by kinetics" to better reflect the differences from one patient to another.
  • the labeled development reagents eg, fluorescent antibody conjugates
  • the invention also allows great specificity, that is to say in particular the absence of artifacts due to the persistence of the previous reagent in the following incubation.
  • several incubation units, alveolus-blade holder-pumping system are combined to operate in parallel according to synchronous or offset sequences, using common reagent reservoirs.
  • the invention can also be implemented for the analysis of histology slides.
  • the slide In the histological mode, the slide carries a sample of tissue from a patient, which can be in the form of a frozen and dried section or a dewormed section, for example.
  • the reagents used in this embodiment are: 1) The specific antibody or antibodies recognizing the elements of interest on the sample section. These antibodies are preferably monoclonal, they recognize either differentiation antigens, such as cytokeratin, or tumor antigens, such as carcinoembryonic antigen. They can be directly labeled or revealed by secondary antibodies themselves labeled either with fluorescent molecules or with enzymes.
  • Incubations can be carried out at laboratory temperature, or at 37 ° C if an accelerating effect is sought. They proceed in successive phases: the first step is the establishment of the specific antibody, which can be a monoclonal antibody suitably diluted according to the rules known to those skilled in the art.
  • the antibody can be introduced automatically by means of the pumping system, or in a preferred mode by pipetting into the open cell, before application of the slide.
  • Several antibodies can be successively brought into contact with the slide, by means of the incubator, provided that in fine the markings are distinguished from each other. Those skilled in the art will have no trouble programming the appropriate sequence to carry out the markings that they have chosen. In a particular mode, drying by air sweeping is carried out to clean the device, after removal of the blade.
  • Step 1- The serum is diluted 1/100 in PBS-milk (0.15 M NaCl, phosphate pH 7 0; 01 M, 50 ml + 1.5 g of milk).
  • Step 2- 40 ⁇ l of sample (diluted serum) are introduced into the open chamber.
  • the test slide (Inodiag) is placed above, the spots in contact with the sample.
  • the cell (incubation chamber) is closed and the incubation is continued for 20 minutes.
  • Step 3- The “buffer” solenoid valve is then opened and the suction pump (10) put into action.
  • the rinsing is carried out with 100 ⁇ l of PBS buffer containing 0.05% tween 20, for a period of approximately 30 seconds. This is done three times in succession. Step 4- The “anti IgM + IgG” solenoid valve is then opened and the suction pump (10) put into action. This allows the introduction into the incubation chamber of a mixture of anti IgG and anti IgM antibodies (80 ⁇ l, diluted in PBS).
  • This reagent is fluorescent.
  • Step 5- The "water” solenoid valve is open and the suction pump (10) is activated for approximately 30 seconds.
  • Step 6- Finally, the solenoid valve linked to the blower air pump (11) is open, as well as the solenoid valve directly linked to the outlet tank (9). The air pump (11) is operated for 20 seconds to dry the blade.
  • Step 1 The sample (100 ⁇ l of primary antibody (ref .: 10032.1, clone: B56, Histopathology, Pécs, Hungary) diluted 1/100) is introduced into the open chamber.
  • Step 2- The slide (6) object holder (tissue section 4 ⁇ m thick, human lymph node) is placed above, the section in contact with the diluted antibody.
  • the cell incubation chamber
  • the incubation is continued for 20 minutes.
  • Step 3- The “buffer” solenoid valve is open and the suction pump (10) is started. Rinse with 100 ⁇ l of buffer, wait 3 minutes. This is done three times in succession.
  • Step 4- The “Detection reagent” solenoid valve is then opened and the suction pump (10) put into action. This allows the introduction into the incubation chamber of the detection reagent (100 ⁇ l, polymer conjugated to the enzyme peroxidase). Incubation 20 minutes. Step 5- Then, rinses identical to the previous step are carried out.
  • Step 6- The “chromogenic substrate” solenoid valve is then opened and the suction pump (10) activated. This allows the introduction into the incubation chamber of the development reagent of a mixture of diamino-benzidine and hydrogen peroxide (100 ⁇ l). Incubation 20 minutes.
  • Step 7- The “water” solenoid valve is open and the suction pump (10) is started. Add distilled water to stop the enzymatic action.

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Abstract

La présente demande concerne un dispositif d'incubation pour supports de sérologie ou d'histologie. Elle concerne également tout appareil comprenant un tel dispositif, ainsi que l'utilisation de ces appareils et/ou dispositifs dans des procédés d'analyse ou de diagnostic.

Description

Dispositif d'incubation pour lames de sérologie et d'histologie
La présente demande concerne un dispositif d'incubation pour supports de sérologie ou d'histologie. Elle concerne également tout appareil comprenant un tel dispositif, ainsi que l'utilisation de ces appareils et/ou dispositifs dans des procédés d'analyse ou de diagnostic.
Arrière Plan de l'Invention
De nombreux tests de diagnostic sont basés sur la réaction en phase hétérogène, entre une surface plane et solide (typiquement une lame porte-objet de micoscopie) et une phase liquide. Dans une première variante (telle que par exemple les tests sérologiques), l'échantillon biologique à tester est contenu dans la phase liquide, et réagit avec une lame portant des éléments réactifs, par exemple des protéines, cellules, séquences d'ADN, bactéries, virus, etc., déposés au préalable sur la lame. Après une première réaction, la lame est mise en contact avec un réactif révélateur. Selon une autre variante, l'échantillon biologique à tester est déposé sur la lame, les éléments réactifs (anticorps, sondes d'ADN ou d'ARN, etc.) et révélateurs étant alors dans la phase liquide. C'est le cas par exemple des tests histologiques où l'échantillon est une coupe de tissu(s) provenant de l'organisme d'un patient.
Aujourd'hui, ces différentes opérations de manipulation de la phase solide et de la phase liquide sont essentiellement manuelles. Certains réactifs sont directement déposés sur la lame ou, dans le mode serologique, c'est l'échantillon biologique lui-même, puis la ou les lames sont trempées dans des bains successifs qui réalisent les opérations de coloration nécessaires à l'observation. Il en résulte différents inconvénients, et notamment : - un risque de fausse manipulation lorsque un échantillon de quelques microlitres est déposé sur une lame et peut glisser en dehors de la zone réactive, - un manque de reproductibilité car il est impossible de contrôler précisément les forces de cisaillement auxquelles est soumis le dépôt sur la lame, - une dérive des réactifs, qui, pour des raisons de coût, ne sont pas renouvelés à chaque trempage.
Les appareils disponibles actuellement traitent les lames de manière ouverte, avec des jets de liquide ou des bains, entraînant des consommations élevées de réactif ainsi qu'un risque élevé de contamination. Ils ne sont pas adaptés à une utilisation à accès aléatoire, qui est seule capable de répondre à l'urgence. Tels sont par exemple les appareils décrits dans les brevets ou demandes de brevets n° WO03/052386, US6,352,861 et US6,495,106 de Lab Vision, Ventana et BioGenex. Ils sont adapatés à l'immunohistologie et ne sont pas utilisés en sérologie. II existe donc un besoin réel de dispositifs d'incubation améliorés pour lames de sérologie ou d'histologie, permettant une analyse rapide, fiable et automatisée. Dans le domaine serologique il y a en particulier un besoin non satisfait d'incubateur de lame à accès aléatoire, qui puisse traiter une lame dans des délais courts (typiquement en moins d'une heure), et répondre aux diagnostics d'urgence en matière de maladies infectieuses. La présente invention apporte une solution à ces besoins.
Résumé de l'Invention La présente demande concerne un nouveau dispositif d'incubation pour lames de sérologie ou d'histologie. Elle concerne également tout appareil comprenant un tel dispositif, ainsi que l'utilisation de ces appareils et/ou dispositifs dans des procédés d'analyse ou de diagnostic. L'objet de la présente invention est notamment de fournir un dispositif d'incubation pour lames de sérologie ou d'histologie qui évite les inconvénients mentionnés précédemment, en assurant la mise en contact des éléments réactifs de manière fiable et automatique.
Un premier objet de l'invention réside plus particulièrement dans un dispositif d'incubation de lames de sérologie ou d'histologie présentant une zone réactive, caractérisé en ce que: - il comprend un support solide (1) ayant une surface plane sur sa face supérieure, dans lequel est aménagé au moins un alvélole (2) ouvert sur la surface du support, l'ouverture ayant une superficie supérieure à celle de la zone réactive de la lame et inférieure à celle de la surface de la lame, - le fond de l'alvéole comprend au moins deux orifices (4) permettant la circulation de fluide(s) dans l'alvéole, - le contour de l'ouverture de l'alvéole est avantageusement muni d'un moyen permettant d'assurer une étanchéité, de préférence d'un joint (5); et - le dispositif comporte en outre des moyens pour disposer et/ou bloquer une lame (6) de sérologie ou d'histologie de manière à ce que la zone réactive de la lame se trouve en face de l'ouverture de l'alvéole à la surface du support, la lame et le support coopérant ainsi pour former une chambre d'incubation étanche. Dans des modes de réalisation particulièrement préférés de l'invention: - le dispositif comporte en outre des moyens pour assurer une alimentation en fluide(s) de l'alvéole (ou de la chambre d'incubation), et/ou - le support comporte une pluralité d'alvéoles tels que définis précédemment, permettant l'incubation en parallèle de plusieurs échantillons, disposés sur une même lame ou sur des lames distinctes, et/ou - le dispositif comporte en outre des moyens d'alimentation automatique de lames et, éventuellement, un lecteur d'identifiant de lames, et/ou - le dispositif comporte en outre des moyens de transfert de lame vers un dispositif de lecture de signal, et/ou - le fond de l'alvéole comprend trois orifices, un pour la sortie des fluides, un pour l'entrée des liquides et un pour l'entrée des gaz. D'une manière particulièrement avantageuse, dans le dispositif de l'invention, la lame porte-objet (6) constitue la face supérieure démontable d'une chambre d'incubation, ladite chambre étant étanche et munie d'orifices (4) permettant la circulation des différents fluides nécessaires au développement de réactions de sérologie ou d'histologie. Ainsi notamment, selon l'invention : - la mise en place de l'échantillon (en mode serologique) ou des réactifs (en mode histologique) ne se fait pas sur la lame mais directement dans le dispositif à un emplacement prévu à cet effet, - les réactifs successifs sont mis en contact avec la lame par un balayage laminaire limitant strictement le cisaillement, - les opérations se succèdent "à réactif perdu", après chaque réaction le réactif utilisé (ou l'excès du réactif) est évacué, et n'est pas réutilisé. Ces caractéristiques sont particulièrement avantageuses et permettent la mise en contact des éléments réactifs de manière fiable et automatique, et de fournir des résultats reproductibles.
Un autre objet de l'invention concerne un procédé d'analyse serologique comprenant l'incubation d'une lame de sérologie comprenant une zone réactive comportant une série de dépôts d'agents infectieux, pathogènes, allergènes ou autoantigènes avec un échantillon de sérum d'un patient, ou une dilution de celui- ci, puis la révélation des anticorps de l'échantillon fixés sur les dépôts au moyen de réactifs marqués, caractérisé en ce que l'incubation est réalisée dans un dispositif tel que défini précédemment. L'échantillon à tester peut être introduit dans un alvéole avant la mise en place de la lame, puis la lame est appliquée sur la surface du support de manière à former la chambre d'incubation étanche dans laquelle la zone réactive de la lame est au contact de l'échantillon. En variante, l'échantillon à tester peut être introduit (pompé) dans la chambre d'incubation formée par la lame mise en place sur l'alvéole. Un autre objet de l'invention concerne un procédé d'analyse histologique comprenant l'incubation d'une lame d'histologie comprenant une zone réactive comportant un échantillon de tissu d'un patient avec une solution d'anticorps spécifiques, puis la révélation des anticorps de la solution fixés sur l'échantillon au moyen de réactifs marqués, caractérisé en ce que l'incubation est réalisée dans un dispositif tel que défini précédemment.
L'invention concerne également l'utilisation d'un dispositif tel que défini précédemment pour l'analyse serologique ou histologique.
Un autre aspect de l'invention concerne des kits, notamment d'analyse biologique, comprenant un dispositif tel que défini précédemment.
L'invention est applicable dans de nombreux domaines, notamment pour l'analyse histologique ou serologique dans un contexte médical, vétérinaire, environemental, agro-alimentaire, etc.
Description détaillée de l'invention Comme indiqué précédemment, l'invention porte sur un dispositif adapté à l'analyse de lames de sérologie ou d'histologie. Le dispositif comporte avantageusement un support solide (1) ayant une surface plane sur sa face supérieure dans lequel est aménagé au moins un alvélole (2) ouvert sur la surface du support, le support coopérant avec la surface de la lame pour former, au niveau de l'alvéole, une chambre d'incubation étanche dont la lame représente la face supérieure amovible, le fond (c'est-à-dire l'ensemble de la paroi constituant l'alvéole) de l'alvéole comprenant par ailleurs au moins deux orifices (4) permettant la circulation de fluide(s) (liquides, gaz) dans la chambre d'incubation ainsi formée. Le support utilisé peut être de formes et de dimensions variées, dans la mesure où il comporte une surface plane, de préférence sur la face supérieure. Le support est typiquement de forme rectangulaire, adaptée à la forme habituelle des lames de sérologie ou d'histologie, même si toute autre forme peut être envisagée (carrée, circulaire, triangulaire, etc.). Ainsi, lorsque le positionnement de la lame est assuré par le couvercle, le support de l'alvéole peut être de taille limitée au contour de la surface assurant l'étanchéité, typiquement un joint limitant l'alvéole. L'épaisseur du support doit être suffisante pour permettre de recevoir l'alvéole (une cavité), d'un volume approprié pour former une chambre d'incubation. Typiquement, la chambre d'incubation (et donc l'alvéole) possède un volume compris entre 5 et 500 μl, par exemple entre 10 et 350 μl, et le support devrait présenter une épaisseur supérieure à 3 mm, par exemple comprise entre 0,5 et 3 cm. Le support solide peut être réalisé à partir de matériaux variés, éventuellement mélangés. Il peut en particulier être composé (ou à base de) de matériau plastique, de métal et/ou de tout matériau rigide résistant aux solutions salines et à des températures supérieures ou égales à 37°C. Dans un mode de mise en œuvre préféré, le support solide est composé (ou à base, c'est-à-dire comprend) de polymétacrylate, de polyester, de polycarbonate, de nylon (delrin, rilsan) ou d'acier inoxydable, seuls ou en mélanges.
L'alvéole ménagé dans le support peut adopter différentes formes, selon les applications envisagées et/ou selon le type de support mis en œuvre. A priori, il n'existe pas de contrainte spécifique quant à la forme de l'alvéole, sous réserve que l'ouverture ait une superficie supérieure à celle de la zone réactive de la lame et inférieure à celle de la surface de la lame, pour permettre la formation de la chambre d'incubation. Par ailleurs, comme décrit dans la suite du texte, le support peut comprendre une pluralité d'alvéoles, permettant l'analyse séparée de plusieurs échantillons. Dans des variantes préférées de mise en œuvre, l'alvéole (et son ouverture) présente une forme circulaire ou allongée, avec des rayons de courbure les plus grands possibles. Il est entendu que d'autres formes peuvent être envisagées (rectangulaire, elliptique, etc.).
D'autre part, comme indiqué précédemment, le contour de l'ouverture de l'alvéole est préférentiellement muni d'un joint (5), permettant d'assurer une étanchéité à la chambre d'incubation. Le joint peut être réalisé par exemple dans ou à partir de tout matériau souple, de préférence de latex, de caoutchouc synthétique ou de silicone. En outre, le joint peut être de forme plane ou torique. Il peut pésenter un diamètre ou une épaisseur variable, typiquement comprise entre 0,5 et 5 mm.
Les orifices (4) prévus dans le fond de l'alvéole ont de préférence un diamètre faible, puisqu'ils sont destinés essentiellement à assurer la circulation de liquides et/ou gaz. Typiquement, leur diamètre est compris entre 0,1 et 3 mm, de préférence entre 0,3 et 2 mm, plus préférentiellement entre 0,5 et 2 mm. Pour assurer une meilleure circulation des fluides dans la chambre d'incubation, et notamment afin de réaliser un balayage, les orifices sont avantageusement disposés de part et d'autre de l'alvéole, c'est-à-dire typiquement diamétralement opposés. Ainsi, lorsque la chambre d'incubation est formée par mise en place de la lame, les orifices se trouvent disposés de part et d'autre de la zone réactive, et permettent de réaliser un balayage de celle-ci.
Dans un mode de mise en œuvre préféré du dispositif de l'invention, l'alvéole comprend deux orifices diamétralement opposés, l'un pour l'entrée des fluides, l'autre pour la sortie des fluides.
Il est entendu que des orifices supplémentaires (par exemple 1 ou 2) peuvent être prévus, soit pour l'alimentation en liquide(s), soit pour le séchage ou l'alimentation en gaz, par exemple, soit encore pour améliorer le flux ou le balayage au sein de la chambre d'incubation. Ainsi, dans un mode de mise en oeuvre préféré du dispositif de l'invention, le fond de l'alvéole comprend trois orifices : un orifice de sortie et deux orifices d'entrée, l'un destiné aux liquides et l'autre aux gaz, notamment à l'air de séchage. Plus préférentiellement, dans ce mode de réalisation, l'orifice de sortie est disposé d'un côté du fond de l'alvéole et les deux orifices d'entrée sont disposés sur le côté diamétralement opposé, typiquement proches l'un de l'autre (voir Figure 8A).
Selon un mode de réalisation particulièrement préféré de l'invention, le dispositif comporte en outre des moyens pour disposer et/ou bloquer une lame de sérologie ou d'histologie de manière à ce que la zone réactive de la lame (6) se trouve en face de l'ouverture de l'alvéole à la surface du support, la lame et le support coopérant ainsi pour former une chambre d'incubation étanche. Les moyens permettant de disposer et/ou bloquer la lame sur le support peuvent être constitués par exemple d'un lamage, d'un épaulement ou de picots. De tels moyens permettent de forcer une mise en place correcte de la lame de manière à ce que la zone réactive se trouve en face de l'ouverture de l'alvéole. Dans une réalisation préférée, un dégagement (13) est ménagé dans le support, à une extrémité de l'emplacement de la lame, pour en faciliter le dégagement par simple pression, et/ou un couvercle (7) mobile et articulé permet de bloquer la lame (appui et maintien), une fois en position. Dans une variante particulière, les moyens pour disposer et/ou bloquer la lame comportent un cadre articulé (14), notamment à glissière et, éventuellement, des moyens de verrouillage. Le cadre articulé comporte avantageusement une articulation ou une charnière permettant la mise en place aisée et guidée de la lame (et ainsi l'ouverture et la fermeture de la chambe d'incubation), ainsi que, éventuellement, un couvercle (141). Les moyens de verrouillage peuvent comporter, par exemple, une molette (142) actionnant une came de verrouillage, ou encore un électroaimant. Dans une autre variante de réalisation particulière, les moyens pour disposer et/ou bloquer la lame sont constitués par un couvercle (7) fixe muni d'un emplacement (71) permettant la mise en place de la lame (6), le bloc support de l'alvéole étant mobile par rapport au dit couvercle. Dans ce cas, c'est le support de l'alvéole qui peut être mû dans la direction verticale de sorte à réaliser la fermeture de la chambre d'incubation lorsque la lame est en place. Dans cette variante, les lames sont avantageusement glissées dans un emplacement (71) (par exemple une rainure) ménagé dans le couvercle, et la montée du support ferme la chambre d'incubation (et place la zone réactive au contact de liquides antérieurement ou ultérieurement introduits dans celle-ci). De préférence, dans le dispositif de l'invention selon ce mode de réalisation, le support et le couvercle fixe sont liés par des moyens de guidage du mouvement du support et comporte avantageusement des moyens pour commander ce déplacement, par exemple électriques ou mécaniques. D'autre part, dans cette variante, le couvercle est avantageusement percé d'une ouverture (3) à l'aplomb de l'alvéole d'incubation, de sorte à permettre l'introduction de l'échantillon dans ledit alvéole avant la mise en place de la lame, le cas échéant. La figure 4 montre cette disposition en perspective cavalière.
Ainsi, un objet particulier de la présente invention concerne un dispositif d'incubation de lames de sérologie ou d'histologie présentant une zone réactive, caractérisé en ce qu'il comprend: - un support solide (1) mobile ayant une surface plane sur sa face supérieure, dans lequel est aménagé au moins un alvéole (2) ouvert sur la surface du support, l'ouverture ayant une superficie supérieure à celle de la zone réactive de la lame et inférieure à celle de la surface de la lame, dans lequel le fond de l'alvéole comprend au moins deux orifices (4) permettant la circulation de fluide(s) dans l'alvéole et le contour de l'ouverture de l'alvéole est muni d'un moyen permettant d'assurer une étanchéité ; - un couvercle fixe (7) muni d'un emplacement (71) permettant la mise en place de la lame, et d'une ouverture (3) ; et - des moyens pour guider le déplacement essentiellement vertical du support (1) mobile vers le couvercle (7) fixe pour permettre de former une chambre d'incubation étanche entre l'alvéole et la lame, lorsque celle-ci est en place, la zone réactive de la lame étant contenue dans ladite chambre d'incubation. Dans un mode de réalisation préféré, les moyens de guidage du mouvement vertical du support comprennent une charnière, de préférence constituée d'une lame d'acier, placée à une distance suffisante de la zone réactive de la lame lorsque celle-ci est en place pour assurer une pression essentiellement uniforme sur le joint de l'alvéole, typiquement de 5, 6, ou 7 cm au moins, 10 cm par exemple, et fixée à la fois au couvercle et au support de l'alvéole (voir Figure 8B). La montée du support, de l'ordre de 3 mm, peut être assurée manuellement, par exemple un levier à came, ou de manière mécanisée par moteur électrique ou un vérin.
Dans un mode de réalisation préféré, le dispositif de l'invention comporte en outre des moyens pour assurer une alimentation en fluide(s) de la chambre d'incubation. Ces moyens d'alimentation comprennent typiquement au moins un réservoir d'alimentation en fluide (8) relié à un premier orifice de l'alvéole, dit orifice d'entrée, par un système de tubulure pour l'introduction de fluide(s) dans l'alvéole, et un réservoir de récupération de fluide (9) relié à un deuxième orifice de l'alvéole, dit orifice de sortie, par un système de tubulure, pour l'élimination des fluides, lesdits systèmes étant connectés à une ou plusieurs pompes (10, 11). Dans une variante de mise en œuvre, on utilise une pompe unique (de préférence aspirante) pour commander l'entrée et la sortie des fluides. Dans un autre mode de réalisation, on utilise la mise en pression des réservoirs pour mouvoir les fluides, chaque canal d'alimentation est alors muni non seulement d'une vanne mais aussi d'un élément de réglage du débit tel qu'un pointeau. Avantageusement, le dispositif comporte plusieurs (par ex. 2 à 6) réservoirs d'alimentation en fluides (8) reliés à l'orifice d'entrée, chaque réservoir étant connecté à une vanne (12). La présence de plusieurs réservoirs d'alimentation permet l'introduction de différents réactifs (liquides, gaz) dans la chambre d'incubation, selon des cinétiques, doses et/ou programmes adaptés. La présence de vannes permet de réguler individuellement l'alimentation en chacun des fluides (ou à partir de chacun des réservoirs d'alimentation présents). Dans une variante préférée, une pompe de type péristaltique est mise en oeuvre, de préférence à mouvement réversible, assurant la mise place successive des liquides par aspiration, chaque liquide étant sous le contôle d'une vanne. Le débit de la pompe peut varier par exemple de 0,1 à 10 ml/min. Un pompe de type seringue peut être utilisée, avec les mêmes débits. D'autre part, dans une variante particulière de l'invention, le dispositif comporte en outre une pompe supplémentaire (11) pour le séchage de la lame ou pour le nettoyage du dispositif. Il s'agit avantageusement d'une pompe à air non volumétrique, avec un débit compris par exemple entre 100 et 3000 ml/min. Il est entendu que ces chiffres sont fournis à titre indicatif, et que certaines réalisations peuvent sortir de ces limites et être adaptées par l'homme du métier. Les deux pompes peuvent être connectées à la même tubulure de sortie, chacune contrôlée par une vanne. Dans le cas d'une pompe péristaltique la vanne n'est pas nécessaire. La pompe à air pour le séchage peut être soit aspirante, auquel cas elle est connectée du même côté que la pompe d'aspiration des liquides, ou du type soufflant, auquel cas elle est connectée de l'autre côté (ainsi qu'il est montré sur la figure 5). Les vannes utilisées sont avantageusement commandées électriquement.
Selon les modes de réalisation, 3 à 6 vannes contrôlent l'arrivée des réactifs, 0 à 3 vannes contrôlent les pompes d'aspiration. Dans une réalisation préférée, une des vannes est utilisée pour assurer la mise à la pression atmosphérique, facilitant l'ouverture et la fermeture de la chambre d'incubation.
Dans un mode particulier de l'invention le circuit d'aspiration peut être commuté directement vers l'un ou l'autre réservoirs d'alimentation en fluides (8) par une vanne trois voies (Figure 9). La présence de ce circuit auxiliaire permet l'élimination des bulles qui peuvent s'introduire dans le système lors d'un changement ou remplissage de réservoir. Le dispositif peut être limité à une seule lame mais, dans une réalisation avantageuse, plusieurs lames sont incubées en parallèle. Dans ce cas, plusieurs alvéoles sont avantageusement prévus dans le support (ou plusieurs supports sont utilisés), chaque alvéole comprenant son jeu d' électrovannes (12). Dans une réalisation particulière les électrovannes sont commandées de façon synchrone et une pompe préristaltique multicanaux assure le transfert des réactifs de manière simultanée dans les différents alvéoles. Un contact auxiliaire peut être prévu pour empêcher l'ouverture des vannes sur un alvéole non utilisé.
Ainsi, un objet particulier de l'invention réside dans un dispositif dans lequel le support comporte une pluralité d'alvéoles tels que définis précédemment, permettant l'incubation en parallèle de plusieurs lames de sérologie ou d'histologie. Typiquement, chaque alvéole est muni de moyens d'alimentation en fluides et les unités alvéole-système d'alimentation ainsi constituées sont agencées pour fonctionner en parallèle, en utilisant les même fluides, selon des séquences synchrones ou décalées. Dans un mode préféré de l'invention la pompe de transfert de liquide est aspirante, la pompe à air est soufflante et connectée à l'orifice d'entrée de l'alvéole, de sorte que les fluides circulent toujours dans le même sens et s'évacuent dans un réceptacle (9) unique. Dans un mode particulier de mise en œuvre, le dispositif de l'invention comporte en outre des moyens d'alimentation automatique de lames et, éventuellement, un lecteur d'identifiant de lames. La lame peut être identifiée par un code à barre ou, de façon préférentielle, par une étiquette électronique.
Dans un autre mode particulier de mise en œuvre, qui peut être combiné avec l'un quelconque des précédents, le dispositif de l'invention comporte en outre des moyens de transfert de lame vers un dispositif de lecture de signal, en particulier un lecteur optique en vue de réaliser les observations et mesures des caractéristiques biologiques des échantillons. Avantageusement, le dispositif de lecture de signal est intégré dans le support et/ou le couvercle du dispositif d'incubation selon l'invention. Dans un mode particulier de l'invention le matériau du support est transparent et le fond de l'alvéole est poli de sorte que le dispositif optique d'observation peut être intégré dans le dispositif d'incubation. A titre d'exemple on peut munir le dispositif d'incubation de la figure 4 d'une optique de détection de fluorescence avec une diode électroluminescente intégrée dans le support et un objectif rétractable venant en contact avec la lame. De tels dispositifs optiques sont grandement facilités par la disposition de fibre optique pour résoudre les problèmes d'encombrement ainsi que l'homme de l'art sait le faire. Dans un mode particulier de l'invention, le fond de l'alvéole au droit de la zone réactive de la lame est constitué du côté plan d'une lentille plan-convexe, première lentille d'un objectif de collecte de la lumière émise par l'échantillon. Selon ce mode de réalisation, pour les mesures de fluorescence, la source excitatrice est placée au dessus de la lame.
Les dispositifs selon l'invention sont adaptés à tout type de lame de sérologie ou d'histologie. Dans ce contexte, au sens de la présente demande, on entend par "lame" tout élément rigide porte-objet pouvant être utilisé pour immobiliser un dépôt biologique, délimitant ainsi une zone réactive. Il peut s'agir par exemple d'une lamelle solide, d'une membrane, d'un filtre, etc. La lame peut être réalisée en (ou à base de) tout matériau connu et conventionnel, comme du plastique, verre, nylon, céramique, métal, des polymères biologiques, de la silice, etc. Des lames préférées sont des lames porte-objet de microscopie en verre. Leurs dimensions sont généralement standard, soit environ 25mm x 75mm. Dans un mode de réalisation préféré, les lames sont munies d'un détrompeur , par exemple sous la forme d'une encoche dans un coin.
Les pipeteurs automatiques du commerce, tels que ceux fabriqués par Cavro, Hamilton, ou Gilson, peuvent être utilisés pour introduire l'échantillon (version sérologie) ou l'anticorps monoclonal (version histologie) à la dilution convenable. Différents mode de réalisation et d'utilisation de l'invention sont décrits dans les exemples et dans les figures annexées, dans lesquelles: La Figure 1 est une vue de dessus de l'alvéole d'incubation en version sérologie. Plan coté. (1) : support creusé de l'alvéole d'incubation (2) et d'une empreinte de lame. (4) : orifices d'entrée et de sortie des liquides et des gaz. (5) : joint d'étanchéité. (13) : dégagement de la lame . La Figure 2 est une vue de dessus de l'alvéole d'incubation en version histologie. Plan coté.
La Figure 3 représente un bloc portant l'alvéole d'incubation selon l'invention à support fixe et couvercle mobile. (1) : support creusé de l'alvéole d'incubation (2) et d'une empreinte de lame. (4) : orifices d'entrée et de sortie des liquides et des gaz. (5) : joint d'étanchéité. (6) : lame, représentée hors place. (7) : couvercle, représenté sans les articulations. (13) : dégagement de la lame.
La Figure 4 représente un dispositif selon l'invention à couvercle (7) fixe et support d'alvéole (1) mobile, pourvu de moyens de guidage et de mise en place de la lame; (3) ouverture du couvercle, permettant l'introduction de l'échantillon dans l'alvéole. La mécanique de montée et descente du bloc n'est pas représentée.
La Figure 5 représente une coupe schématique de principe des circulations en version sérologie. Le bloc des électrovannes (12) est constitué d'un socle de métacrylate percé de canalisations fines et sur lequel sont boulonnées les vannes.
Le bloc est lui-même boulonné sur le support d'alvéole. Les tubulures sont représentées par des lignes pointillées. Le circuit électrique n'est pas représenté. La Figure 6 est un schéma de principe des circulations en version histologie. Il n'y a pas de dispositif de séchage, considéré comme facultatif en histologie. La Figure 7 représente une disposition d'un incubateur à quatre lames selon l'invention, vu de dessus à l'échelle 1/2- Les dispositifs de verrouillage des lames sont représentés en gris. Chaque dispositif consiste en un cadre (métallique) articulé (14) portant un couvercle transparent (141), ainsi qu'une molette (142) actionnant la came de verrouillage (non figurée). Les grands cercles sont les emplacements des flacons de tampon et d'eau, les petits cercles hachurés sont les emplacements des réactifs à utilisation restreinte, tels que les agents colorés.
La Figure 8A représente un schéma d'alvéole à trois orifices, deux pour l'entrée des fluides et un pour leur sortie ; la Figure 8B représente un dispositif selon l'invention pourvu de moyens de guidage et de mise en place de la lame (6), constitués d'une charnière comprenant une lame d'acier (clinquant) fixée au couvercle (7) et au support de l'alvéole (1). Sur cette représentation, la montée du support est assurée manuellement par un levier à came. La Figure 9 représente un schéma de montage hydraulique (câblage fluidique) d'un dispositif de l'invention comprenant des vannes trois voies (symbole Y) permettant de commuter un circuit d'aspiration directement vers l'un ou l'autre réservoirs d'alimentation en liquides (8) par un circuit auxiliaire. La figure 10 représente une disposition d'un incubateur à quatre lames selon l'invention, vue en perspective cavalière. Les unités d'incubation répondent aux schémas de principe de la figure 8.
Comme illustré sur les figures, l'invention peut être mise en œuvre pour l'analyse de lames de sérologie. Dans le mode serologique, la lame porte une série de dépôts biologiques ("spots"), par exemple d'agents infectieux, pathogènes, d'autoantigènes ou d'allergènes. Les dépôts sont soigneusement repérés, ce repérage constituant un code d'identification. L'échantillon liquide à tester est un sérum de patient, généralement dilué dans un tampon approprié. Les réactifs mis en œuvre sont : 1) Les agents de révélation des anticorps du patient éventuellement fixés sur la lame et, d'une manière préférentielle, des anticorps d'origine animale couplés à des molécules marqueurs, par exemple fluorescentes. Les anticorps d'origine animale (chèvre, souris, rat, lapin) sont préférentiellement de deux types: les uns reconnaissent les immunoglobuline de type M, les autres les immunoglobulines de type G. Chaque type d'anticorps est couplé à un marqueur spécifique. Par exemple, les premiers sont couplés à la fluoresceine et les seconds à la rhodamine. Il est entendu que d'autres combinaisons de colorants et/ou marqueurs sont possibles, telles que les fiuorochromes Alexa Fluor 488 et Alexa Fluor 594, pourvu que les spectres d'excitation ou d'émission diffèrent. De tels colorants et/ou marqueurs peuvent être trouvés dans le commerce, par exemple auprès de Sigma (Saint-Louis, Mo, USA), Molecular Probes (Eugène, Oregon, USA) ou FluoProbes, y compris sous forme conjuguée aux anticorps anti IgG et anti IgM. Dans l'invention ils sont utilisés de préférence en mélanges dilués de manière à réaliser un marquage rapide et spécifique, selon les procédures connues de l'homme de l'art. 2) Les solutions de rinçage qui sont utilisées, solutions salines légèrement détergentes selon des compositions connues de l'homme de l'art, pour rincer les réactifs en contact avec la lame, et solutions plus astringentes et eau distillée pour rincer l'appareil.
Les incubations peuvent être effectuées à température du laboratoire, ou à 37°C si un effet accélérateur est recherché. Elles procèdent par phases successives: la première étape est la mise en place dans l'alvéole (2) ou dans la chambre d'incubation de l'échantillon liquide à tester, généralement entre 10 et 100 μl. L'échantillon peut être introduit de manière automatique au moyen du système de pompage ou, dans un mode préféré, par pipetage dans l'alvéole ouvert, avant l'application de la lame. Ensuite, la lame (6) est mise en place, assurant la mise en contact de la zone réactive avec l'échantillon liquide à tester. La lame est appliquée sur le contour de l'alvéole de sorte à réaliser une étanchéité. Après un temps d'incubation approprié, le dispositif rince la lame au moyen d'une solution de rinçage, puis amène les réactifs de révélation marqués (e.g., les conjugués anticorps fluorescents). A l'issue d'une nouvelle incubation, la chambre d'incubation est rincée à nouveau. Dans un mode préféré, la dernière opération est un séchage par balayage d'air. Au cours du processus automatique d'incubation, les réactifs sont donc successivement introduits par pompage et entrent en contact avec la zone réactive de la lame, avec des temps de pause permettant le couplage réaction-diffusion. A la fin du processus la lame est ou non séchée par un courant gazeux. Pour assurer une grande sensibilité, chaque réaction doit être aussi complète que possible, à l'exception de la première qui peut être "contrôlée par la cinétique" pour mieux refléter les différences d'un patient à un autre. L'invention permet en outre une grande spécificité, c'est-à-dire notamment l'absence d'artefacts dûs à la persistence du réactif précécent dans l'incubation suivante. Dans un mode préféré, plusieurs unités d'incubation, alvéole-porte-lame- système de pompage, sont associées pour fonctionner en parallèle selon des séquences synchrones ou décalées, en utilisant des réservoirs de réactifs communs.
L'invention peut également être mise en œuvre pour l'analyse de lames d'histologie. Dans le mode histologique la lame porte un échantillon de tissu d'un patient, qui peut se présenter sous forme d'une coupe congelée et séchée ou d'une coupe déparafinée, par exemple. Les réactifs mis en œuvre dans ce mode de réalisation sont : 1) Le ou les anticorps spécifiques reconnaissant les éléments d'intérêt sur la coupe échantillon. Ces anticorps sont de préférence monoclonaux, ils reconnaissent soit des antigènes de différenciation, tel que la cytokératine, soit des antigènes tumoraux, comme l'antigène carcinoembryonaire. Ils peuvent être directement marqués ou révélés par des anticorps secondaires eux-mêmes marqués, soit par des molécules fluorescentes, soit par des enzymes. 2) Les solutions de rinçage utilisées, solutions salines légèrement détergentes selon des compositions connues de l'homme de l'art, pour rincer les réactifs en contact avec la lame, et solutions plus astringentes et eau distillée pour rincer l'appareil.
Les incubations peuvent être effectuées à température du laboratoire, ou à 37°C si un effet accélérateur est recherché. Elles procèdent par phases successives: la première étape est la mise en place de l'anticorps spécifique, qui peut être un anticorps monoclonal convenablement dilué selon les règles connues de l'homme de l'art. L'anticorps peut être introduit de manière automatique au moyen du système de pompage, ou dans un mode préféré par pipetage dans l'alvéole ouvert, avant l'application de la lame. Plusieurs anticorps peuvent être successivement mis en contact avec lame, au moyen de l'incubateur, pourvu qu'in fine les marquages se distinguent les uns des autres. L'homme de l'art n'aura aucune peine à programmer la séquence adéquate pour réaliser les marquages qu'il aura choisis. Dans un mode particulier, un séchage par balayage d'air est effectué pour nettoyer l'appareil, après retrait de la lame.
Dans un mode préféré, plusieurs unités d'incubation, alvéole-porte-lame- système de pompage, sont associées pour fonctionner en parallèle selon des séquences synchrones ou décalées, en utilisant des réservoirs de réactifs communs. D'autres aspects et avantages de le présente invention apparaîtront à la lecture des exemples de mode d'utilisation qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.
Exemple 1 - Description d'une incubation de sérologie
Ce mode de mise en œuvre est décrit en relation avec la Figure n° 5. Hors cellule, le sérum est chauffé 30 minutes à 57°C (décomplémentation) puis conservé à 4°C. Etape 1- Le sérum est dilué 1/100 dans PBS-lait (NaCl 0.15 M, phosphate pH 7 0;01 M, 50 ml + 1.5 g de lait). Etape 2- 40 μl d'échantillon (sérum dilué) sont introduits dans la chambre ouverte. La lame test (Inodiag) est placée au dessus, les spots en contacts avec l'échantillon. La cellule (chambre d'incubation) est fermée et l'incubation est poursuivie pendant 20 minutes. Etape 3- L'électro vanne « tampon » est alors ouverte et la pompe d'aspiration (10) mise en action. Le rinçage est effectué par 100 μl de tampon PBS contenant du tween 20 0.05%, pendant une période de 30 secondes environ. Cette opération est effectuée trois fois en suivant. Etape 4- L' électrovanne « anti IgM+IgG » est ensuite ouverte et la pompe d'aspiration (10) mise en action. Ceci permet l'introduction dans la chambre d'incubation d'un mélange d'anticorps anti IgG et anti IgM (80μl, dilué dans PBS).
L'incubation est poursuivie pendant 10 minutes environ. Ce réactif est fluorescent.
Ensuite, des rinçages identiques à l'étape précédente sont réalisés. Etape 5- L'électrovanne "eau" est ouverte et la pompe d'aspiration (10) mise en action pendant 30 secondes environ. Etape 6- Enfin l'électrovanne liée à la pompe à air soufflante (11) est ouverte, ainsi que l'électrovanne directement liée au réservoir de sortie (9). La pompe à air (11) est actionnée pendant 20 secondes, pour sécher la lame.
Exemple 2 - Description d'une incubation histologique
Ce mode de mise en œuvre est décrit plus particulièrement en relation avec la Figure n° 6. Hors cellule, la coupe est déparaffinée, réhydratée et pré-traitée selon les règles d'immunomarquage connues de l'homme de l'art. Etape 1- L'échantillon (100 μl d'anticorps primaire (réf.: 10032.1, clone: B56, Histopathologie, Pécs, Hongrie) dilué au 1/100) est introduit dans la chambre ouverte.
Etape 2- La lame (6) porte-objet (coupe de tissu d'une épaisseur a 4 μm, ganglion lymphatique humain) est placée au dessus, la coupe en contacts avec l'anticorps dilué. La cellule (chambre d'incubation) est fermée et l'incubation est poursuivie pendant 20 minutes.
Etape 3- L'électrovanne « tampon » est ouverte et la pompe d'aspiration (10) est mise en action. Rinçage par 100 μl de tampon, attente 3 minutes. Cette opération est effectuée trois fois en suivant.
Etape 4- L'électrovanne « Réactif de détection » est ensuite ouverte et la pompe d'aspiration (10) mise en action. Ceci permet l'introduction dans la chambre d'incubation du réactif de détection (100 μl, polymère conjugé à l'enzyme péroxidase). Incubation 20 minutes. Etape 5- Ensuite, des rinçages identiques à l'étape précédente sont réalisés.
Etape 6- L'électrovanne « substrat chromogène » est ensuite ouverte et la pompe d'aspiration (10) mise en action. Ceci permet l'introduction dans la chambre d'incubation du réactif de révélation d'un mélange de diamino-benzidine et d'eau oxygénée (100 μl). Incubation 20 minutes. Etape 7- L'électrovanne « eau » est ouverte et la pompe d'aspiration (10) mise en marche. Apport de l'eau distillée pour arrêter l'action enzymatique.

Claims

Revendications
1. Dispositif d'incubation de lames de sérologie ou d'histologie présentant une zone réactive, caractérisé en ce que: - il comprend un support solide (1) ayant une surface plane sur sa face supérieure, dans lequel est aménagé au moins un alvéole (2) ouvert sur la surface du support, l'ouverture ayant une superficie supérieure à celle de la zone réactive de la lame et inférieure à celle de la surface de la lame, - Le fond de l'alvéole comprend au moins deux orifices (4) permettant la circulation de fluide(s) dans l'alvéole, - le contour de l'ouverture de l'alvéole est muni d'un moyen permettant d'assurer une étanchéité ; et - le dispositif comporte en outre des moyens pour disposer et/ou bloquer une lame (6) de sérologie ou d'histologie de manière à ce que la zone réactive de la lame se trouve en face de l'ouverture de l'alvéole à la surface du support, la lame et le support coopérant ainsi pour former une chambre d'incubation étanche.
2. Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que les moyens permettant de disposer et/ou bloquer la lame sur le support de manière à ce que la zone réactive se trouve en face de l'ouverture de l'alvéole sont constitués d'un lamage, d'un épaulement ou de picots, et éventuellement d'un couvercle (7) mobile et articulé permettant de bloquer la lame une fois en position.
3. Dispositif selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que un dégagement (13) est ménagé dans le support, à une extrémité de l'emplacement de la lame, pour faciliter le dégagement de la lame par simple pression.
4. Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que les moyens pour disposer et/ou bloquer la lame comportent un cadre articulé (14), notamment à glissière et, éventuellement, des moyens de verouillage.
5. Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que les moyens pour disposer et/ou bloquer la lame sont constitués par un couvercle (7) fixe muni d'un emplacement (71) permettant la mise en place de la lame (6), le bloc support de l'alvéole étant mobile par rapport au dit couvercle.
6. Dispositif selon la revendication 5, caractérisé en ce que le support et le couvercle fixe sont liés par des moyens de guidage du mouvement du support et en ce qu'il comporte en outre des moyens pour commander ce déplacement, par exemple électriques ou mécaniques.
7. Dispositif selon la revendication 5 ou 6, caractérisé en ce que le couvercle fixe est percé d'une ouverture (3) à l'aplomb de l'alvéole d'incubation.
8. Dispositif d'incubation de lames de sérologie ou d'histologie présentant une zone réactive, caractérisé en ce qu'il comprend: - un support solide (1) mobile ayant une surface plane sur sa face supérieure, dans lequel est aménagé au moins un alvéole (2) ouvert sur la surface du support, l'ouverture ayant une superficie supérieure à celle de la zone réactive de la lame et inférieure à celle de la surface de la lame, dans lequel le fond de l'alvéole comprend au moins deux orifices (4) permettant la circulation de fluide(s) dans l'alvéole et le contour de l'ouverture de l'alvéole est muni d'un moyen permettant d'assurer une étanchéité ; - un couvercle fixe (7) muni d'un emplacement (71) permettant la mise en place de la lame, et d'une ouverture (3) ; et - des moyens pour guider le déplacement essentiellement vertical du support (1) mobile vers le couvercle (7) fixe pour permettre de former une chambre d'incubation étanche entre l'alvéole et la lame, lorsque celle-ci est en place, la zone réactive de la lame étant contenue dans ladite chambre d'incubation.
9. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'alvéole présente une forme circulaire ou allongée.
10. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'alvéole possède un volume compris entre 5 et 500 μl.
11. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le moyen permettant d'assurer une étanchéité comprend un joint (5).
12. Dispositif selon la revendication 11, caractérisé en ce que le joint est fait d'un matériau souple, de préférence de latex, de caoutchouc synthétique ou de silicone, et/ou en ce qu'il est de forme plane ou torique.
13. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le support solide est composé de matériau plastique, de métal et/ou de tout matériau rigide résistant aux solutions salines et à une température supérieure ou égale à 37°C.
14. Dispositif selon la revendication 13, caractérisé en ce que le support solide est composé de polymétacrylate, de polyester, de polycarbonate, de nylon (delrin, rilsan) ou d'acier inoxydable, seuls ou en mélanges.
15. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les orifices (4) de l'alvéole ont un diamètre compris entre 0,1 et 3 mm et/ou sont disposés de part et d'autre de l'alvéole, afin de réaliser un balayage.
16. Dispositif selon la revendication 15, caractérisé en ce que l'alvéole comprend deux orifices diamétralement opposés, l'un pour l'entrée des fluides, l'autre pour la sortie des fluides.
17. Dispositif selon la revendication 1 ou 15, caractérisé en ce que l'alvéole comprend trois orifices, l'un pour la sortie des fluides, les deux autres, proches l'un de l'autre, pour l'entrée des liquides et des gaz respectivement.
18. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comporte en outre des moyens pour assurer une alimentation en fluide(s) de la chambre d'incubation.
19. Dispositif selon la revendication 18, caractérisé en ce que les moyens d'alimentation comprennent au moins un réservoir d'alimentation en fluide (8) relié à un premier orifice de l'alvéole, dit orifice d'entrée, par un système de tubulure pour l'introduction de fluide(s) dans l'alvéole, et un réservoir de récupération de fluide (9) relié à un deuxième orifice de l'alvéole, dit orifice de sortie, par un système de tubulure, pour l'élimination des fluides, lesdits systèmes étant connectés à une ou plusieurs pompes (10, 11).
20. Dispositif selon la revendication 19, caractérisé en ce qu'il comporte plusieurs réservoirs d'alimentation en fluides reliés à l'orifice d'entrée, chaque réservoir étant connecté à une vanne (12).
21. Dispositif selon la revendication 19 ou 20, caractérisé en ce que les moyens d'alimentation comprennent une (ou des) vanne(s) trois voies permettant de commuter un circuit d'aspiration directement vers l'un ou l'autre réservoirs d'alimentation en liquides (8) par un circuit auxiliaire.
22. Dispositif caractérisé en ce que le support comporte une pluralité d'alvéoles tels que définis dans l'une quelconque des revendications précédentes.
23. Dispositif selon la revendication 22, caractérisé en ce que chaque alvéole est muni de moyens d'alimentation en fluide et en ce que les unités alvéole-système d'alimentation ainsi constituées sont agencées pour fonctionner en parallèle, en utilisant les même fluides, selon des séquences synchrones ou décalées.
24. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comporte en outre des moyens d'alimentation automatique de lames et, éventuellement, un lecteur d'identifiant de lames.
25. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comporte en outre des moyens de transfert de lame vers un dispositif de lecture de signal.
26. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 24, caractérisé en ce qu'il comporte un dispositif de lecture de signal intégré dans le support et/ou le couvercle.
27. Procédé d'analyse serologique comprenant l'incubation d'une lame de sérologie comprenant une zone réactive comportant une série de dépôts d'agents infectieux, pathogènes, allergènes ou autoantigènes avec un échantillon de sérum d'un patient, ou une dilution de celui-ci, puis la révélation des anticorps de l'échantillon fixés sur les dépôts au moyen de réactifs marqués, caractérisé en ce que l'incubation est réalisée dans un dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 26.
28. Procédé selon la revendication 27, caractérisé en ce que l'échantillon à tester est introduit dans un alvéole avant la mise en place de la lame, puis la lame est appliquée sur la surface du support de manière à former la chambre d'incubation étanche dans laquelle la zone réactive de la lame est au contact de l'échantillon.
29. Procédé selon la revendication 27, caractérisé en ce que l'échantillon à tester est pompé dans la chambre d'incubation formée par la lame mise en place sur l'alvéole.
30. Procédé d'analyse histologique comprenant l'incubation d'une lame d'histologie comprenant une zone réactive comportant un échantillon de tissu d'un patient avec une solution d'anticorps spécifiques, puis la révélation des anticorps de la solution fixés sur l'échantillon au moyen de réactifs marqués, caractérisé en ce que l'incubation est réalisée dans un dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 26.
31. Utilisation d'un dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 26 pour l'analyse serologique ou histologique.
32. Kit comprenant un dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 26.
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