WO2005061001A1

WO2005061001A1 - 癌の抑制方法

Info

Publication number: WO2005061001A1
Application number: PCT/JP2004/019800
Authority: WO
Inventors: Toshihiro Nakajima; Satoshi Yamasaki; Naoko Yagishita
Original assignee: Locomogene, Inc.
Priority date: 2003-12-24
Filing date: 2004-12-24
Publication date: 2005-07-07
Also published as: US20080039409A1; JPWO2005061001A1; CN1909927A; EP1709973A1; KR100809890B1; CA2551543A1; KR20070003798A; AU2004305386A1

Abstract

本発明は、p53癌抑制遺伝子またはp53タンパク質を活性化させて核に局在化させることを特徴とする癌の抑制方法、及びp53癌抑制遺伝子又はp53タンパク質の活性を促進する物質を含む医薬組成物を提供する。

Description

明細書癌の抑制方法技術分野

本発明は、 p53 癌抑制遺伝子または p53 タンパク質を活性化させて p53 タンパク質を核に局在化させる方法に関する。また、本発明は、 p53癌抑制遺伝子又は p53 タンパク質の活性化を促進する物質を含む医薬組成物に関する。背景技術

シノピオリンは、リゥマチ患者由来滑膜細胞で過剰発現している膜タンパク質として発見された新規タンパク質である（WO02/052007) 。そして、遺伝子改変動物を用いた研究により、シノビオリンは関節リゥマチの発症に必須の分子であることが判明した。

タンパク質構造予測システムにより、シノビオリンは RING finger モチーフを有することが示唆されている。このモチーフはタンパク質のュビキチン化に重要な役割を果たす E3ュビキチンライゲースという酵素に多く見出されているが、実際、シオビォリンが E3ュビキチンライゲースの特徴のひとつである自己ュビキチン化活性を有することが証明されている (WO02/052007) 。

ところで、 p53遺伝子は、第 17染色体 pl3に位置しており、癌細胞の発生及び増殖においてきわめて重要な癌抑制遺伝子である。 p53タンパク質は、 DNA 上の特異的塩基配列 [5'-(A/T)GPyPyPy-3')]を認識し、 wafl/cipl、 GADD45, BAX 等の特定の遺伝子の転写活性化を促す。また、（i)その他の多くの遺伝子の転写を抑制すること、（ii)SV40 ラージ T抗原、アデノウィルス EIB タンパク質、ノピローマウィルス E6 などのウィルス性癌遺伝子、あるいは mdm2 等の細胞性癌遺伝子と結合すること、（iii)ミスマッチを含む DNAと特異的に結合すること等の生理機能が知られている。

従って、癌の抑制物質を見出すには、 p53 癌抑制遺伝子又は p53 タンパク質の機能を制御する分子を解析することが重要である発明の開示本発明は、 p53 癌抑制遺伝子または p53 タンパク質の活性化を促進する方法、及び p53癌抑制遺伝子又は p53 タンパク質の活性化を促進する医薬組成物を提供することを目的とする。

本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を行った。そして、シノビォリンホモノックアウト動物を詳細に解析したところ、野生型に比し、ァポトーシスを起こしている細胞が多数観察され、また、アポトーシスの誘導に深く関与している p53 タンパク質が核内に局在し、強く発現していることが判明した。そして、シノビォリンの機能を阻害することにより、 p53癌抑制遺伝子または 53癌抑制タンパク質が活性化されて癌細胞の増殖が阻止されることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は以下の通りである。

(1) p53 癌抑制遺伝子の活性化又は p53 タンパク質の活性を促進する物質を含む医薬組成物。

(2) p53 癌抑制遺伝子又は p53 タンパク質の活性化を促進する物質が、シノビォリンの発現及び/又は機能阻害物質である（1) 記載の医薬組成物。

(3) シノビォリンの発現及び/又は機能阻害物質が、シノビオリンをコ一ドする遺伝子に対する siRNA又は shRNAである（2) 記載の医薬組成物。

(4) シノビオリンをコードする遺伝子が、配列番号 1に示される塩基配列を含むものである（3) 記載の医薬組成物。

(5) siRNA が、配列番号 1に示す塩基配列のうち一部の配列を標的とするものである（3) 記載の医薬組成物。

(6) 癌を治療するための（1) 〜（5) のいずれか 1項に記載の医薬組成物。 ) シノビォリンの発現及び/又は機能を阻害することを特徴とする p53 癌抑制遺伝子又は p53タンパク質の活性化方法。

) シノビォリンの発現及び/又は機能を阻害することを特徴とする p53 タンパク質の核への局在化方法。

) シノビォリンの発現及び/又は機能を阻害して p53 タンパク質を核に局在化させることを特徴とする癌の抑制方法。

0 ) 核に局在化した p53 タンパク質に、さらに放射線照射又は紫外線照射を行うことを特徴とする請求項 9記載の方法。

1 ) 核に局在化した p53 タンパク質を含む細胞に、さらに抗癌剤を接触させ、又は当該細胞の周囲の脈管に塞栓を施すことを特徴とする請求項 9記載の方法。

2 ) シノビオリンの発現及び/又は機能を阻害することを特徴とする、 p53タンパク質のアミノ酸残基の一部をリン酸化する方法。

3 ) アミノ酸残基の一部が、第 1 5番目のセリン残基である（1 2 ) 記載の方法。

4 ) シノビォリンの発現及び/又は機能を阻害することを特徴とする、リン酸化酵素の活性化方法。

5 ) リン酸化酵素が ATM若しくは ATR又はこれらと同様の活性を持つ酵素等である（1 4 ) 記載の方法。

6 ) シノビォリンの発現及び/又は機能を阻害することにより p53 タンパク質を活性化し、活性化された p53 タンパク質により p21 タンパク質の発現を誘導する方法。

7 ) シノビォリンの発現及び/又は機能を阻害して p53 タンパク質に p21タンパク質の発現を誘導させることを特徴とする癌の抑制方法。 8 ) シノビオリンの発現及び/又は機能を阻害することを特徴とする、 p53タンパク質のュビキチン化を阻害する方法。

9 ) シノビォリンの発現阻害が、シノビオリンをコードする遺伝子に対する siRNA又は shHNAによるものである（7 ) 〜（1 8 ) のいずれか 1項に記載の方法。

0 ) シノビォリンの機能阻害が、シノビォリンの p 53 タンパク質への結合機能阻害である（7 ) 〜（1 8 ) のいずれか 1項に記載の方法。 ( 2 1 ) シノビオリンをコードする遺伝子が、配列番号 1に示される塩基配列を含むものである（1 9 ) 記載の方法。

( 2 2 ) siRNA 力配列番号 1に示す塩基配列のうち一部の配列を標的とするものである（1 9 ) 記載の方法。図面の簡単な説明図 1は、シノビォリンホモノックァゥトマウス胎仔線榫芽細胞 (MEFs)における免疫組織染色の結果を示す写真である。

図 2は、 synoチの embryo における抗 p53抗体による免疫組織染色の結果を示す写真である。

図 3は、 p53に関するウェスタンブロッティングの結果を示す写真である。図 4は、 synoチの MEF培養細胞における p53 のリン酸化部位を同定した結果を示す写真である。

図 5は、シノビオリンに対する siRNA処理によって亢進した Serl5のリン酸化がカフエイン添加によりどのように影響するかを調べたウェスタンブ口ッティングの写真である。

図 6は、シノビオリンに対する siRNA処理による、 p53及ぴ p21 の発現が高まることを示すウェスタンプロッティングの写真である。

図 7は、フローサイトメ一ターによる細胞周期の観察結果を示す図である。図 8は、 Tissue array を、抗シノビオリン抗体 (10Da)を用いて免疫染色した結果を示す写真である。

図 9は、 Tissue array を、抗シノビオリン抗体 (10Da)を用いて免疫染色した結果を示す写真である。

図 1 0は、 GFP野生型 p53を導入した細胞における p 53の局在を観察した写真である。

図 1 1は、 GFP野生型 p53及び FLAG野生型シノビオリンを強発現させて、 400 倍希釈一次抗体 a -FLAG 抗体、 200 倍希釈二次抗体 α ·マウス IgG-TRITC又は 1 M DAPIで核を染色し、 p 53 の局在を観察した写真である。

図 1 2は、 GFP野生型 p53及ぴ FLAGシノビオリン C307Sを強発現させて、 400 倍希釈一次抗体 a -FLAG抗体、 200 倍希釈二次抗体ひ -マウス IgG-TRITC又は 1 DAPIで核を染色し、 p 53 の局在を観察した写真である。

図 1 3は、 MBP-Sy no violin dTM-His による GST_p53の in vitroュビキチン化反応を示す写真である。

図 1 4は、シノビォリン RNAiによる RA滑膜細胞での p53 mRNA量を示すグラフである。

図 1 5は、作製した p53 結合ドメイン欠失体の概略図、及び結合アツセィを行った結果を示す図である。

図 1 6は、 p53結合ドメイン欠失体と ³⁵S-p53について GSTプルダウンアツセィを行った結果を示す図である。発明を実施するための最良の形態

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明は、シノビォリンの発現及び/又は機能を阻害して p53 (_P53 癌抑制遺伝子または p53 タンパク質を意味する）を核に局在化及び活性化させることにより、癌を抑制することを特徴とする。本発明は、シノビォリンの発現及び/又は機能を阻害すると、リン酸化酵素により p53 力 Sリン酸ィヒされて p53 が活性化し、そしてサイクリン依存性リン酸化酵素阻害剤である p21の発現が高まり、その結果、癌細胞の G1期から S期への移行が妨げられることにより癌の発生又は増殖を抑制するという知見ならびにシノビオリンがそのュビキチンリガーゼを介して _p53 の発現を抑制するという知見に基づき完成されたものである。

1 . 53の活性化

( 1 ) シノビオリンの発現及び/又は機能の阻害と p53の活性化

正常細胞を紫外線等にさらすと、細胞内の p53 が活性化して、その結果細胞増殖が阻止されることから、 p53の濃度を上昇させることにより、癌細胞の増殖を止めることができる。つまり、 p53が機能しない場合は、癌細胞の増殖が止められず、癌が進行することになる。事実、 p53は正常な個体の細胞にはほとんど見られないが、癌患者由来の細胞の約半数においてはこの p53の欠損変異が起こっている。また、このような変異が起こっていない場合でも、 p53の制御機構に何らかの変異が生じて癌抑制機能が失われている。したがって、癌の進行を抑えるには p53 を有効に機能させることが必要である。 .

本発明においては、 p53の活性化を癌治療の有効な方法の一つとするため、シノビォリンの機能に着目した。そして、シノビオリンホモノックアウト動物を作製し、詳細に解析したところ、野生型に比してアポトーシスを起こしている細胞が多数観察された。すなわち、シノビォリンの機能を阻害すると、アポトーシスに深く関与している p53 の活性化が促進され、シノビオリンの機能阻害が癌抑制につながることを見出した。

ここで、「シノビォリンの発現」とは、シノビオリンをコードする遺伝子の転写及び翻訳が生じること、又はこれらの転写 '翻訳によりシノビオリンタンパク質が生成されることを意味する。また、「シノビォリンの機能」とは、 p53 の活性化を抑制することを意味し、上記シノビォリンの機能には、シノビオリンが p53 と結合する機能および p53 をュビキチン化する機能も含まれる。従って、「シノビォリンの発現及び/又は機能を阻害する」とは、野生型シノビオリン遺伝子又はタンパク質の量、機能又は活性と比較して、その量、機能又は活性を低下又は消失させることをいう。上記「阻害」には、機能と発現の両者を阻害すること、及びどちらか一方を阻害することのいずれも含まれる。

シノビオリンは p 53 のュビキチン化を促進するため、シノビォリンと p 53 との結合を阻害することにより、 p 53 のュビキチン化を阻害することができ、 p 53 のュビキチン化を阻害すれば、 p 53 は活性化され、ひいては癌の抑制につながるといえる。

なお、アポトーシスとは、細胞が自ら引き起こすプログラムされた細胞死を意味し、細胞核の染色体凝集、細胞核の断片化、細胞表面微絨毛の消失、細胞質の凝集、カスパーゼの活性化、ミトコンドリア膜電位の消失等を特徴とする。細胞に上記特徴が生じたときに、アポトーシスが引き起こされたと判断する。

本発明において、胎児胚における p53 の免疫染色を行うと、シノビオリンホモノックアウトマウス胎児胚では全身において p53 が強く発現する。また、シノビオリンホモノックアウトマウス胎児胚から単離した胎仔線維芽細胞（MEFs) も、野生型から単離したものに比して強く発現しており、しかも p53 は核内に強く局在する。この核局在は野生型ではまったく観察されない。また、シノビォリンと p53 を強発現させると、 p53 は細胞質内にシノビォリンと共局在する。このことは、シノビォリンの発現及び/又は機能を阻害することにより、 p53を核内へ移行させることができることを意味する。さらに、シノビオリンホモノックアウトマウス胎仔 MEFs では、高い放射線感受性又は紫外線感受性を示す。従って、本発明において、癌細胞中のシノビォリンの発現及び/又は機能を阻害して p53 を癌細胞の核に移行させた後に、 p 53 に対して放射線照射又は紫外線照射を行うと、癌細胞の増殖を効果的に抑制することができる。放射線照射手段は、特に限定されるものではないが、例えば γ線を 1〜： LOG y照射することができる。また、紫外線照射は、紫外線（波長 100〜400 nm、好ましくは 290〜400 nm) を、適当な紫外線照射装置（フナコシ社、デルマレイ社、キーエンス社製等）を用いて照射することができる。

さらに、本発明は、核に局在化した p53 を含む細胞（特に癌細胞）に、さらに抗癌剤を接触させることにより、効率良く癌を抑制することが可能である。あるいは、上記核に局在化した p53 を含む癌細胞の周囲の脈管（例えば血管又はリンパ管）に塞栓を施すことで、癌を抑制することもできる。

「抗癌剤」には、アルキル化剤、代謝拮抗薬、微小管阻害薬、白金錯化合物、分子標的治療薬などが含まれる。これらの抗癌剤の具体例として以下のものを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。

くアルキル化剤 >

マスタード系：シクロホスファミド（ェンドキサン) 、メルファラン等アジリジン系：チォテパ等

アルキルスルホン系：ブスルファン等ニトロソ尿素系： -ムスチン、口ムスチン等

ぐ代謝拮抗薬 >

葉酸誘導体：メトトレキセ一ト等

プリン誘導体：メルカブトプリン、ァザチォプリン等

ピリミジン誘導体： 5ーフノレオ口ゥラシル、テガフール、カルモフール等

く微小管阻害薬 >

ビン力アル力ロイド：ビンクリスチン、ビンブラスチン等

タキサン：パクリタキセル、ドセタキセル等

くホルモン類似薬〉

タモキシフェン、エストロゲン等

<白金錯化合物 >

シスプラチン、カルポプラチン等

ぐ分子標的治療薬 >

イマ二チブ、リツキシマブ、ゲフィ二チブ等抗癌剤を癌細胞に接触させるための方法は、 P 53 が核に局在化した細胞が含まれる細胞又は組織（癌細胞又は癌組織）に、抗癌剤を添加する方法、あるいは担癌患者又は担癌動物に抗癌剤を投与する方法などが採用される。この場合の抗癌剤の処理量は、特に限定されるものではないが、添加する場合には 100 ρΜ〜100 Μ、好ましくは 1 ηΜ〜10 μ Μである。動物体内に投与するときは、例えば抗癌剤としてエンドキサンを使用するときは、 0.1 〜： LOO mg/kg/day、好ましくは 2〜25 mg/kg/dayである。エンドキサン以外の抗癌剤についても、当業者は投与量又は添加量を適宜設定することができる。

核に局在化した p53 を含む癌細胞の周囲の脈管に塞栓を施すには、 p 53 が核に局在化した癌細胞が含まれる細胞集団又は組織の周囲の血管に血栓を ' 形成させてもよく、血管又はリンパ管については脂肪による塞栓、空気ゃガスによる塞栓を形成させてもよレ、。 ( 2 ) シノビォリンの発現及び/又は機能阻害による p53 のリン酸化促進と活性化

さらに、本発明においては、 p53のアミノ酸残基の一部をリン酸化することにより p53 を活性化させることを特徴とする。 p53 の活性化につながるリン酸化の対象となるアミノ酸残基は、 p53のアミノ酸配列のうちセリン残基であることが好ましく、第 15番目のセリン残基 (Serl5)がさらに好ましレ、。

P53 の Serl5 がリン酸化されると、 p53 の発現が高まり、転写活性が亢進し、その結果転写産物が増加する。この p53 の Serl5 のリン酸化には、 ATM (ataxia-telangiectasia mutated)、 ATR(ataxia-teiangiectasia related)、等のリン酸化酵素が深く関与している。 ATM は、ヒトの常染色体性劣性遺伝疾患である毛細血管拡張性運動失調症の原因タンパク質であり、 DNA の損傷を感知して癌抑制遺伝子 p53 をリン酸化することで細胞の増殖をコントロールする機能を有する。 ATRは、 ATMのファミリーの一つであるが、広範囲にわたる化学療法薬、紫外線の照射、あるいはタンパクリン酸化酵素の抑制により誘導され、かつ、 ATMが関与しない p53の活性化に関与するリン酸化酵素である。

ATM 及び ATR は、カフエインによりその機能が阻害されることが知られているが、本発明においては、シノビォリンの発現及び/又は機能の阻害実験にカフェインを用いることにより、シノピオリンが ATM及び ATR活性化を調節していることが判明した。

すなわち、カフェイン非存在下において、シノビォリンの発現及び/又は機能を阻害すると p53 が活性化される。一方、カフェイン存在下でシノビォリンの発現及び/又は機能を阻害すると、 p₅₃ の活性化は抑制される。また、カフェインにより ATM及び ATR の活性（_P53 のリン酸化）が阻害されることは知られている。

カフェインにより ATM及ぴ ATRの活性を阻害することにより、シノビォリンの発現及び/又は機能を阻害しても p53 は活性化されないことから、シノビオリンの発現及び/又は機能を阻害すると、 ATM及ぴ ATR が活性化されて p53 の活性化を誘導するというメカニズムが考えられる。そうすると、シノビォリンの発現及び/又は機能を阻害することによりこれらのリン酸化酵素活性が高められるといえる。従って、本発明は、シノビォリンの発現及び/又は機能を阻害することにより、リン酸化酵素の活性化を促進することを特徴とする。 ATM及び ATR と同様の活性を有する酵素等（P53 をリン酸化する酵素等）は、 DNA-PK又は GSK3 j3等でも良い。

p53 の Serl5 がリン酸化されることにより発現が誘導される物質としては、 p21 というタンパク質が知られている。 p21は、サイクリン依存性リン酸化酵素（CDK) 活性の阻害剤として機能し、 CDK活性を阻害することにより、細胞周期の調節を担うタンパク質である。 CDK は、細胞周期の抑制の要となり、そのパートナーであるサイクリンタンパク質と共に機能し、例えば、細胞の休止状態である G1期から DNA の複製期である S期へのスムーズな移行を司る。癌細胞において、 p53 が活性化されると、 CDK 阻害剤である p21の発現が高まるため、癌細胞の G1期から S期への移行が妨げられることにより癌が抑制される。従って、本発明は、上記のように、シノビォリンの発現及び/又は機能を阻害させることにより、 p53 の活性化を高めて p21の発現を誘導させ、 CDKの阻害を起こすことにより癌を抑制することを特徴とする。

( 3 ) p53のュビキチン化の阻害と安定化

シノビオリンは、 p53をュビキチン化する。ュビキチン化とは、タンパク質の分解マーカー分子であるュビキチンによるタンパク質の翻訳後の修飾反応をいう。このュビキチン化の生理的意義は、プロテオソーム系のタンパク質分解機構へ送られるためのタグ修飾として、従来認識されていた。そして、その後の研究により、現時点でのュビキチン化の意義は、タンパク質機能を制御する可逆的タンパク質修飾システムとして位置づけられている。

ュビキチン化は、具体的には、ュビキチン活性化酵素（E1) 、ュビキチン結合酵素（E2) およびュビキチンリガーゼ（E3) などの酵素が協同したカスケ一ド反応を繰り返すことにより、基質となるタンパク質にュビキチン分子を枝状に結合させてポリュビキチン鎖を形成する過程をいう。このポリュビキチン鎖は、ュビキチン分子内の 4 8番目のリシン残基の ε -ァミノ基を介して形成され、 26Sプロテアソームへの分解シグナルとなり、標的タンパク質を分解に導く。 .

本発明は、シノビォリンの発現及び/又は機能を阻害することにより p53 を活性化させることを特徴とし、このような p53 の活性化は、上記 p53 のリン酸化機構とは別に、 p53 のュビキチン化が阻害されるという機構に着目したものである。

( 4 ) シノビォリンと p53の結合部位の決定

シノビォリンの p53 結合ドメインは、例えば、シノビォリンのアミノ酸配列のうち、ある領域を欠失させた、 p53結合ドメイン欠失体を数種類作製して、 ³⁵S-p53 について GST ブルダゥンアツセィを行うことにより決定することができる。具体的には、上記のシノビォリンの p53 結合ドメイン欠失体を GST-融合タンパク質として大腸菌等で発現させて、 ³⁵S-p53 タンパク質とのタンパク質-タンパク質間結合を GSTプルダウンアツセィ法により確認する。

これにより、シノビオリンにおける p53 結合ドメインは、シノビオリンタンパク質に含まれるアミノ酸配列（配列番号 2 ) の第 236 から 270番目までの 35ァミノ酸残基であることが判明した。

前記の通り、シノビオリンは p 53 のュビキチン化を促進する。従って、シノビオリンの機能の一つである p 53 への結合機能を阻害することにより、 p 53 のュビキチン化が阻害され、 p 53 が活性化される。 ρ 53 'との結合に関与するシノビオリンタンパク質の領域は、好ましくはシノビオリンのアミノ酸配列の第 236 から 270番目の領域である。従って、主に上記領域を、結合阻害のための標的領域として選択することが好ましい。シノビオリンと ρ 53 との結合を阻害するためには、例えばシノビオリンに対するアンタゴ二スト（低分子化合物、ペプチド等）を作用させ、バインディングアツセィ、イーストツーハイブリッド法又はュビキチン化活性測定法により評価することができる。あるいは、シノビォリンの上記第 236 から 270番目の領域を認識する抗体をシノビオリンと反応させることもでき、これらの方法により、シノビオリンと ρ 53との結合が阻害される。 2 . シノピオリン発現及び/又は機能阻害並びに活性阻害

p53 を活性化するためには、シノビォリンの発現及び/又は機能を阻害する方法が採用される。

シノビオリンの発現及び/又は機能阻害には、特に限定されるものではないが、例えば RNA干渉（RNAi) を利用することができる。シノビオリン遺伝子に対する siRNA(small -interfering RNA)を設計及ぴ合成し、これを細胞内に導入させることによって、 RNAiを引き起こすことができる。

RNAi とは、 dsRNA(double -strand RNA)が標的遺伝子に特異的かつ選択的に結合し、当該標的遺伝子を切断することによりその発現を効率よく阻害する現象である。例えば、 dsRNA を細胞内に導入すると、その； NA と相同配列の遺伝子の発現が抑制 (ノックダウン) される。

siRNAの設計は、以下の通り行なうことができる。

(a) シノビオリンをコ一ドする遺伝子であれば特に限定されるものではなく、任意の領域を全て候補にすることが可能である。例えば、ヒトの場合では、 GenBank Accession number AB024690 (配列番号 1 ) の任意の領域を候補にすることができる。

(b) 選択した領域から、 AAで始まる配列を選択し、その配列の長さは 19 〜25塩基、好ましくは 19〜21塩基である。その配列の GC含量は、例えば 40〜60%となるものを選択するとよい。具体的には、配列番号 1に示される塩基配列のうち、以下の塩基配列から選ばれる少なくとも 1つの配列を含む DNA を siRNA の標的配列として使用することができる。特に、（i) (配列番号 3 ) 、 (ii) (配列番号 4 ) 、 (vi) (配列番号 8 ) 、 (vii) (配列番号 9 ) 、 (viii) (配列番号 10) を標的とすることが好ましい。

(i) AA TGTCTGCATCATCTGCCGA GA (配列番号 3 )

(ii) AA GCTGTGACAGATGCCATCA TG (配列番号 4 )

(iii) AA AGCTGTGACAGATGCCATC AT (配列番号 5 )

(iv) AA GAAAGCTGTGACAGATGCC AT (配列番号 6 )

(v) AA GGTTCTGCTGTACATGGCC TT (配列番号 7 )

(vi) AA CAAGGCTGTGTACATGCTC TA (配列番号 8 )

(vii) AA ATGTTTCCACTGGCTGGCT GA (配列番号 9 ) (viii) AA GGTGTTCTTTGGGCAACTG AG (配列番号 1 0 )

(ix) AA CATCCACACACTGCTGGAC GC (配列番号 1 1 )

(x) AA CACCCTGTATCCAGATGCC AC (配歹 IJ番号 1 2 )

(xi) AA GGTGCACACCTTCCCACTC TT (配歹 IJ番号 1 3 )

(xii) AA TGTTTCCACTGGCTGGCTG AG (配列番号 1 4 )

(xiii) AA GAGACTGCCCTGCAACCAC AT (配歹 U番号 1 5 )

(xiv) AA CGTTCCTGGTACGCCGTCA CA (配列番号 1 6 )

siRNAを細胞に導入するには、 in vitroで合成した siRNAをプラスミド DNA に連結してこれを細胞に導入する方法、 2本の RNA をァニールする方法などを採用することができる。

また、本発明は、 RNAi効果をもたらすために shRNAを使用することもできる。 shRNA とは、ショートヘアピン： RNA(short hairpin RNA)と呼ばれ、一本鎖の一部の領域が他の領域と相補鎖を形成するためにステムループ構造を有する RNA分子である。

shRNA は、その一部がステムループを構造を形成するように設計することができる。例えば、ある領域の配列を配列 A とし、配列 Aに対する相補鎖を配列 B とすると、配列 A、スぺーサ一、配列 Bの順になるようにこれらの配列が一本の RNA鎖に存在するようにし、全体で 45〜60塩基の長さとなるように設計する。配列 A は、標的となるシノビオリン遺伝子（配列番号 1 ) の一部の領域の配列であり、標的領域は特に限定されるものではなく、任意の領域を候補にすることが可能である。そして配列 Aの長さは 19 〜25塩基、好ましくは 19〜21塩基である。

3 . 医薬組成物

本発明において作製された shRNA、 siRNAは、シノビォリンの発現及ぴ /又は機能を阻害する物質であり、 p53 を活性化させる医薬組成物（特に癌の遺伝子治療剤）として使用することができる。

本発明の医薬組成物を癌の遺伝子治療剤として使用する場合は、適用部位は特に限定されず、脳腫瘍、舌癌、咽頭癌、肺癌、乳癌、食道癌、胃癌、瞵臓癌、胆道癌、胆嚢癌、十二指腸癌、大腸癌、肝癌、子宫癌、卵巣癌、前立腺癌、腎癌、膀胱癌、横紋筋肉腫、'線維肉腫、骨肉腫、軟骨肉腫、皮膚癌、各種白血病（例えば急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、成人型 T 細胞白血病、悪性リンパ腫）、等を対象として適用される。上記癌は、原発巣であっても、転移したものであつても、他の疾患と併発したものであってもよい。

本発明の医薬組成物を遺伝子治療剤として使用する場合は、本発明の医薬組成物を注射により直接投与する方法のほか、核酸が組込まれたベクターを投与する方法が挙げられる。上記べクターとしては、アデノウィルスべクター、アデノ随伴ウィルスべクター、へノレぺスゥイノレスベクター、ワクシニァウィルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウィルスベクター等が挙げられ、これらのウィルスベクターを用いることにより効率よく投与することができる。

また、本発明の医薬組成物をリボソームなどのリン脂質小胞体に導入し、その小胞体を投与することも可能である。 siRNAや shRNA を保持させた小胞体をリボフヱクシヨン法により所定の細胞に導入する。そして、得られる細胞を例えば静脈内、動脈内等に全身投与する。脳等に局所投与することもできる。

本発明の医薬組成物の投与量は、年齢、性別、症状、投与経路、投与回数、剤型によって異なるが、例えばアデノウイルスの場合の投与量は 1 日 1 回あたり 10⁶〜10i³個程度であり、 1週〜 8週間隔で投与される。

siRNA 又は shRNA を目的の組織又は器官に導入するために、市販の遺伝子導入キット（例えばアデノエクスプレス：クローンテック社）を用いることもできる。

以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

〔実施例 1〕 MEF培養細胞における p53の活性化の検討

シノビオリンホモノックアウトマウス（syno-/-) 胎児線維芽細胞 (MEFs) における p53 をウェスタンプロッティングにより検出し、さらに細胞を免疫組織染色により確認した。すなわち、免疫染色法は、 MEFs を常法に従いスライドガラス上に固定し、抗 p53抗体（マウスモノクローナル抗体 BD： Becton, Dickinson社）を用いて免疫染色を行った。 3% 牛血清アルブミン（BSA) で 30 分ブロッキングを行った標本に、 0.3°/。BSAで希釈した抗 p53抗体（BD： 10pg/ml) を室温で 60分免疫反応させた。反応後の標本を PBSで洗浄後、 TRITC標識抗マウス IgG抗体（Dako社）を 2次抗体として免疫反応させた。抗 p53 抗体に免疫反応する抗原の確認は、蛍光顕微鏡で行った。

その結果、野生型に比し、 syno-Λの MEF培養細胞では p53 の活性化を起こしている細胞が多数確認された（図 1、「MEF-/-」のパネル）。

〔実施例 2〕 syno-/_マウスにおける p53活性化の検討

syno-/-マウスにおける p53活性化の検討を、 embryoを用い免疫染色により行った。

すなわち、 synoチの胎仔における免疫染色は、常法に従い組織をスライドガラス上に固定し、ベクタスティン ABC キット（VECTOR社）を用いて行った。ブロッキング試薬で 30分ブロッキングした標本に対して、 5pg/ml に希釈した抗 p53抗体 FL393を室温で 60分間免疫反応させた。反応後の標本を PBSで洗浄し、 HRP標識抗ゥサギ IgG抗体を 2次抗体として免疫反応させた。抗 p53 抗体に免疫反応する抗原は、 HRP 活性に基づく 3,3'- ジァミノべンジジン四塩酸塩の発色により確認した。対比染色としてメチルグリーン染色を行った。

この結果、 syno- の embryo における p53 が活性化していることが確認された（図 2 ) 。〔実施例 3〕 p53に対するシノビォリンの効果

syno-/-の MEF培養細胞における p53 をウェスタンブロッテイングにより検出した。

すなわち、各種細胞を細胞破砕液（50 mM Tris-HCl (pH8.0) 、 150 mM NaCl、 1% NP40、 1 mM PMSF、 0.1%sodium dodecyl sulfate (SDS) 、 2 g/ml Leupeptin、 2 g/ml Aprotinin、 2pg/ml Pepstatin) を用いて細胞破砕画分を調製した。その後、 SDS ポリアクリルアミド電気泳動（SDS-PAGE) により細胞破砕画分を分離した。 SDS-PAGE 後、細胞由来タンパク質は、エレクト口プロッティング法によりニトロセルロース (NC) 膜に転写した。この NC膜に対し、 5%スキムミルクを加えた ris buffered saline (TBS) で室温、 1時間ブロッキングした後、抗 p53抗体 c- terminal aa;195.393または FL393を 5%スキムミルクを加えた TBSで希釈して室温、 1時間免疫反応させた。反応後の NC膜を 0.1% Tween20/TBS で洗浄し、 horse radish peroxidase (HRP) 標識抗ゥサギ IgG抗体を 2次抗体として室温、 1 時間免疫反応させ、 0.1% Tween20/TBS で洗浄し、 HRP活性を検出することにより目的抗原を検出した。 HRP活性の検出には ECL キット（Amersham 社）を用いた（Clinical Chemistry. 25, pl531, 1979) 。

その結果、ウェスタンブロッテイングにより syno-/-の MEF培養細胞における p53発現量が増加していることが確認された（図 3 ) 。

〔実施例 4〕 syno- の MEF培養細胞における p53 のリン酸化部位の同定

本実施例においては、抗 p53 抗体を用いたウェスタンブロッテイングにより p53のリン酸化部位の同定を行った。

すなわち、 p53 (配列番号 1 7 ) の異なるセリン残基のリン酸化を認識する 4 種の抗リン酸化 p53 モノクローナル抗体 (Phospho-p53(serl5) 、 Phospho-p53(ser20) 、 Phospho-p53(ser37)および Phospho-p53(ser46) ； Becton, Dickinson社）を用いて、 MEF細胞の蛋白質を SDS'PAGE で分離し、ウェスタンプロッティング法を行った。ウェスタンブロッテイング法の操作は、一次抗体として抗リン酸化 p53 モノクローナル抗体を、そして標識抗体として抗マウス IgG ヒッジ -HHP を用いる他は実施例 3 に記載のとおりである。

その結果、 syno-/-の MEF培養細胞において、 p53のアミノ酸配列（配列番号 1 7 ) 中、第 15番目のセリン残基のリン酸化が顕著であった（図 4 ) 。図 4において、左上のパネルが、第 15番目のセリン残基がリン酸化された 2004/019800 ものである。 53 kDa付近のバンドが顕著に濃く表れている。

〔実施例 5〕 Serl5のリン酸化亢進のメカニズムの解明

細胞株として野生型の p53 を発現していることが確認されている RKO (ヒト大腸がん由来細胞株）を 60 mmプレートに l.OxlO⁵細胞/プレート 12 mL で細胞を播種し、 Oligofectamineを用いて GFPおよぴシノビォリンに対する siRNA をトランスフエクトした後、 72時間後に Serl5 のリン酸化に重要な ATM(ataxia-telangiectasia mutated)および ATR(ATM and Rad3 related)の阻害剤であるカフェイン（10 mM)を添加し、リン酸化 Serl5-p53 に対する抗体 Phospho-p53(serl5)を用いてウェスタンプロッティングを行った。

その結果、シノビオリンに対する siRNA によって亢進した Serl5 のリン酸化はカフェイン添加（添加後 12時間、 24時間）により、完全に阻害された（図 5 ) 。よって、シノビオリンは通常、 ATM および ATR の機能を阻害することで、 p53の抑制をしていることが示された。

〔実施例 6〕 p53 により誘導される p21 の発現にシノビォリンが及ぼす影響

RKO細胞をシノビオリンに対する siRNA処理し、 p53の転写産物である p21の発現の変化をウェスタンプロッティングで検討した。

すなわち、抗 p21ポリクローナル抗体（Santa Cruz社）を用いて、細胞株として野生型の p53 を発現していることが確認されている RKO (ヒト大腸がん由来細胞株）を 60 mmプレートに l.OxlO⁵細胞/プレート /2 mL で細胞を播種し、 Oligofectamine を用いて GFP およぴシノビォリンに対する siRNA をトランスフエクトした後、 72時間後の蛋白質を SDS-PAGE で分離し、ウェスタンブロッテイング法を行った。ウェスタンブロッテイング法の操作は、一次抗体として抗 p21 ポリクローナル抗体を、そして標識抗体として抗マウス IgG ヒッジ -HHP を用いる他は実施例 3 に記載のとおりでめる。

その結果、シノビオリンに対する siRNA処理によって、 p53の発現が高まると同時に、 p21 の発現も増加した。この効果は 72時間で明確に示された（図 6 ) 。

〔実施例 7〕シノビオリン発現阻害による p53 関連タンパク質の発現、細胞周期への影響等の検討

本実施例においては、滑膜細胞におけるシノビオリンを、 RNAi効果により阻害した際の p53 関連タンパク質の発現、細胞周期への影響の検討を行った。

RA滑膜細胞を 10 cmディッシュに 9.0xl0⁴細胞で播種し、シノビォリン siRNA (最終濃度 25 nM) をトランスフエタトした後、フローサイトメ一ターにより細胞周期を観察した。その結果、 siRNA 25 nM(No.589)では、 G0/G1期における細胞周期の遅延が見られた（図 7 ) 。

siRNAとしては h589を用いた。

なお、 h589 とは、以下のセンス鎖及びアンチセンス鎖ををァニールさせた 2本鎖 RNAを意味する。

センス鎖 h589： GGU GUU CUU UGG GCA ACU G TT (配列番号 1 8 )

アンチセンス鎖 h 589： CAG UUG CCC AAA GAA CAC C TT (配列番号 1 9 )

〔実施例 8〕癌組織におけるシノピオリンの発現の検討

Tissue array (CHEMICON 个土： 10 common human cancer tissue with normal human tissue)を、抗シノビオリン抗体 (10Da)を用いて免疫染色した。

免疫染色に使用した抗体濃度は 8 IX g/ml であり、使用したキットはシンプルスティン MAX (M)である。

その結果、正常組織でのシノビォリンの発現は、大腸、腎、肺、卵巣、精巣、皮膚及ぴ乳腺で認められたのに対し、神経及ぴリンパ節では認められなかった。また、各腫瘍組織においてシノビォリンの発現が確認され、特に、発現が明らかに亢進していると判断された組織は、神経 · リンパ節であった (図 8及び図 9 ) 。

〔実施例 9〕培養細胞中でシノビオリン及ぴ p53 を共発現させた場合の各々の局在への影響

3種類のプラスミド、 GFP-p53、 FLAG -synoviolin , および FLAG- synoviolin C307S (ュビキチン（Ub) 化活性なし）を Saos 2細胞に導入した。各プラスミドは、以下の通りである。

GFP-p53： Green fluorescence protein と野生型 53 のフューンョン蛋白発現

FLAG- synoviolin： FLAGタグっき野生型シノビオリン発現

FLAG-synoviolin C307S (ュビキチン（Ub) 化活性なし）： FLAG タグつき失活型シノビオリン発現 fuGENEG (Roche)によるトランスフエクション処理して 24 時間後に 10%ホルマリンで固定し、 400 倍希釈一次抗体 a -FLAG抗体、 200 倍希釈二次抗体 α -mouse IgG-TRITC、 1 M DAPIで核を染色して、その局在を観察した。

その結果、野生型 p53 は強発現させると核に局在することが観察された (図 1 0 ) 。野生型シノビオリンは強発現すると細胞質（特に核周辺）に局在した。また、野生型 p53 と野生型シノビオリンを強発現させると、本来核に局在する p53 が核周辺に細かいドット状に分布し、シノビォリンと共局在していることが観察された（図 1 1 ) 。野生型 p53 とシノビオリン C307S mutantを強発現させると、 p53が細胞質内に大きなドットを形成し、シノビォリンと共局在していることが観察された（図 1 2 ) 。

以上のことから、シノビォリンと p53 は一定条件下で共局在することが示された。ュビキチン化活性の有無でその局在の形態が変化することが考えられる。

〔実施例 1 0〕 MBP- Synoviolin dam-His による GST-p53 の in vitroュビキチン化の検討シノビォリンの細胞内における増減により p53 の細胞内タンパク質量の変動が観察されており、シノビォリンによる p53 の制御が示唆されている。そこで、シノビォリンが直接 p53 をュビキチン化（Ub) するか否かを調べるために、 GST-p53および MBP-Synoviolin dTM-Hisを用いて in vitro Ub 化反応の検討を行った。

GST-p53： N末端側に GSTを融合させた p 53を大腸菌内で発現させ、それを生成して得た画分。

MBP-Synoviolin dTM-His： N末端側に MBP， C末端側に Hisタグを融合させたシノビオリンを大腸菌内で発現させ、それを精製して得た画分。 pGEX/_P53を保持した大腸菌 (BL21)を 500mlの LB培地で培養し、 IPTG による誘導後（1 mM、 30°C、 6h)、培養液より 0.5% NP-40を含む緩衝液を用いて大腸菌抽出液を調製した。

大腸菌抽出液より GST-p53を GSH-セファロース樹脂を用いて 0.1% NP- 40存在下で精製した。その透析後の試料を用いて、 MBP-Synoviolin dTM- Hisおよび他の in vitro Ub化反応に用いる組成物（ATP、 PK-His-HA_Ub、 yeast El、 His-UbcH5c) を組み合わせて反応を行った（図 1 3 ) 。反応後、タンパク質を 7.5% SDS-PAGE により分離し、 PVDF 膜上に転写して抗 p53抗体 (FL393あるいは DO-1)により膜上の p53タンパク質を検出した。また、 GST-p53の添加量を変化させて同様の反応および検出を行った。

その結果、 GST-p53精製画分おょぴ MBP-Synoviolin dTM- Hisを含む全ての組成物を添加した場合に、約 90kDaの位置を中心として p53由来のラダー状のシグナルが観察された（図 1 3 ) 。また、それらのシグナルは、 GST-p53 の添加量に依存して増強した。これらの結果から、シノビオリンが直接 p53 のュビキチン化に関与していると言える。従って、シノビオリンの発現及び/又は機能を阻害することにより、 p53 のュビキチン化を抑制できることが示された。

〔実施例 1 1〕 RNAi 下におけるシノビオリン、 p53 mRNA 量の検討本実施例では、シノビオリン RNAi 条件下において、シノビオリン及ぴ関連遺伝子について、経時的に mRNA量の変化を検討することでシノビォリンが細胞周期、アポトーシスなどへ及ぼす影響を検討した。

RA滑膜細胞を 30000cells/10cmディッシュで播種し、定法に従い 25nM siRNA (No. 589) をトランスフエクシヨンし、細胞培養 4 日間の間、経時的に細胞を回収し、 mRNA を得た。 l ^ g の mRNA をテンプレートとし、ランダムプライマーを用いて逆転写 PCR を行い、 cDNA を得た。得られた cDNAについて、 ABI TaqMan Gene expression assay (GEX)を用いて、定量を行った。対照遺伝子を 18S rRNAとして mRNA量を算出した。

GEX 試薬ターゲットアツセィ No. (アツセィ ID) は、シノビォリンが Hs00381211一 ml、 TP53 Hs00153340_mlである。

その結果、シノビオリン siRNA存在下では、シノビオリン mRNA 量が減少するが、 p53 の mRNA 量は変化していないことが確認された（図 1 4 ) 。

〔実施例 1 2〕シノビォリンの p53結合ドメインの決定

GST-Sy no violinと p53が In vitro プルダウンアツセィで結合し、それにはシノビオリンタンパク質のアミノ酸配列（配列番号 2 ) の第 236 から 270番目までの 35アミノ酸残基が必要十分である。

そこで、本実施例では、さらに、シノビォリンが p53 に結合するために必要なドメインを同定するために、図 1 5に示すように、シノビォリンの p53 結合ドメイン欠失体を作製して、 ³⁵S-p53 について以下の通り GST プルダウンアツセィを行った（図 1 6 ) 。

100 Lの Competent cell (BL-21株）を： Lの各 GSTタンパク質をコードしたプラスミドで形質転換した。各 GST タンパク質とプラスミドの名前は以下のとおりであった。

GSTタンパク質：プラスミド

GST： pGEX-6P-l (Pharmacia Biotech)

GST-SynoATM 236-617： pGEX-5-1 1 SATM GST-SynoATM 236-270： p6'3

GST-SynoATM 271.617： pST490

4 mLの LB-Amp+に接種し、 37°Cでー晚培養した。翌日 Pre-culture の OD600を測定し、 15 mlの LB'Amp+に OD600=3.0相当を接種した（終濃度 0.2) 。 25°C恒温槽で約 2 hr培養し、 OD600=0.6~0.8 になったことを確認した後、恒温槽に氷を加えて 20°Cに冷却し、培養容器を 10 分つけて 20 °Cまで冷却した。 0.1M IPTG を 15 z L (終濃度 = 0.1 mM、通常の 1/1000) 、 1 mM ZnCl₂を 150 ^ L (終濃度 =10 μ Μ) 加えて、 20°Cで 4 hr 震盪培養し GST タンパク質の発現を誘導した。誘導後、遠心して細胞を回収した（5000 rpm、 5 min、 4°C) 。 1 ml PBS (-)に細胞を再懸濁し、エツぺンドルフチューブに移し、細胞を回収した（14000 rpm、 1 min、 4°C) 。上清を全て吸い取った後、 500 / Lの PBS(-) / Z (PBS (-) / 10 / M ZnCl₂) に再懸濁し、液体窒素で凍結、 _ 20°Cで保存した。翌日一 20°Cのサンプルを 37°Cの恒温槽に 10 minつけて融かし、次に氷水中につけて 0°Cまで冷却した。以下のプロテアーゼ阻害剤を混合し、 1 サンプルあたり 6.5 ^ L加えた。

100 mM PMSF (Final 1 mM) 20 μΐ

Aprotinin (Final 0.1%) 2 μΐ

0.5 mg /ml PepstatinA (Final 0.5 μg/Ώll) 2 μΐ

1 mg I ml Leupeptin (Final 1 g/ml) 2 μΐ 各サンプルを超音波破砕した（Power Level 7、 15秒、 3回）。一回ごとに氷水中に 3 0秒つけて冷却した。次に 500 の 2 X GST Buffer I Z (2% TritonX- 100, 720 mM NaCl、 1 x PBS( -)、 10 At M ZnCl₂、 10 mM β -Mercaptoethaol, 2 mM PMSF, 0.1%aprotinin) を加え混合後、さらに超音波破砕した（Power Level 7、 15 秒、 1 回）。破砕した液を 14000rpm 30min 4°Cで遠心した。この間に 1mlの 1 x PBS (-)で 200 μ Lの 80% -slurry Glutathione Sepharose ビーズを 3 回洗い、 lGO ^ L の 1 x PBS (-)を加え、 50%-slurry に調整した。遠心後の上清 1 ml に 80 z L の 50%-slurry Glutathione Sepharose ビーズを加え、 4°Cで 2 hr Rotationして GST タンパク質をビーズに結合させた。 1 mL の 1 X GST-Buffer I Z ( 1% TritonX-100, 360 mM NaCl、 0.5 x PBS ( 、 5 z M ZnCl₂、 5 mM j3 -mercaptoet anol, 1 mM PMSF、 0.05% aprotinin) で 4 回ビーズを洗った。遠心は 2000rpm、 lmin、 4°Cで行った。残った上清を全てきれいに吸いとつた後、 60 Lの 1 X GST-Buffe r / Zを加え、合計 lOO ^ Lにした。このうち 10 / L を等量の 2 X SDS Sample Buffer と混ぜ、 100°C、 5 min、ヒートブロックで熱し、ずつ 10%ゲルに Apply した。同時に 0.25〜4 /i gの BSAも Apply した。泳動（150 V 50 min) 、 CBB染色（未使用のもので 30 min) 、脱色（1 hr を 2 回）、グリセロール水（30~60 min) 、（ゲル乾（80° ( 、 1 hr) して、 GST タンパク質の発現、回収効率をチェックした。翌日、 35S-p53 の In vitro Translationを行った。まず、以下の試薬を混合した。

TNT Reticulocyte Lysate (-80°C) 25 μ L

TNT Reticulocyte Buffer (-80°C) 2 μ L

Amino Acids Mixture (-Met) (-80°C) 1 i L

DEPC-treated Water 15

RNase Inhibitor (培養室- 20° C)

TNT polymerase (培養室- 20° C) 1 / L

^{3 5} S-Met 4 z L

Plasmid (υ53 · ΗΑ) 1 u L

Total 50 /i L

30°C恒温槽で 1.5~2.5 hr保温し、 In vitro Translation した。この間に G-25カラムのふたを緩めて軽く遠心（2500 rpm、 1 min, 4°C) し、 100 μ Lの Pull-down Buffer V (20 mM HEPES pH 7.9、 150 mM NaCl、 0.2% Triton X- 100) を乗せてさらに遠心し、カラムを洗った。このカラムに In vitro Translation 溶液を 50 全量乗せて遠心した（2500rpm、 lmin、 4°C) 。さらに 200 ;u L の Pull-down Buffer V を乗せて、再度遠心した (2500rpm lmin、 4°C) 。これを In vitro Translation Product (IvTL) として用いた。そのうち 4 /z L を、 16 z L の Milli-Q、 20 μ L の 2 x SDS Buffer と混ぜ、 On put 10%とした。 30 z g の GST タンパクが結合したビーズを含んだ 1 mlの Pull-down Buffer Vに 120 Lの IvTLを加え、 4°Cで l hr Rotation した。遠心（10000 rpm, 1 min、 4°C) した後、上清を 370 i L ずつ GST、各 GST-Synoviolin ビーズを含んだ 1 ml の Pulldown Buffer Vに加え、 4°Cで 1 hr Rotationした。このビーズを 1 mlの Pull- down Buffer Vで 4回洗った。この時上清は必ず 100 μ Lぐらい残し、ビーズを吸い取らないようにした。遠心は 2500 rpm、 1 min、 4°Cで行った。上清を吸いとつた後、 40 ^ の 1 X SDS Sample Buffer を加えて、 Pulldown サンプルとした。 On put 10%と Pull-down サンプルを 100°Cで 5min、熱し、 -20°Cで保存した。翌日サンプルを 37°Cの恒温槽で lOmin温め、 10 Lずつ 10%ゲルに Applyした。泳動（150 V 50 min) 、 CBB染色 ( 30 min) 、脱色（lhr x 2) 、グリセロール水（30~60 min) 、ゲル乾 (80°C、 lhr) した後、 IP Plate に露光させた。 14 時間後、露光した IP Plateを BASで読み取り、 ImageGaugeで定量した。また C.B.B.染色したゲルはフィルムスキャナーで読み取った。

その結果、 p53結合ドメイン欠失体は結合活性をほぼ完全に失っていた。また、図 1 5から、 p53結合ドメインは 236から 270アミノ酸の 35ァミノ酸の一ヶ所のみであると考えられる。産業上の利用可能性

本発明により、 p53癌抑制遺伝子の活性を促進する物質が提供される。この物質は、 p53 を活性化して p53 を核に移行させることができるため、癌の治療用医薬組成物として有用である。本発明において、シノビォリンの発現及び/又は機能を阻害することにより、癌の治療が可能となる。配列表フリーテキスト

配列番号 1 7 ：合成ォリゴヌクレオチド（DNA/RNA混合物）配列番号 1 8 ：合成ォリゴヌクレオチド（DNA/RNA混合物)

Claims

請求の範囲

I . p53 癌抑制遺伝子又は p53 タンパク質の活性を促進する物質を含む医薬組成物。

2 . p53 癌抑制遺伝子又は p53 タンパク質の活性化を促進する物質が、シノビォリンの発現及び/又は機能阻害物質である請求項 1記載の医薬組成物。

3 . シノビオリンの発現及び/又は機能阻害物質が、シノビオリンをコードする遺伝子に対する siRNA又は shRNAである請求項 2記載の医薬組成物。

4 . シノビオリンをコードする遺伝子が、配列番号 1に示される塩基配列を含むものである請求項 3記載の医薬組成物。

5 . siRNA ヽ配列番号 1に示す塩基配列のうち一部の配列を標的とするものである請求項 3記載の医薬組成物。

6 . 癌を治療するための請求項 1〜 5のいずれか 1項に記載の医薬組成物。

7 . シノビォリンの発現及び/又は機能を阻害することを特徴とする p53 癌抑制遺伝子又は p53タンパク質の活性化方法。

8 . シノビォリンの発現及び/又は機能を阻害することを特徴とする p53 タンパク質の核への局在化方法。

9 . シノビォリンの発現及び/又は機能を阻害して p53 タンパク質を核に局在化させることを特徴とする癌の抑制方法。

1 0 . 核に局在化した p53 タンパク質に、さらに放射線照射又は紫外線照射を行うことを特徴とする請求項 9記載の方法。

I I . 核に局在化した p53 タンパク質を含む細胞に、さらに抗癌剤を接触させ、又は当該細胞の周囲の脈管に塞栓を施すことを特徴とする請求項

9記載の方法。

1 2 . シノビォリンの発現及び/又は機能を阻害することを特徴とする、 p53 タンパク質のアミノ酸残基の一部をリン酸化する方法。

1 3 . アミノ酸残基の一部が、第 1 5番目のセリン残基である請求項 1 2記載の方法。

14. シノビォリンの発現及び/又は機能を阻害することを特徴とする、リン酸化酵素の活性化方法。

1 5. リン酸化酵素が ATM若しくは ATR又はこれらと同様の活性をもつ酵素等である請求項 14記載の方法。

16. シノビォリンの発現及び/又は機能を阻害することにより p53 タンパク質を活性化し、活性化された p53 タンパク質により p21 タンパク質の発現を誘導する方法。

17. シノビオリンの発現及び/又は機能を阻害して p53 タンパク質に p21 タンパク質の発現を誘導させることを特徴とする癌の抑制方法。

18. シノビォリンの発現及び/又は機能を阻害することを特徴とする、 p53 タンパク質を活性化する方法。

19. シノビオリンの発現阻害が、シノビオリンをコ一ドする遺伝子に対する siRNA又は shRNAによるものである請求項 7〜 18のいずれか 1 項に記載の方法。

20. シノビオリンの機能阻害が、シノビオリンの p 53 タンパク質への結合機能阻害および/又はュビキチン化阻害である請求項 7〜 1 8のいずれか 1項に記載の方法。

21. シノビオリンをコ一ドする遺伝子が、配列番号 1に示される塩基配列を含むものである請求項 1 9記載の方法。

22. siRNA 力配列番号 1に示す塩基配列のうち一部の配列を標的とするものである請求項 19記載の方法。