WO2005059174A1 - Método y kit para genotipificación de hla-drb basados en la pcr en tiempo real - Google Patents

Método y kit para genotipificación de hla-drb basados en la pcr en tiempo real Download PDF

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WO2005059174A1
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hla
drb
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Manuel Juan Otero
Natàlia CASAMITJANA PONCES
Ricardo Pujol Borrell
Roger Colobran Oriol
Eduardo Palou Rivera
Maria Rosa Faner Canet
Ana Ribera Crusafont
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Universitat Autònoma De Barcelona
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    • C12Q1/6881—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for tissue or cell typing, e.g. human leukocyte antigen [HLA] probes
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • This invention relates to the field of medicine in general and specifically to medical research, molecular biology, forensic medicine and diagnosis.
  • the invention provides a method for determining the genotype (ie, the set of specific alleles) of an individual. This facilitates the determination of compatibility in transplants and the propensity for a specific disease of the individual.
  • MHC major histocompatibility complex
  • HLA human leukocyte antigen system
  • the HLA comprises several genes grouped in a 4 Mb segment on the short arm of chromosome 6 (cf. DA Rhodes et al., "Genetics and molecular genetics of the MHC", Rev. Immunoqenet. 1999, vol. 1, pp. 21-31).
  • the HLA region comprises six major loci that structurally encode homologous proteins that are classified in class I HLA (HLA-A, B, Cw) and in class II (HLA-DR, DQ, DP), which present antigens to two subtypes Different from cells.
  • Class II molecules are heterodimeric glycoproteins that consist of an alpha chain and a beta chain.
  • MHC class II molecules are expressed on the cell surface of macrophages, B cells, activated T cells and other cell types
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) involved in the presentation of antigens to T cells expressing the CD4 cell surface glycoprotein (cf. Bjorkman et al., Ann. Rev. Biochem. 1990, vol. 59, pp. 253-88).
  • the DP, DQ and DR genes are located in separate regions of the MHC. In the DR region, a single DRA locus encodes the non-polymorphic DRalpha chain, but nine different DRB loci, designated from DRB1 to DRB9, encode the polymorphic DRbeta chain. The number of DRB alleles identified is increasing continuously. Due to this fact, the precise determination of allelic subtypes is essential for the typing of potential donors for transplantation, where very precise HLA compatibility between the donor and the transplant recipient seems to be critical to minimize the risk of rejection.
  • PCR-SSO sequence-specific primers
  • PCR-SSP the gene sequence is confirmed by amplification of the hypervariable region of the target HLA antigen for determine the type of HLA antigen.
  • a nylon membrane is prepared (on which the amplified DNA is immobilized by the specific primers of the HLA gene) and the specific oligonucleotide probes of the respective type of HLA are hybridized for typing.
  • both methods have been effective in routine laboratory practice, they require time-consuming post-PCR processing and post-PCR contamination is a real risk.
  • PCR-SSP requires the use of a large number of PCR reactions and is difficult to automate, thus limiting its performance. On the other hand, even if the PCR-SSO is capable of greater performance, its processing times are longer and does not allow discrimination between motifs located in the cis or trans strands of DNA.
  • HLA typing laboratories have to analyze a large number of samples and need to increase the resolution of the typing to have more valid clinical results for transplantation, particularly for bone marrow transplantation. Therefore, it would be highly desirable to provide new typing methods, particularly if they are improved in the sense of being faster, of being potentially automatable, of providing greater resolution and of reducing the risks of contamination.
  • HLA typing based on real-time PCR also called fluorotyping
  • fluorotyping does not require post-PCR processing and could be fully automated (cf. EP 1,229,128 A1; SJ Faas et al., " Sequence-specific priming and exonuclease-released fluorescence detection of HLA-DQB1 ally ", Tissue Antigens 1996, vol. 48, pp. 97-112; K. Slateva et al.," HLA-DRB fluorotyping by dark quenching and automated analysis " , Tissue Antigens 2001, vol. 58, pp. 250-4).
  • one aspect of the present invention relates to a method for determining the HLA-DRB genotype of a nucleic acid sample, comprising the steps of: (i) amplifying any nucleic acid comprising exon 2 of at least one of the genes of the DRB loci by real-time PCR; (I) detect the fluorescence signals by fluorescently labeled nucleotide probes during the amplification carried out in step (i), under conditions where said probes specifically bind to the amplified nucleic acid sequences; and (ii) compare more than one signal detected in step (ii) with an experimentally defined fluorescence pattern, said pattern having been established by an initial definition based on the theoretical comparison of the nucleotide probe sequences of the step ( ii) with the sequences of different alleles of the genes selected from step (i), followed by a definitive definition based on an experimental determination of which of the theoretical signals are actually positive (black squares in FIG. 2) and which are actually negative (white squares in FIG. 2). Steps (i
  • the nucleic acid in the sample will be DNA, usually genomic DNA.
  • the method of the present invention can be used with other nucleic acids, such as messenger RNA or cloned DNA, and the nucleic acid can be single stranded or double stranded.
  • kits for determining the HLA-DRB genotype of a nucleic acid sample by performing the method described above comprises: (i) primers for amplifying the nucleic acids of at least one of the genes of the HLA-DRB loci by real-time PCR; ( ⁇ I) fluorescently labeled nucleotide probes to detect fluorescence signals during amplification; and (iii) experimentally defined fluorescence patterns to compare the detected signals as described above.
  • the genes of the DRB loci in step (ii) are selected from the group consisting of DRB1, DRB3, DRB4 and DRB5.
  • the real-time PCR follows the fluorescence emitted during the reaction as an indicator of the production of the amplifier during each cycle of the PCR (ie, in real time), contrary to detection at the endpoint by conventional quantitative PCR methods.
  • Real-time PCR does not detect the size of the amplifier and thus does not allow differentiation between DNA and cDNA amplification.
  • the real-time PCR system is based on the detection and quantification of a fluorescent developer.
  • the kit provides primers that are single stranded nucleic acids that are 10 to 30 nucleotides in length, particularly 14 to 24 nucleotides, and that comprise sequences complementary to the sequences of a region located at intron-exon 2-intron 2 length of at least one of the genes selected from the group consisting of DRB1, DRB3, DRB4 and DRB5.
  • the primer sequences are selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-19.
  • the amplification step (i) of the method is carried out with two or more primers. Real-time PCR is performed using universal thermal cycling parameters and PCR reaction conditions known to a person skilled in the art.
  • the kit of the invention also provides probes that are single stranded nucleic acids that are 10 to 45 nucleotides in length, particularly 13 to 34 nucleotides, and that comprise sequences complementary to the sequences of a region located along exon 2 of at least one of the genes selected from the group consisting of DRB1, DRB3, DRB4 and DRB5.
  • the sequences of the probes are selected from the group formed by SEQ ID NO: 22-48 or from the complementary sequences of this group.
  • the probes are labeled as fluorochromes of the "tag-quencher label" developer marker type, and the probes degrade due to the 5 '-> 3 * exonuclease activity of the DNA polymerase .
  • TaqMan probes from Applied Biosystems, Foster City, CA, USA are used for this purpose.
  • Specific markers for this purpose are FAM (6- carboxy-fluorescein), VIC and TET (6-carboxy-4,7,2 ', 7'-tetrachloro-fluorescein), which are fluorescent developer markers, and TAMRA (6- carboxy-N, N, N ', N'-tetramethyl-rhodamine) and MGB (minor DNA groove ligand) which are fluorescent and non-fluorescent occult markers, respectively.
  • Taqman probes use exonuclease activity ⁇
  • TaqMan probes are designed to hybridize to an internal region of a PCR product.
  • Synthetic specific primers and kit specific probes are designed from the human genomic HLA-DRB sequences.
  • the term "specific" means that the primers and probes comprise a nucleotide sequence completely complementary to an allelic sequence of HLA-DRB.
  • the kit further comprises two primers for the glyceraldehydrophosphate dehydrogenase (GAPDH) gene with SEQ ID NO: 20 and SEQ ID NO: 21, and a GAPDH probe with SEQ ID NO: 49, added as a control.
  • This control may be external (in a different tube), but is preferably internal (in the same tube).
  • the kit may optionally comprise instructions for determining the HLA-DRB genotype of a sample according to the kit ingredients.
  • the genotyping method of the present invention and the kit for performing the method has some clear advantages over the methods and kits known in the art: post-amplification steps are avoided and thus labor is saved and the risk of pollution; the time required for typing can be shortened to two and a half hours if the initial steps of loading the reagents and the sample in the reaction cells are finally automated; the use of allele-specific probes and the use of more than one probe in a single tube allows the reduction of the number of PCR tubes, thereby further simplifying the PCR typing procedure and achieving significant reagent clipping. and cost, while the resolution is increased.
  • locus means the position occupied by each HLA gene.
  • Loci plural of locus
  • allele refers to one of the two or more alternative forms of a gene, differing in the genetic sequence and resulting in observable differences in hereditary characters (phenotype), and they are found in the same place on a chromosome.
  • the different alleles of this locus are called DRB1 * 01, DRB1 * 02, etc., and these alleles together form what is called an "allelic group” in this description.
  • the genotyping method of the present invention facilitates, for example, the determination of transplant compatibility in an individual and its propensity for a specific disease.
  • the method of the present invention is faster and easier to automate, gives a higher resolution and reduces the risks of sample contamination.
  • FIG. 1 shows an example of the results of HLA-DRB typing of a DNA sample.
  • FIG. 2 shows the fluorescence pattern for the interpretation of the results.
  • ⁇ Rn represents the standardized signal of the developer minus the baseline signal established in the first cycles of the PCR.
  • Rn is the standard signal of the developer, which represents the fluorescence signal of the developer marker divided by the fluorescence signal of the passive reference marker (ROX, included in Buffer A).
  • Ct represents the PCR cycle in which an increase in the fluorescence of the developer above the baseline signal can be detected for the first time. The Ct for an amplification curve occurs at the point where the fluorescence signal grows beyond the threshold value.
  • FIG. 1 A shows the graph of the fluorescent amplification of the FAM probes. ⁇ Rn FAM vs. is represented. Ct.
  • FIG. 1B shows the graph of the fluorescent amplification of the TET probes (GAPDH amplification control). ⁇ Rn TET vs. Ct.
  • FIG. 1C shows the graph of the fluorescent amplification of the VIC probes. ⁇ Rn VIC vs. Ct.
  • the positive probes for these samples were the following: the FAM probes of tubes 5, 6, 8, 12, 13 and 15; VIC probes of tubes 3, 4, 7, 12, 13 and 15.
  • the HLA-DRB genotype deduced from this sample was HLA-DRB1 * 11, 15; DRB3; DRB5.
  • FIG. 2 FIG.2A-K
  • FIG. 2 FIG.2A-K
  • Tuning of the typing method construction of a fluorescence pattern.
  • DNA samples A total of 100 samples from patients transplanted with solid organs or bone marrow, and from healthy donors, were selected from the inventor's DNA sample store, to represent alleles of all defined HLA-DRB specificities serologically in the Spanish population.
  • the genomic DNA of these samples was obtained by a standard salt precipitation method (cf. SA Miller et al., "A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells", Nucleic Acids Res. 1988, vol. 16, pp. 1215).
  • PCR reaction A set of 16 PCR tubes was used. A total of 19 primers (14 pairs) and 28 fluorogenic probes were used to identify all the HLA-DRB1, DRB3, DRB4 and DRB5 alleles, corresponding to the HLA-DR1 -16 and DR51 -53 serological specificities. 2 pairs of primers per reaction were used: one pair for the HLA-DRB genes and another pair for the GAPDH gene to provide internal control of positive amplification. The sequence and location of the primers are listed in TABLE 1.
  • All primers were designed to have a melting temperature between 58 and 60 ° C, and probes between 65 and 67 ° C, to ensure that the PCR reactions worked under the same conditions. While most probes are attached to the 3 'end of the TAMRA concealer marker, in some of them a non-fluorescent concealer (MGB probe) was used to be able to use shorter probes while maintaining the melting temperature.
  • MGB probe non-fluorescent concealer
  • Each PCR reaction was carried out in a final volume of 20 ⁇ l containing the following components: Buffer A (TaqMan ® 1000 Rxn Gold / Buffer A Pack, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), 0.46 u of AmpliTaq Gold , MgCI 2 [see final concentrations in TABLE 4], 200 ⁇ M of each dNTP, primers, a FAM probe, a VIC probe (in TABLE 4 the mixtures of primers and the probes used in each tube are detailed, and their final concentrations), 25 nM of each GAPDH primer, 75 nM of the GAPDH-TET probe and 50-100 ng of DNA.
  • Buffer A TaqMan ® 1000 Rxn Gold / Buffer A Pack, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA
  • AmpliTaq Gold MgCI 2
  • MgCI 2 100 ⁇ M of each dNTP
  • primers primers
  • FAM probe primers
  • VIC probe in T
  • the amplifications were carried out in a 7700 SDS (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) that detected and recorded the fluorescence emission during the real-time amplification process. After an initial denaturation at 95 ° C for 10 min, the samples were subjected to 40 temperature cycles of a denaturation step at 95 ° C for 20 s and a hybridization / extension step at 64 ° C for 1 min.
  • Taqman probes were purchased from Applied Biosystems, Foster City, CA, USA: FAM (6-carboxy-fluorescein), VIC, TET (6-carboxy-4,7,2 * , 7'-tetrachloro-fluorescein), TAMRA (6-carboxy-N, N, N ', N * -tetrametyl-rodamine) and MGB (minor DNA groove ligand).
  • TABLE 1 shows the sequences and position of the 3 'end of the primers used.
  • the positions of the GAPDH primers refer to the GenBank sequence with the accession number J04038.
  • the asterisk indicates that these primers are described in O. Olerup et al., "HLA-DR typing by PCR amplification with sequence specific primers (PCR-SSP) in 2 hours: an altemative to serological DR typing in clinical practice ⁇ ncluding donor- recipient matching in cadaveric transplantation ", Tissue Antigens 1992, vol. 39, pp. 225-35.
  • the symbol # indicates that the primer is described in K.
  • DNA samples and PCR reaction To validate the method, two hundred samples from transplanted patients and healthy donors were randomly selected. The genomic DNA of these samples was obtained by a standard method of precipitation of nucleic acids. The PCR reaction for these samples was carried out as in the development of the method described above. An example of the HLA-DRB typing of a DNA sample with the new method is presented in FIG. one.
  • GAPDH Intron H TCTGAGCCAGCCACCAGAG intron H-4671 SEQ ID NO: 21 TABLE 2. Sequences, fluorescent markers, melting temperatures and position of the fluorogenic probes used. All HLA-DRB probes are located in exon 2. The position of the GAPDH probe is referred to the GenBank sequence with the accession number J04038. An asterisk means MGB probe.

Abstract

Método para determinar el genotipo de los loci DRB del antígeno leucocitario humano a partir de una muestra de ácido nucleico, y kit para realizar dicho método. El kit comprende cebadores específicos de alelo para amplificar ácidos nucleicos derivados de los loci HLA-DRB mediante PCR en tiernpo real, sondas específicos de alelo marcadas fluorescentemente para detectar la señales de fluorescencia durante la amplificación; y patrones de fluorescencia definidos experimentalmente para comparar las señales detectadas. En particular los genes de los loci DRB se seleccionan entre DRB1, DRB3, DRB4 y DRB5. Supera algunas de las limitaciones de los métodos de tipifcación convencionales basados en ADN, en términos de tiempo, posibilidad de automatización y aumento de la resolución, mientras se reduce el número de reacciones PCR. Es útil p.ej. para determinar compatibilidad en trasplantes o predisposición a una enfermedad especifica.

Description

Método y kit para la qenotipificación de HLA-DRB basados en la PCR en tiempo real
Esta invención se relaciona con el campo de la medicina en general y específicamente con la investigación médica, la biología molecular, la medicina forense y el diagnóstico. En particular, la invención proporciona un método para la determinación del genotipo (es decir, el conjunto de alelos específicos) de un individuo. Esto facilita la determinación de la compatibilidad en los trasplantes y la propensión a una enfermedad específica del individuo.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
En el trasplante entre individuos inmunogenéticamente diferentes se establece la inmunidad en el trasplante y se induce una reacción de rechazo contra el injerto. Existen antígenos que inducen una inmunidad en el trasplante particularmente intensa como dianas de esta reacción, que se llaman antígenos mayores de histocompatibilidad. Estos antígenos son controlados por un grupo de genes llamado complejo mayor de histocompatibilidad ("major histocompatibility complex", MHC), conocido en los humanos como el sistema de antígenos leucocitarios humanos ("human leukocyte antigens", HLA). Estos genes que codifican las moléculas HLA se encuentran entre los genes más variables en humanos: cada variante codifica para moléculas que unen péptidos diferentes. Estos genes son los mismos en todas las células de un individuo particular, pero difieren de una persona a otra.
El HLA comprende varios genes agrupados en un segmento de 4 Mb en el brazo corto del cromosoma 6 (cfr. D.A. Rhodes et al., "Genetics and molecular genetics of the MHC", Rev. Immunoqenet. 1999, vol. 1 , pp. 21-31). La región HLA comprende seis loci mayores que codifican estructuralmente proteínas homologas que se clasifican en la clase I HLA (HLA-A, B, Cw) y en la clase II (HLA-DR, DQ, DP), que presentan antígenos a dos subtipos diferentes de células. Las moléculas de clase II son glicoproteínas heterodiméricas que consisten en una cadena alfa y una cadena beta. Las moléculas MHC de clase II se expresan en la superficie celular de los macrófagos, células B, células T activadas y otros tipos celulares
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) involucrados en la presentación de antígenos a las células T que expresan la glicoproteína de superficie celular CD4 (cfr. Bjorkman et al., Ann. Rev. Biochem. 1990, vol. 59, pp. 253-88). Los genes DP, DQ y DR se localizan en regiones separadas del MHC. En la región DR, un único locus DRA codifica la cadena DRalfa no polimórfica, pero nueve loci DRB diferentes, denominados de DRB1 a DRB9, codifican la cadena DRbeta polimórfica. El número de alelos DRB identificados está aumentando continuamente. Debido a este hecho, la determinación precisa de los subtipos alélicos es esencial para la tipificación de potenciales donantes para el trasplante, donde la compatibilidad HLA muy precisa entre el donante y el receptor del trasplante parece ser crítica para minimizar el riesgo de rechazo.
Para la tipificación de HLA generalmente se han usado tests serológicos utilizando reacciones con antisueros y tests citológicos. Sin embargo, se requiere mucho tiempo y gran trabajo para su examen, la operación es complicada, y la precisión en los resultados obtenidos es más bien pobre. La tipificación de HLA por técnicas basadas en la reacción en cadena de la polimerasa ("polymerase chain reaction", PCR) se ha convertido en una alternativa a los métodos serológicos, ampliamente usada en la práctica clínica. Los métodos de tipificación de HLA basados en la PCR más comunes, que han superado las limitaciones de los tests serológicos, son la PCR con cebadores específicos de secuencia ("PCR with sequence-specific primers", PCR-SSP) (cfr. O. Olerup et al.,"HLA-DR typing by PCR amplification with sequence specific primers (PCR-SSP) in 2 hours: an altemative to serological DR typing in clinical practice including donor- recipient matching in cadaveric transplantation", Tissue Antigens, 1992, vol. 39, pp. 225-35; M. Bunce et al., "Phototyping : comprehensive DNA typing for HLA-A, B, C, DRB1 , DRB3, DRB4, DRB5 & DQB1 by PCR with 144 primer mixes utilizing sequence-specific primers (PCR-SSP)", Tissue Antigens, 1995, vol 46, pp. 355-67) y la hibridación con cebadores específicos de secuencia ("sequence-specific oligonucleotide", PCR-SSO) (cfr. EP 514.534; EP 417.160 and R.K. Saiki et al., "Analysis of enzymatically amplified beta- globin and HLA-DQ alpha DNA with allele-specific oligonucleotide probes", Nature. 1986 vol 324, pp. 163-6).
En el método PCR-SSP, la secuencia del gen se confirma mediante la amplificación de la región hipervariable del antígeno HLA diana para determinar el tipo de antígeno HLA. En el método PCR-SSO, se prepara una membrana de nilón (sobre la que se inmobiliza el DNA amplificado por los cebadores específicos del gen HLA) y se hibridan las sondas de oligonucleótidos específicas del tipo respectivo de HLA para la tipificación. Aunque ambos métodos han sido efectivos en la práctica rutinaria de laboratorio, requieren un procesamiento post-PCR que consume tiempo y la contaminación post-PCR es un riesgo real. Además, la PCR-SSP requiere el uso de un gran número de reacciones de PCR y es difícil de automatizar, limitando así su rendimiento. Por otro lado, incluso si la PCR-SSO es capaz de un mayor rendimiento, sus tiempos de procesado son más largos y no permite discriminar entre motivos situados en las hebras cis o trans de DNA.
Los laboratorios de tipificación de HLA tienen que analizar un gran número de muestras y necesitan incrementar la resolución de la tipificación para tener resultados clínicos más válidos para el trasplante, particularmente para el trasplante de médula ósea. Por lo tanto, sería altamente deseable proporcionar nuevos métodos de tipificación, particularmente si estos están mejorados en el sentido de ser más rápidos, de ser potencial mente automatizables, de proporcionar mayor resolución y de reducir los riesgos de contaminación.
EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN
En algunos estudios previos se ha publicado que la tipificación de HLA basada en la PCR en tiempo real, también llamada fluorotipificación, no requiere procesado post-PCR y podría automatizarse completamente (cfr. EP 1.229.128 A1 ; S.J. Faas et al., "Sequence-specific priming and exonuclease- released fluorescence detection of HLA-DQB1 alíeles", Tissue Antigens 1996, vol. 48, pp. 97-112; K. Slateva et al., "HLA-DRB fluorotyping by dark quenching and automated analysis", Tissue Antigens 2001 , vol. 58, pp. 250- 4). En la técnica anterior la PCR en tiempo real para la tipificación de HLA se ha utilizado únicamente como un equivalente a la PCR-SSP con una sonda específica de locus fluorogénica. Expadiendo todavía más la utilidad de la PCR en tiempo real, en la presente invención esta tecnología se utiliza para distinguir entre los alelos de un locus dado. Así, un aspecto de la presente invención se refiere a un método para determinar el genotipo HLA-DRB de una muestra de ácido nucleico, que comprende los pasos de: (i) amplificar cualquier ácido nucleico que comprenda el exón 2 de al menos uno de los genes de los loci DRB por la PCR en tiempo real; (¡i) detectar las señales de fluorescencia mediante sondas nucleotídicas marcadas fluorescentemente durante la amplificación llevada a cabo en el paso (i), en condiciones donde dichas sondas específicamente se unen a las secuencias de ácidos nucleicos amplificadas; y (¡ii) comparar más de una señal detectada en el paso (ii) con un patrón de fluorescencia definido experimental mente, habiendo sido establecido dicho patrón por una definición inicial basada en la comparación teórica de las secuencias de las sondas nucleotídicas del paso (ii) con las secuencias de diferentes alelos de los genes seleccionados del paso (i), seguido de una definición definitiva basada en una determinación experimental de cuales de las señales teóricas son en realidad positivas (cuadrados negros en la FIG. 2) y cuales son en realidad negativas (cuadrados blancos en la FIG. 2). Los pasos (i) y (ii) de este método se llevan a cabo en el mismo tubo y sin ninguna manipulación adicional de la muestra.
En general, el ácido nucleico en la muestra será ADN, normalmente ADN genómico. Sin embargo, el método de la presente invención se puede usar con otros ácidos nucleicos, tales como ARN mensajero o ADN clonado, y el ácido nucleico puede ser de hebra simple o de hebra doble.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a un kit para determinar el genotipo HLA-DRB de una muestra de ácido nucleico llevando a cabo el método descrito anteriormente. El kit comprende: (i) cebadores para amplificar los ácidos nucleicos de al menos uno de los genes de los loci HLA- DRB por la PCR en tiempo real; (¡i) sondas nucleotídicas marcadas fluorescentemente para detectar señales de fluorescencia durante la amplificación; y (iii) patrones de fluorescencia definidos experimentalmente para comparar las señales detectadas como se describe anteriormente. En una realización particular de esta invención, los genes de los loci DRB en el paso (ii) se seleccionan del grupo formado por DRB1 , DRB3, DRB4 y DRB5.
La PCR en tiempo real sigue la fluorescencia emitida durante la reacción como un indicador de la producción del amplímero durante cada ciclo de la PCR (es decir, en tiempo real), contrariamente a la detección en el punto final por los métodos de PCR cuantitativos convencionales. La PCR en tiempo real no detecta el tamaño del amplímero y así no permite la diferenciación entre ADN y la amplificación de ADNc. El sistema de PCR en tiempo real se basa en la detección y cuantificación de un revelador fluorescente.
En una realización particular de la invención, el kit proporciona cebadores que son ácidos nucleicos de hebra simple que tienen una longitud de 10 a 30 nucleótidos, particularmente de 14 a 24 nucleótidos, y que comprenden secuencias complementarias a las secuencias de una región situada a lo largo de intrónl-exón 2-intrón 2 de al menos uno de los genes seleccionados del grupo formado por DRB1 , DRB3, DRB4 y DRB5. Particulamente, las secuencias de los cebadores se seleccionan del grupo formado por SEQ ID NO: 1-19. El paso de amplificación (i) del método se lleva a cabo con dos o más cebadores. La PCR en tiempo real se realiza usando parámetros térmicos de ciclado universales y condiciones de la reacción de PCR conocidas por un experto en la materia.
El kit de la invención también proporciona sondas que son ácidos nucleicos de hebra simple que tienen una longitud de 10 a 45 nucleótidos, particularmente de 13 a 34 nucleótidos, y que comprenden secuencias complementarias a las secuencias de un región situada a lo largo de exón 2 de al menos uno de los genes seleccionados del grupo formado por DRB1, DRB3, DRB4 y DRB5. Particularmente, las secuencias de las sondas se seleccionan del grupo formado por SEQ ID NO: 22-48 o de las secuencias complementarias de este grupo. En una realización particular, las sondas se marcan como fluorocromos del tipo marcador de revelador-marcador de ocultador ("repórter label-quencher label"), y las sondas se degradan debido a la actividad exonucleasa 5'->3* de la ADN polimerasa. En particular, se utilizan las sondas TaqMan de Applied Biosystems, Foster City, CA, USA, para este fin. Marcadores específicos para este propósito son FAM (6- carboxi-fluoresceina), VIC y TET (6-carboxi-4,7,2',7'-tetracloro-fluoresceina), que son marcadores de revelador fluorescentes, y TAMRA (6-carboxi- N,N,N',N'-tetrametil-rodamina) y MGB (ligando del surco menor del ADN) que son marcadores de ocultador fluorescentes y no fluorescentes, repectivamente. Las sondas Taqman utilizan la actividad exonucleasa β
fluorogénica 5' de la Taq polimerasa para medir la cantidad de secuencias target en las muestras. Estas sondas son cebadores más largos que los cebadores (20-30 bases de longitud con un valor Tm de 10 °C más alto) que contienen un marcador fluorescente normalmente en 5', y un marcador de ocultador (normalmente TAMRA) por lo general en 3' . Cuando se irradia, el marcador fluorescente excitado transfiere energía a la molécula más cercana de marcador de ocultador en lugar de emitir fluorescencia (esto se llama FRET, acrónimo de "Fórster or fluorescence resonance energy transfer"). Así, la proximidad del revelador y del ocultador impide la emisión de cualquier fluorescencia mientras la sonda está intacta. Las sondas TaqMan están diseñadas para hibridarse a una región interna de un producto de PCR. Cuando la polimerasa replica, su actividad exonucleasa 5' libera la sonda. Esto finaliza la actividad del ocultador (no FRET) y el marcador de revelador empieza a emitir fluorescencia que aumenta en cada ciclo proporcional al ritmo de liberación de la sonda. La acumulación de productos de PCR se detecta monitorizando el aumento de fluorescencia del marcador de revelador (los cebadores no están marcados). Debido a que la liberación ocurre sólo si la sonda se hibridiza a la secuencia diana, la fluorescencia detectada se origina de una amplificación específica. Los ensayos se pueden realizar utilizando múltiples marcadores con distintas longitudes de onda de emisión.
Los cebadores específicos sintéticos y las sondas específicas del kit están diseñadas a partir de las secuencia de HLA-DRB genómico humano. El término "específico" significa que ios cebadores y las sondas comprenden una secuencia nucleotídica totalmente complemetaria a una secuencia alélica de HLA-DRB.
En otra realización particular, el kit comprende además dos cebadores para el gen de la gliceraldehidofosfato deshidrogenasa (GAPDH) con SEQ ID NO: 20 y SEQ ID NO: 21 , y una sonda para GAPDH con SEQ ID NO: 49, añadidos como control. Este control puede ser externo (en un tubo diferente), pero es preferiblemente interno (en el mismo tubo). El kit puede opcionalmente comprender instrucciones para determinar el genotipo HLA- DRB de una muestra según los ingredientes del kit. El método de genotipificación de la presente invención y el kit par realizar el método tiene algunas ventajas claras respecto a los métodos y los kits conocidos en la técnica: se evitan los pasos de post-amplificación y así se ahorra trabajo y se reduce el riesgo de contaminación; el tiempo que se requiere para la tipificación pueden acortarse hasta dos horas y media si los pasos iniciales de cargar los reactivos y la muestra en las cubetas de reacción finalmente se automatizan; el uso de sondas específicas de alelo y el uso de más de una sonda en un único tubo permite la reducción del número de tubos de PCR, con lo que se simplifica aún más el procedimiento de tipificación de PCR y se alcanza un recorte importante de reactivos y coste, mientras que la resolución se aumenta.
Los términos "genotipificación" y "tipificación" se usan como sinónimos en esta descripción y se refieren a cualquier test que revele los alelos específicos heredados por un individuo, lo cual es particularmente útil para situaciones en las que más de una combinación genotípica puede producir la misma presentación clínica. En la presente descripción, el término "locus" significa la posición ocupada por cada gen HLA. Los "loci" (plural de locus) para los antígenos DR incluyen DRA y DRB1 -B9. El término "alelo" se refiere a una de las dos o más formas alternativas de un gen, difiriendo en la secuencia genética y resultando en diferencias observables en los caracteres hereditarios (fenotipo), y se encuentran en el mismo lugar en un cromosoma. En el caso del locus HLA DRB1 , los alelos diferentes de este locus se llaman DRB1*01 , DRB1*02, etc., y estos alelos en conjunto forman lo que se llama un "grupo alélico" en esta descripción.
El método de genotipicación de la presente invención facilita por ejemplo la determinación de la compatibilidad de trasplante en un individuo y su propensión a una enfermedad específica. Como se menciona anteriormente, en comparación con algunos métodos de tipificación de HLA conocidos en la técnica, el método de la presente invención es más rápido y más fácil de automatizar, da una resolución mayor y reduce los riesgos de contaminación de la muestra.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos, dibujos y la lista de secuencias se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La FIG. 1 muestra un ejemplo de los resultados de tipificación de HLA-DRB de una muestra de ADN.
La FIG. 2 (FIG. 2A-K) muestra el patrón de fluorescencia para la interpretación de los resultados.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE REALIZACIONES PARTICULARES
Descripción detallada de las figuras
En la FIG. 1 ΔRn representa la señal normalizada del revelador menos la señal de la línea de base establecida en los primeros ciclos de la PCR. Rn es la señal normalizada del revelador, que representa la señal de fluorescencia del marcador de revelador dividida por la señal de fluorescencia del marcador de referencia pasivo (ROX, incluido en el Tampón A). Ct representa el ciclo de PCR en el que se puede detectar por primera vez un aumento de la fluorescencia del revelador por encima de la señal de la línea de base. El Ct para una curva de amplificación sucede en el punto en el que la señal de fluorescencia crece más allá del valor umbral. La FIG. 1 A muestra el gráfico de la amplificación fluorescente de las sondas FAM. Se representa ΔRn FAM vs. Ct. La FIG. 1B muestra el gráfico de la amplificación fluorescente de las sondas TET (control de amplificación GAPDH). Se representa ΔRn TET vs. Ct. La FIG. 1C muestra el gráfico de la amplificación fluorescente de las sondas VIC. Se representa ΔRn VIC vs. Ct. Las sondas positivas para estas muestras fueron las siguientes: las sondas FAM de los tubos 5, 6, 8, 12, 13 y 15; las sondas VIC de los tubos 3, 4, 7, 12, 13 y 15. El genotipo HLA-DRB deducido de esta muestra fue HLA-DRB1*11 ,15; DRB3; DRB5. En la FIG. 2 (FIG.2A-K) se listan las especificidades HLA-DRB detectadas para cada reacción. Horizontalmente están las sondas fluorescentes usadas, y verticalmente las especificidades correspondientes. Un cuadrado negro indica un positivo real, una cruz indica un positivo no específico, "p" indica un positivo probable (no probado), y "pi" indica un positivo probable no especifico (no probado).
Puesta a punto del método de tipificación: construcción de un patrón de fluorescencia.
Muestras de ADN: Un total de 100 muestras provenientes de pacientes trasplantados con órganos sólidos o con médula ósea, y de donantes sanos, se seleccionaron del almacén de muestras de ADN de los inventores, para representar los alelos de todas las especificidades HLA-DRB definidas serológicamente en la población española. El ADN genómico de estas muestras fue obtenido por un método estándar de precipitación por salado (cfr. S.A. Miller et al., "A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells", Nucleic Acids Res. 1988, vol. 16, pp. 1215).
Reacción de PCR: Se usó un conjunto de 16 tubos de PCR. Un total de 19 cebadores (14 pares) y de 28 sondas fluorogénicas se utilizaron para identificar todos los alelos HLA-DRB1 , DRB3, DRB4 y DRB5, correspondientes a las especificidades serológicas HLA-DR1 -16 y DR51 -53. Se usaron 2 pares de cebadores por reacción: un par para los genes HLA- DRB y otro par para el gen GAPDH para proporcionar el control interno de amplificación positiva. La secuencia y la localización de los cebadores están listadas en la TABLA 1. En cada tubo se usaron 3 sondas con diferente marcador fluorescente, dos sondas específicas para DRB marcadas en su extremo 5' con FAM y VIC (exceptuando los tubos 14 y 16 donde sólo se usó una sonda específica para DRB), y una tercera sonda para GAPDH marcada con TET. La secuencia, localización, el marcador fluorescente y la temperatura de fusión de las sondas están listadas en la TABLA 2. El diseño de cebadores y de sondas se hizo a partir de las secuencias de los genes de HLA-DRB que se encuentran en la base de datos: EMBL-EBI Immunogenetics datábase > IMGT/HLA > Introduction to the IMGT/HLA Sequence Datábase, cop. 2003. http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla/intro.html [consultado en 2003]. Todos los cebadores se diseñaron para tener una temperatura de fusión entre 58 y 60 °C, y las sondas entre 65 y 67 °C, para asegurar que las reacciones de PCR trabajasen bajo las mismas condiciones. Mientras que la mayoría de sondas están unidas al extremo 3' del marcador de ocultador TAMRA, en algunas de ellas se usó un ocultador no fluorescente (sonda MGB) para poder usar sondas más cortas pero manteniendo la temperatura de fusión. Cada reacción de PCR se llevó a cabo en un volumen final de 20 μl que contenía los siguientes componentes: Tampón A (TaqMan® 1000 Rxn Gold / Tampón A Pack, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), 0.46 u de AmpliTaq Gold, MgCI2 [ver las concentraciones finales en la TABLA 4], 200 μM de cada dNTP, cebadores, una sonda FAM, una sonda VIC (en la TABLA 4 se detallan las mezclas de cebadores y las sondas usadas en cada tubo, y sus concentraciones finales), 25 nM de cada cebador de GAPDH, 75 nM de la sonda GAPDH-TET y 50- 100 ng de ADN. Las amplificaciones se llevaron a cabo en un 7700 SDS (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) que detectó y grabó la emisión de fluorescencia durante el proceso de amplificación en tiempo real. Después de una desnaturalización inicial a 95 °C durante 10 min, las muestras se sometieron a 40 ciclos de temperatura de un paso de desnaturalización a 95 °C durante 20 s y de un paso de hibridación/extensión a 64 °C durante 1 min. Las sondas Taqman fueron adquiridas a Applied Biosystems, Foster City, CA, USA: FAM (6-carboxi-fluoresceina), VIC, TET (6-carbox¡-4,7,2*,7'-tetracloro- fluoresceína), TAMRA (6-carbox¡-N,N,N',N*-tetramet¡l-rodam¡na) y MGB (ligando de surco menor de ADN).
La TABLA 1 muestra las secuencias y la posición del extremo 3' de los cebadores usados. Las posiciones de los cebadores de GAPDH se refieren a la secuencia del GenBank con el número de acceso J04038. El asterisco indica que estos cebadores están descritos en O. Olerup et al., "HLA-DR typing by PCR amplification with sequence specific cebadores (PCR-SSP) in 2 hours: an altemative to serological DR typing in clinical practice ¡ncluding donor-recipient matching in cadaveric transplantation", Tissue Antigens 1992, vol. 39, pp. 225-35. El símbolo # indica que el cebador está descrito en K. Kotsch et al., "Sequencing of HLA class II genes based on the conserved diversity of the non coding regions: sequencing based typing of HLA-DRB genes", Tissue Antigens 1999, vol. 53, pp. 486-97. RN indica el número de registro de CAS. En las secuencias degeneradas de cebadores, el símbolo Y indica C o T, S indica G o C, y K indica G o T. Construcción de un patrón de fluorescencia: El patrón para la interpretación de las señales positivas se dedujo comparando las secuencias de los cebadores y de las sondas usadas en cada reacción y las secuencias de todos los alelos publicados. En algunos casos los resultados predichos se modificaron por los resultados observados que se obtuvieron con las muestras de ADN durante la puesta a punto del método. La FIG. 2 muestra el patrón de fluorescencia resultante.
Validación del método de genotipificación
Muestras de ADN y reacción de PCR: Para validar el método se seleccionaron al azar doscientas muestras de pacientes trasplantados y de donantes sanos. El ADN genómico de estas muestras se obtuvo mediante un método estándar de precipitación de ácidos nucleicos. La reacción de PCR para estas muestras se llevó a cabo como en la puesta a punto del método descrito anteriormente. Un ejemplo de la tipificación del HLA-DRB de una muestra de ADN con el nuevo método, se presenta en la FIG. 1.
Análisis de datos e interpretación
Para la tipificación fluorogénica del HLA-DRB, la amplificación por PCR de una muestra se realizó en paralelo con las 16 mezclas de cebadores y sondas. La presencia de un producto de PCR se asoció con un incremento significativo en la emisión de fluorescencia del correspondiente marcador de revelador. En la TABLA 5 se detallan las especificidades HLA-DRB detectadas por cada reacción.
Comparación con otros métodos de genotipificación
Independientemente, todas las muestras se tipificaron por métodos convencionales basados en la PCR, como la PCR-SSO, la PCR-SSP o la tipificación basada en la secuencia ("sequence-based typing", SBT). Las doscientas muestras analizadas para validar la técnica dieron resultados que fueron concordantes en todos los casos con los tipos HLA obtenidos previamente con los métodos convencionales de tipaje de ADN, como se muestra en la TABLA 6. Se observó una reducción importante en la proporción de los resultados ambiguos obtenidos por el nuevo método comparado con los métodos estándar de baja resolución como la PCR-SSP y la PCR-SSO. Con el nuevo método, en algunos casos se consiguió una resolución intermedia-alta de la tipificación.
TABLA 1. Secuencias y posición de los cebadores 3' usados.
Cebador Secuencia Posición Referencia
E02* TCCTGTGGCAGCCTAAGAGG exon 2-126 RN 213397-50-3 SEQ ID NO: 1
E04* ACGTΓTCTTGGAGCAGGTTAAAC exon 2-124 RN 590447-87-3 SEQ ID NO: 2
E2-100 FW GCACGTTTCTTGGAGTACTCTACG exon 2-123 RN 149782-49-0 SEQ ID NO: 3
E2-144C RV TCCGTCCCGTTGAAGAAAT exon 2-134 SEQ ID NO: 4
E2-201 FW CGCTTCGACAGCGACGT exon 2-219 RN 134193-51-4 Acc. No. BD104297 SEQ ID NO: 5
E2-201 RV CACGTCGCTGTCGAAGCG exon 2-201 SEQ ID NO: 6
E2-210 RV TACTCCCCCACGTCGCTG exon 2-210 SEQ ID NO: 7
E2-322 RV CYCCGTAGTTGTGTCTGCA exon 2-322 SEQ ID NO: 8
11-04 FW CTTCTGTAACCGGATCGTTCTT intron 1-475 SEQ ID NO: 9
11-07 FW GΪCAGΪ I I I I I CCCÜGAGA intron 1-450 SEQ ID NO: 10
11-Com FW TTCGTGTCCCCACAGCAC exon 2-103 RN 451718-32-4 SEQ ID NO: 11
12-15 RV CCGCGGCCATGCTCAC intron 2-1 SEQ ID NO: 12
12-1 Com RV CGCGCCGCGCTCAC intron 2-1 SEQ ID NO: 13
12-45 RV CACACACACACACACACTCAGATTC intron 2-43 SEQ ID NO: 14
I2-RB7# ACACACACACTCAGATTCTCC intron 2-40 RN 259466-27-8 Acc. No. AX001239 SEQ ID NO: 15
DRB3 102-FW ACGTTTCTYGSAGCTGYKTAA exon 2-102 SEQ ID NO: 16
DRB4 115-FW CAGGCTAAGTGTGAGTGTCATTTCC exon 2-115 SEQ ID NO: 17
DRB4328-RV CTCTCCACAACCCCGTAGTTGTA exon 2-328 RN 515893-57-9 SEQ ID NO: 18
DRB5 102-FW A(C/T)GTTTCTTGCAGCAGGATAAGTA exon 2-102 SEQ ID NO: 19
GAPDH FW AAGGTGGTGAAGCAGGCGT exon 8-4476 SEQ ID NO: 20
GAPDH Intron H TCTGAGCCAGCCACCAGAG intron H-4671 SEQ ID NO: 21 TABLA 2. Secuencias, marcadores fluorescentes, temperaturas de fusión y posición de las sondas fluorogénícas usadas. Todas las sondas HLA-DRB se sitúan en el exón 2. La posición de la sonda de GAPDH está referida a la secuencia del GenBank con el número de acceso J04038. Un asterisco significa sonda MGB.
MarcaTm SEQ ID
N° Sonda Secuencia Posición dor (°C) NO:
1F EVH CACTCATGTTTAACCTGCTCCAAGAAACG FAM 66.3 130-103 22
1V WQG TTACCCTGCCACAGGAAACGTGC VIC 66 122-100 23
2F K-D AGAAATGACACTCAAACTTATCCTGCTTCAAGA FAM 65.8 139-107 24
2V EEV CTCAAACTTAACCTCC VIC* 66.2 129-114 25
3F WQLF ATGACATTCAAACTTAAGCTGCCACAAGAAA FAM 66.2 135-105 26
3V EYSTS TCAGACGTAGAGTACTC VIC* 66.5 128-113 27
4F EYSTG AGAAATAACACTCACCCGTAGAGTACTCCAAGAA FAM 65.6 138-106 28
4V P-R ACTCCCTCTTAGGCTGCCACAGGA VIC 65.2 129-107 29
5F EQA CGGCCCGCGCCTGCT FAM 66.6 307-293 30
5V, 13V KDFL TGTCTTCCAGGAAGTCCTTCTGGCTG VIC 66.6 298-273 31
6F FDYF TACTTCCATAACCAAGAGGAG FAM* 66.6 175-195 32
6V, 15V YFHN TACTTCCATAACCAGGAGG VIC* 66.4 175-193 33
7F AEH TGTTCCAGTGCTCCGCAGCAG FAM 65.6 271-251 34
7V RPDE TCCAGTACTCCTCATCAGGCCGC VIC 65.5 271-249 35
8F GEFR CGCCCGGAACTCCCCCA FAM 66.1 235-218 36
8V EQR CGGCCCGCCTCTGCTCC VIC 66.2 308-291 37
9F EDER CGGCCCGCTCGTCTTCCA FAM 66.5 307-290 38 V EDKR CGCGGCCCGCTTGTCTTC VIC 65.9 308-292 39
10F VAES TCCAGGACTCGGCGACAGGC FAM 66.7 271-251 40
10V PSAE TACTCGGCGCTAGGCCGCC VIC 66.4 266-248 41
11F RALV TAGGTGTCCACCAGGGCCCG FAM 66 320-301 42
11V EQK-Q CCGGCCCCGCTTCTGCT VIC 65.5 309-293 43
12F VGE TGAAGCTCTCACCAACCCCGTAGTTG FAM 66 355-330 44
12V WE TGAAGCTCTCCACAACCCCGTAGTTG VIC 66 355-330 45 3F KDIL TCCAGGATGTCCTTC FAM* 66.9 294-279 46 4V RAAV AGGTGTCCACCTCGGCCCG VIC 66.4 319-301 47 6F PDAE TTCCAGTACTCAGCGTCAGGCCG FAM 66.4 272-250 48 4490- 49 GAPDHexδ CAAGGGCATCCTGGGCTACACTGA TET 67.1 4513 TABLA 3. Preparación de las mezclas de cebadores. La concentración final de las mezclas fue de 12.5 μM excepto la mezcla 10 que era a 50 μM. El símbolo * indica una concentración para ese cebador de 1.56 μM; el símbolo # indica 5 μM; y el símbolo ∞ indica 25 nM.
Mezcla cebadores sentido cebadores antisentido
1 11-04 FW E2-144C RV 11-07 FW
2 11-Com FW E2-210 V
3 H-Com FW E2-201 RV
4 E02 E2-322 RV
7 E2-100 FW E2-201 RV
8 E2-100 FW E2-322 RV
5 E2-201 FW 12-45 RV
12 E2-100 FW* 12-1 Com RV* E02* 12-15 RV*
9 E04 I2RB7
10 DRB5 102-FW E2-322 RV DRB3 102-FW
11 DRB4 115-FW DRB4327-RV
GAPDH GAPDH FW" GAPDH Intron H"
TABLA 4. Cantidades de reactivos para la PCR (en ul)
Tubos 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 10 mezcla de cebadores 1 2 3 3 4 7 8 5 5 5 5 5 12 9 11 (50 μM) sonda FAM 1 F 2F 3F 4F 5F 6F 7F 8F 9F 10F 11F 12F 13F 15F
O 16F c_
> sonda VIC 1V 2V 3V 4V 5V 6V 7V 8V 9V 10V 11V 12V 13V 14V 15V D m tampón A 10x 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2
CΛ MgCI225 mM 4 2,4 4 3,2 2,4 2,4 3,6 2,4 2,4 3,2 1 ,6 3,2 1 ,6 1 ,6 2,4 2,4 c
CΛ dNTPs 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 mezcla cebadores 12,5 μM 1,25 1,25 1 ,25 1,25 1 ,25 1 ,25 1 ,25 1,25 1,25 1,25 1,25 1 ,25 2,5 1 ,25 2 1 ,25 c o FAM 5 μM 0,6 1 1 1 0,6 1 0,6 0,6 1 0,4 0,4 0,7 0,5 0,8 0,6 VIC 5 μM 0,6 1 1 0,8 0,6 1 0,6 0,8 1 1 0,4 0,7 1 0,6 1
73 cebadores GAPDH 1 μM 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 m O GAPDH-TET 15 μM 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 H2O 3,85 4,65 3,05 4,05 5,45 4,65 4,25 5,25 4,65 4,45 6,65 4,45 4,7 6,85 4,1 6,05 r σ> volumen total de reactivos 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 volumen "master mix" de 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 reactivos para PCR volumen final por tubo 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20
TABLA 5. Cebadores v sondas usados en cada tubo v especificidades detectadas en cada reacción.
Figure imgf000019_0001
TABLA 6. Concordancia de resultados del nuevo método de tipificación v otros métodos usados. Se indica el número de muestras para cada tipo de análisis. grupo tipificación PCR- nuevo método concordancia alélico SSO y PCR-SBT de tipificación DRB1*01 38 38 100% DRB1*03 55 55 100% DRB 1*04 44 44 100% DRB1*07 69 69 100% DRB1*08 10 10 100% DRB 1*09 8 8 100% DRB1*10 3 3 100% DRB1*11 62 62 100% DRB1*12 11 11 100% DRB1*13 47 47 100% DRB1*14 14 14 100% DRB1*15 31 31 100% DRB1*16 8 8 100% DRB3 165 165 100% DRB4 109 109 100% DRB5 37 37 100%

Claims

REIVINDICACIONES
1. Método para determinar el genotipo de los loci DRB del antígeno leucocitario humano ("human leukocyte antigen DRB", HLA-DRB) a partir de una muestra de ácido nucleico, que comprende los pasos de:
(i) amplificar cualquier ácido nucleico que comprende el exón 2 de al menos uno de los genes de los loci DRB mediante la reacción en cadena de la polimerasa ("polymerase chain reaction", PCR) en tiempo real;
(¡i) detectar señales de fluorescencia mediante sondas nucleotídicas marcadas fluorescentemente durante la amplificación llevada a cabo en el paso (i), en condiciones en las que dichas sondas específicamente se unen a las secuencias de ácidos nucleicos amplificadas; y
(iii) comparar más de una señal detectada en el paso (ii) con un patrón de fluorescencia experimentalmente definido; habiendo sido dicho patrón establecido mediante una definición inicial basada en la comparación teórica de las secuencias de sondas nucleotídicas del paso (ii) con las secuencias de los diferentes alelos de los genes seleccionados del (i), seguido de una definición definitiva basada en una determinación experimental de cuales de las señales teóricas son en realidad positivas (cuadrados negros en la FIG. 2) y cuales en realidad son negativas (cuadrados blancos en la FIG. 2);
donde los pasos (i) y (ii) se llevan a cabo en el mismo tubo y sin ninguna manipulación adicional de la muestra.
2. Método según la reivindicación 1 , donde los genes de los loci DRB en el paso (ii) se seleccionan del grupo formado por DRB1, DRB3, DRB4 y DRB5.
3. Método según la reivindicación 2, donde el paso de amplificación (i) se lleva a cabo con dos o más cebadores los cuales son hebras simples de ácidos nucleicos teniendo una longitud de 10 a 30 nucleótidos y que comprenden secuencias complementarias a secuencias de una región situada a lo largo de intrónl -exón 2-intrón 2 de al menos uno de los genes seleccionados del grupo formado por DRB1, DRB3, DRB4 y DRB5.
4. Método según la reivindicación 3, donde la longitud de los cebadores es de 14 a 24 nucleótidos.
5. Método según la reivindicación 4, donde las secuencias del cebador se seleccionan del grupo formado por SEQ ID NO: 1-19.
6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 2-5 donde el paso de detección (ii) se lleva á cabo con una o más sondas las cuales son hebras simples de ácidos nucleicos con una longitud de 10 a 45 nucleótidos y las cuales comprenden secuencias complementarias a secuencias de una región situada a lo largo de exón 2 de al menos uno de los genes seleccionados del grupo formado DRB1, DRB3, DRB4 y DRB5.
7. Método según la reivindicación 6, donde la longitud de las sondas es de 13 a 34 nucleótidos.
8. Método según la reivindicación 7, donde las secuencias de las sondas se seleccionan del grupo formado por SEQ ID NO: 22-48.
9. Método según la reivindicación 7, donde las secuencias de las sondas se seleccionan de las secuencias complementarias del grupo formado por SEQ ID NO: 22-48.
10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 6-9, donde las sondas se marcan con fluorocromos del tipo marcador de revelador-marcador de ocultador ("repórter label-quencher label"), y las sondas se degradan debido a la actividad exonucleasa 5'->3' de la polimerasa del ADN.
11. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dos cebadores para el gen de gliceraldehidofosfato deshidrogenasa (GAPDH) con SEQ ID NO: 20 y SEQ ID NO: 21 , y una sonda para GAPDH con SEQ ID NO: 49 se añaden como control.
12. Kit para determinar el genotipo de los loci DRB del antígeno leucocitario humano (HLA-DRB) a partir de una muestra de ácido nucleico mediante la realización del método de la reivindicación 1 , que comprende: (i) cebadores para amplificar los ácidos nucleicos de al menos uno de los genes de los loci HLA-DRB mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real;
(ii) sondas nucleotídicas marcadas fluorescentemente para detectar las señales de fluorescencia durante la amplificación; y
(iii) patrones de fluorescencia definidos experimentalmente para comparar las señales detectadas, habiendo sido establecidos dichos patrones mediante una definición inicial basada en la comparación teórica de las secuencias de sondas nucleotídicas con las secuencias de los diferentes alelos de los loci HLA-DRB, seguido de una definición definitiva basada en una determinación experimental de cuales de las señales teóricas en realidad son positivas (cuadrados negros en FIG. 2) y cuales son en realidad negativas (cuadrados blancos en FIG. 2).
13. Kit según la reivindicación 12, donde los genes de los loci DRB se seleccionan del grupo formado por DRB1 , DRB3, DRB4 y DRB5.
14. Kit según la reivindicación 13, donde los cebadores son ácidos nucleicos de hebra simple que tienen una longitud 10 a 30 nucleótidos y que comprenden secuencias complementarias a secuencias de la región situada a lo largo de intrón 1-exón 2-intrón 2 de al menos uno de los genes seleccionados del grupo formado DRB1 , DRB3, DRB4 y DRB5.
15. Kit según la reivindicación 14, donde la longitud de los cebadores es de 14 a 24 nucleótidos.
16. Kit según la reivindicación 15, donde las secuencias de cebador se seleccionan del grupo formado por SEQ ID NO: 1 -19.
17. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 13-16, donde las sondas son ácidos nucleicos de hebra simple que tienen una longitud 10 a 45 nucleótidos y que comprenden secuencias complementarias a secuencias de la región situada a lo largo de exón 2 de al menos uno de los genes seleccionados del grupo formado por DRB1 , DRB3, DRB4 y DRB5.
18. Kit según la reivindicación 17, donde la longitud de las sondas es de 13 a 34 nucleótidos.
19. Kit según la reivindicación 18, donde las secuencias de las sondas se seleccionan del grupo formado por SEQ ID NO: 22-48.
20. Kit según la reivindicación 18, donde las secuencias de las sondas se seleccionan de las secuencias complementarias del grupo formado por SEQ ID NO: 22-48.
21. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 17-20, donde las sondas se marcan con fluorocromos de tipo marcador de revelador-marcador de ocultador ("repórter label-quencher label"), y las sondas se degradan debido a la actividad exonucleasa 5'->3' de la polimerasa del ADN.
22. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 12-21 , donde dos cebadores para el gen gliceraldehidofosfato deshidrogenasa (GAPDH) con SEQ ID NO: 20 y SEQ ID NO: 21 , y una sonda para GAPDH con SEQ ID NO: 49 se añaden como control.
23. Kit para determinar el genotipo de los loci DRB del antígeno leucocitario humano (HLA-DRB) a partir de una muestra de ácido nucleico mediante la realización del método de la reivindicación 1 , que comprende:
(i) cebadores para amplificar los ácidos nucleicos de al menos uno de los genes de los loci HLA-DRB mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real, siendo las secuencias de estos cebadores seleccionadas del grupo formado por SEQ ID NO: 1-19;
(ii) sondas nucleotídicas marcadas fluorescentemente para detectar las señales de fluorescencia durante la amplificación, siendo las secuencias de estas sondas seleccionadas del grupo formado por SEQ ID NO: 22-48.
(iii) dos cebadores para el gen gliceraldehidofosfato deshidrogenasa (GAPDH) con SEQ ID NO: 20 y SEQ ID NO: 21 , y una sonda para GAPDH con SEQ ID NO: 49 añadidos como control; y (iv) patrones de fluorescencia definidos experimentalmente para comparar las señales detectadas, habiendo sido establecidos dichos patrones mediante una definición inicial basada en la comparación teórica de las secuencias de sondas nucleotídicas con las secuencias de los diferentes alelos de los loci HLA-DRB, seguido de una definición definitiva basada en una determinación experimental de cuales de las señales teóricas en realidad son positivas (cuadrados negros en FIG. 2) y cuales son en realidad negativas (cuadrados blancos en FIG. 2).
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