WO2005040214A1 - Facteur viii viralement securise a faible teneur en multimeres superieurs - Google Patents

Facteur viii viralement securise a faible teneur en multimeres superieurs Download PDF

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Abdessatar Chtourou
Michel Nogre
Roland Schmitthaeusler
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    • G01N33/86—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood coagulating time or factors, or their receptors

Definitions

  • the present invention relates to a composition of Factor NUI of virally secure plasma origin, obtained after nanometric filtration, comprising von Willebrand Factor (FvW) at a rate less than or equal to 15% of higher decamers and multimers.
  • Such compositions have a virus titer reduction factor greater than 4 log and are therefore suitable for the treatment of hemophilia.
  • NUI factor or anti-hemophilic factor is a plasma protein present in low concentration in human plasma. This factor catalyzes the biochemical reactions of blood coagulation by increasing the reaction speed to lead to the formation of a hemostatic fibrin clot obtained from soluble fibrinogen subjected to the action of thrombin in the presence of calcium.
  • the NUI factor intervenes in the cascade of reactions leading to thrombin formation which is the enzymatic activity responsible for the transformation of fibrinogen into fibrin.
  • the central point of coagulation therefore rests on the presence and activation of FNIII. Hemophiliac individuals, deficient for FNIII, are treated by injection of these purified FNIII obtained either by genetic recombination or by extraction from human plasma.
  • virus inactivation and / or elimination processes must be applied in order to protect hemophiliacs treated by these concentrates from any infection due to viruses transmissible by blood or its derivatives: hepatitis A virus, B, C, NIH or parovirus B 19 ....
  • one of the essential problems linked to the preparation of factor NUI from plasma lies in the need to inactivate and / or eliminate viruses originally contained in the blood at least according to regulatory standards while maintaining an optimum yield. factor after the process.
  • Many viral inactivation techniques have thus been developed such as dry heating, pasteurization, solvent-detergent treatment. All of these techniques are relatively effective with regard to enveloped viruses, but the inactivation or elimination of naked viruses, in particular small viruses such as parvo virus B19 or the hepatitis A virus, constitutes a major obstacle.
  • Newer technologies use the viral retention capabilities of small pore size membranes. These technologies actually have a notable effectiveness with regard to small viruses such as parvovirus B19 or the hepatitis A virus and can be applied to proteins of low molecular weight. However, the cutoff thresholds used, which are less than 900 kD, do not allow the filtration of proteins or protein complexes of high molecular weight such as the NUI factor without major loss of yield.
  • the NUI factor is presented as a complex protein structure of an active protein, FNIII, transported by a high molecular weight protein to which FNIII is linked by ionic and hydrophobic bonds.
  • the high molecular weight protein is the Von Willebrand factor (FvW) consisting of a set of elementary monomers having a variable degree of multimerization leading to structures assembled in tetramer up to buildings comprising more than sixteen monomers.
  • VW Von Willebrand factor
  • the final product may contain FvW at various degrees of multimerization (METZ ⁇ ER, HERME ⁇ TL et al. - Haemophilia (1998), 4 (Suppl. 3), 25-32).
  • the assurance of virus elimination by means of filters is guaranteed by validation methods carried out on the filter after passage of FNIII solution. These methods can for example be the measurement of gas diffusion through the membrane or, in the case of curophane filters, the measurement of the passage of calibrated colloidal gold particles through the filter.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition of factor NUI of plasma origin whose viral safety corresponds to a reduction factor greater than 4 log, which meets the safety requirements in terms of elimination of virus by filtration.
  • the composition of FNIII thus secured is characterized by a low residual rate of FvW of high multimerization.
  • the invention relates to a composition of Factor NUI of plasma origin, obtained after filtration through a nanometric filter with nominal pore opening of 15 ⁇ 2 nm to 23 ⁇ 2 nm, characterized in that it comprises Von Willebrand factor (FvW) at a rate less than or equal to 15% higher decamers and multimers.
  • the titer reduction factor for a virus with a size of 27 ⁇ 3 nm is greater than or equal to 4 log, preferably 5 log, advantageously 6 log compared to the solution before filtration.
  • composition may be in the form of a solution for injection by the intravenous, intramuscular or subcutaneous route for example.
  • the invention also relates to the correlation between the presence of at most 15% higher decamers and multimers of FvW with a viral titer reduction factor of at least 4 log.
  • the invention relates to a method for testing the. viral security of a Factor NUI composition of plasma origin, said method comprising a step consisting in determining the residual level of FvW of high multimerization.
  • a composition is virally secure in the case where less than 15% of higher decamers and multimers of FvW are detected.
  • the invention relates to a test kit making it possible to implement the method mentioned above comprising the reagents necessary for the assay of FvW multimers with a degree of multimerization greater than or equal to 10.
  • the invention also relates to a process for the preparation of a virally secure factor NUI solution comprising a step of filtration through " nanometric filters with nominal pore opening of between 15 ⁇ 2 nm and 23 ⁇ 2 nm, ie a interval of 13 mil at 25 nm, a step of assaying von Willebrand Factor (FvW) of higher decamers and multimers.
  • the assay step preferably consists of checking that the level of higher decamers and multimers of FvW is less than or equal
  • a sample is subjected to gel electrophoresis allowing the multimers to be separated by their size.
  • the multimers are visualized using an anti-FvW antibody labeled with 1-125 or other markers.
  • an anti-FvW can also be used of rabbit (Darko corp, USA) and a second anti-rabbit Ig antibody conjugated with horseradish peroxidase (HRP) and visualize the multimers using a commercially available chemiluminescent kit (ECL detection kit, Amersham Pharmacia) to detect HRP on western blots.
  • HRP horseradish peroxidase
  • solutions of factor NUI are obtained whose factor of reduction of the titer of a virus with a size of 27 ⁇ 3 nm is greater than or equal to 4 log, preferably 5 log, advantageously 6 log .
  • the NUI factor solution before filtration optimally comprises a chaotropic ion, for example CaC12, at a concentration greater than or equal to 0.2 M, for example 0.25 or 0.35 M.
  • the invention also relates to the use of a composition mentioned above for preparing a medicament intended for the treatment of diseases related to blood clotting, in particular hemophilia.
  • Example 1 Process for the preparation of FNIII secured by filtration on a 15 nm nanometric filter and verification of the FvW content of multimerization> 10.
  • viruses tested are bacteriophages Phi X 174, non-enveloped viruses, of diameter
  • the virus culture and their titration are carried out in accordance with the AF ⁇ OR standard: ⁇ F T 72-181.
  • the FNIII is collected at the outlet of the Toyopearl DEAE column and brought to pH 6; the CaC12 concentration is brought to 0.35 M.
  • the temperature of the solution and of the filter is thermostatically controlled at 35 ° C. and the filtration pressure is adjusted to less than 100 mbar.
  • the flow rate is 1.2 1 / h per m2.
  • the yield of FNIII: C is approximately 70% compared to FNIII: C before filtration.
  • Table I gives the distribution of FvW multimers.
  • Table I Distribution of multimers (Planova® 15 ⁇ ) There is a significant decrease in decamers / pentadecamers: the distribution goes from 15% to 9%.
  • Example 2 Process for the preparation of FNIII secured by filtration on a nanometric filter of 20 nm and verification of the FvW content of multimerization> 10.
  • Table II gives the composition of the FvW multimers.
  • Table II Distribution of FvW multimers (Planova P21). Decamers-pentadecamers are significantly reduced from 13% to 10%. Hexadecamers are drastically reduced from 11% to 2%. The viral titer reduction factor is 4.3 log.
  • Example 3 Filtration at high pressure and through a porosity of approximately 20 nm
  • the FNIII solution is adjusted to pH 6 and the CaC12 concentration is brought to 0.35 M.
  • the temperature is 22 ° C and the pressure is adjusted to 400 mbar.
  • Decamers-pentadecamers are reduced from 13% to 8%. Hex and more are reduced from 10% to 7%.
  • the viral titer reduction factor is 6.1 log.
  • Example 4 test on a 20 nm polysulfone type filter at high pressure.
  • n ° 3 was put in place to evaluate the behavior of the higher pressure cuprophane filter, so as to collect observations under similar conditions.
  • the FNIII solution is brought to pH6 in the presence of CaCl2 at 0.35 M.
  • the solution and the filter are thermostatically controlled at 35 ° C.
  • the pressure required to implement the filter is 950 mbar. Under these conditions, the average flow rate is 71 / h per m2.
  • the NUI Factor yield is 70% compared to the initial FNIII. Table IN gives the composition in multimers of FvW.
  • the hexadecamers undergo a drastic reduction from 10% to 6%.
  • Table N shows the sum of the values of the multimers from the decamer, we see that: when the sum of higher decamers and multimers of FvW is at most equal to 15%, the reduction in viral titer is always> 4 log. On the other hand, if this sum exceeds 16%, the reduction in the viral titer is less than 4 log.
  • Example 1 Example 2
  • Example 3 Example 4 Before After Before After Before After Before After Before After Before After After After After
  • Multimomme 10-15 15% 9% 13% 10% 13% 8% 27% 12% Multimomme 16 and + 11% 4% 10% 2% 10% 7% 10% 6%

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Abstract

La présente invention se rapporte à une composition de Facteur VIII d’origine plasmatique sécurisé viralement, obtenue après filtration nanométrique, comprenant du Facteur von Willebrand (FvW) à un taux inférieur ou égal à 15 % des décamères et multimères supérieurs. De telles compositions présentent un facteur de réduction du titre des virus supérieur à 4 log et sont donc adaptées pour le traitement de l’hémophilie.

Description

Facteur NIII viralement sécurisé à faible teneur en multimères supérieurs
La présente invention se rapporte à une composition de Facteur NUI d'origine plasmatique sécurisée viralement, obtenue après filtration nanométrique, comprenant du Facteur von Willebrand (FvW) à un taux inférieur ou égal à 15 % de décamères et multimères supérieurs. De telles compositions présentent un facteur de réduction du titre des virus supérieur à 4 log et sont donc adaptées pour le traitement de l'hémophilie.
Le disponibilité en facteur de coagulation est en depuis un certain temps un problème de santé public. Pour répondre à la demande, les industriels ont développés des techniques de production de facteurs recombinants dont on pensait qu'elles pourraient à terme supplanter la fabrication à partir de pool de plasma. Toutefois, les quantités produites apparaissent encore insatisfaisante et les investissements pour le développement de ces produits sont conséquents. Par ailleurs, une réaction immunitaire contre ces facteurs recombinants est observée chez les patients, ce qui implique l'administration de dose élevée pour aboutir à l'effet thérapeutique souhaité. Enfin, certains patients ne tolèrent pas les facteurs recombinants.
Ainsi, la production de facteurs de coagulation d'origine plasmatique reste un enjeu important.
Le facteur NUI ou facteur anti-hémophilique est une protéine plasmatique présente en faible concentration dans le plasma humain. Ce facteur catalyse les réactions biochimiques de la coagulation du sang par augmentation de la vitesse de réaction pour aboutir à la formation d'un caillot de fibrine hémostatique obtenu à partir du fibrinogène soluble soumis à l'action de la thrombine en présence de calcium. Le facteur NUI intervient dans la cascade de réactions aboutissant à la thrombinoformation qui est l'activité enzymatique responsable de la transformation du fibrinogène en fibrine. Le point central de la coagulation repose donc sur la présence et l'activation du FNIII. Les individus hémophiles, déficients pour le FNIII, sont traités par injection de ces FNIII purifiés obtenus soit par recombinaison génétique, soit par extraction du plasma humain.
Dans ce dernier cas, des procédés d'inactivation et/ou d'élimination de virus doivent être appliqués afin de protéger les hémophiles soignés par ces concentrés de toute infection due à des virus transmissibles par le sang ou ses dérivés : virus des hépatites A, B, C, NIH ou parovirus B 19....
Ainsi, un des problèmes essentiels liés à la préparation du facteur NUI à partir du plasma, réside dans la nécessité d'inactiver et/ou d'éliminer des virus originellement contenus dans le sang au minimum selon les normes réglementaires tout en conservant un rendement optimum en facteur à l'issue du procédé. De nombreuses techniques d'inactivation virale ont ainsi été développées telles que le chauffage à sec, la pasteurisation, le traitement solvant-détergent. L'ensemble de ces techniques est relativement efficace vis-à-vis des virus enveloppés mais l'inactivation ou l'élimination des virus nus, notamment des petits virus tels que le parvo virus B19 ou le virus de l'hépatite A, constitue un obstacle majeur.
Des technologies plus récentes utilisent les capacités de rétention virale de membranes de faible taille de pores. Ces technologies présentent effectivement une efficacité notable vis-à-vis de virus de petite taille tels que les parvovirus B19 ou le virus de l'hépatite A et peuvent être appliquées à des protéines de faible poids moléculaire. Cependant, les seuils de coupure utilisés, qui sont inférieurs à 900 kD, ne permettent pas d'envisager la filtration de protéines ou complexes protéiques de haut poids moléculaire comme le facteur NUI sans perte majeure de rendement.
Le facteur NUI se présente comme un édifice protéique complexe d'une protéine active, le FNIII, transportée par une protéine de haut-poids moléculaire à laquelle le FNIII est lié par des liaisons ioniques et hydrophobes. La protéine de haut poids moléculaire est le Facteur von Willebrand (FvW) constitué d'un ensemble de monomères élémentaires ayant un degré de multimérisation variable conduisant à des structures assemblées en tétramère jusqu'à des édifices comportant plus de seize monomères.
Selon les méthodes de purification de FNIII mises en œuvre, le produit final peut contenir du FvW à divers degré de multimérisation (METZΝER, HERMEΝTL et al. - Haemophilia (1998), 4 (Suppl. 3), 25-32).
Or, dans notre brevet FR 97 15888, nous avons décrit qu'il est possible de filtrer le FNIII plasmatique, malgré sa taille, tout en retenant des virus de taille supérieure ou égale à 20 nm, sur des filtres de porosité d'environ 15 nm avec une concentration en ions chaotropiques d'au moins 0,2 M.
Plus récemment, la recherche conduite pour perfectionner ce procédé et choisir différentes natures de matériaux filtrants a fait apparaître que la taille des pores du filtre et les limites techniques peuvent varier selon les fabricants. Ainsi, il est apparu nécessaire de trouver un test rapide et reproductible permettant de vérifier que le produit final répond bien aux exigences sanitaires.
L'assurance de l'élimination des virus par le moyen de filtres est garantie par des méthodes de validation effectuées sur le filtre après passage de solution de FNIII. Ces méthodes peuvent être par exemple la mesure de diffusion gazeuse à travers la membrane ou, dans le cas de filtres en curophane, la mesure du passage de particules d'or colloïdal calibrées à travers le filtre.
Mais aucune méthode ne se réfère au produit filtré lui-même pour déterminer qu'il a subi une filtration capable de retenir les virus dans des proportions fixées.
Une analyse plus fine de la composition des multimères du FNIII avant et après filtration a été réalisée, en même temps qu'une mesure de la réduction du titre viral apportée par la filtration de facteur NUL Nous avons trouvé de façon surprenante et inattendue que l'appauvrissement en multimères de haut poids moléculaire de FvW mesurés dans les filtrats de FNIII est corrélé avec l'efficacité de la rétention de virus par le filtre. En outre, nous avons découvert qu'il est possible de filtrer à environ 20 nm grâce à la vérification de la teneur en multimères. Nous proposons donc un nouveau moyen permettant la production à haut rendement et la caractérisation du FNIII qui répondent aux exigences d'élimination de virus par le filtre nanométrique.
Description
Ainsi, dans un premier aspect, la présente invention porte sur une composition pharmaceutique de facteur NUI d'origine plasmatique dont la sécurité virale correspond à un facteur de réduction supérieur à 4 log, ce qui répond aux exigences de sécurité en matière d'élimination de virus par filtration. La composition de FNIII ainsi sécurisée est caractérisée par un faible taux résiduel de FvW de haute multimérisation.
Plus spécifiquement, l'invention concerne une composition de Facteur NUI d'origine plasmatique, obtenue après filtration à travers un filtre nanométrique d'ouverture nominale de pores de 15±2 nm à 23±2 nm, caractérisée en ce qu'elle comprend du Facteur von Willebrand (FvW) à un taux inférieur ou égal à 15 % de décamères et multimères supérieurs. Dans cette composition, le facteur de réduction du titre d'un virus d'une taille de 27±3 nm est supérieur ou égale à 4 log, de préférence 5 log, avantageusement 6 log comparé à la solution avant filtration.
Cette composition peut se trouver sous la forme d'une solution injectable par voie intraveineuse, intramusculaire ou sous-cutanée par exemple.
L'invention concerne également la corrélation entre la présence de 15 % au plus de décamères et multimères supérieurs de FvW avec un facteur de réduction du titre viral d'au moins 4 log. Ainsi, dans un deuxième aspect, l'invention porte sur un procédé pour tester la. sécurité virale d'une composition de Facteur NUI d'origine plasmatique, ledit procédé comprenant une étape consistant en la détermination du taux résiduel de FvW de haute multimérisation. En particulier, on considérera qu'une composition est sécurisée viralement dans le cas où l'on détecte moins de 15% de décamères et multimères supérieurs de FvW.
Dans un aspect complémentaire, l'invention porte sur un kit de test permettant de mettre en œuvre le procédé mentionné ci-dessus comprenant les réactifs nécessaires pour le dosage des multimères de FvW de degré de multimérisation supérieur ou égal à 10.
L'invention porte également sur un procédé de préparation d'une solution de facteur NUI sécurisée viralement comprenant une étape de filtration à travers des filtres " nanométriques d'ouverture nominale de pores comprise entre 15±2 nm et 23±2 nm, soit un intervalle de 13 mil à 25 nm, une étape de dosage du Facteur von Willebrand (FvW) de décamères et multimères supérieurs. L'étape de dosage consiste de préférence en une vérification que le taux de décamères et multimères supérieurs de FvW est inférieur ou égal à 15 %. Par example, un échantillon est soumis à une électrophorèse sur gel permetttant de séparer les multimères par leur taille. Les multimères sont visualisés en utilisant un anticorps anti-FvW marqué au 1-125 ou d'autres marqueurs. L'intensité lumineuse de chaque bande correspondant chacune à un multimère de FvW est déterminée et le taux limite en multimère supérieur exposé ici est calculé. On peut également utiliser un anti-FvW de lapin (Darko corp, USA) et un second anticorps anti- Ig de lapin conjugué avec la horseradish peroxidase (HRP) et visualiser les multimères au moyen d'un kit chemi-luminescent disponible dans le commerce (ECL détection kit, Amersham Pharmacia) pour détecter HRP sur western blots.
On obtient à l'issue de ce procédé des solutions de facteur NUI dont le facteur de réduction du titre d'un virus d'une taille de 27±3 nm est supérieur ou égal à 4 log, de préférence 5 log, avantageusement 6 log. La solution de facteur NUI avant filtration comprend de manière optimale un ion chaotropique, par exemple CaC12, à une concentration supérieure ou égale à 0.2 M, par exemple 0.25 ou 0.35 M.
L'invention vise également l'utilisation d'une composition mentionnée ci-dessus pour préparer un médicament destiné au traitement des maladies liées à la coagulation sanguine, notamment l'hémophilie.
Exemple 1: Procédé de préparation de FNIII sécurisé par filtration sur filtre nanométrique de 15 nm et vérification de la teneur en FvW de multimérisation > 10.
Les virus testés sont des bactériophages Phi X 174, virus non enveloppés, de diamètre
27 ± 3 nm.
La culture des virus et leur titrage sont effectués conformément à la norme AFΝOR : ΝF T 72-181.
Le FNIII est recueilli à la sortie de la colonne Toyopearl DEAE et amené à pH 6 ; la concentration en CaC12 est portée à 0.35 M. La température de la solution et du filtre est thermostatée à 35 °C et la pression de filtration est ajustée à moins de 100 mbar.
Dans ces conditions, le débit est de 1.2 1/h par m2.
Le rendement en FNIII : C est d'environ 70 % par rapport au FNIII : C avant filtration.
Le tableau I donne la répartition des multimères de FvW.
Facteur vW Avant filtre Après filtre <pentamères 41 % 53 %
5 à 9 mères 34 % 34 %
10 à 15 mères 15 % 9 %
16 mères et + 11 % 4 %
Tableau I : Répartition des multimères (Planova® 15Ν) On constate une diminution significative des décamères/pentadécamères : la répartition passe de 15 % à 9 %.
Pour les hexadecamères et plus, la réduction est encore plus importante : elle passe de ll % à 4 %.
Le titrage des virus PhiX174 démontre une réduction de 6 log à la filtration.
Exemple 2: Procédé de préparation de FNIII sécurisé par filtration sur filtre nanométrique -de 20 nm et vérification de la teneur en FvW de multimérisation > 10.
La filtration a été effectuée sur un filtre de même nature (cuprophane, Piano va) mais de porosité différente (20 à 22 nm), une solution de FNIII obtenue comme dans l'exemple 1 est ajustée à pH 6 et additionnée de CaC12 à 0.45 M. La pression est réglée à 17 mbar et l'ensemble solution et filtre est thermostaté à 35 °C. Dans ces conditions, le débit est de 1.2 1/h par m2 et le rendement de FNIII est de 80 % par rapport au FNIII initial.
Le tableau II donne la composition des multimères de FvW.
Facteur vW Avant filtre Après filtre
< pentamères 47 % 56 % 5 à 9 mères 32 % 34 %
10 à 15 mères 13 % 10 %
16 mères et + 11 % 2 %
Tableau II : Répartition des multimères de FvW (Planova P21). Les décamères-pentadécamères sont significativement réduits et passent de 13 % à 10 %. Les hexadecamères sont drastiquement réduits de 11 % à 2 %. Le facteur de réduction du titre viral est de 4.3 log.
Exemple 3 : Filtration à haute pression et à travers une porosité d'environ 20 nm
Dans le but d'examiner la performance du filtre Planova P21 dans des conditions de pression plus élevées et à température ambiante, la solution de FNIII est ajustée à pH 6 et la concentration en CaC12 est amenée à 0.35 M. La température est de 22 °C et la pression est ajustée à 400 mbar.
Dans ces conditions, la vitesse de filtration atteint 51/h par. m2 et le rendement en Facteur NUI est de 64 % par rapport au produit de départ. Le tableau III donne la composition en multimères de FvW.
Multimères FvW Avant filtre Après
< 5 mères 44 % 50 %
5 à 9 mères 34 % 35 %
10 à 15 mères 13 % 8 %
16 mères et + 10 % 7 %
Tableau III : Répartition des multimères de FvW (Planova P21 à pression élevée)
Les décamères-pentadécamères sont réduits de 13 % à 8 %. Les hexadecamères et plus sont réduits de 10% à 7 %. Le facteur de réduction du titre viral est de 6.1 log.
Exemple 4: test sur filtre de type polysulfone 20 nm à haute pression.
Dans le but de valider un autre type de filtre, un essai de filtration de FNIII a été effectué sur un filtre type polysulfone DN20 (Pall). Ce type de filtre admet des pressions plus élevées que les filtres cuprophane. Ainsi l'exemple n° 3 a été mis en place pour évaluer le comportement du filtre cuprophane à pression plus élevée, de façon à recueillir des observations dans des conditions approchantes.
La solution de FNIII est amenée à pH6 en présence de CaC12 à 0.35 M. La solution et le filtre sont thermostatés à 35°C. La pression nécessaire à la mise en œuvre du filtre est de 950 mbar. Dans ces conditions, le débit moyen s'établit à 71/h par m2. Le rendement en Facteur NUI est de 70 % par rapport au FNIII initial. Le tableau IN donne la composition en multimères de FvW.
Multimères FvW Avant filtre Après filtre
< 5 mères 35 % 53 %
5 à 9 mères 38 % 30 %
10 à 15 mères 27 % 12 % 16 mères et + 10 % 6 %
Tableau IN : Répartition des multimères de FvW (DN20 Pall, polysulfone)
Les hexadecamères subissent une réduction drastique de 10 % à 6 %.
Cependant, la réduction du titre viral n'est que de 2.1 log ce qui est nettement en dessous de la norme fixée par les autorités réglementaires (> 4 log) pour démontrer l'efficacité d'un procédé d'élimination de virus, en vue de réduire la charge virale potentielle d'un produit dérivé du plasma humain.
Conclusion
Le tableau N reprend la somme des valeurs des multimères à partir du décamère, on constate que : lorsque la somme décamères et multimères supérieurs de FvW est au plus égale à 15 %, la réduction du titre viral est toujours > 4 log. En revanche, si cette somme dépasse 16 %, la réduction du titre viral est inférieure à 4 log.
Cette corrélation entre multimères d'ordre 10 et plus de FvW et présence de virus est probablement liée à des phénomènes de passage à travers ces filtres selon les conditions de filtration, la porosité, la nature des matériaux filtrants, la texture du filtre, la géométrie des pores. Tous ces paramètres peuvent avoir une influence sur la rétention ou la non- rétention de virus. Les tests appliqués au filtre donnent, après utilisation, une indication de son efficacité, mais c'est seulement dans le cas de l'invention que le produit filtré, le Facteur NUI accompagné de multimères FNIII caractérisés selon leur degré de multimérisation que l'assurance d'une filtration efficace pour la rétention de virus peut être donnée.
L'efficacité de rétention virale > 4 log est alors reliée à la distribution de multimères de FvW dans le filtrat d'au plus 15 % de multimères de degré de multimérisation > 10. Ces données sont résumées dans le tableau N :
Exemple 1 Exemple 2 Exemple 3 Exemple 4 Avant Après Avant Après Avant Après Avant Après
Multimères 10-15 15 % 9 % 13 % 10 % 13 % 8 % 27 % 12 % Multimères 16 et + 11 % 4 % 10 % 2 % 10 % 7 % 10 % 6 %
Total 26 % 13 % 23 % 12 % 23 % 15 % 37 % 18 %
Facteur de réduction viral (log) 6.0 4.3 6.1 2.1
Tableau N : Corrélation entre le facteur de Réduction (Rf) viral et la composition en multimères FvW > 10 mères.

Claims

REVENDICATIONS
1. Composition de Facteur VIII d'origine plasmatique sécurisé viralement, caractérisée en ce qu'elle obtenue après filtration à travers un filtre nanométrique d'ouverture nominale de pores de 15±2 nm à 23±2 nm et en ce qu'elle comprend du Facteur von Willebrand (FvW) à un taux inférieur ou égal à 15 % de décamères et multimères supérieurs.
2. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que le facteur de réduction du titre d'un virus d'une taille de 27±3 nm est supérieur ou égale à 4 log, de préférence 5 log, avantageusement 6 log comparé à la solution avant filtration.
3. Composition pharmaceutique selon l'une des revendications 1 et 2 se trouvant sous la forme d'une solution injectable par voie intraveineuse, intramusculaire ou sous-cutanée.
4. Procédé pour tester la sécurité virale d'une composition de Facteur NUI d'origine plasmatique obtenue par filtration nanométrique, comprenant une étape consistant en la détermination du taux résiduel de FvW de haute multimérisation.
5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que la détection de moins de 15% de décamères et multimères supérieurs de FvW après filtration nanométrique indique que ladite composition est sécurisée viralement.
6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que la détection de moins de 15% de décamères et multimères supérieurs de FvW est corrélée avec un facteur de réduction du titre viral d'au moins 4 log.
7. Procédé de préparation d'une solution de facteur NUI sécurisée viralement comprenant une étape de filtration à travers des filtres nanométriques . d'ouverture nominale de pores comprise entre 15±2 nm et 23±2 nm, une étape de dosage du Facteur von Willebrand (FvW) de décamères et multimères supérieurs.
8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'étape de dosage consiste en une vérification que le taux de décamères et multimères supérieurs de FvW est inférieur ou égal à 15 %.
9. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'un taux de décamères et multimères supérieurs de FvW inférieur ou égal à 15 % indique que le facteur de réduction du titre d'un virus d'une taille de 27±3 nm est supérieur ou égale à 4 log, de préférence 5 log ou 6 log.
10. Utilisation d'une composition selon l'une des revendications 1 à 3 ou d'une solution de facteur NUI obtenue par le procédé selon l'une des revendications 7 à 9 pour préparer un médicament destiné au traitement des maladies liées à la coagulation sanguine, notamment l'hémophilie.
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