WO2003083478A1

WO2003083478A1 - Face de capteur pour biopuce porteuse de nanoparticules de polyethylene glycolate

Info

Publication number: WO2003083478A1
Application number: PCT/JP2003/003504
Authority: WO
Inventors: Kazunori Kataoka; Yukio Nagasaki; Hidenori Otsuka; Katsumi Uchida; Takehiko Ishii; Yuko Suzuki; Yoshitsugu Akiyama; Seiji Takae
Original assignee: Japan Science And Technology Agency
Priority date: 2002-04-03
Filing date: 2003-03-24
Publication date: 2003-10-09
Also published as: CA2480770A1; KR20040105839A; US20050106570A1; EP1496363A4; EP1496363A1; CN1646912A

Description

明細書ポリエチレングリコール化ナノ粒子を担持するバイオセンサーナツプ表面技術分野

本発明は、バイオアツセィの技術分野に関し、より具体的には、生物学的流体等に含まれる被検体以外の夾雑物による非特異吸着もしくは結合を低減もしくは防止するか、被検体の検出感度を高めることのできるバイオセンサ一系、ならびに該バイオセンサー系を使用するアツセィ方法に関する。

背景技術

生物学的試料中に存在する被検体を検出する方法として、多種多様な検出様式をもつバイオセンサーが提案されている。そのようなバイオセンサ一の中で、表面プラズモン共鳴（以下、 S P Rともいう）を利用するセンサ一は、金属薄膜の表面およびその近傍における屈折率変化に対して敏感である（例えば、 A. Szabo et al. , Curr. Opin. Strnct. Bio 1. 5 ( 1 9 9 5 ) 6 9 9 - 7 0 5参照）。 S P Rは、表面と複雑な生物学的溶液との間で生じる過程のインサイチュ（i_n situ) での観察が可能であり、そして例えば標識を使用することなくリアルタイムに被検体からのデータが入手できるので、動力学的および熱力学的なパラメ一ターを取得するのに適していることから注目を集めているセンサーの一つである。このような表面をもつバイオセンサ一チップの典型的なものとしては、アマシャムフアルマシアバイオテク（株）から入手できる B I A C O R E (商標）がある。この B I A C O R Eは、末端がカルボキシル化されたデキストランのマトリックスが半透明の状態で金の薄膜上に固定されている。より具体的には、式 H S— R— Y ( Rは 1 0原子を越える鎖の長さを有し、ヘテロ原子で中断されていてもよい炭化水素鎖であり、 Yはリガンド又は生適合性多孔質マトリックスを共有結合させるための活性基である）で表される有機分子を用いて、そのチオール（またはメルカプト）基を介して金、銀などの自由電子金属の薄膜表面へ結合させて密に詰め込まれた単層で該表面を被覆し、次いで、生適合性多孔質マ卜リックスとして、リガンドを結合させるための官能基を有していてもよいァガロース、デキストラン、ポリエチレングリコール等からなるヒドロゲルを共有結合した表面を有するバイオセンサーチップが提供されている（例えば、米国特許第 5 7 6 3 1 9 1号参照。）。このようなバィォセンサーチップ上での生物学的物質、例えば、タンパク質の検出に際しては、 S P Rシグナルの一定の増幅および非特異吸着の防止が達成される。

また、主として、目的とする被検体タンパク質等の測定に際して、生物学的流体中等に存在する夾雑物のセンサーチップ表面への非特異吸着を防止するものとして、支持体上へ硫黄原子（メルカプト基の）を介して結合したスぺ一サー分子（炭素原子数 1〜3 0のアルキレン鎖）に親水性リンカ一部（鎖長 4から 1 5原子の直鎖分子）と固相反応物質（ビォチン誘導体残基）が順に共有結合した表面を有するセンサーチップも提供されている（例えば、米国特許第 3 0 7 1 8 2 3号参照。）。また、 HS—スぺーサ一分子（炭素原子数 1 1のアルキレン鎖） —親水性リンカー（エチレンォキシド単位 3個または 6個からなる鎖）一をベースとする化合物を用い、メルカプト基を介して金表面に自己集成した単層を有するセンサーチップも提供されている（例えば、 Roberts et al.， J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 6548— 6555参照。）。さらに、エチレンォキシド単位が 5— 10, 000の範囲にあるへテロテレケリツクポリマ一を担持する表面をもつセンサーチップを提案されている（WO 01/86301 A 1参照。）。

上述のとおり、このような表面を有するセンサ一チップは S PRシグナルの一定の増幅も達成される。しかしながら、さらなる検出感度を高め得るバイオセンサ一系として、コロイド金（Au) を金薄膜表面（これらの表面には、上記の各文献に記載されているような、デキストラン層、ポリエチレングリコール層を担持しない。）を有するセンサ一チップと組み合わせて使用するものも多数提供されている。一般に、かような系では、コロイド金を使用しない系に比べて、プラズモン角の大きなシフト、広幅なプラズモン共鳴および最低反射率の著しい増大がもたらされること等が、利点として挙げられている（例えば、 L. A. Lyon et al. , Anal. Chem. 1 998, 70, 51 77— 5183、特に、 51 77頁の序の項； J. Am. Chem. Soc. 2000, 122, 9071— 9 077 ； E. Hutter et al.， J. Phys. Chem. B 2001, 105， 1 1 159— 1 1 168 ；特開 2002— 267669号公報、特開 20 00 - 55920号公報、参照。）。これらの金コロイドまたは金ナノ粒子を S PRの増幅もしくは増強に用いる系のセンサーチップ表面は、共通して、金薄膜上をアルカンチオール（例えば、 3—メルカプトプロピオン酸もしくは 3—メルカプトェチルアミン）等で修飾し、次いでビォチンまたはアビジンもしくはストレプトアビジン、抗体、等を共有結合させている。金コロイドまたは金ナノ粒子は、上記のようなアルカンチォ一ル類を用いるか、または用いることなく、タンパク質を結合（化学的吸着を含む。）して、ピオチン一ストレプトアビジン、抗原一抗体のごとき、生物学的な特異的結合対を形成することにより、上記のセンサ一チップ表面に結合させている。また、 E. Hutter et al. , では、金または銀の支持体（センサーチップ）上に 2—アミノエタンチオール（Α ΕΤ) または 1， 6—へキサンジチオール（HDT) を用いて、直接、金ナノ粒子を固定すると、 Au/AETZAu系は増強された SPR感度を示すが、 AuZHDTZAu系は、金ナノ粒子の増幅効果が相当低くなることが示唆されている（その第 11159頁、序の項参照。）。またさらに、上記のような金ナノ粒子を用いてガラス製センサ一チップ上に自己集成単層を形成すると、可視一 UVスぺクトロフォトメータ一で、チップ表面上で生物分子間の相互作用がリアルタイムに追跡できることも知られている（例えば、 N, Nath et al.， Anal. Cheni. 2002， 74, 504- 509参照。）。

なお、上記のようなバイオセンサ一系を構成するものでないが、バイオアッセィにおける標識として用いる金属粒子の表面をポリエチレングリコール（またはポリエチレンォキシドともいう）のような水溶性で、かつ、水性媒体中でモビリティの高いポリマ一鎖で修飾し、該粒子の分散安定性を改善する方法（W. Pwuelfine et al. , J. Am. Chem. Soc. 120 (48) , 12696— 12697 (1998) ) や、金属粒子表面に結合したポリェチレングリコールの該結合部位の他の末端に機能性化合物の残基を有するポリエチレングリコール化 [以下、 PEG修飾 (PEG modified) ともいう。 ] 金属粒子、半導体粒子または磁性粒子も水性媒体中で分散安定性を示すものとして知られている（Otsuka et al. , J. Am. Chem. So 200 1， 123, 8226— 8230) ；特開 2 00 1 - 200050号公報；特開 200 2— 80903号公報、参照。）。また、半導体ナノ粒子をポリマー（例えば、ジアセチレン、スチレン等で取り囲むようにした粒子を生物学的な物質を検出するためのプローブとして用いることも提案されている（例えば、米国特許第 62 07392号明細書参照。）。

上述の金ナノ粒子を S P Rの感度の向上に用いる系では、金ナノ粒子とバイオセンサ一チップの金薄膜表面との間の距離または粒子と表面との結合様式によって増感効果が異なることが示唆されている（例えば、 N. Nath et al. , 参照。）。したがって、上述のような金ナノ粒子とバィォセンサーチップを用いる系を、米国特許第 5763191号に記載されている系へ適用しても、感度が低下するか、または夾雑物の非特異吸着の防止ができない、可能性がある。

発明の開示

本発明者らは、 B I AC ORE®のセンサ一チップや、ポリエチレングリコール修飾表面をもつセンサーチップと、主として水性媒体中での分散安定性を改善するものとして提供されているポリエチレングリコール修飾金属粒子もしくは半導体粒子を組み合わせて用いると、対応するセンサーチップによるバイオアツセィの感度を高め得るとともに、夾雑物による非特異吸着を防止または抑制できることを見出した。本発明は，かような知見に基づき、完成されたものである。本発明によれば、（A) 構造式 I ：

(X_W²— PEG— W¹— L)_x— PCL—（L— W¹— PEG— ff²— Y)_y ( I ) 式中、 P C Lは自由電子金属微粒子、金属酸化物微粒子または半導体微粒子を表し、

Xはバイオセンサーチップ表面に結合することのできる官能基もしくは機能性部分を表し、

Yは Ci一 C₆アルキル基、 Xの官能基もしくは機能性部分を形成するのに使用できる保護されていてもよい官能基および Xと同一もしくは異なる機能性部分からなる群より選ばれる 1種以上の基もしくは部分を表し. Lは P C Lに結合する基もしくは結合部分を表し、

W¹および W²は、単結合または同一もしくは異なる連結基を表し、

P EGは、エチレンォキシド単位：（一 CH₂CH₂0—）。（ここで、 n は 5— 10， 000のいずれかの整数である。）を表し、

ここで、（X—W²_P EG— W¹— L)*と（L一 W¹— P EG—W²— Y)_y における W²— P E G— W¹— Lは同一もしくは異なることができ、そして

Xおよび yは、独立して 1以上の整数であり、かつ、一緒になって P E G鎖が水性媒体中で P C Lの表面を被覆するのに十分な整数を表すのポリエチレングリコール修飾ナノ粒子と、

(B) (A) の粒子が Xを介して結合することができ、かつガラスなどの誘電体または P C Lの材料に担当する材料からなる表面を有するバィォセンサーチップとのセットを含んでなるバイオアッセィに用いるためのバイオセンサー系が提供される。別の態様の本発明として、前記の構造式 Iにおける Xが生物学的な特異的結合対を形成する一員の残基であり、 Yが生物学的な特異的結合対を形成する残基以外の基であり、

Lは、式

HS-(CH₂)_p- R²0- )_m -

(ここで、 pは 2— 12のいずれかの整数を表し、 R R²および R³ は独立して d— C _βアルキル基を表し、そして mは 2〜100のいずれかの整数を表す）の基を表し、そして X + yは P C Lの表面 1 nm²当たり 0.1— 0.5、好ましくは 0.25— 0.40に相当するいずれかの数であり、（xZx + y) x l O Oが 1一 99、好ましくは 20— 65 の整数であり、そして PCLの横断面の平均寸法が 1一 500 nm、好ましくは 5— 500 nmであるポリエチレングリコール修飾ナノ粒子も提供される。

さらに別の態様の発明として、（a) 前記ポリエチレングリコール修飾ナノ粒子を用意し、

(b) 該ナノ粒子の P C Lの材料に対応する薄膜表面を有し、該ナノ粒子の Xの生物学的な特異的結合対の一員に対する他の一員が直接または少なくとも d— C_eアルキレン基もしくは（一 CH₂CH₂0— _n (ここで、 nは 5— 10, 000のいずれかの整数である）を介して担持された表面を有するバイオセンサーチップを用意し、

( c ) (a) の粒子および（b) のバイオセンサーチップを該生物学的な特異的結合を形成しうる構成員のいずれかの一員を被検体として含むことが疑われる生物学的流体と接触させ、

(d) 被検体の競合作用による（a) の粒子と（b) のバイオセンサ一チップ表面との結合の程度の変化を決定し、

(e) 該変化を生物学的流体中の被検体濃度の指標とする、ことを含んでなる生物学的流体中の被検体の検出方法も、提供される。本発明に従う、（A) の粒子と（B) のバイオセンサ一チップとのセットは、それらが結合（共有結合または非共有結合（例えば、生物学的な特異的結合にみられる疎水結合、イオン結合、化学吸着、等））を形成すると、例えば共鳴ラマン散乱を表面增感効果により増大させる。

特に、自由電子金属微粒子にあっては表面ブラズモン共鳴シグナルの著しい変化（ブラズモン角の大きなシフト、広幅なプラズモン共鳴および最低反射率の増大）がもたらされる。驚くべきことに、このような変化は、バイオセンサーチップ上にかなりの厚さをもつデキストラン層を担持する B I ACORE (商標）センサ一チップと該（A) の粒子が結合した場合にも認められる。

さらに、本発明に従う、（A) の粒子で被覆された（B) のバイオセンサ一チップ表面は、仮に該チップ表面が上記のようなデキストラン層やポリエチレングリコール修飾されていなくても、例えば、生物学的流体中に存在するタンパク質等の非特異的吸着を有意に抑制できる。

図面の簡単な説明図 1は本発明に従う P E G修飾金ナノ粒子とセンサーチップ表面との関係を示す概念図である。 a ) は金属面上に P E G修飾金ナノ粒子が固定された高感度システムの略図であり、（ i ) は非特異的吸着を抑制する P E G鎖を表し、（ϋ ) リガンド分子を表し、そして（ffi ) は S P R 応答を強化する金粒子を表す。 b ) は、競合アツセィ系を構成する略図である。

図 2は 1 a c 6 5とレクチンの特異的結合を確認するために行った実験結果のセンサーグラムである。

図 3は P E G修飾金ナノ粒子表面上のラクトース密度とレクチン固定化表面とのレスポンスの関係を示すグラフである。

図 4はラクトースーレクチンを介して結合した P E G修飾金ナノ粒子とセンサ一チップとのガラクトースの競合による解離状態を示すセンサ一グラムである。

図 5は非結合末端にァミノ基を有する P E G修飾金ナノ粒子のゼ一夕電位の測定結果を示すグラフ（書印の曲線）と非結合末端ァセタール化ホルミル基を有する金ナノ粒子の同様な測定結果を示すグラフ（讕印の曲線）である。

図 6は非結合末端にピオチン残基を有する P E G修飾金ナノ粒子へのタンパク質の担持量を測定した結果を示すグラフである。

図 7は、金チップ表面に非結合末端にアミノ基を有する P E G修飾金ナノ粒子を直接吸着させた表面における各種タンパク質の吸着性を示すグラフである。

図 8は、図 7で用いた金ナノ粒子を S P D Pを利用して金チップ表面に結合させた表面のタンパク質の吸着性を示すグラフである。発明の具体的な記述

本発明に従うバイオセンサー系の特に注視している使用は、表面ブラズモン共鳴（S PR) を利用したバイオアツセィ（生物分子のアツセィ）に向けられているが、本発明にいうアツセィは S P R以外のトレースできるシグナル、放射能、各種電磁波の接触角、沈降、紫外分光、ラマン散乱、等の変化を利用するものも包含する。本発明にいうバイオアツセィが検出対象とする生物分子は、所謂、生物学的な特異的結合対（例えば、生物分子どうしが疎水結合、イオン結合、等によって形成する。）、より具体的には非共有結合対を形成する構成員、リガントとレセプダ一、例えば、抗原もしくはハプテンと抗体、糖とレクチン、基質と酵素、ホルモンとその受容体、オリゴヌクレオチドとそれの相補鎖、ピオチンとアビジンもしくはストレプトアビジン類のごとき結合対を形成するいずれかの構成員であることができるが、これらに限定されない。

本発明にいう「バイオセンサー系」とは、上記のごときアツセィを行うのに用いることのできる各要素またはそれらの集成体もしくは組み合わせ物を意味する。さらに、本明細書では、「微粒子」および「ナノ粒子」は、互換可能に使用されており、特記されない限り、ナノオーダ一のものに限定されることなく、サブナノまたは数マイクロメータ一のものまで包含するものとして用いられている。

以下、本発明の構成について詳述する。

(A) 構造式 Iで表される P E G修飾ナノ粒子に関して

PCLは、自由電子金属（例えば、金、銀、白金、アルミニウム、銅、等）、半導体（例えば、 CdS、 Zn S、 Cd S e、 I nAs等）および金属酸化物（例えば、 T i 0₄、 C r ₂0₃等）からなる群より選ばれる材料製の微粒子であることができる。限定されるものでないが、 1〜 500 nmの平均横断面の寸法を有するものが都合よく利用できる。

Lは、上記粒子表面に結合（化学結合もしくは化学吸着、金属酸化物にあっては、水酸化により生じる表面一 OH基を介する共有結合等）しうる基もしくは部分を介する結合であり、本発明の目的に沿うものであれば、いかなるものであってもよい。し力、し、好ましくは、次式（ i ) - (M) および（ffi)

OR¹

( i) HS— (CH₂)_p―、 (ii) R²0— Si— (CH₂)_p— および

OR³

からなる群より選ばれる基を介する結合を表す（ここで、 pは 2〜1 2 のいずれかの整数を表し、 R R²および R³は独立して d— C₆アルキル基を表し、そして mは 2— 500、好ましくは 5〜 1 00のいずれかの整数を表す。）。かような結合は、例えば（ i ) および（iii) の基または部分（もしくはセグメント）であるときは、上記の粒子表面との間で形成されるものであることができ、また、（ii) の基または部分であるときは、水酸化された金属酸化物表面の一 OHとシラノール基との間の脱アルコール反応を伴って形成される結合であることもできる。 P EGは、エチレンォキシド単位：（一 CH₂CH₂0—） _n (ここで、 nは 5— 10, 000、好ましくは 10〜 10, 000、より好ましくは 20〜2500のいずれかの整数である。）である。

Xはバイオセンサーチップ表面に結合することのできる官能基もしくは機能性部分を表す。官能基もしくは機能性部分は、上記の Lを形成しうるものとして例示した式（i) 、（ii) および（m) で示される基もしくは部分であることもでき、さらに、上記の生物学的な特異的結合対を形成しうる一構成員の残基、ならびにバイオアツセィに影響を及ぼさないタンパク質の残基であることもできる。

該特異的結合対の構成員のうち、一般に分子量の小さいもの、例えば，ハプテン、糖、基質、ホルモン、オリゴヌクレオチド、ピオチン由来の残基が好ましい。

Yは d— C_eアルキル基、 Xについて定義した基もしくは機能性部分またはその保護された形態にある部分または Xとは別の基もしくは機能性部分またはその保護された形態にある基もしくは部分であることができる。 Xとは別の基もしくは部分の代表的なものとしては、次式（iv) 、 (V) および（vi)

および（vi) — C00H

(ここで、 R^aは独立して、水素原子または C,— C_eアルキルを表し、 R^bは独立して C,一 C₆アルキルォキシまたは 2つの R^bが一緒になってォキシもしくは d— Ceアルキルで置換されていてもよいエチレン基を形成する原子団を表す。）で表される基から選ばれるものが挙げられる ₍ Yの好ましいものとしては、上記式（）、（V ) および（vi) 、並びに Xについて定義した、式（i) および C,一 C_eアルキル基からなる群より選ばれる基もしくは部分を挙げることができる。

W¹および W²は独立して、連結基、例えば単結合、 d— C₆アルキレン、 — COO— (酸素原子を介してエチレンォキシド単位のメチレン基に結合する）、一 0—、一 S—、一（d— Ceアルキレン）一 COO—、一（Ct— C_eアルキレン）一 0—および一（d— C₆アルキレン）一 S—からなる群より選ばれる基であることができる。

以上の各基、部分およびまたはセグメントから構成される式（Π) および（m) ：

(Π) X-W²- P E G -W¹- L および

(DO L -W¹- P E G -W²- Y

で表されるポリマーは、上記 Xおよび Yの定義から理解できるように同一であることができるが、異なっていることが好ましい。また、これらの式中の W²— PEG— W'— Lは同一もしくは異なることができる。式 (Π) および式（ΠΙ) で表されるポリマ一は、それぞれ独立して 1以上の整数個（それぞれ、 Xおよび yの整数に対応する。）が単一 PC L表面上に結合する。これらの x+yは、 P C L表面を P E G鎖が被覆するのに十分な整数で存在する。この数は、本発明に従う、ポリエチレングリコール化粒子表面（かような粒子でセンサーチップ表面が被覆された場合にはその被覆表面）に水性媒体中で非特異的なタンパク質等の吸着が抑制できる数であろう。抑制の程度については、後述する実施例を参考にできる。なお、非特異的なタンパク質等の吸着とは、例えば、 Xが生物学的な特異的結合対を形成しうる一員、例えば、抗原である場合に、それに対する抗体が結合するような特異的結合を介するもの以外の吸着を意味する。限定されるものでないが、 x + yの具体的な数は、 PCL 表面 l nm ²当たり 0.1— 0.5、好ましくは 0.25— 0.40となる数に相当するいずれかの数である。 Xと yの割合は、上述のとおり、式 (Π) と式（DI) で表されるポリマーが同一であることができるように、任意であることができる。しかし、後述するような、バイオセンサ一表面と該 P E G修飾粒子との生物学的な特異的結合に対する被検体の競合作用を利用するようなアツセィにおいては、 Xと yの総数当たりの Xの割合は、 1— 99、好ましくは 20— 65であることができる。このような割合で式（Π) (Xが生物学的な特異的結合対を形成する一員である。）のポリマーと式（ID) (Yが Xと異なり、 Xと結合しない基もしくは部分である。）のポリマーを PCL上に配置できる。このような態様の粒子は、迅速かつ、高感度のアツセィを行うことに役立つ。

以上のポリエチレングリコール化粒子の典型的なものは、上述の ots uka et al. , J. Am. Chem. So 2001, 123, 8226— 823 0、特開 2001— 200050号公報、特開 2002— 80903号公報に記載されており、また、これらの記載に準じて製造できる。また、該粒子を形成するために利用できる。特に、ヘテロテレケリックポリマ —は、本発明の一部が提案した、 WO 96/32434. WO 96 /33233 WO 97Z06202に記載するブロックコポリマーの α， ω—末端の機能化を参考すれば、当業者にとって容易に製造できるであろう。

なお、上記の定義中で用いた、 d— Ceアルキル、 C,— C₆アルキルォキシ、 d— C₆ァルキレンが、異なる基または部分について用いられている場合であっても、それらは共通の意味を有する。例えば、 d—

C₈アルキルは、メチル、ェチル、 n—プロピル、 i s o—プロピル、 n—プチル、 s e c.—プチル、 n—へキシル等を表し、 d— C_eアルキルォキシとしては、上記 C !— C ₆アルキルのそれぞれの対応するアルキルォキシが例示される。また、 C!一 C ₆—アルキレンは、メチレン、エチレン、プロピレン、 1, 3— トリメチレン、 1， 6—へキサメチレン等である。

(B) バイオセンサ一チップに関して

バイオセンサーチップは、その表面が上記（A) で詳述した PEG修飾ナノ粒子の X基もしくは部分と結合でき、バイオアツセィに利用できるものであれば、その形状、寸法に制限はない。しかし、好ましくは、その表面はセッ卜で用いられる P C Lを形成する材料と同一もしくは同一のクラス（例えば、自由電子金属の場合、金と金、金と銀；半導体の場合、 C d Sと C d S、 C d Sと I nA s) となるように選ぶのが、 (A) の粒子と該センサーチップから得られる上述のごときシグナルを増強するのに好ましい。しかし、可視一 UVスぺクトロメーターを用いてシグナルを検出する場合には、これらの光を透過するクリスタルまたはガラスであることもできる。該表面は、通常、対応する材料を蒸着させた薄膜であることができる。

このような表面は、上記（A) の粒子における Xの基もしくは部分との結合形成が促進できるように修飾されているか、また、 Xがタンパク質である場合には、材料それら自体であることができる。かような修飾は、式（I) における Lについて記載したような、 PC Lとの結合性を示す基もしくは部分を少なくとも一片末端にもつ有機化合物で行うことができる。例えば、金、銀、半導体から形成された表面をもつチップでは、アルカンチオール（例えば、 3—メルカプトプロピオン酸もしくは 2—メルカプトアミン）を用いて表面を修飾した後、遊離のカルボキシル基もしくはアミノ基を利用して、生物学的な特異的結合対を形成しうる一員（Xの一員に対するもの）を共有結合して好ましい表面を完成することができる。このような表面をもつバイオセンサ一チップとしては、上述の L. A. Lyon et al. , Ε. Hutter et al.，特開 2002— 267 669号公報、特開 2000— 55920号公報に記載されたものが例示できる。

また、表面にデキストラン層を担持した B I ACORE (商標）センサーチップ、ポリ（ォキシエチレン）鎖を中間に有するヘテロテレケリツクポリマーで被覆された表面をもつセンサーチップ（例えば、 WO 0 1/86301 A 1参照）をもつものも、本発明で使用できる。

その他のセンサーチップも、当業者であれば、以上の従来技術を参照することにより作製できるであろう。

以上の P C L表面およびセンサーチップ表面を修飾するのに用いることのできる典型的なヘテロテレケリップポリマーは、下記の反応スキームに従って製造できる。

反応スキーム I

(CH₃CH₂0)₂CHCH₂CH₂0©M©

(ie>M®と省記する）

(CH₃CH₂0)₂CHCH₂CH₂0- (CH₂CH₂0)_nCH₂CH₂0^eM® (CH₃CH₂0) ₂CHCH₂CH₂0- (CH₂CH₂0)_nCH₂CH₂0S0₂CH₃ ( 1 )

CH₃S0₂C1

(CH3CH2O) ₂CHCH₂CH₂0- (CH₂CH₂0)_nCH₂CH₂SC(=S)0CH₂CH₃ ( 2 )

KaO—ヱチル

ジチ才カルボネート

(CH₃CH₂0)₂CHCH₂CH₂0-(CH₂CH₂0)_nCH₂CH₂SH (3) プロピノレアミン

反応スキーム Π— a

I©M© ^ I— (CHzCHzO)^! -CH₂CH₂0© M®

CH₂CH₃ ^{n 1}

V

反応スキーム Π - b ：

CH₂ = CH-CH₂0CH₂CH— (0CH₂CH₂) _n— 0^Θ M®

OR¹

HSi-OR²

OR³

H₂PtCl₆

(以上の各式中の略号は、 Mはカリウム、ナトリウム、リチウムを表す。）

以上のリビング重合工程は、それ自体公知の反応条件の下で実施できる（例えば、上記の WO 96/32434、 WO 97/06202. 等を参照されたい。）。その他は、後述する実施例に従い、または記載されている条件を改変して実施できる。

また、式

C=0

I

0

(CH₂)₂

I

N

は、本発明者らの一部による Kataoka et al. , Macromolecules、 1 9 9 9、 3 2、 6 8 9 2— 6 8 9 4に記載の方法に従って得ることができる。 P E G Mw= 5 0 0 0 g/ o 1、 P AMA (ポリ [ (2— N， N—ジメチルァミノ）ェチルメタクリレート] ) の重合度 m= 6 8) を後述する P E G修飾微粒子の作成に用いる。

これらのポリマ一を用いる P C Lの P E G修飾について、簡単に述べると、構造式 Iにおける P C Lを構成する自由電子金属微粒子、金属酸化物微粒子または半導体微粒子は、それぞれ、市販品を利用するか、それぞれ相当するコロイドを形成することにより得た微粒子を利用することができる。また、本発明に従う P E G修飾ナノ粒子は、例えば、それぞれ相当する微粒子（例えば、 0. 5 η πι〜1 ;«πι、好ましくは l nm 〜2 0 0 n mの平均粒径）を形成する工程中に上述の前駆体ポリマーを共存させて形成することにより、前駆体ポリマーが微粒子表面に結合した、構造式 Iの表面またはその前駆表面を作成することもできる。 (A) の粒子と（B) のセンサーチップのセッ卜に関して

(B) のセンサ一チップ表面が B I A C OR E (商標）のようなデキストラン層をもつものまたは WO 0 1 /8 6 3 0 1 A 1に記載されているようにポリ（エチレンォキシド）鎖を中間に有するポリマーで修飾されたもの以外は、被検体を含むことが疑われる試料液と接触する表面が（A) の粒子で実質的に被覆されるように、（A) の粒子と（B) のセンサ一チップは使用され、特に、これらは結合した状態で使用される。こうして、（A) の粒子が（B) のセンサーチップ表面を被覆した形態にある表面は、（A) の粒子表面上の式（Π) および式（DI) で表されるポリマーの作用により、表面へのタンパク質等の非特異的吸着を有意に抑制できる。勿論のこと、粒子による各種シグナルの増幅効果も得られる。

また、（A) の粒子における Xが生物学的な特異的結合対を形成する一員であり、（B) のセンサーチップ表面上に、該一員に対する他の一員が存在する場合には、ァッセィの概念について略図的に示す図 1に示すような態様で、（A) の粒子と（B) のセンサ一チップとのセットを使用できる。図中の三角印は、例えば、糖、ピオチン、抗原もしくはハプテン、ホルモン、オリゴヌクレオチド等を表し、該三角が嵌合する印は、それぞれ、レクチン、アビジンもしくはストレブトァビジン、抗体, 受容体タンパク質、相補性ォリゴヌクレオチドもしくは該ヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチド、等を表す。また、これらの印に結合する波線はポリ（エチレンォキシド）セグメントであることができる。このような概念図で表されるバイオアッセィ方法も本発明の一態様でめ。

一般的には、（a) 上記に従って製造されうる（A) の粒子を用意し、

(b) 該ナノ粒子の PCLの材料に対応する薄膜表面を有し、該ナノ粒子の Xの生物学的な特異的結合対の一員に対する他の一員が直接または少なくとも d— C_eアルキレン基もしくは（一 CH₂CH₂0—） _π (ここで、 ηは 5— 10, 000のいずれかの整数である）を介して担持され表面を有するバイオセンサ一チップを用意し、

(c) (a) の粒子および（b) のバイオセンサーチップを該生物学的な特異的結合を形成しうる構成員のいずれかの一員を被検体として含むことが疑われる生物学的流体と接触させ、

(d) 被検体の競合作用による（a) の粒子と（b) のバイオセンサーチップ表面との結合の程度の変化を決定し、

(e) 該変化を生物学的流体中の被検体濃度の指標とする、ことを含んでなる生物学的流体中の被検体の検出方法、が提供される。上記の段階（d) における、（a) の粒子と（b) のセンサーチップとの結合の程度の変化は表面プラズモン共鳴スぺクトルの変化、例えばプラズモン角のシフト、最低反射率の増大、であることが好ましい。このようなアツセィ方法は、生物学的な特異的結合対を形成する一員 (被検体）を含むことが疑われる水性液体試料のいかなるものにも、理論上、適用できるが、特に、生物学的流体、例えば、血清、血漿、尿、唾液、等、またはこれらの濃縮もしくは希釈液に適用することを意図している。

かような方法によれば、迅速かつ高感度のアツセィができる。

以下、具体例を挙げてさらに本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されない。

製造例 1 ： PEG修飾金微粒子の製造法（その 1) ：

使用ポリマー： Acetal— PEG—SH (Mn = 5000)

Acetal- PEG-SH : HAuC l 4= 1/6 ： 1 (モル比）の比で混合した水溶液に HA u C 1₄に対して 10倍モル量の N a BH₄を添加し、還元法により金コロイドを調整した。末端ァセタール基を p H 2塩酸で処理しアルデヒド基に返還後、 p—ァミノフヱニルー^ー D—ラクトピラノシドと反応し、ラクトース一 P E G— S Hで修飾した金コロイド水溶液（平均粒径： 8.7 n m) を得た。

なお、ァセタール一 P EG— SHは、下記のとおりに製造した。アルゴン置換した受器中に蒸留テトラヒドロフラン（THF) 20m 1と開始剤 3, 3—ジエトキン一 1一プロパノール 0.2mmo l (0. 032m l ) を加え、さらに当量のカリウムナフタレンを加えて 15分撹拌することでメタル化を行った。その後、エチレンォキシド 22.7 mmo 1 (1, 135m l ) を加え、室温で 2日間撹拌し重合させた。停止剤として N—スクシンィミジルー 3— (2—ピリジルチオ）プロピォネート（SPDP) 0.4mmo 1 (0.125 g) を少量の蒸留 TH Fに溶解させ、この溶液に対し前記の重合反応溶液を等圧滴下漏斗にて氷冷下で滴下した。一晩撹拌して停止反応を行った後に、飽和食塩水洗浄 ' クロ口ホルム抽出、エーテル再沈、ベンゼン凍結乾燥を経て、ポリマ一を回収した。回収したポリマーは¹ H— NMRにて構造を確認し、末端に導入された S P D P残基の量は、 2—メルカプトエタノールと反応させることによって遊離した 2—チォピリドンの UV吸収によっても確認した。 PEG— S S— Py 2.0x 10 -²mmo 1 (l O Omg) を蒸留水 4 m 1に溶解させ、さらに 5倍 m o 1量のジチオトレイトール 0.1m mo 1 (15.42m g) を加え、室温で 30分撹拌した。反応後、飽和食塩水洗浄 · クロ口ホルム抽出 ·エーテル再沈を経てポリマー（以下. P EG 5000と略記する）を回収した。回収したポリマ一は¹ H— N MRによって構造を確認し、さらに 2—ピリジルジスルフィド（2— P DS) との反応により、末端 S H基の定量を行った。

製造例 2 ： PEG修飾金微粒子の製造法（その 2) ：

使用ポリマ一： Acetal— P EG— SH (Mn = 3200)

(1) 使用ポリマーの製造

反応スキーム Iに従い、開始剤に 3, 3 -ジェトキシー 1—プロパノ —ル、停止剤にメチルスルフォニルクロライドを用いてァセタール基とメチルスルホニル基を有するヘテロ二官能性 P E Gをァニオン重合により合成した。さらに、テトラヒドロフラン（THF) 中でカリゥムオルトェチルジチォカルボネ一トと室温で 3時間反応させることによって、メチルスルホニル基をェチルジチォカルボネ一ト基に転化したポリマ一を得た。

その後、同じく THF中でプロピルァミンとの反応によって上式で示されるひ一末端にメルカプト基を有するヘテロ二官能性 P E G (Acetal 一 PEG— SH) を得た。

(2) 金粒子の PEG修飾 Acetal— P E 0— S H (Mn = 3200) とァセタール一 PEO— O H (比較例）（Mn = 3000) を、それぞれポリマーと金粒子とのモル比が 5.0 X 10⁶ ： 1になるように測りとり純水 2.0 mLに溶解させた。そして、 NaOH溶液にてpH6.5に調製し、金コロイド 1.0 mL (2.58x 10 ¹³mo pH6.5) を加え室温で 3時間激しく撹拌させた。次いで、遠心分離 [42, 000 g (gは重力加速度）、 30分] 後、溶液を取り除き、残渣に THF 3 mLを加えて超音波をかけて再分散させた。これらのサンプルについて UVを用いて特性解析を行った。

このポリマ一を用いた金粒子の調製においては、遠心分離後、 THF 溶液に再分散させたときの UV— v i sスぺクトルから、未修飾の金粒子の U Vスぺクトルは、粒子の凝集に基づく 600 nm以上に大きな吸収ピークを示していることが確認できた。 Acetal— P E 0— OH (比較例）で処理した金粒子は、未修飾の金粒子の UVスぺクトルのように 6 00 nm以上に大きなピークを持たなかったものの、全体的にピークが高波長側へシフトし多少微粒子分散が不安定化していることが確認された。他方、遠心操作後、 p H 3の水溶液中に再分散させた時も Acetal— P E G— S Hのみが非常に安定であり、ベンゼンを用いた凍結乾燥後の再分散性もよいことが確認できた。

(3) PEG修飾金微粒子の特性（ゼ一タ電位）

通常の金微粒子の水溶液分散系では粒子表面を負に荷電させることによりそのチャージ反発により分散安定化させているのに対し、 P E G化金微粒子ではその表面に全くチャージがないことがゼ一タ電位測定（大塚電子： E L S 8000) により確認された。すなわち、市販の金微粒子は一 34.5 mVであるのに対し、今回作成した金微粒子一へテロ P EG複合体（Acetal— PEG— SHノ Au) では一 0.86mVとなつており、殆ど誤差の範囲で粒子表面にチャージがないといえ、表面が P E G鎖で覆われているものと推測される。

測定データを表 1に示す。ァセタール一 P E G— S HZ金（Au) 粒子のゼ一タ電位

測定溶液：

緩衝剤 NaH₂P0₄ · 2H₂0と Na₂HP0₄. 12H₂0を 10mM (モル濃度）加え、そのイオン強度を 0.015、 ρΗを 7.5に調整したリン酸緩衝溶液。

測定機器： EL S— 8000 (大塚電子）

製造例 3 ： PEG修飾金微粒子の製造法（その 3) ：

この例では、使用ポリマ一（Acetal— P E G— P AMA) ：

CH₃

CH₃CH₂0、 I

>CHCH₂CH₂0-(CH₂CH₂0)_n-(CH₂C)_ffl-H

CHaCH.O'

C=0

0

I

(CH₂)₂

(上述の Kataoka et al.， Macromolecules、 1999、 32、 689 2— 6894に記載の方法に従って得られた。 PEG Mw= 5000 gZmo 1、 P AMA (ポリ [ ( 2— N， N—ジメチルァミノ）ェチルメタクリレート] ) の n = 130、 m= 100) を用いポリエチレングリコール化 C d S半導体微粒子を作成した。 2.5mgZmLの塩化金酸（H A u C 1₄) 水溶液 1 mLと、 6 m g Lのァセタール一 P E G/PAMAブロック共重合体水溶液 5 mL (NH： A u = 8 ： 1) を混ぜ室温で 24時間撹拌した。所定時間ごとに UV— V i sスぺクトルを測定したところ、金微粒子に由来する 540 nmのピークが次第に上昇し、還元剤を加えない状態で金コロイド粒子（微粒子）分散体が生成していることが確認された。この溶液を光散乱により測定（DLS ：動的光散乱）したところ、平均粒径 12 nmの単分散コロイド粒子が生成していることが確認された。

さらに、透過型電子顕微鏡によって、完全に均一な粒子が生成していることが確認された。この溶液を p H= 2〜10の範囲で変化させ、 1 曰放置しても全くスぺクトルに変化は見られず、この系で極めて安定な金コロイド粒子（微粒子）が得られたことが確認された。

この溶液にプロック共重合体の 10倍当量の 1, 2—ジァミノ— 4, 5 ージメトキシ 2塩酸塩（DDB) を添加し、 NaC lによって pHを 2. 45に調整した。溶液を分画分子量 500の透析膜にて透析し、励起波長 269 nmで蛍光測定した結果、 410 n mに強い蛍光を示した。この結果より、調整された金粒子表面に Acetal— P E G/P AMAブロック共重合体の末端ァセタール基がアルデヒド基に変換され、 DDBと効率的に反応していることが確認された。こうして形成したアルデヒド基を介して各種の機能性部分をもたらすことができる。

製造例 4 ： P E G修飾半導体微粒子の製造：

蒸留水 80mL中に上述の Acetal— P E GZP AMAブロック（4. 19 X 10 "⁷mo 1 ) 、 C d C 12 (6 10 -^emo 1 ) 及び Na₂S ， 9H₂0 (6 10"⁶mo 1 ) を加え、撹拌機（750 r pm) で 20 分間撹拌した。得られた PEG修飾半導体（Cd S) 微粒子（粒径 4 n m) を励起波長 300 nmにて蛍光を測定したところ C d S微粒子特有の強い蛍光が現れた。

実施例 1 ： PEG修飾微粒子のセンサーチップ表面への固定化：

(1) センサーチップ表面の調製

N—スクシンィミジル一 3 _ ( 2—ピリジルジチォ）プロピオネート (S PDP) と SPDPのジスルフィド結合還元剤であるジチオスレィトール（DTT) をそれぞれ lmM、 2mMとなるように混合したエタノール溶液をセンサーチップの金表面に 2時間反応させた。その後、洗浄した金表面をこの溶液に 30分浸潰させ、さらに、 O. lmgZm l ストレプトアビジン PBS溶液（pH6.4) を 20分間流すことで、金表面のストレブトァビジン化を行った。

(2) 製造例 2に従って得られた PEG (Acetal- P E G - S H) 修飾金微粒子を調製後、 pH2に金微粒子溶液を調整し、 2時間ァセタ一ル基の脱保護を行い、アルデヒド基に変換した。溶液を pH 6に調整し- PEGに対して 4倍量のビオシチンヒドラジドを添加し、 6時間攪拌しながら反応させた（ここで、 PEGに対して 4倍量とは、金微粒子の表面積を粒径から算出し、 P EGの表面密度を 0.25〜0.40本 11111 ²と仮定した。この値は微粒子の個数から P EGの本数を算出した値である。通例表面密度は 0.25を使っている。 0.25の値は PEG化金微粒子の Tgから算出したものである）。その後、 Na BH₄を加え 3 日間攪拌した。遠心精製後、 10mM— PBS (pH 6.4) を溶媒置換溶液を調製した。こうして得られたピオチニル化された PEG修飾金微粒子溶液に（1) で調製した金表面を有するチップを浸漬することにより、該表面に P EG修飾金微粒子が固定された。

(3) 表面の特性

(2) で調製された P EG修飾金微粒子固定化表面を 0. lmgZm 1ゥシ血清アルブミン（BSA) PBS溶液（pH6.4) に 1時間浸潰させ、表面への吸着量を S PRにより測定した。その結果、未処理の金表面に対する BS A吸着は S PR角度変化より = 21° であつたが、 P E G修飾金微粒子固定化表面においては、 △0 = 0.02° であった。これらのデータは、 P E G修飾金微粒子固定化表面は血液中のタンパク質 BS Aの、非特異的吸着を抑制することを示す

実施例 2 ： PEG修飾金ナノ粒子を利用した S PRによるアツセィ以下常に S PRの流速は常に 10 L/m i nであり、設定温度は 2 5°Cである。またバッファ一はすべて 0.22〃mフィルターを通した後、脱気したものを用いた。また、別の流路はレクチンを固定化していないコントロールの流路とした。また、センサ一チップ表面のレクチンに結合した金ナノ粒子をすベて解離させる再生溶液には、 l O OmgZ mLのガラクトースを含むバッファーを用いた。

A) センサーチップへのレクチンの固定化

実験方法と結果

SPRセンサ一チップ（CM5 ： B I A COREより入手。）を挿入して、りん酸緩衝溶液（pH 7.4, 10. 15) を SPRの流路に安定するまで流した。次に EDC (N—ェチル一 N'_ (3—ジメチルァミノプロピル）カルボジィミド塩酸塩）と NHS (N—ヒドロキシスクシンィミド）の 1 ： 1混合溶液を 100 Lインジクトし、チップ上のカルボキシル基を活性化させた。続けて RCA₁₂n (50 g/mL. 溶媒は pH5.0の酢酸緩衝溶液）をインジェクトして固定化させ、最後に 1Mエタノールァミド塩酸塩）を 70// Lインジヱクトして、残つた活性化 NHS基をプロッキングした。この時の RUと最初の RUの差により、レクチン固定量は 5600 RU (~5.6 n g/mm²= 2.8 x 10-²レクチン nm²) となった。

B) 1 c 65とレクチンの特異的結合の確認（ 1 a c 65とは金ナノ粒子（PEG 520本）上の PEGの末端の 65%にラクトースを有するサンプル）

実験方法 - 40 i g/mLの l a c 65を 1800秒間（300 xL) インジェク卜することで、センサ一チップ表面のレクチンと金ナノ粒子の結合を測定した。その後バッファーを 3000秒間流すことにより、金ナノ粒子の解離を測定し、最後に l O OmgZmLのガラクトースをインジェク卜することでセンサーチップを再生した。

結果と考察

図 2に 1 a c 65のセンサーグラムを示す。同じ濃度のフリーのラクト一ス一 PEG— S— S— PEG—ラクトースはほとんど RUの増加がなかったのに対して、 1 a c 65は 5200 RUの増加が得られた。また、ラクトースを表面に有するミセルの系と比較すると、 7000 RU のレクチンが結合しているセンサーチップ上に 5 O O ja gZmLのミセルをインジェクトすると〜 1400 RUのレスポンスが得られているが、本実験で用いた金ナノ粒子の粒径はこのミセルと同じくらいであるが、 10分の 1濃度で 4倍のレスポンスが得られたことから、金ナノ粒子によりレスポンスが大きく上昇したと言える。このように大きなレスボンスが得られた理由としては、一つは金ナノ粒子の比重が非常に大きいため、チップ表面の誘電率が大きく上昇したことと、チップの金基板と金ナノ粒子との表面プラズモンどうしの相互作用とが挙げられる。

次にバッファ一を流したときの解離についてであるが、バッファーを流してもほとんど解離しなかった。そのため、金ナノ粒子とレクチン結合は非常に強いものだと考えられる。

また、 1 a c 0は結合が確認されなかったのに対して、 l a c 65は結合が確認されたことと、ガラクトースを添加することにより、大きくレスポンスの減少、つまり金ナノ粒子の解離が確認されたことから、金ナノ粒子表層のラクトースと RCA 120レクチンとの特異的結合が示唆された。

C) 結合におけるリガンド密度の効果

実験方法

ラクト一ス密度 0〜65%の金ナノ粒子（ 1 a c 0、 I a c l 0、 1 a c 20、 1 a c 30 l a c 40、 l a c 50、 l a c 65) をそれぞれ 40、 10、 1、 0. 1〃 gZmLの濃度で 300 / Lインジヱクトし、その結合量を測定した。

結果と考察

まず、 l a c O— l a c 65における濃度とレスポンスの関係を図 3 (a) に示す。ここから、ラクトース密度が大きいほど、また濃度が大きいほど RUは増加するという結果が得られた。また、 10 i g/mL の濃度でィンジヱクトしたときの 1 a c O— 1 a c 65までのセンサーグラムを図 3 (b) に、リガンド密度と結合量（RU) との関係を図 3 (c) に示す。これらの結果から、 l a c l Oはほとんどレクチンとラクトースは結合せず、 1 a c 20は少し結合が確認され、さらにそれ以上ではリガンド密度の増加に伴い、結合が促進するということになり、これは UVの結果とほぼ一致する。 UVの実験の考察では、臨界値が 2 0%の理由として、 1) レクチンが過剰に溶液中に存在するために粒子がレクチンによりキヤッビングされる、 2) スペクトルの変化として表面プラズモンを検出するにはある程度以上の金ナノ粒子の凝集が必要である、 3) 多価結合の三つの理由を考えていたが、 S PRではキヤツビングは起こらないし、 U Vの時のように表面プラズモンのスぺクトル変化を見ているわけでもないので臨界値の理由は多価結合が考えられる。具体的には、リガンド密度が大きいと多数のリガンドとレクチンが結合して、強固な結合を生じるが、小さいリガンド密度では、 1対 1のリガンドとレクチンの結合のように少数のリガンドしか結合に関与できないと考えられる。

D) 解離におけるリガンド密度の効果

実験方法

ラクトース密度 30 -65%の金ナノ粒子（ l a c 30、 l a c 40、 1 a c 50 1 a c 65) 40〃 gZmLをそれぞれ数 10 Lインジェクトし、約 400 RU金ナノ粒子を結合させた。その後、ガラクト一ス 0.1、 1 fi gZmLを含むバッファーをィンジヱクトし、各ガラクトース濃度での解離量を測定した。

結果と考察

図 4 (a) にガラクトース 0.1 z g/mLをインジェク卜したときのセンサーグラムを示す。ここでは l a c 30、 l a c 40は時間がたつにつれて徐々に解離していくのが確認されたが、 l a c 65、 l a c 50はほとんど解離が確認されなかったので、リガンド密度と解離量との関係を図 4 (b) に示した。ここから 40%と 50%の間に顕著な差が見られた。すなわち、 l a c 30、 1 a c 40の解離量に比べて、 1 a c 50、 1 a c 65の解離量はかなり少なかった。これは UVの実験にいても N I Aの増加に 40%と 50%の間で大きな差があったことと関連があると考えられる。恐らく、このリガンド密度で多価結合の価数に変化があつたのではないかと推測される。

また、解離によって高感度に検出することを考えると、リガンド密度が 30%以下ならば、 0. 1 gZmL以下まで検出できるということも示された。これに対して 50%以上ならば、検出限界はそれ以上の濃度となり、解離においてはリガンド密度がある程度低い方がより高感度に検出できることになり、リガンド密度の効果を詳細に調べることによつて、このような応用も考えることができる。

製造例 5 ：非結合末端ァミノ化粒子の製造

市販の金微粒子溶液（ 5 n m) に対して 5 x 10⁴倍量の acetal— P EG— SHに還元剤として N a BH₄を加え、 1時間反応させた後、金微粒子溶液と同じ P H = 6.5に調整したものを金微粒子溶液と混合し、 1時間撹拌反応させた。 HO— P EG— OHを lmgZm 1加え、ゥォ一夕一バス 75 °Cに保ち 2時間反応させた。この安定化金コロイド溶液 (金微粒子粒径： 5 nm、 P EG 4500) を遠心分離（ 4 °C、 350 000 X g、 40分）することで余剰ポリマーを除去した後、 HC 1を用いて p H 2に調整し、ァセタール基の脱保護を行った（2時間）。脱保護後、 N a OHを用いて pH6に調整し、下記の表 2に示すような条件で酢酸ァンモニゥムを加え 3時間反応させた。 3時間後 P E Gに対してそれぞれ還元剤を加え撹拌した。 24時間後、遠心精製（4°C、 35 0000 g. 30分）を行い、超純水に再分散させた。末端アミノ化の確認として電位の測定を行った。表 2 ：アミノ化反応の条件試行酢酸ァンモニゥム還元剤の種類還元剤添加方法

(RUN) 添加量

1 lOmg/ml トリアセテート PEGの 10倍量を 2時間置きに 3回添加した後、

1曰撹拌

2 10mg/ml 水素化ホウ素ナ PEGの 10倍量を添加しトリウムた後、 1曰撹拌

測定結果を図 5に示す。図から、低 pHでのゼ一夕電位がプラスになり、アミノ化が確認された。実施例 3 ：金ナノ粒子を S PRチップ表面に直接固定化し、 P EG末端をピオチン化する方法オゾン洗浄した金チップ（オゾン洗浄機で 15分）を用意した。これを、別に、用意したアミノ基を有する P EG化金ナノ粒子（P EG 45 00粒径 5 nm、 0.76 10 °m o 1 /m L ) を含む P EG— OH (2000) 1 mg/m 1に浸漬（一晩）した（サンプル 1) 。

B i aCo r e 3000に装着し、スルホスクシンィミジル D—ピオチン（0.1 mgZm 1流速 20〃 1 /分）を 10分間流し P EG末端ァミノ基のピオチン化を行った（サンプル 2) 。次いで、無水酢酸 10 %水溶液（流速 10 H 1 Z分）を 20分流し、未反応ァミノ基のァセチル化を行った（サンプル 3) 。このようにして調製した S PRセンサ一チップ表面に対してタンパク吸着試験を行った。

実施例 4 ： S P Rセンサ一チップ表面に S P DPにて活性エステルを導入し、アミノ基を有する PEG化金ナノ粒子を固定化する方オゾン洗浄した金チップ（オゾン洗浄機で 15分）を用意した。これを ImM S PDPおよび 2mM D T T含有エタノール溶液に 30分間浸漬した。

さらに别に、用意したアミノ化金ナノ粒子（P E G 4500粒径 5 n m、 0.76 x 10— ¹⁰mo 1 ZmL) を含む P E G— OH (2000) lmg/m 1に浸漬（一晩）した（サンプル 4) 。

B i a Co r e 3000に装着し、スルホスクシンィミジル D—ピオチン（0.1 m g/m 1流速 20m 1 /分）を 10分間流し P E G末端ァミノ基のピオチン化を行った（サンプル 5) 。次いで、無水酢酸 10 %水溶液（流速 10 a 1 分）を 20分流し、未反応ァミノ基のァセチル化を行った（サンプル 6) 。このようにして調製した S PRセンサ一チップ表面に対してタンパク吸着試験を行った。

結果を図 6に示す。図 6中の R u n 1はサンプル 1を用いた結果、 R u n 2はサンプル 1の代わりに acetal— P E G金ナノ粒子を用いた結果、 R u n 3はサンプル 4を用いた結果、 R u η 4はサンプル 4の代わりに acetal— P E G金ナノ粒子を用いた結果を示す。図 6より、アミノ基を有する P EG化金ナノ粒子の S PRセンサ一チップ表面への担持量が大きいことがわかる。また、各表面調製における各段階でのレスポンス変化の様子を下記の表 3に示す。表 3 ：各手順段階でのレスポンス変化の様子直接吸着による S P D Pによる固定化 1一（1) 固定化 1一（2) ( X 10 - ⁴⁰) (X 10 "⁴⁰)

S PD Pによる変化量 2800 金微粒子による変化量 5500 2980 活性エステルビオチン 397 949 による変化量無水酢酸による変化量 390 158

金チップ表面に直接ァミノ化金微粒子を浸漬させ調製した直接吸着による表面（1) において特異 '非特異吸着を観察した結果を図 7に示す ( 図 7中、一番上の線はストレプトアビジン、，中間の線は B S A (ァミノ基残余状態）、一番下の線は B S Aの吸着を、棒グラフは左から順にサンプル 1にストレプトアビジンを、サンプル 2に B SAを、そしてサンプル 3に B S Aを吸着させる試験の結果である。他方、金チップ表面に S PD Pを利用してァミノ化金微粒子を固定化した表面（2) において特異 ·非特異吸着を観察した結果を図 8に示す, 図 7および図 8から、図 8の S P DPで固定化した表面（2) においてストレブトァビジンとの特異的吸着がより多く観察されていることがわかる。これまで調製してきたピオチン化金微粒子を用いた表面ではストレブトアビジンと B S Aの吸着を観察しても特異 ·非特異と言えるような大きな差異が観察されなかったのに対し、図 8では 2500 (x l 0" ⁰) と 9 ( X 10"°) という大きな差異を確認することができる。産業上の利用可能性

本発明に従えば、生物学的流体中の被検体を検出するに際し、夾雑タンパク質等の非特異的吸着を抑制した上、高感度を有するバイオアツセィのセンサー系が提供される。したがって、各種診断機器の製造業、また、診断業で本発明は利用できる。

Claims

請求の範囲

1. (A) 構造式 I ：

(X— W²— PEG— W¹—い _Y— PCL— L— W¹— PEG— W²— Y)_v ( I )

x^J 式中、 P C Lは自由電子金属微粒子、金属酸化物微粒子または半導体微粒子を表し、

Yは C,— C_eアルキル基、 Xの官能基もしくは機能性部分を形成するのに使用できる保護されていてもよい官能基および Xと同一もしくは異なる機能性部分からなる群より選ばれる 1種以上の基もしくは部分を表し- Lは P C Lに結合する基もしくは結合部分を表し、 W¹および W²は、単結合または同一もしくは異なる連結基を表し、 P E Gは、エチレンォキシド単位：（一 CH₂CH₂0— )_n (ここで、 n は 5— 10， 000のいずれかの整数である。）を表し、ここで、（X— W²— P EG— W'— L) と（L— W¹— P EG— W²— Y)_y における W²— P E G—W¹— Lは同一もしくは異なることができ、そして Xおよび yは、独立して 1以上の整数であり、かつ、一緒になつて P E G鎖が水性媒体中で P C Lの表面を被覆するのに十分な整数を表すのポリエチレングリコール修飾ナノ粒子と、

(B) (A) の粒子が Xを介して結合することができ、かつガラスまたは P C Lの材料に担当する材料からなる表面を有するバイオセンサ一チップとのセットを含んでなるバイオアッセィに用いるためのバイオセンサ一系。

2. (A) の粒子と（B) のバイオセンサ一チップ表面が Xを介して結合することにより、（A) の粒子が（B) のバイオセンサーチップの一つの表面の一部領域もしくは全領域を実質的に被覆するように担持された請求項 1記載のバイオセンサ一系。

3. (A) の粒子と（B) のバイオセンサ一チップ表面が、相互に結合されうるか、または水性媒体中で被検体の競合作用により被検体により置換されるように結合した状態で使用されるものである請求項 1記載のバイオセンサー系。

4. 構造式 Iにおける— L—が

HS-(CH₂) P R²0—

(ここで、 pは独立して 2— 12のいずれかの整数を表し、 R R²および R ³は独立して d— C_eアルキル基を表し、そして mは 2— 100 のいずれかの整数を表す）の基を表し、

W¹および W²が独立して、単結合、 d— C₆アルキレン、 —COO— (酸素原子を介してエチレンォキシド単位のメチレン基に結合する）、 — 0—、一 S―、一（C !— C₆アルキレン）一 C 0〇一、一（d—（：₆ァルキレン）一 O—および一（d— C ₆アルキレン）一 s—からなる群より選ばれる基を表す、請求項 1記載のバイオセンサ一系。

5. (A) の粒子における構造式 Iの Xが生物学的な特異的結合対を形成する一員の残基であり、（B) のセンサーチップが構造式 Iの P C Lを形成する材料に対応する材料製の薄膜表面を有しており、そして該表面に Xの生物学的な特異的結合対を形成する一員に対する他の一員が直接または少なくとも d— C_eアルキレン基もしくは（一 CH₂CH₂0 -) _n (ここで、 nは 5 _ 10, 000のいずれかの整数である）を介して担持されている、請求項 1記載のバイオセンサー系。

6. (A) の粒子における構造式 Iの Xが

OR¹

HS— (CH₂)_p―、 H₂N-(CH₂)_p- または R²0— Si— (CH₂)_p -

OR³

(ここで、 pは独立して 2— 12のいずれかの整数を表し、 R R²および R³は独立して d— C_eアルキルを表す）の基を表し、（B) のセンサーチップが構造式 Iの P C Lを形成する材料のいずれかから製造された薄膜表面か、またはガラス表面を有しており、そして、（A) の粒子と（B) の表面が Xの官能基を介して結合しており、但し、（B) の表面がガラス製である場合には Xがトリアルコキシシリルを有する、請求項 1記載のバイオセンサ一系。

7. (A) の粒子の構造式 Iにおける Yが式

CHc または一 C00H

、R^a 、Rb (ここで、 R^aは独立して、水素原子または Ci— C₆アルキルを表し、 R^bは独立して d— C ₆アルキルォキシまたは 2つの R^bが一緒になつてォキシもしくは d— Ceアルキルで置換されていてもよいエチレン基を形成する原子団を表す）の基である請求項 5記載のバイオセンサー系。

8. (A) の粒子の構造式（ I ) における X + yが 1 nm²当たり 0. 1-0.5に相当するいずれかの整数である請求項 1記載バイオセンサ一系。

9. (A) の粒子中の P C Lが 5〜500 nmの平均横断面の長さを有する請求項 1記載のバイオセンサー系。

10. 構造式 I ：

(X— W²— PEG— W¹—い X— PCL— (L—W¹— PEG— W²— Y)_y ( I ) 式中、 P C Lは自由電子金属微粒子、金属酸化物微粒子または半導体微粒子を表し、

Yは C,一 C₆アルキル基、 Xの官能基もしくは機能性部分を形成するのに使用できる保護されていてもよい官能基および Xと同一もしくは異なる機能性部分からなる群より選ばれる 1種以上の基もしくは部分を表し- Lは P C Lに結合する基もしくは結合部分を表し、

W¹および W²は、単結合または同一もしくは異なる連結基を表し、 PEGは、エチレンォキシド単位：（一 CH₂CH₂0— )„ (ここで、 n は 5— 10, 000のいずれかの整数である。）を表し、

ここで、（X—W²_ P E G— W'_L)_Xと（L—W¹— P E G-W²- Y)_y における W²— P E G— W¹— Lは同一もしくは異なることができ、が生物学的な特異的結合対を形成する一員の残基であり、 Yが生物学的な特異的結合対を形成する残基以外の基であり、

Lは、式

0R¹

HS-(CH₂)_p- R²0-Si— (CH₂)_p- または )_m- OR³

(ここで、 pは 2— 12のいずれかの整数を表し、 R R²および R³ は独立して C,一 C₆アルキル基を表し、そして mは 2— 100のいずれかの整数を表す）の基を表し、

そして x + yは P C Lの表面 l nm ²当たり 0.1— 0.5に相当するいずれかの数であり、（x/x + y ) X 100が 1— 99の整数であり、そして P C Lの横断面の平均寸法が 5— 500 n mであるポリエチレングリコール修飾ナノ粒子。

11. Xの生物学的な特異的結合対を形成する一員が単糖もしくはォリゴ糖、抗原もしくはハプテン、基質、ホルモンおよびオリゴヌクレオチドからなる群より選ばれる物質由来の残基である請求項 10記載のポリエチレングリコール化ナノ粒子。

12. (a) 請求項 10記載のポリエチレングリコール修飾ナノ粒子を用意し、 (b) 該ナノ粒子の P C Lの材料に対応する薄膜表面を有し、該ナノ粒子の Xの生物学的な特異的結合対の一員に対する他の一員が直接または少なくとも d— Ceアルキレン基もしくは（一 CH₂CH₂0— )_π (；こで、 ηは 5 _ 10, 000のいずれかの整数である）を介して担持され表面を有するバイオセンサーチップを用意し、

(c) (a) の粒子および（b) のバイオセンサ一チップを該生物学的な特異的結合を形成しうる構成員のいずれかの一員を被検体として含むことが疑われる生物学的流体と接触させ、

( e ) 該変化を生物学的流体中の被検体濃度の指標とする、ことを含んでなる生物学的流体中の被検体の検出方法。

13. 段階（d) の（a) の粒子と（b) のバイオセンサーチップとの結合の程度の変化が、表面プラズモン共鳴スぺクトルの変化により検出される請求項 12記載の検出方法。

14. 生物学的な特異的結合対を形成しうる構成員が糖とそれに対するレクチン、抗原もしくはハプテンとそれに対する抗体、基質とそれに対する酵素、ホルモンとそれに対する受容体タンパク質、オリゴヌクレォチドとそれの相補鎖配列を含むォリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドからなる群より選ばれる請求項 12記載の検出方法。

15. (a) の粒子と（b) のバイオセンサ一チップ表面とが生物学的な特異的結合対を形成して予め結合されている請求項 12記載の検出方法。