WO2002011529A1 - Procede de construction d'un animal par manipulation genetique et animal clone - Google Patents

Procede de construction d'un animal par manipulation genetique et animal clone Download PDF

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Tomohiro Kono
Yukiko Ono
Nobuhiro Shimozawa
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/873—Techniques for producing new embryos, e.g. nuclear transfer, manipulation of totipotent cells or production of chimeric embryos
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a genetically modified animal and a method for producing a cloned animal (a genetically identical animal population). Animals created by these methods are useful as model animals for various diseases and the like. Conventional technology
  • Known methods for producing genetically engineered animals include a method of injecting a gene into the nucleus of a fertilized egg and a method of introducing a gene into embryonic stem cells (ES cells) using homologous recombination. Also requires a great deal of labor and time. In particular, when a gene is introduced into embryonic stem cells, the target genetically engineered animal cannot be obtained directly, but can be obtained in the next generation through a reproductive chimera individual, so that the labor and time are greater. Embryonic stem cells from which reproductive chimeras can be efficiently produced are limited to a specific lineage, so if you want to obtain a genetically engineered animal of a lineage other than that lineage, backcross to the target lineage Need to be repeated.
  • somatic cloned animals have been produced in horses, sheep, goats and mice.
  • cells whose cell cycle has been synchronized to the G0 / G1 phase by serum starvation culture or the like or cells cultured without synchronized culture are usually used.
  • Wakayama T. et al. Reported a method using cells synchronized in metaphase (M phase) (Wakayama T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999, 26, 14984-14989).
  • Metaphase cells used in this method were selected using only cell size as an index.
  • the nuclear transfer operation is performed only once.
  • a first object of the present invention is to solve the problems of the conventional method for producing a somatic cell cloned animal and to provide a means for more efficiently producing a somatic cell cloned animal.
  • a second object of the present invention is to solve the above-mentioned problems concerning the production of a genetically modified animal and to provide means for producing a genetically modified animal in a short time. Means for solving the problem
  • the present inventors have conducted intensive studies in order to solve the above problems, and as a result, have obtained the following knowledge.
  • genetically engineered animals can be created in a shorter time than conventional methods.
  • embryonic stem cell nuclei as the donor nucleus can significantly reduce the mortality during the growth of the cloned animals produced.
  • the present invention has been completed based on the above findings.
  • the first aspect of the present invention relates to a method for producing a genetically modified animal, comprising the following steps.
  • a second aspect of the present invention relates to a method for producing a genetically modified animal, comprising the following steps.
  • the third aspect of the present invention relates to a method for producing a cloned animal, comprising the following steps.
  • the fourth aspect of the present invention relates to a method for producing a cloned animal, comprising the following steps.
  • the method for producing a genetically modified animal of the present invention includes the following steps (A) to (D) and (F), and optionally includes step (E).
  • step (A) genetic manipulation is performed on animal cells.
  • Any animal cells may be used here, and for example, fibroblasts, embryonic stem cells, cumulus cells, Sertoli cells and the like can be used, but embryonic stem cells are preferably used.
  • the use of embryonic stem cells can reduce the mortality during the growth of the resulting individual.
  • Animal cells are not particularly limited as long as they are derived from animals other than humans, and cells derived from mice, mice, pigs, sheep, monkeys and the like can be used.
  • Examples of the gene manipulation include gene introduction, gene disruption (gene targeting), and gene replacement (knock-in).
  • the cell cycle of the animal cell is synchronized with the metaphase.
  • Entrainment to metaphase can be achieved with appropriate reagents, such as Nocodazole, Colcemid, and the like.
  • step (C) the nucleus of the cell whose cell cycle has been synchronized to metaphase is transferred to the cytoplasm of an enucleated unfertilized egg.
  • the enucleation of an unfertilized egg is performed, for example, by aspirating and removing a slightly transparent portion of the cytoplasm of the unfertilized egg in an operation solution containing cytochalasin B, a cytoskeleton polymerization inhibitor.
  • Nuclear transfer can be performed by cell fusion using the Sendai virus or electrical stimulation or intracytoplasmic injection.
  • step (D) the nucleus is activated.
  • the activation treatment include a method using strontium, ethanol, electrical stimulation and the like. The activated nucleus starts fissioning.
  • step (E) the activated nucleus is transplanted to an enucleated fertilized egg.
  • Step (E) is not essential, and step (F) may be immediately shifted to step (F).
  • Enucleation and nuclear transfer can be performed in the same manner as in step (C).
  • the fertilized eggs are preferably used 8 to 12 hours after insemination.
  • an operation for obtaining a transplanted nucleus-derived newborn is performed. Specifically, operations such as culturing activated eggs and transplanting them into the uterus of a foster parent are performed. These operations can be performed according to a conventional method.
  • the method for producing a cloned animal of the present invention comprises the following steps (B) ′ to (D) and (F) And (E) if necessary.
  • Steps (C) to (F) are the same as the above-described method for producing a genetically modified animal.
  • (B) ′ is the same as the above-described method for producing a genetically engineered animal, except that embryonic stem cells are essential as animal cells.
  • the genetically engineered embryonic stem cell line TT2 was seeded on a single feeder cell layer to form embryonic stem cell colonies.
  • the genetically engineered TT2 strain was obtained from Kyoto University's Virus Research Institute and Assistant Prof. Yoichi Makai. The gene is in a state of heterogeneity).
  • As the feeder cells fibroblasts obtained by shredding a 1-day-old fetus of a CD-1 mouse with scissors and the like and then treating with trypsin were cultured and treated with mitmycin. After sufficient growth of the embryonic stem cells, the cells were treated with trypsin-EDTA, detached from the culture dish together with one feeder cell, and seeded on another culture dish. One hour after the seeding, the cell suspension in the culture dish was collected.
  • the time required for the embryonic stem cells and feeder cells to adhere to the culture dish varies, and within 1 hour after seeding, the feeder cells adhere to the bottom of the culture dish, but the embryonic stem cells float in the culture medium It is in a state. Therefore, the cell suspension collected by the above operation contains only embryonic stem cells. After centrifugation, the cell suspension was suspended in a cryopreservation solution (70% DMEM, 10MEMDMS0, 20% FBS) at a concentration of 1 ⁇ 10 5 cells / 0.5 ml per tube, and cryopreserved in liquid nitrogen.
  • a cryopreservation solution 70% DMEM, 10MEMDMS0, 20% FBS
  • cryopreserved embryonic stem cells pre-gelatinized in co one-diameter and 60 thigh 2xl0 4 cell seeded in culture dishes coating, and cultured for 3 days 15% FBS added ES culture. Since this culture dish does not contain feeder cells, subsequent embryonic stem cells are not contaminated with feeder cells.
  • a culture solution containing the same amount of nocodazole was added except for half of the culture solution (final concentration of nocodazole: O ⁇ g / ml). Synchronization treatment was performed on metaphase cells. If the time of nocodazole treatment was prolonged, damage to the cells was observed, so the treatment time was set to 2 hours in this example.
  • Metaphase cells are weakly adherent and are suspended in the culture medium, so collecting the culture medium allows recovery of metaphase cells.
  • Metaphase cells have a round morphology and are about 1.5 times larger in diameter than cells in the interphase cell cycle, and the proportion of metaphase cells in recovered cells was determined using this morphology as an index. . As a result, about 80 cells were metaphase cells.
  • HCG was administered to B6CBF1 female mice, and unfertilized eggs at the second metaphase were collected 14 hours later.
  • a cut of about 1 to 4 was made with a glass knife as a micro tool.
  • a M2 solution containing cytochalasin B 5 Mg / ml
  • enucleation of the unfertilized egg was performed by confirming that the chromosome was inside.
  • the first nuclear transfer was performed using the unfertilized eggs thus enucleated as the recipient cytoplasm and the nuclei of the embryonic stem cells as donor nuclei.
  • the nuclear transfer procedure is equipped with a Hoffman modulation contrast device in an egg manipulation solution (solution using M2 medium as a basic medium) containing cytochalasin B (5 g / ml) and nocodazole (0.4 zg / ml). This was performed under a microscope.
  • the remaining eggs were subjected to a second nuclear transfer.
  • the nucleus of the constructed egg 8 to 12 hours after the activation treatment was used as the donor nucleus
  • the enucleated fertilized egg (F1 X F1) 8 to 12 hours after the insemination was used as the recipient cytoplasm. Went as.
  • Enucleation and nuclear transfer operations were performed as described above. The operation after nuclear transfer was performed in the same manner as above. Table 1 shows the status of each transplant operation.
  • Table 1 As shown in Table 1, 51.1% of eggs obtained by a single nuclear transfer operation developed to transferable embryos, and finally 3.7% (20) of newborns Grew up. Of the eggs obtained by the two transfer operations, 68.0% developed to transferable embryos and 2.6 2. (7) developed to neonates. Of these newborns, 17 and 6 are growing normally, respectively.
  • the present invention provides a novel method for producing genetically engineered animals and cloned animals.
  • the method for producing a genetically modified animal of the present invention since the target genetically modified cells can be selected at the stage of cell culture, all the individuals produced are genetically modified individuals, and the genetically modified animals can be obtained efficiently. .
  • this method makes it possible to directly obtain a genetically engineered animal without using a reproductive chimera individual. By performing genetic manipulation on the target line, backcrossing to the target line is unnecessary. Therefore, in this method, genetically engineered animals can be produced in a short period of time.
  • a cloned animal can be obtained efficiently because the mortality of the produced cloned animal in the growth process is low.

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Description

¾ 糸田 »
遺伝子操作動物及びクローン動物の作出方法 発明の属する技術分野
本発明は、 遺伝子操作動物の作出方法及びクローン動物 （遺伝的に全く同一の 動物集団） の作出方法に関する。 これらの方法によって作出された動物は、 各種 疾患などのモデル動物として有用である。 従来の技術
遺伝子操作動物の作出方法としては、 受精卵の核へ遺伝子を注入する方法や相 同組換えを利用して胚性幹細胞（ES細胞） へ遺伝子を導入する方法などが知られ ているが、 いずれも多大な労力と時間を要する。 特に胚性幹細胞へ遺伝子を導入 する場合、 目的の遺伝子操作動物が直接得られるわけではなく、 生殖キメラ個体 を介した次世代で得られるため、 その労力と時間はより多大なものとなる。 また、 生殖キメラを効率的に作出できる胚性幹細胞は、 特定の系統に限定されているた め、 その系統以外の系統の遺伝子操作動物を得ようとする場合は、 目的の系統へ の戻し交配を繰り返すことが必要となる。
ところで、 これまでにゥシ、 ヒッジ、 ャギ、 マウスで体細胞クローン動物が生 産されている。 これらの体細胞クローン動物の作製法においては、 通常、 血清飢 餓培養等によりその細胞周期を G0/G1期に同調した細胞、 あるいは同調培養行わ ずに培養された細胞が使用される。 Wakayama T.らは、 ***中期 （M期） に同調し た細胞を使用する方法について報告しているが（Wakayama T.ら Proc. Nat l . Acad. Sci . USA, 1999, 26, 14984-14989)、 この方法で使用される***中期の細胞は、 細胞の大きさのみを指標として選抜されたものである。 また、 これらの体細胞ク ローン動物の作製においては、 核移植操作は 1回だけしか行われていない。 発明が解決しょうとする課題
本発明者らは、 体細胞クローン動物の作製法において、 ドナ一となる細胞の細 胞周期を***中期に同調し、 また、 核移植操作を 2回行うことにより、 体細胞ク ローンを効率的に作出できるという知見を得、 先に特許出願を行った （特願平
11-32772号、 未公開）。 しかし、 この方法は、 従来の方法に比べれば優れた方法 であるが、 新生仔が成体まで成長する過程で多数死亡してしまうという問題を有 していた。
本発明の第一の目的は、 従来の体細胞クローン動物の作出方法が有する問題を 解決し、より効率的に体細胞クローン動物を作出する手段を提供することにある。
また、 本発明の第二の目的は、 上述した遺伝子操作動物の作出に関する問題を 解決し、 短期間で遺伝子操作動物を作出できる手段を提供することにある。 課題を解決するための手段
本発明者は、 上記の課題を解決するため、 鋭意検討を重ねた結果、 以下の知見 を得た。
-遺伝子操作を行った動物細胞の核をドナー核として体細胞クローンを作出する ことにより、 従来の方法に比較し、 短期間で遺伝子操作動物を作出できること
- ドナ一核として、 胚性幹細胞の核を使用することによリ、 作出されるクローン 動物の生育過程における死亡率を大幅に低減できること
以上の知見に基づき、 本発明は完成されたものである。
即ち、 本発明の第一は、 以下の工程を含むことを特徴とする遺伝子操作動物の 作出方法に関する。
( 1 ) 動物細胞に遺伝子操作を行う工程
( 2 ) 遺伝子操作を行った動物細胞の細胞周期を***中期に同調させる工程
( 3 ) 細胞周期を***中期に同調させた細胞の核を除核した未受精卵の細胞質に 移植する工程
( 4 ) 移植した核に活性化処理をする工程
( 5 ) 移植した核由来の新生仔を得る工程
また、 本発明の第二は、 以下の工程を含むことを特徴とする遺伝子操作動物の 作出方法に関する。
( 1 ) 動物細胞に遺伝子操作を行う工程
( 2 ) 遺伝子操作を行つた動物細胞の細胞周期を***中期に同調させる工程 (3) 細胞周期を***中期に同調させた細胞の核を除核した未受精卵の細胞質に 移植する工程
(4) 移植した核に活性化処理をする工程
( 5 ) 活性化処理をした核を除核した受精卵に移植する工程
(6) 移植した核由来の新生仔を得る工程
更に、 本発明の第三は、 以下の工程を含むことを特徴とするクローン動物の作 出方法に関する。
( 1 ) 胚性幹細胞の細胞周期を***中期に同調させる工程
(2) 細胞周期を***中期に同調させた細胞の核を除核した未受精卵の細胞質に 移植する工程
(3) 移植した核に活性化処理をする工程
(4) 移植した核由来の新生仔を得る工程
更に、 本発明の第四は、 以下の工程を含むことを特徴とするクローン動物の作 出方法に関する。
( 1 ) 胚性幹細胞の細胞周期を***中期に同調させる工程
(2) 細胞周期を***中期に同調させた細胞の核を除核した未受精卵の細胞質に 移植する工程
(3) 移植した核に活性化処理をする工程
( 4 ) 活性化処理をした核を除核した受精卵に移植する工程
(5) 移植した核由来の新生仔を得る 発明の開示
本発明の遺伝子操作動物の作出方法は、 以下の （A) 〜 （D) 工程及び （F) 工程を含み、 必要に応じて （E) 工程を含むことを特徴とするものである。
(A) 動物細胞に遺伝子操作を行う工程
(B) 遺伝子操作を行った動物細胞の細胞周期を***中期に同調させる工程
(C) 細胞周期を***中期に同調させた細胞の核を除核した未受精卵の細胞質に 移植する工程
(D) 移植した核に活性化処理をする工程 ( E ) 活性化処理をした核を除核した受精卵に移植する工程
( F ) 移植した核由来の新生仔を得る工程
工程 （A) では、 動物細胞に遺伝子操作を行う。 ここで使用する動物細胞は、 どのようなものでよく、 例えば、 繊維芽細胞、 胚性幹細胞、 卵丘細胞、 セルトリ 細胞などを用いることができるが、 好ましくは胚性幹細胞を使用する。 胚性幹細 胞を使用することにより、得られる個体の生育過程における死亡率を低減できる。 動物細胞は、 ヒト以外の動物に由来するものであれば特に限定されず、 マウス、 ゥシ、 ブタ、 ヒッジ、 サルなどに由来する細胞を使用することができる。 遺伝子 操作としては、 例えば、 遺伝子導入、 遺伝子破壊 （ジーンターゲッティング）、 遺 伝子置換 （ノックイン） などを挙げることができる。
工程 （B ) では、 動物細胞の細胞周期を***中期に同調させることを行う。 分 裂中期への同調は、 適当な試薬、 例えば、 ノコダゾ一ル （Nocodazole)、 コルセミ ド （colcemid) などにより行うことができる。
工程 （C ) では、 細胞周期を***中期に同調させた細胞の核を除核した未受精 卵の細胞質に移植することを行う。 未受精卵の除核は、 例えば、 細胞骨格重合阻 害剤であるサイトカラシン Bを含む操作液中で未受精卵の細胞質のやや透明の部 分を吸引除去して行う。 核の移植は、 センダイウィルス、 電気刺激による細胞融 合法や細胞質内注入法によって行うことができる。
工程 （D ) では、 核に活性化処理を行う。 活性化処理としては、 ストロンチウ ム、 エタノール、 電気刺激等を用いた方法を例示できる。 活性化処理を行った核 は***を開始する。
工程 （E ) は、 活性化処理をした核を除核した受精卵に移植することを行う。 工程 （E ) は、 必須ではなく、 工程 （D ) から直ちに工程 （F ) へ移行してもよ い。 除核及び核の移植は、 工程 （C ) と同様に行うことができる。 受精卵は、 媒 精から 8〜12時間後のものを使用するのが好ましい。
工程 （F ) では、 移植した核由来の新生仔を得るための操作を行う。 具体的に は、 活性化処理をした卵の培養、 仮親の子宮への移植などの操作を行う。 これら の操作は、 常法に従って行うことができる。
本発明のクローン動物の作出方法は、 以下の （B )' 〜 （D ) 工程及び （F ) ェ 程を含み、 必要に応じて （E) 工程を含むことを特徴とするものである。
( B ) ' 胚性幹細胞の細胞周期を***中期に同調させる工程
(C) 細胞周期を***中期に同調させた細胞の核を除核した未受精卵の細胞質に 移植する工程
(D) 移植した核に活性化処理をする工程
( E ) 活性化処理をした核を除核した受精卵に移植する工程
(F) 移植した核由来の新生仔を得る工程
工程 （C)〜 （F) は、 上記の遺伝子操作動物の作出方法と同様である。 また、 (B)' も動物細胞として胚性幹細胞を必須とする点を除き、上記の遺伝子操作動 物の作出方法と同様である。 実施例
遺伝子操作を行つた胚性幹細胞 TT2株をフィーダ一細胞層に播種し、 胚性幹細 胞のコロニーを形成させた。 遺伝子操作を行った TT2株は、 京大 ' ウィルス研、 真貝洋一助教授より入手したもので、 この細胞の G9a遺伝子は、 エレクト口ポー レーシヨンによる相同組換えによって不活化されている （不活化した G9a遺伝子 はへテロの状態にある）。 フィーダ一細胞は、 CD- 1マウスの胎齢 15.5日目の胎児 をハサミ等で細切後、 トリプシン処理をして得た繊維芽細胞を培養し、 マイトマ イシン処理したものを用いた。 胚性幹細胞を十分に増殖させた後、 トリプシン- EDTAで処理してフィーダ一細胞と共に培養皿からはがし、別の培養皿に播種した。 播種から 1時間後に培養皿中の細胞浮遊液を採取した。 胚性幹細胞とフィーダ一 細胞とでは培養皿へ接着するまでの時間が異なり、 播種から 1時間以内でフィ一 ダー細胞は培養皿の底面に接着するが、 胚性幹細胞は培養液中に浮遊した状態に ある。 従って、 前記操作により採取された細胞浮遊液は胚性幹細胞だけが含まれ ていることになる。細胞浮遊液を遠心処理後 1チューブあたり 1 Xl05cell/0.5ml の濃度で凍結保存液 （70%DMEM、 10¾DMS0, 20%FBS) 中に浮遊させ、 液体窒素中に 凍結保存した。
凍結保存した胚性幹細胞を融解して、 予めゼラチンでコ一ティングした直径 60腿の培養皿に 2xl04cell播種し、 3日間 15%FBS添加 ES培養液中で培養した。 この培養皿は、 フィーダ一細胞を含まないので、 これ以後の胚性幹細胞にはフィ —ダ一細胞は混入していない。 培養液の半量を除き、 同量のノコダゾ一ルを含む 培養液を加え （ノコダゾ一ルの最終濃度： O ^ g/ml ) ***中期の細胞への同調 処理を行った。 ノコダゾ一ル処理の時間を長くすると、 細胞への傷害が認められ たため、 本実施例においては、 処理時間を 2時間とした。 ノコダゾ一ル処理後の 培養液を採取し、 lOOOrpmで 5分間遠心することによリ***中期の細胞を回収し た。 ***中期の細胞は接着性が弱く培養液中に浮遊しているので、 培養液を採取 することにより、 ***中期の細胞を回収できる。 ***中期の細胞は丸い形態を示 し、 直径は間期の細胞周期にある細胞よりも約 1. 5倍ほど大きいので、 この形態 を指標として回収細胞中の***中期の細胞の割合を調べた。 その結果、 約 80 の 細胞が***中期の細胞であった。
B6CBF1雌マウスに hCGを投与し、 14時間後に第二減数***中期の未受精卵を採 取した。 この未受精卵の透明帯に、 マイクロツールであるガラスナイフで 1ノ 4 ほどの切れ目を作った。 次にサイトカラシン B (5 M g/ml ) を含む M2溶液中にて 透明帯の切れ目よりマイクロツールであるガラスピぺットを揷入し、 未受精卵の 細胞質のやや透明な部分を吸引除去して、 その内部に染色体があることを確認す ることで未受精卵の除核を行った。 なお、 これらの顕微操作はマイクロマニピュ レ一タを装着した倒立顕微鏡下で行い、 以下の操作もこの装置で行った。 このよ うにして除核した未受精卵をレシピエント細胞質とし、 上記胚性幹細胞の核をド ナ一核とし、 第 1回目の核移植を行った。 核移植操作は、 サイトカラシン B (5 g/ml )とノコダゾ一ル （0. 4 z g/ml ) を含む卵子操作液 （M2培地を基本培地とする 溶液） 中で、 ホフマンモジュレーションコントラスト装置を装備した顕微鏡下で 行った。 このような顕微鏡を用いることにより、.ピペットに注入された細胞の染 色体の凝集状態を観察することができ、 確実に***中期細胞を選別できる。 ドナ 一核とレシピエント細胞質との融合は、 不活化したセンダイウィルスを用いて行 つた。 その融合率はおよそ 75 であった。 融合完了後、 1〜2時間培養液中で培養 し、 その後 10mMストロンチウムを含む培養液中で 4〜6時間培養して核を活性化 させた。 この結果、 移植された核の 93%が第 2極体を放出し、 正常な発生を開始 した。 このような処理を行った卵の一部を、 CZB培養液の微小滴中で 4日間体外 培養を行った。 体外培養 4日目に桑実胚あるいは胚盤胞に発生した卵子は偽妊娠 3日目の仮親マウスの子宮へ移植した。
残りの卵については、 第 2回目の核移植に供した。 第 2回目の核移植は、 活性 化処理から 8〜12時間後の構築卵の核をドナー核とし、 媒精から 8〜12時間後の 除核した受精卵 （F1 X F1) をレシピエント細胞質として行った。 除核及び核移植 操作は、 上記と同様に行った。 また、 核移植後の操作も上記と同様に行った。 各移植操作における発生状況を表 1に示す。
表 1
Figure imgf000008_0001
表 1に示すように、 1回の核移植操作により得られた卵については、 その 51. 1% が移植可能胚にまで発育し、 最終的には 3. 7% (20匹） が新生仔まで発育した。 2 回の移植操作により得られた卵については、 68. 0%が移植可能胚にまで発育し、 2. 6¾ (7匹） が新生仔まで発育した。 これらの新生仔のうち、 それぞれ 17匹およ び 6匹が正常な成長を遂げている。
なお、 胚性幹細胞の代わりに繊維芽細胞を使用して上記と同様の操作を行った が、 新生仔 5匹中 2匹しか正常な成長を遂げることができなかった。 発明の効果
本発明は、 遺伝子操作動物及びクローン動物の新規な作出方法を提供する。 本発明の遺伝子操作動物の作出方法では、 細胞培養の段階で目的の遺伝子操作 細胞が選別できるため作出される個体は全て遺伝子操作個体であり、 効率的に遺 伝子操作動物を得ることができる。 また、 この方法では、 胚性幹細胞を用いた従 来の方法とは異なり、 生殖キメラ個体を介することなく、 遺伝子操作動物を直接 得ることが可能であり、 さらに、 作出しようとする系統の培養細胞に遺伝子操作 を行うことで、 目的系統への戻し交雑も不要である。 従って、 この方法では、 短 期間で遺伝子操作動物を作出することができる。 また、 本発明のクローン動物の作出方法では、 作出されたクローン動物の生育 過程における死亡率が低いので効率的にクローン動物を得るこどができる。

Claims

言青求の範囲
1. 以下の工程を含むことを特徴とする遺伝子操作動物の作出方法。
( 1) 動物細胞に遺 ί云子操作を行う工程
(2) 遺伝子操作を行った動物細胞の細胞周期を***中期に同調させる工程
(3) 細胞周期を***中期に同調させた細胞の核を除核した未受精卵の細胞質に 移植する工程
(4) 移植した核に活性化処理をする工程
(5) 移植した核由来の新生仔を得る工程
2. 以下の工程を含むことを特徴とする遺伝子操作動物の作出方法。
( 1) 動物細胞に遺伝子操作を行う工程
(2) 遺伝子操作を行った動物細胞の細胞周期を***中期に同調させる工程
(3) 細胞周期を***中期に同調させた細胞の核を除核した未受精卵の細胞質に 移植する工程
(4) 移植した核に活性化処理をする工程
(5) 活性化処理をした核を除核した受精卵に移植する工程
(6) 移植した核由来の新生仔を得る工程
3. 動物細胞が、 胚性幹細胞であることを特徴とする請求項 1又は 2記載の遺 伝子操作動物の作出方法。
4. 以下の工程を含むことを特徴とするクローン動物の作出方法。
( 1 ) 胚性幹細胞の細胞周期を***中期に同調させる工程
(2) 細胞周期を***中期に同調させた細胞の核を除核した未受精卵の細胞質に 移植する工程
(3) 移植した核に活性化処理をする工程
(4) 移植した核由来の新生仔を得る工程
5. 以下の工程を含むことを特徴とするクローン動物の作出方法。
( 1) 胚性幹細胞の細胞周期を***中期に同調させる工程
(2) 細胞周期を***中期に同調させた細胞の核を除核した未受精卵の細胞質に 移植する工程 (3) 移植した核に活性化処理をする工程
( 4 ) 活性化処理をした核を除核した受精卵に移植する工程
(5) 移植した核由来の新生仔を得る工程
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