WO2001090728A1

WO2001090728A1 - Capteur par resonance plasmonique de surface (spr) et procede de mesure utilisant ce capteur

Info

Publication number: WO2001090728A1
Application number: PCT/JP2001/004255
Authority: WO
Inventors: Isao Karube; Takuo Akimoto
Original assignee: Katayanagi Institute
Priority date: 2000-05-25
Filing date: 2001-05-22
Publication date: 2001-11-29
Also published as: JP2001337036A; EP1306662A1; US20030113231A1; CA2407793A1; EP1306662A4; AU2001256790A1

Description

明細書差動式 S P Rセンサー及ぴ該センサーを用いた測定法技術分野

本発明は、表面プラズモン共鳴（S P R) を利用した S P Rセンサーに係り、詳しくは差動式 S P Rセンサーに関するものである。本発明に係る S P Rセンサーは好適にはプローブ型バイオセンサーとして具現化される。背景技術

S P Rセンサーは一般に図 1 ( a ) に示す構造を有する。表面プラズモン（ S u r f a c e P 1 a s m o n ： S P ) は金属と試料の誘電率によって決定される。この S Pの波数べクトルは光を入射することで励起することができ、一般的な S P Rセンサーでは、図中のプリズム側から光を入射することで S Pの励起を行う。

図 1 ( a ) の配置を用い、また光源として白色光線を用いた場合に得られる結果は図 1 ( b ) に示す通りであり、ある波長におい極/」、俥を得ることができる。本明細書ではこれを共鳴波長と呼ぶ。この共鳴波長が前述の S Pの波数べクトルと一致するので、共鳴波長から試料の誘電率を決定することができる。タンパク質の相互作用を検出する実験では、例えば、金属膜上に抗体を固定化し金属膜上の抗原抗体反応を起こさせる。この時の金属膜上の誘電率変化を見積もることで、抗原抗体反応の程度を見積もることが、 S P Rセンサ一をパイォセンサーとして利用する場合の方法である。

S P Rセンサーは、タンパク質の相互作用を検出する装置として広く使用され、注目を集めている。しかし、現在使用されている S P Rセンサ一は大型であり、また、フローインジェクション形式を採用することから、試料を i n s i t uで測定することができない。このことから、いわゆるプロープ型 S P Rセンサ—は試料を i n s i 1; uで測定することができるセンサ一として有効な方法と考えられる。

しかし、 S P Rセンサーを用いてタンパク質相互作用を検出する場合、毎回の測定においてベースラインを決定し、その値からの変化量としてタンパク質相互作用を見積もる必要がある。すなわち目的とするタンパク質相互作用を検出するためには、測定試料の他に、ベースラインを決定するための試料が必要となる。したがって従来の測定方法に従うならば、プロープ型 S P Rセンサーを用いて i n s i t uの測定を行う場合においても、他の試料を用いてベースラインを決定する必要がある。これでは、プロープ型 S P Rセンサーの特徴である i n s i t u測定の有利性が減殺されてしまう。

そこで、差動式 S P Rセンサーを用いることが検討される。差動式 S P Rセンサーの本質はく同一の金属膜上に抗体を固定した面と、抗体を固定化しない面を作成し、それら両方の面で得られる共鳴波長を比較することで抗原抗体反応を見積もることである。しかし、同一の金属膜上に抗体を固定化した面と固定化しない面を作成しても、それらの面で起きる現象を独立に観測することは困難である。なぜなら、例えば抗原抗体反応によつて得られる誘電率の変化は微小なため、すなわち共鳴波長の変化は微小なため、それぞれの面での共鳴波長を独立に決定することが困難であるからである。

本発明は、前記不具合を解決するべく創案されたものであって、共鳴波長を独立に決定することができ、ベースラインの決定を必要としない差動式 S P Rセンサーを提供することにある。発明の開示本発明が採用した技術手段は、金属膜上に被測定物質を固定化した面と固定化していない面とを形成してなる差動式 S P Rセンサーであって、該金属膜に膜厚の異なる誘電体膜を複数形成し、一つの誘電体膜の表面を参照面とし、他の誘電体膜の表面を動作面として被測定物質を固定化するように構成したことを特徴とするものである。この差動式 S P R センサーは、プロープ型 S P Rセンサーのみならず、いわゆるフローインジェクション型 S P Rセンサーにも適用することができるが、以下の理由から、特にプローブ型 S P Rセンサーにおいて有利に採用される。差動式 S P Rセンサーは、 ①ベースラインの決定を必要としない、 ② 非特異的吸着による測定精度の低下を抑えることができる、 ③温度変化による測定精度の低下を抑えることができる、という利点を有する。ここで利点②③については、差動式以外の方法でも実現することができる。 ②については測定試料中に非特異的結合を抑制する薬品を加える、 ③ については温度制御をする等で達成できる。しかしながら、プロープ型の場合は、センサーを試料（例えば海や体内の組織等）に浸すことで測定を完了させることが狙いなので、前記解決方法を採用することはできず、したがって、プローブ型センサーにとって差動式の方法は有用な手段となる。また利点.①については、フローインジェクション型の場合には、一般的に実験室で十分な時間をかけて実験ができる場合が多く、また、流路の変更も容易であるため、差動式の方法はさほど大きなメリツトを有しない。これに対して、測定の簡便性、迅速性が要求されるプロープ型において差動式はとりわけ有用である。

金属膜上に誘電体層を形成する構成についても、特にプローブ型にとつて有用である。フローインジェクションに差動式を用いる場合には、抗体を固定化した面と固定化していない面をある程度の距離を離して同一の金属膜上に形成させれば差動式の方法を実現することができる。この場合、誘電体層は必ずしも必要ではなく、異なる厚みの誘電体層を用いた場合には、前述の「ある程度の距離を離して」という作業を省くことができるという効果を有するに留まる。これに対して、プローブ型の場合は、「ある程度の距離を離して」という作業で抗体を固定化した面と固定化しない面とを作製しても、それらを独立に観測することはできない。したがって、プローブ型においては、膜厚の異なる誘電体を設けることが必須の構成要素となる。

プローブ型 S P Rセンサーは、光源と、センサープローブと、光検出器とを有し、該プロープは、センサー面を備えた金属膜と、反射面とを有しており、該プロープの基端側は光の入出端部を構成しており、該光源は該プローブの基端側に光学的に連結されており、該光検出器は該金属膜及ぴ該反射面を介して該プローブの基端側から出射された光を受光するように構成されている。プローブ型センサー自体は公知であり、例えば図 7、図 8に示すような従来のプローブ型センサ一の構成を本発明に採用することもできる。

しかしながら、本出願人の研究によると、該センサー面と該反射面とをプローブの長さ方向に対して傾斜状に延出する傾斜面に形成し、これらを互いに直角に会合するように構成することで、従来のプローブ型センサ一に比べて、測定感度が良好なプロ一プ型 S P Rセンサ一を提供できることがわかった。このようなプロープ型センサーにおいて、センサ一面に対する光の入射角は好ましくは 6 0度から 8 0度の間である。また、本発明が採用した測定法は、金属膜上に被測定物質を固定化した面と固定化していない面とを形成してなる差動式 S P Rセンサーであつて、該金属膜に膜厚の異なる誘電体膜を複数形成し、一つの誘電体膜の表面を参照面とし、他の誘電体膜の表面を動作面として被測定物質を固定化してなる差動式 S P Rセンサーを用いた測定法であって、該動作面における測定結果と該参照面における測定結果とを比較することで測定物質を測定することを特徴とするものである。従来の測定法を代表的な用途である抗原の測定を例にとると以下のとおりである。抗原と特異的に反応する抗体がセンサー表面に固定化される。最初に、抗原を含まない緩衝液の共振角を測定する。次に抗原を含む緩衝液で一定時間満たして抗原抗体反応を生じさせる。反応後、抗原を含まない緩衝液でセンサー表面を洗浄し、反応後の共振角を測定する。そして、抗原抗体反応の前後での共振角の差を求め、それを抗原濃度に換算する。これに対して、本発明に係る測定法では、抗原を含む緩衝液を動作面および参照面で測定して比較することで、抗体濃度を算出するようにしたものである。

本発明に係る S P Rセンサーは好適には抗原抗体反応の検出に用いられるが、本発明の S P Rセンサーは抗原抗体反応の測定に限定されるものではなく、相互作用の様子が「結合」という場合に広く適用することができ、例えば、核酸あるいは核酸アナログのハイプリダイゼーション、核酸とタンパク質の相互作用、レセプターとリガンドの結合、糖鎖同士の相互作用等に用いることもできる。センサー面に固定化される被測定物質についても、測定物質に応じて抗体以外の物質が固定化される。金属膜に付着させる誘電体層については、実施の形態ではプラズマ重合膜を用いたが、膜形成手段はこれに限定されるものではなく、他の公知の薄膜形成手段を適宜採用することができる。誘電体層は実施の形態では H M D S膜であるが、他の誘電体層を用いてもよい。以下に述べる実施の形態では、膜厚の異なる誘電体膜を二つ形成することで動作面、参照面を構成しているが、例えば、膜厚の異なる三つの誘電体膜を設け、二つにそれぞれ異なる抗体を固定化し、他の一つを参照面として、同時に二つの物質を測定することもできる。図面の簡単な説明

第 1図は（ a ) は S P Rセンサーの原理図、（ b ) は観測される信号であり、第 2図（ a ) は差動式 S P Rセンサーの原理図、（ b ) は差動式 S P Rセンサーで観測される信号であり、第 3図はプローブ型 S P Rセンサ一の正面図、側面図およぴ端面図であり、第 4図はセンサー面を示すセンサープローブの拡大図であり、第 5図は口ーブ型 S P Rセンサーの固定部分の概略図であり、第 6図はプローブ型 S P Rセンサーの全体図であり、第 7図は公知のプローブ型 S P Rセンサー（ J o r g e n s o n e t . a 1 . 1 9 9 1 ) の模式図であり、第 8図は公知のプロ一ブ型 S P Rセンサー（C h a i 1 1 e t . a 1 1 9 9 7 ) の模式図であり、第 9図は差動式プローブ型 S P Rセンサーで得られた反射光強度と波長の関係を示す図であり、第 1 0図は動作面と参照面それぞれで得られる結果を示す図であり、第 1 1図は差動式で得られる結果を示す図であり。第 1 2図は差動式と一般的な方法を用いた場合に得られる B S A抗体濃度に対する検量線を表す図である。発明を実施するための最良の形態

差動式 S P Rセンサーについて図 2に基づいて説明する。図 2 ( a ) の模式図は、同一の金属膜上に膜厚の異なる誘電体層を形成させて段差状のセンサー面を構成し、その一方の面に抗体を固定化することを示している。この場合に得られる信号は図 2 ( b ) に示すように、誘電体層の厚い面と誘電体層の薄い面それぞれからの二つの共鳴波長である。すなわち、それぞれの面の誘電体層の厚さに依存する共鳴波長を得ることで、それぞれの共鳴波長変化分を明確に観測することができる。

センサープローブの構成について図 3に基づいて説明する。図 3は本発明に係るセンサープローブの基本的構成を示すもので、特に差動式に限定するものではない。センサープロープは長尺状の本体を有し、先端側（図では下端側）には、センサー面を備えた金属膜と、反射鏡（反射面）とが形成されており、一方該プロープの基端側（図では上端側）は光の入出端部を構成している。該センサー面と該反射面とはプロープの長さ方向に対して傾斜状に延出する傾斜面に形成されていると共に、互いに直角に会合するように構成されている。センサープローブは図のものでは上から平行光線が入射される。センサ一面は光路に対して直交する面に対して 6 8度の角度で傾斜状に延出しており、上端面から入射した光はセンサー面に入射角 6 8度で入射するように設計されている。反射面は光路に対して直交する面に対して 2 2度の角度で傾斜状に延出している。センサー面で反射した光は反射面によって反射され、上端面に出射するように設計されている。このセンサーでは、初めに反射面で反射した後にセンサー面に入射角 6 8度で入射する光路も考えられるが、それぞれの光路で得られる S P R信号は同じである。センサー面に対する光の入射角は 6 8度に限定されるものではなく、好ましくは 6 0度から 8 0度の間の入射角を適宜選択することが可能である。

センサープローブのセンサー面は、金を膜厚 5 2 n m、クロムを 2 n mスパッタリングすることによって作製してある。反射面はクロムを約 1 0 0 n mスパッタリングすることで作製した。センサープローブは B K 7ガラスを使用してある。センサープローブの直径は 3 mni、長さは 1 5 mniである。尚、図 7、図 8は公知のプローブ型 S P Rセンサーを示す図であって、本発明に係る差動式の方式はこれらの公知のプローブ型 S P Rセンサーに適用することも可能である。

図 4に差動式 S P Rセンサーのセンサープローブの拡大図を示す。センサ一面の左右それぞれに膜厚の異なる誘電体層を形成させて差動式のセンサープローブを構成する。センサ一面は金属膜上に膜厚の異なるプラズマ重合膜を形成して差動式 S P Rセンサーを構成する。誘電体層は H e x a m e t h y l d i s i 1 o x a n e (HMD S ) をプラズマ重合することで作製した。 HMD Sプラズマ重合膜は金属膜上に強固に形成され、また疎水性であることから、非特異的なタンパク質の吸着を妨げる。プラズマ重合膜の厚さは、それぞれの共鳴波長が十分離れるために必要な厚さとして、それぞれ l n m、 3 4 n mとした。プラズマ重合は、ペルジャ一内の真空度 1. 3 P a とした後、 m o n o m e rガスを

4 0 P a導入し、 R F発振器によって m o n o m e rガスをプラズマとする。実施例では、 H e x a m e t h y 1 d i s i 1 o x a n e (HM D S ) (信越シリコーン）を m o n o m e rガスとして用い、重合時間は参照面 5秒間、動作面 1 5 0秒間であり、発振出力はいずれの場合も 1

5 0Wである。

図 4において、センサー面（ a ) で示した面には膜厚の薄いプラズマ重合膜のみを形成した。センサー面（b ) で示した面には膜厚の厚いプラズマ重合膜を形成し、プラズマ重合膜上にゥシ血清アルブミン（B o i n e S e r u m A l b u m i n : B S A) を固定ィヒした。本明細書では、誘電体層が薄い面で B S Aが固定化されていない面を参照面、誘電体層が厚く B S Aが固定化されている面を動作面という。もちろん、誘電体層の膜厚が薄い方に B S Aを固定化して動作面としてもよい。センサープローブへの抗体の固定化については、リン酸緩衝液に 1 0 g / 1 のゥシ血清アルプミンを混合した液体にセンサープローブを約 8 時間浸すことで、ゥシ血清アルプミンをセンサープローブへ固定化した。この際、センサープローブの参照面には粘着テープを貼り、 B S Aが参照面に固定されるのを防止した。

図 5に基づいてセンサープローブの固定について説明する。図 5では筒状の固定部材に対して右側からセンサープローブを挿入するように記载してあり、該固定部材には左側から光ファイバ一を挿入するようになつている。光ファイバ一のコアの直径は 2 0 0 mであり、開口数は 0 . 3 9である。光ファイバ一からの光を平行光線とするために、本実施例では平凸レンズを用いた。用いた平凸レンズの直径は 4 mmであり、焦点距離は 4 mmである。また、このレンズはセンサープローブからの反射光線を、光ファイバ一端面に焦点を持つ集光光線あるいは収束光線とする働きも担っている。

図 6に基づいてプローブ型 S R Pセンサーの全体構成について説明する。 5 0Wのハロゲンランプ（光源）からの光をレンズと鏡を用いて平行光線とする。平行光線は、ビームスプリツターを通してレンズによつて光ファイバ一に導かれる。図中の光ファイバ一の端面には、センサ一プローブとセンサープローブの固定部材が接続されている。センサープローブからの反射光はビームスプリツターと光ファイバ一を通して、分光器に導かれる。分光器からの光は C C Dによって検出され、コンビユータによって共鳴波長が読み取られる。

図 9に差動式 S P Rセンサープローブで得られた反射光強度と波長の関係を示す。図から二つの共鳴波長が確認できる。これらはそれぞれ、プラズマ重合膜が厚く B S Aが固定化されている面での共鳴波長と、プラズマ重合膜が薄く B S Aが固定化されていない面での共鳴波長を示している。ここでは、プラズマ重合膜が厚くかつ B S Aが固定されている面を動作面、プラズマ重合膜が薄く B S Aが固定化されていない面を参照面と呼ぶ。

図 1 0に差動式 S P Rセンサ—で抗原抗体反応を測定した結果の一例を示す。図では動作面で得られた結果と、参照面で得られた結果とを併せて示した。両者の結果において（ a ) の領域で抗体を含まない緩衝液を 1 0分間測定し、（ b )の領域で抗体を含む緩衝液を 2 0分間測定する。再び（ c ) の領域で抗体を含まない緩衝液を 1 0分間測定する。図 1 0から、動作面で得られた結果では（b ) の領域において、抗原抗体反応による共鳴波長の増加が観測されていることが判る。一方で、参照面での領域（b ) では、試料全体の誘電率変化のみに依存する変化しか確認できない。一般的な S P Rセンサーでは、図 1 0の動作面での信号における領域（ a ) と（ c ) の共鳴波長を比較することで、抗体の結果量を定量する。

図 1 1 に図 1 0における動作面で得られた共鳴波長引く参照面で得られた信号の時間変化を示した。図 1 1においても、図 1 0の動作面から得られた結果と同様に、領域（b ) における共鳴波長の増加が確認できる。この場合、抗体の結合量は領域（b ) の開始時刻の共鳴波長と領域（b ) の終止時刻の共鳴波長の変化分で特徴付けられると考えられる。この方法に従い抗体濃度算出する場合、領域（ a ) 及び（ c ) に示される測定は不要である。

図 1 2に一般的な方法で得られた抗体濃度に対する検量線と差動式を用いた場合の検量線を併せて示した。図 1 2の結果から両者の方法に基づく抗体濃度の算出方法には大きな相違はないと判断できる。以上の考察から、差動式のプローブ型 S P Rセンサーを用いた場合、測定試料のみを必要とする測定が可能となる。また、測定試料中に様々な物質が存在する場合、それらの物質が非特異的に金属膜へ結合し測定制度の低下となることが予想できる。しかし、差動式プローブ型 S P Rセンサーの場合、動作面の信号から参照面の信号を引いた値を有効な値とするので、それら非特異的な結合に共鳴波長変化は相殺されると考えられる。産業上の利用可能性

本発明に係る S P Rセンサーは、生体中あるいは環境中に存在する特定のタンパク質や化学物質を測定することに利用できる。特に、プロ一ブ型 S P Rセンサーにおいては、試料を i n s i t uで測定することができる。

Claims

請求の範囲

1 . 金属膜上に被測定物質を固定化した面と固定化していない面とを形成してなる差動式 S P Rセンサーであって、該金属膜に膜厚の異なる誘電体膜を複数形成し、一つの誘電体膜の表面を参照面とし、他の少なくとも一つの誘電体膜の表面を動作面として被測定物質を固定化するように構成したことを特徴とする差動式 S P Rセンサー。

2 . 請求項 1において、前記センサーはプローブ型 S P Rセンサーであり、プローブのセンサー面を形成する金属膜に動作面と参照面とを形成したことを特徴とする差動式 S P Rセンサー。

3 . 請求項 2において、前記センサーは、光源と、センサープローブと、光検出器とを有し、該プローブはセンサー面を備えた金属膜と、反射面とを有しており、該プローブの基端側は光の入出端部を構成しており、該光源は該プロープの基端側に光学的に連結されており、該光検出器は該金属膜及ぴ該反射面を介して該プロープの基端側から出射された光を受光するように構成されていることを特徴とする差動式プローブ型 S P Rセンサー。

4 . 請求項 3において、前記金属膜及ぴ反射面はプロープの先端側に形成してあることを特徴とする差動式プローブ型 S P Rセンサー。

5 . 請求項 4において、センサー面に対する光の入射角は略 6 0度から略 8 0度の間であることを特徴とする差動式プローブ型 S P Rセンサー

6 . 請求項 4において、該センサー面と該反射面とはプロープの長さ方向に対して傾斜状に延出する傾斜面に形成されていると共に、互いに直角に会合するように構成されていることを特徴とする差動式プローブ型 S P Rセンサー。

7 . 請求項 5において、該センサー面と該反射面とはプローブの長さ方向に対して傾斜状に延出する傾斜面に形成されていると共に、互いに直角に会合するように構成されていることを特徴とする差動式プローブ型 S P Rセンサ一。

8 . 金属膜上に被測定物質を固定化した面と固定化していない面とを形成してなる差動式 S P Rセンサーであって、該金属膜に膜厚の異なる誘電体膜を複数形成し、一つの誘電体膜の表面を参照面とし、他の少なくとも一つの誘電体膜の表面を動作面として被測定物質を固定化してなる差動式 S P Rセンサーを用いた測定法であって、該動作面における測定結果と該参照面における測定結果とを比較することで測定物質を測定することを特徴とする差動式 S P Rセンサーを用いた測定法。

9 . 請求項 8において、該動作面における共鳴波長と該参照面における共鳴波長とを比較することを特徴とする差動式 S P Rセンサーを用いた測定法。

1 0 . 請求項 9において、該センサーはプローブ型センサーであることを特徴とする差動式 S P Rセンサーを用いた測定法。