WO2001073117A1 - Verwendung von partikeln, die signalgebende eigenschaften und mindestens eine affinitätsgruppierung für markierte nukleinsäuren besitzen - Google Patents

Verwendung von partikeln, die signalgebende eigenschaften und mindestens eine affinitätsgruppierung für markierte nukleinsäuren besitzen Download PDF

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WO2001073117A1
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Andreas Bosio
Alexander Scheffold
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MEMOREC STOFFEL GmbH - MEDIZINISCH-MOLEKULARE ENTWICKLUNG, KÖLN
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6804—Nucleic acid analysis using immunogens

Definitions

  • the present invention relates to the use according to claim 1 and carriers according to claim 8.
  • the invention relates to a carrier which makes it possible to bind two or more differently labeled nucleic acids, which are hybridized independently of one another with nucleic acids immobilized on a surface, and to make them measurable with the aid of the different signaling molecules built into or carried in the carrier.
  • Microarrays solid supports, on the surface of which nucleic acids are immobilized at different addressable positions
  • the nucleic acids to be analyzed are changed so that they can subsequently be identified and quantified (radioactivity, chemiluminescence fluorescence, etc.).
  • the modification can either be a
  • the technical problem on which the invention is based is to avoid the disadvantages mentioned above and to ensure a more precise quantification of nucleic acids.
  • the problem addressed is solved by using particles selected from the group consisting of liposomes and / or micelles with signaling properties and at least one affinity group for labeled nucleic acids for the detection of labeled nucleic acids which are hybridized with nucleic acid immobilized on a surface.
  • the nucleic acids have different labels. In this way, for example, healthy and diseased tissue can be differentiated.
  • the particles preferably have a particle size of 20 to 4000 nm, preferably 200 to 400 nm.
  • the particles and their production are described in Scheffold A, Miltenyi S, Radbruch A, Magnetofluorescent liposomes for increased sensitivity of immunofluorescence. Immunotechnology 1995; l (2): 127-37.
  • the signaling property is caused in particular by electromagnetic radiation, in particular fluorescence, radioactivity, luminescence, phosphorescence, electromagnetic resonance.
  • the affinity group is preferably an antibody or an antibody fragment.
  • the affinity grouping can be directed against any kind of low molecular haptens such as Alexa Fluor 488; Amino-3-deoxydigoxigenin hemisuccinamide; biotin; BODIPY; Cascade Blue; Cy2; CY3; CY5; dansyl; DNP (dinitrophenol); DIG (digoxigenin); Alexa Fluor 488; 5 (6) - SFX; fluorescein; Lucifer yellow iodoacetamide; Marina Blue; Oregon Green 488; 5 (6) -TAMRA; PE (phycoerythrin); Rhodamine Red; Texas Red.
  • the nucleic acids must then be labeled with the corresponding haptens.
  • the invention also relates to supports with a surface on which nucleic acids are immobilized which are hybridized with labeled nucleic acids, particles which have signaling properties and at least one affinity group for the labeled nucleic acids, after which the first affinity group is bound to the labeled nucleic acids.
  • the particles for the carrier according to the invention for the highly sensitive immunofluorescence detection of hybridized nucleic acids preferably consist of magnetofluorescent liposomes which contain several thousand fluorescent molecules and colloidal magnetic particles.
  • the liposomes are preferably composed of 40 to 50 mol%, in particular 45 mol% of phosphatidylcholine, 5 to 15 mol%, in particular 10 mol% of phosphatidylglycerol, 2 to 10 mol%, in particular 5 mol% of phosphatidylethanolamine and 35 to 45 mol%, in particular 40 mol% cholesterol.
  • the liposomes When using water-soluble fluorophores (e.g. carboxyfluorescein), the liposomes contain a 1 to 100 mM solution of the fluorescent dye depending on the solubility and the fluorescence behavior of the respective fluorophore, which solution is obtained by immersing the liposomes in a correspondingly concentrated fluorophore solution and diffusing the fluorophore into the liposomes be preserved.
  • water-insoluble fluorophores are used, the liposomes contain the corresponding fluorophore in a molar ratio of 1: 100 to 1: 1000 depending on the solubility and the fluorescence behavior of the respective fluorophore.
  • the fluorophore-containing liposomes are obtained by the fact that during the production of the liposomes Depending on the solubility and the fluorescence behavior of the fluorophore, the corresponding fluorophore is added in a molar ratio of 1: 100 to 1: 1000 based on the number of moles of the lipids.
  • the liposomes contain superparamagnetic microparticles with a diameter of 50 to 100 nm. These are obtained by immersing the liposomes in a solution of superparamagnetic microparticles, the absorption of which at 500 nm is 500 nm (optical density, OD 450 ).
  • liposomes particles with a pseudo-fluid, biphasic surface
  • all other microparticles due to the fluidic properties, an affinity grouping on the surface of the liposomes can move freely. This is of crucial importance for the affinity or avidity (total bond strength between two molecules or particles, which is influenced by several binding regions), because:
  • the binding strength between rigid, spherical particles (microspheres) with a diameter of 20 to 4000 nm, and a relatively rigid tube with a diameter of approx. 2 nm (double-stranded DNA) is therefore decisive for steric reasons through the binding of a single one Affinity group determined.
  • the bond strength between fluidic, spherical particles (liposomes and micelles) with a diameter of 20 to 4000 nm, and a relatively rigid tube with a diameter of approx. 2 nm (double-stranded DNA) is most likely determined by more than one affinity group.
  • An antigen (target molecule) is bound in a first approximation by one of the two binding sites of an antibody in a reversible bimolecular reaction.
  • the simple bimolecular reaction can only be used for the reaction between an antigen with an epitope and homogeneous antibodies. If there are two identical epitopes on the antigen at such a distance that the two binding sites of one antibody or two contiguous antibodies (e.g.
  • IgM or the liposomes equipped with the antibodies described here contain the same or two adjacent, contiguous antigen molecules (labeled, double-stranded DNA) the reaction is no longer bimolecular, so that complicated equations have to be used for the kinetics of immune complex formation. If the two antibody binding sites can react, the second binding site, for example, is bound to the epitope much more quickly than the first (entropic effect) because the antigen molecule is already very close to the antibody, so that the apparent affinity (avidity) is usually at least that is increased 10 4 times.
  • the increased affinity leads to an increased and more specific binding, which explains the higher sensitivity and specificity of the liposomes, ie particles that have a biphasic fluidic surface, compared to other spherical particles.
  • Antibodies for example anti-DNP, anti-DIG etc., are added to the amino groups of the amino acids in the with succinimidyl-4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate via thiol groups, which can be exposed by reagents reducing SS groups Liposomes conjugated to phosphatidyl ethanolamines. Typical reduction conditions are set with dithiothreitol.
  • RNAs to be examined are transcribed into the corresponding cDNA using a conventional RT reaction.
  • derivatized nucleotides such as DNP-dCTP, DIG-CTP etc. are added, which are incorporated into the resulting cDNA.
  • different cDNAs can be labeled differently in independent reactions. These differently labeled total cDNAs, e.g. healthy and diseased tissue are placed on a microarray for hybridization. After hybridization has been carried out, the derivatized and hybridized cDNAs can be recognized with the aid of the antibodies directed against them, which are conjugated to the liposomes, and can be identified and quantified by measuring the different fluorescences.
  • several thousand fluorescent molecules can be used in one step for a correspondingly high sensitivity of the analysis without enzymatic amplification.
  • spotting buffer 2 herring sperm DNA.
  • the arrays were washed for 15 min in TNT buffer at RT, blocked for 30 min with TNB buffer at RT and then simultaneously for 1 h with Cy3 and Cy5-labeled liposomes (antiBio-Cy3 or antiDig-Cy5 liposomes) or with Cy3-labeled streptavidin ( Strept Cy3) stained at RT with shaking (150 rpm) in a total volume of 50 ⁇ l.
  • the liposomes were washed beforehand with a 10-fold volume of PBS and centrifuged for 20 min at 4 ° C. and 13000 rpm.
  • the colored arrays were then washed with TNT buffer with shaking for 20 min and with 0.06 x SSC for 2 min.
  • the arrays were measured with a laser scanning device (ScanArray 3000, General Scanning, Inc.) and the signal intensities were calculated (Imagene 2.0, Biodiscovery, Inc.), see FIGS. 1 and 2.
  • ScanArray 3000 General Scanning, Inc.
  • Imagene 2.0, Biodiscovery, Inc. see FIGS. 1 and 2.
  • overlay represents the green color bound anti-Dig-Cy5 liposomes, while the red color represents antiBiotin-Cy3 liposomes.
  • Example 2 In this experiment it was to be determined whether the staining using liposomes produced a signal amplification in comparison to the conventional direct incorporation of fluorescence-labeled nucleotides.
  • cDNA arrays with 18 different cDNAs were produced, with each cDNA being applied 8 times in total (four identical quadrants, each with 2 spots).
  • the cDNAs applied are summarized in Table 1.
  • the order of the cDNAs in the respective quadrants is from bottom right to top left, so that, for example, cDNA No. 1 "EC7" can be found in the bottom right corner of the respective quadrant.
  • RNA was extracted from murine spleen and liver. The mRNA was isolated from this.
  • biotin or digoxigenin-labeled samples were also hybridized together on arrays and then labeled as in Example 1 with antiBio-Cy3 or antiDig-Cy5 liposomes. It can be seen here that the signal intensity also decreases with decreasing output quantity, but that all signals can still be recognized even at 0.01 ⁇ g. This shows that liposome labeling is much more sensitive than conventional direct labeling.
  • the signal quotients of the individual arrays are summarized in a bar diagram in FIG. It can be seen here that the signal quotients are comparable for both methods, with the exception that with the standard method the yellow bars (0.01 ⁇ g starting quantity) are no longer available for some genes, since the absolute signal intensity of the underlying signals is too low.
  • Table 2 summarizes the signal quotients again in a table. The number of detectable genes is also shown here. "Detectable genes" are those whose signal intensity in at least one of the two fluorescence channels is at least 2 times higher than the corresponding signal intensity of the mean value of the negative controls (herring sperm DNA and salt). This again shows that liposome labeling is more sensitive than conventional direct labeling.

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Abstract

Verwendung von Partikeln mit signalgebenden Eigenschaften und mindestens einer Affinitätsgruppierung für markierte Nukleinsäuren zur Detektion markierter Nukleinsäuren, die mit auf einer Oberfläche immobilisierten Nukleinsäure hybridisiert sind. Auch Träger mit Partikeln, die signalgebende Eigenschaften und mindestens eine Affinitätsgruppierung für markierte Nukleinsäuren zur Detektion markierter Nukleinsäuren aufweisen, sind Gegenstand der Erfindung.

Description

Verwendung von Partikeln, die signalgebende Eigenschaften und mindestens eine Affinitätsgruppierung für markierte Nukleinsäuren besitzen
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind die Verwendung gemäß Anspruch 1 und Träger gemäß Anspruch 8.
Die Erfindung betrifft einen Träger, der es ermöglicht zwei oder mehr unterschiedlich markierte Nukleinsäuren, die unabhängig voneinander mit auf einer Oberfläche immobilisierten Nukleinsäuren hybridisiert sind, zu binden und mit Hilfe der in den Träger eingebauten bzw. mitgeführten unterschiedlichen signalgebenden Moleküle messbar zu machen.
Microarrays (feste Träger, auf deren Oberfläche Nukleinsäuren auf unterschiedlichen adressierbaren Positionen immobilisiert sind) werden zunehmend für die parallele Identifizierung und Erstellung von Transkriptionsprofilen von Polynukleinsäuren eingesetzt. Hierbei werden zur Hybridisierung die zu analysierenden Nukleinsäuren so verändert, dass sie nachher identifizierbar und quantifizierbar sind (Radioaktivität, Chemilumineszenz Fluoreszenz etc.). Die Modifizierung kann entweder ein
Molekül, das selbst ein Signal abgeben kann (direkte Markierung) oder aber ein Molekül sein, das von einem zweiten Molekül erkannt wird, welches wiederum markiert ist (indirekte Markierung). Ein Problem bei der Anwendung der Microarrays ist die Sensitivität, mit der zu analysierende Nukleinsäuren auf diesen Trägern erkannt werden können bzw. begrenzte Ausgangsmengen an zu analysierender Nukleinsäuregemische, die einen sensitiven Nachweis nicht zulassen.
Nach dem Stand der Technik gibt es zwei Möglichkeiten, um dieses Problem zu lösen. Erstens wird versucht, die zur Verfügung stehende Nukleinsäure auf unterschiedliche Weise zu amplifizieren, bevor sie mit dem Microarray hybridisiert wird (T7-In-vitro-transkription, (Eberwine et al.) oder PCR, um nur zwei Methoden zu erwähnen). Zweitens wird versucht, mit Hilfe der indirekten Markierung bzw. in Kombination mit der direkten Markierung die bereits hybridisierten und chemisch modifizierten Nukleinsäuren zu erkennen und über eine sekundäre Reaktion in Kombination mit der erkannten Stelle, z.B. durch enzymatische Reaktionen, starke Signale hervorzurufen (Stichwort Sandwich, Tyramin, Horseradish peroxidase etc.). Die Nachteile dieser Vorgehensweise liegen darin begründet, dass die hierbei eingesetzten enzymatischen Verfahren oft zu einer nicht linearen Amplifikation führen, dass heißt, dass die Menge der vorliegenden unterschiedlichen Nukleinsäuren unterschiedlich verstärkt wird. Da aber die Menge an Nukleinsäure mit Hilfe der Microarray-Analyse bestimmt werden soll, stellt die ungleichmäßige Amplifikation die gesamte Analyse in Frage. Weiterhin sind sowohl die enzymatischen als auch die nicht enzymatischen Verstärkungsreaktionen oftmals mehrstufige Reaktionen und sehr aufwendig.
Das der Erfindung zu Grunde liegende technische Problem besteht darin, die oben genannten Nachteile zu vermeiden und eine genauere Quantifizierung von Nukleinsäuren zu gewährleisten.
Erfindungsgemäß wird das angesprochene Problem gelöst durch eine Verwendung von Partikeln ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Liposomen und/oder Mizellen mit signalgebenden Eigenschaften und mindestens einer Affϊnitätsgruppierung für markierte Nukleinsäuren zur Detektion markierter Nukleinsäuren, die mit auf einer Oberfläche immobilisierten Nukleinsäure hybridisiert sind.
In einer vorteilhaften Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Verwendung tragen die Nukleinsäuren unterschiedliche Markierungen. So können dadurch beispielsweise gesundes und krankes Gewebe differenziert werden.
Die Partikel weisen vorzugsweise eine Partikelgröße von 20 bis 4000 nm, vorzugsweise 200 bis 400 nm auf. Die Partikel und ihre Herstellung sind beschrieben in Scheffold A, Miltenyi S, Radbruch A, Magnetofluorescent liposomes for increased sensitivity of immunofluorescence. Immunotechnology 1995; l(2) : 127-37.
Die signalgebende Eigenschaft wird insbesondere durch elektromagnetische Strahlung, insbesondere Fluoreszenz, Radioaktivität, Lumineszenz, Phosphoreszenz, elektromagnetische Resonanz, hervorgerufen. Die Affinitätsgruppierung ist bevorzugt ein Antikörper oder ein Antikörperfragment. Die Affinitätsgruppierung kann gegen jegliche Art von niedermolekularen Haptenen gerichtet sein wie z.B. Alexa Fluor 488; Amino-3- deoxydigoxigenin hemisuccinamide; Biotin; BODIPY; Cascade Blue; Cy2; CY3; CY5; Dansyl; DNP (Dinitrophenol); DIG (Digoxigenin); Alexa Fluor 488; 5(6)- SFX; Fluorescein; Lucifer yellow iodoacetamide; Marina Blue; Oregon Green 488; 5(6)-TAMRA; PE (Phycoerythrin); Rhodamine Red; Texas Red. Die Nukleinsäuren müssen dann mit den entsprechenden Haptenen markiert sein.
Gegenstand der Erfindung sind auch Träger mit einer Oberfläche an der Nukleinsäuren immobilisiert sind, welche mit markierten Nukleinsäuren hybridisiert sind, wobei Partikel, die signalgebende Eigenschaften und mindestens eine Affinitätsgruppierung für die markierten Nukleinsäuren aufweisen, danach die erste Affinitätsgruppierung an die markierten Nukleinsäuren gebunden sind.
Die Partikel für den erfindungsgemäßen Träger für die hoch sensitive Immunofluoreszenz-Detektion hybridisierter Nukleinsäuren besteht vorzugsweise aus magnetofluoreszenten Liposomen, die mehrere tausend fluoreszierender Moleküle und kolloidale magnetische Partikel enthalten.
Die Liposomen setzen sich vorzugsweise zusammen aus 40 bis 50 mol%, insbesondere 45 mol% Phosphatidylcholin, 5 bis 15 mol%, insbesondere 10 mol% Phophatidylglycerol, 2 bis 10 mol%, insbesondere 5 mol% Phosphatidylethanolamin und 35 bis 45 mol%, insbesondere 40 mol% Cholesterin.
Bei Einsatz wasserlöslicher Fluorophore (z.B. carboxyfluoreszein) enthalten die Liposomen in Abhängigkeit von der Löslichkeit und des Fluoreszenzverhaltens des jeweiligen Fluorphors eine 1 bis 100 mM Lösung des Fluoreszenzfarbstoffes, welche durch Eintauchen der Liposomen in eine entsprechend konzentrierte Fluorophor-Lösung und Diffusion des Fluorophors in die Liposomen erhalten werden. Bei Einsatz von wasserunlöslichen Fluorophoren enthalten die Liposomen in Abhängigkeit von der Löslichkeit und des Fluoreszenzverhaltens des jeweiligen Fluorphors das entsprechende Fluorophor im molaren Verhältnis von 1 : 100 bis 1: 1000. Die Fluorophor-enthaltenden Liposomen werden dadurch erhalten, dass bei der Herstellung der Liposomen dem Lipidgemsich in Abhängigkeit der Löslichkeit und des Fluoreszenzverhaltens des Fluorophors das entsprechende Fluorophor im molaren Verhältnis 1 : 100 bis 1 : 1000 bezogen auf die Molzahl der Lipide zugegeben wird.
Die Liposomen enthalten superparamagnetische Mikropartikel mit einem Durchmesser von 50 bis 100 nm. Diese werden durch Eintauchen der Liposomen in eine Lösung aus superparamagnetischen Mikropartikel erhalten, dessen Absorption bei 450 nm (Optischen Dichte, OD450) 500 beträgt.
Ein prägnanter Unterschied zwischen Liposomen (Partikel mit pseudo-fluider, biphasischer Oberfläche) und allen anderen Micropartikeln ist der, dass aufgrund der fluidischen Eigenschaften, eine Affinitätsgruppierung auf der Oberfläche der Liposomen frei beweglich ist. Dies ist für die Affinität bzw. Avidität (Gesamtbindungsstärke zwischen zwei Molekülen oder Partikeln, die von mehreren Bindungsregionen beeinflusst wird) der Partikel von ausschlaggebender Bedeutung, denn:
A) Aus theoretischen, sterischen sowie fertigungstechnischen Gründen kann nur eine endliche Anzahl an Affinitätsgruppierungen auf der Oberfläche eines Partikels eingebracht werden.
B) Die Dichte der aufgebrachten Affinitätsgruppierungen muß sehr genau ausgewählt werden, da bei zu hoher Dichte eine gegenseitige Abstoßung und Behinderung zu erwarten ist, bei zu geringer Beladungsdichte aber die Wahrscheinlichkeit der Bindung an das Zielmolekül stark herabgesetzt wird.
Die Bindungsstärke zwischen starren, sphärischen Partikeln (microspheres) mit einem Durchmesser von 20 bis 4000 nm, und einem relativ starren Tubus mit einem Durchmesser von ca. 2 nm (doppelsträngige DNA) wird also aus sterischen Gründen maßgeblich durch die Bindung von einer einzigen Affinitätsgruppe bestimmt. Die Bindungsstärke aber zwischen fluidischen, sphärischen Partikeln (Liposomen und Mizellen) mit einem Durchmesser von 20 bis 4000 nm, und einem relativ starren Tubus mit einem Durchmesser von ca. 2 nm (doppelsträngige DNA) wird mit größter Wahrscheinlichkeit von mehr als einer Affinitätsgruppe bestimmt. Dies ist folgendermaßen zu erklären: Nach erfolgter Bindung eines Zielmoleküls durch eine erste Affinitätsgruppe eines Liposoms können weitere Affinitätsgruppen des selben Liposoms im Zuge der ständigen lateralen Diffusion (ca. 10"6 - 10"7 m pro s) - wie sie für Lipiddoppelschichen sehr wohl bekannt ist - an ein benachbartes Zielmolekül wandern und eine zweite Bindung eingehen.
Ein Antigen (Zielmolekül) wird in erster Näherung durch eine der beiden Bindungsstellen eines Antikörpers in einer reversiblen bimolekularen Reaktion gebunden. Die Affinitätskonstante beträgt für die meisten Antikörper K=105 bis 1011 L/mol. Die einfache bimolekulare Reaktion lässt sich nur für die Umsetzung zwischen einem Antigen mit einem Epitop und homogenen Antikörper anwenden. Wenn auf dem Antigen zwei identische Epitope in einer solchen Entfernung vorliegen, dass die beiden Bindungsstellen eines Antikörpers oder zwei zusammenhängender Antikörper (z. B. IgM oder die hier beschriebenen Antikörper bestückten Liposomen) mit dem gleichen oder zwei benachbarten, zusammenhängenden Antigenmolekülen (markierte, doppelsträngige DNA) verläuft die Reaktion nicht mehr bimolekular, so dass für die Kinetik der Immunkomplexbildung komplizierter Gleichungen angewendet werden müssen. Wenn die beiden Antikörperbindungsstellen reagieren können, wird beispielsweise die zweite Bindungsstelle sehr viel schneller als die erste am Epitop gebunden (entropischer Effekt), weil sich das Antigenmolekül bereits sehr nah am Antikörper befindet, so dass die scheinbare Affinität (Avidität) in der Regel um mindestens das 104 fache erhöht ist.
Die erhöhte Affinität (Avidität) führt zur verstärkten und spezifischeren Bindung, was die höhere Sensitivität und Spezifität der Liposomen, also Partikel, die eine biphasische fluidische Oberfläche aufweisen, gegenüber anderen sphärischen Partikeln erklärt. Antikörper, beispielsweise Anti-DNP, anti-DIG etc. werden mit Succinimidyl-4- (N-maleimidomethyl)cyclohexane-l-carboxylat über Thiolgruppen, die durch S-S-Gruppen reduzierende Reagenzien freigelegt werden können, an die Amino-Gruppen der in den Liposomen vorliegenden Phosphatidyl-Ethanolamine konjugiert. Typische Reduktionsbedingungen werden mit Dithiothreitol eingestellt.
Die zu untersuchenden RNAs werden über eine konventionelle RT-Reaktion in die entsprechende cDNA umgeschrieben. Hierbei werden derivatisierte Nukleotide zugegeben wie DNP-dCTP, DIG-CTP etc., die in die entstehende cDNA eingebaut werden. Unter Verwendung unterschiedlich derivatisierter Nukleotide können in unabhängigen Reaktionen unterschiedliche cDNAs unterschiedlich markiert werden. Diese unterschiedlich markierten Gesamt- cDNAs, z.B. von gesundem und krankem Gewebe werden zur Hybridisierung auf einen Microarray aufgegeben. Nach durchgeführter Hybridisierung können die derivatisierten und hybridisierten cDNAs mit Hilfe der gegen sie gerichteten Antikörper, die mit den Liposomen konjugiert sind, erkannt und durch Messung der unterschiedlichen Fluoreszenzen identifiziert und quantifiziert werden. Somit können ohne enzymatische Amplifikation in einem Schritt mehrere tausend fluoreszierende Moleküle für eine entsprechend hohe Sensitivität der Analyse genutzt werden.
Die Erfindung wird an Hand der folgenden Beispiele näher erläutert.
Beispiel 1)
Liposomen zur Signalverstärkung
Es wurden ca. 300 bp lange cDNA-Fragmente unter Einbau von Biotin-dUTP bzw. Digoxigenin-dUTP mittels PCR generiert ("EC20 Biotin" bzw. "EC20 Digoxigenin") auf einen beschichteten Objektträger doppelt aufgetropft (300 pg) und kovalent gebunden (siehe PCT/EP 99/04014). Auf diesen "EC20Bio_EC20Dig-Arrays" enthielt jeder Spot ein Gemisch aus beiden cDNA Fragmenten im Verhältnis EC20 Biotin : EC20 Digoxigenin von 1000: 1;200: 1;40: 1;8: 1; 1 : 1; 1:8; 1:40; 1:200; 1 : 1000. Zusätzlich wurden zwei Negativ-Kontrollen aufgetropft: 1) Spotting Puffer 2) Heringssperma DNA. Die Arrays wurden 15. min in TNT Puffer bei RT gewaschen, 30 min mit TNB Puffer bei RT geblockt und anschließend 1 h gleichzeitig mit Cy3 und Cy5 markierten Liposomen (antiBio-Cy3 bzw. antiDig- Cy5 Liposomen) oder aber mit Cy3 markiertem Streptavidin (Strept Cy3) bei RT unter Schütteln (150 rpm) in einem Gesamtvolumen von 50 μl gefärbt. Die Liposomen wurden hierzu vorher mit lOfachem Volumen an PBS gewaschen und 20 min bei 4 °C und 13000 rpm zentrifugiert.
Anschließend wurden die gefärbten Arrays 20 min mit TNT Puffer unter Schütteln und 2 min mit 0.06 x SSC gewaschen. Die Arrays wurden mit einem Laser Scanning Gerät (ScanArray 3000, General Scanning, Inc.) vermessen und die Signalintensitäten verrechnet (Imagene 2.0, Biodiscovery, Inc.), siehe Fig. 1 und Fig. 2. In der zusammenfassenden Fig. (Overlay) repräsentiert die grüne Farbe gebundene anti-Dig-Cy5 Liposomen, die rote Farbe dagegen antiBiotin-Cy3 Liposomen. Es lässt ich erkennen, dass a) die Färbung der cDNA Fragmente spezifisch ist, b) die Mischungsverhältnisse der aufgebrachten cDNA-Fragmente nachweisbar sind und c) die Signalintensität der antiBio Cy3 Liposomen größer als die von Strep Cy3 ist.
Beispiel 2 ) In diesem Experiment sollte ermittelt werden, ob die Färbung mittels Liposomen im Vergleich zum konventionellen direkten Einbau von fluoreszenzmarkierten Nukleotiden eine Signalverstärkung erbringt.
Hierzu wurden cDNA-Arrays mit 18 unterschiedlichen cDNAs (300 pg) hergestellt, wobei jede cDNA insgesamt 8fach aufgetragen wurde (vier identische Quadranten mit je 2 Spots). Die aufgetragenen cDNAs sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Die Reihenfolge der cDNAs ist in den jeweiligen Quadranten von rechts unten nach links oben, so dass z.B. die cDNA Nr. 1 "EC7" in der rechten unteren Ecke des jeweiligen Quadranten zu finden ist. Für die Untersuchung wurde RNA aus muriner Milz und muriner Leber extrahiert. Hieraus wurde die mRNA isoliert. Jeweils 1 μg, 0,1 μg und 0,01 μg der mRNA wurde in einer reversen Transkription unter Einbau von a) fluoreszenzmarkierten Nukleotiden (Cy3-dCTP für Milz bzw. Cy5-dCTP für Leber) und b) biotinylierten (Milz) bzw. digoxigenierten dUTP (Leber) in cDNA umgeschrieben. Die konventionell markierten Cy3- bzw. Cy5- cDNAs wurden jeweils gemeinsam auf einen Array hybridisiert. Aus Fig.3 lässt sich erkennen, dass die Intensität der Signale mit abnehmender Ausgangsmenge geringer wird, so dass bei 0,01 μg Ausgangsmenge kaum noch Signale erkennbar sind. Die Biotin- bzw. Digoxigenin markierten Proben wurden ebenfalls gemeinsam auf Arrays hybridisiert und anschließend wie unter Beispiel 1 mit antiBio-Cy3 bzw. antiDig-Cy5 Liposomen markiert. Hier lässt sich erkennen, dass zwar auch die Signalintensität mit abnehmender Ausgangsmenge geringer wird, dass aber trotzdem auch bei 0,01 μg noch alle Signale erkennbar sind. Damit ist gezeigt, dass die Liposomen-Markierung wesentlich sensitiver als die konventionelle Direkt-Markierung ist.
In Fig.4 sind die Signalquotienten der einzelnen Arrays in einem Balkendiagramm zusammengefasst. Hier lässt sich erkennen, dass die Signalquotienten für beide Methoden vergleichbar sind mit der Ausnahme, dass bei der Standardmethode die gelben Balken (0,01 μg Ausgangsmenge) für manche Gene nicht mehr vorhanden sind, da die Absolutsignalintensität der zugrundeliegenden Signale zu gering ist. In Tabelle 2 sind die Signalquotienten nochmals tabellarisch zusammengefasst. Des weiteren ist hier die Anzahl an detektierbaren Genen dargestellt. Als "detektierbare Gene" werden solche bezeichnet, deren Signalintensität in mindestens einem der beiden Fluoreszenzkanäle mindestens 2fach höher als die entsprechende Signalintensität des Mittelwertes der negativ-Kontrollen beträgt (Heringssperma-DNA und Salz). Damit ist nochmals gezeigt, dass die Liposomen-Markierung sensitiver als die konventionelle Direkt-Markierung ist.

Claims

Patentansprüche
1. Verwendung von Partikeln ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Liposomen und/oder Mizellen mit signalgebenden Eigenschaften und mindestens einer Affinitätsgruppierung für markierte Nukleinsäuren zur Detektion markierter Nukleinsäuren, die mit auf einer Oberfläche immobilisierten Nukleinsäuren hybridisiert sind.
2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Partikel unterschiedliche Affinitätsgruppierungen tragen und/oder unterschiedliche signalgebende Eigenschaften haben.
3. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei die Partikel eine Partikelgröße von 20 bis 4000 nm aufweisen.
4. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die signalgebende Eigenschaft auf elektromagnetischer Strahlung, insbesondere Fluoreszenz, Radioaktivität, Lumineszenz, Phosphoreszenz, elektromagnetische Resonanz, oder Kombinationen davon beruht.
5. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Affinitätsgruppierung ein Antikörper oder Antikörperfragment ist.
6. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Affinitätsgruppierung gegen niedermolekulare Haptene gerichtet ist.
7. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Nukleinsäuren mit niedermolekularen Haptenen markiert sind.
8. Träger mit einer Oberfläche an der Nukleinsäuren immobilisiert sind, welche mit markierten Nukleinsäuren hybridisiert sind, wobei Partikel, die signalgebende Eigenschaften und mindestens eine Affinitätsgruppierung für die markierten Nukleinsäuren aufweisen, danach die erste Affinitätsgruppierung an die markierten Nukleinsäuren gebunden sind.
9. Träger nach Anspruch 8, wobei die Partikel unterschiedliche Affinitätsgruppierungen tragen und/oder unterschiedliche signalgebende Eigenschaften haben.
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