WO2001016337A1

WO2001016337A1 - Stereostructure de decarabamylase et procede d'utilisation

Info

Publication number: WO2001016337A1
Application number: PCT/JP2000/005901
Authority: WO
Inventors: Takahisa Nakai; Souichi Morikawa; Kiyoto Ishii; Hirokazu Nanba; Kazuyoshi Yajima; Yasuhiro Ikenaka; Satomi Takahashi
Original assignee: Kaneka Corporation
Priority date: 1999-08-31
Filing date: 2000-08-30
Publication date: 2001-03-08
Also published as: CN1376202A; JP2001069981A; EP1209234A1; KR20020037044A; EP1209234A4

Description

明細書デカルパミラ一ゼの立体構造およびその利用法技術分野

本発明は、 D— N—力ルバモイルーひ一アミノ酸を対応する D— α—アミノ酸に変換する酵素（以下、デカルバミラ一ゼという）の結晶に関する。また、本発明は、該結晶を用いた X線結晶構造解析により決定されたデカルバミラ一ゼの立体構造およびその利用、特に、該立体構造を利用したデカルバミラーゼの耐熱性、有機溶剤耐性、空気酸化に対する耐性等の安定性、酵素反応の至適 p Hの変更および比活性向上に関するアミノ酸の変異を設計する方法に関する。さらに、本発明は、上記立体構造を利用してデカルバミラーゼ変異体を製造する方法、得られたデカルバミラ一ゼ変異体、および、その利用に関する。背景技術

光学活性な D— α—ァミノ酸類は医薬中間体として重要な化合物であり、特に半合成ぺニシリン類または半合成セファロスポリン類の製造中間体である D -フェニルグリシン、 D—パラヒドロキシフエニルダリシンなどが工業的に有用な化合物例として挙げられる。このような D— α—アミノ酸類の製造法としては、対応する D— Ν—力ルバモイルー α—アミノ酸類の力ルバモイル基を除去してこれらを得る方法が公知であり、この際の力ルバモイル基の除去は化学的方法または微生物の酵素反応を利用する方法によって行われる。

力ルバモイル基の除去を行う酵素は、デカルバミラーゼと呼ばれる。この酵素は、 D—N—力ルバモイル— α—アミノ酸の D—α—アミノ酸類への変換を触媒する。この酵素は、シユードモナス属、ァグロパクテリゥム属、ァェロバクタ —属、ァエロモナス属、プレビパクテリゥム属、バチルス属、フラボパクテリゥム属、セラチア属、ミクロコッカス属、アースロバクタ一属、アルカリゲネス属、ァクロモバクタ一属、モラキセラ属、パラコッカス属、ブラストパクター属、およびコマモナス属から同定されている。デカルバミラーゼのアミノ酸配列およびまたは核酸配列は、ァグロパクテリゥム属から決定されており、例えば、 Ag r o b a c t e r i um r ad i o ba c t e r NR R L B 1 1291および Ag r o b a c t e r i um s p. KNK712 (カネカ菌）が挙げられる。

一般に、酵素は常温または高温でこれを反応に用いる工業利用の際の条件に耐え得るほど十分な安定性を有していない場合が多く、その安定性が生産物のコス卜に影響する場合が多い。また、酵素反応を有利に進行させる手段として、固定化酵素または固定化菌体等のいわゆる「バイオリアクター」として繰り返し反応に用いることが行われているが、この際にも酵素の安定性によって使用回数が制限され、生産物のコストに与える影響が大きい。

有用な反応を触媒する酵素を有効に工業利用するためには、安定性などの物性または触媒能の高い優れた酵素を迅速かつ効率的に創製する手法が望まれる。物性または機能を改良した酵素を取得する方法としては、酵素をコードする遺伝子に化学処理または酵素処理などにより人為的な変異を加え、変異を含んだ組換え体 DN Aを宿主細胞に導入して、目的の機能および/または物性を有する酵素をスクリーニングするいわゆるランダムスクリーニング法がよく知られている。一方、近年の構造生物学の進歩に伴い、酵素などの数多くのタンパク質の立体構造が X線結晶解析または NMR解析により明らかにされてきており、その立体構造および分子設計手法を用いたタンパク質の物性または機能改変も盛んに行われるようになつている。

ここで、「タンパク質の立体構造」とは、あるアミノ酸配列を有するタンパク質がある条件下で折り畳まれて形成される、ある条件およびそのアミノ酸配列によって規定されるタンパク質の三次元構造のことをいう。タンパク質の立体構造は、例えば、 X線結晶構造解析または核磁気共鳴によって決定され得る。

デカルバミラーゼの物性の改変については、ランダムスクリ一二ング法により耐熱性の向上した酵素生産株（E. c o l i JM109) をスクリーニングすることに成功し、工業利用に有利なデカルバミラーゼ変異体が取得されている (国際公開 W〇 94/03613号パンフレツト）。また、部位特異的変異誘発により、安定性の向上した変異体（特開平 9— 173068号公報）が取得されている。しかし、これらの例は、アミノ酸の一次配列のみに基づいて変異体を作製したものであって、酵素の立体構造を利用した合理的な分子設計手法を活用したものではない。

これまでにデカルバミラーゼおよびその類縁酵素であって、その立体構造が明らかにされたものは知られていない。デカルパミラーゼは、アミノ酸配列が既に知られているタンパク質の配列データベース、 P I R Re l e a s e 57 (米国国立バイオテクノロジー情報センター、 NCB I) に対する配列類似性解析からアミダーゼ、二卜リラ一ゼ等の加水分解酵素と 25〜30%程度の弱い配列類似性を有することが明らかになつている。しかしながら、弱い配列類似性を有するこれらの酵素の立体構造は、これまでいずれも明らかにはされていない。そのため、分子設計手法でしばしば用いられる類似タンパク質の立体構造を用いたいわゆるホモロジーモデリングの手法（例えば、 Sw i s s— Pd bv i ewe r (モデリングプログラム）（Swi s s I n s t i t u t e o f B i o i n f o rma t i c s (S I B) , ExPASy Mo l e c u l a r B i o l ogy S e rve r (h t t p : ZZwww. exp a s y. c h/ より入手可能））； Gu e x、 Ν· および P e i t s c h, M. C. ( 1997) SWI SS— MODEL and t h e Sw i s s -Pd bV i ewe r : A n e nv i r onmen t f o r c omp a r a t i ve p r o t e i n mod e l i ng, E l e c t r opho r e s i s 18、 2714— 2723) により、デカルバミラーゼの立体構造を推定することは事実上不可能であった。また、仮に類縁酵素の立体構造が決定されたとしても、 3 0 %に満たない弱い配列類似性では、合理的な分子設計手法を適用するために十分な精度をもって立体構造モデルを得ることは難しい。酵素反応の至適 P Hの変更、比活性向上に関するアミノ酸変異等を精度良く予測し、それに基づき分子設計するためには、デカルバミラーゼの精密な原子座標データが必須である。デカルバミラーゼの立体構造を決定することができれば、精密な立体構造の解析、およびこれに基づく合理的な分子設計手法を適用することが可能となり、ひいては工業利用に有利な改変酵素を迅速かつ効率的に取得することも可能となる。 (発明が解決しょうとする課題）

本発明は、このような課題を解決すべく、現在工業利用に供されているデカルパミラ一ゼの単結晶を取得し、 X線結晶構造解析によりその立体構造を明らかにすることを目的とする。本発明はまた、デカルバミラ一ゼの立体構造を利用して、基質である D— N—力ルバモイル— α—ァミノ酸類に対する反応性の向上、反応 ρ Ηの最適化、熱および空気酸化に対する安定性向上等を目指した分子設計を行うことにより、工業利用により有利な優れたデカルバミラーゼ変異体を提供すること、および得られたデカルバミラ一ゼ変異体を利用した D— α—アミノ酸の製造方法を提供することを目的とする。発明の開示

(課題を解決するための手段）

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、デカルバミラーゼの単結晶およびその重原子誘導体結晶を取得し、これら結晶の重原子同型置換法および多波長異常分散法を用いた X線結晶構造解析によりデカルバミラ一ゼの精密な立体構造を決定し、そしてこれらの立体構造を基に特性の改善された変異体を作製することにより、本発明を完成するに至った。本発明は、直方晶系の空間群 P 2 , 2 , 2および配列番号 1に示されるァミノ酸配列、または直方晶系の空間群 P 2 , 2 , 2 iおよび配列番号 2に示されるアミノ酸配列を有する、デカルバミラーゼ結晶に関する。結晶が直方晶系の空間群 P 2！ 2 i 2および配列番号 1に示されるアミノ酸配列、または空間群 P 2 , 2,2 , および配列番号 2に示されるアミノ酸配列を有する、デカルバミラーゼ結晶に関する。一つの実施態様において、上記結晶は直方体形状の単位格子を有し、単位格子定数： a = 66. 5-68. 5A、 b= 135. 5〜： L 38. 0A、 c = 6 6. 5-68. 5 Aを有し得る。また、上記アミノ酸配列が配列番号 1であり得る。別の実施態様において、上記結晶は直方体形状の単位格子を有し得、そして単位格子定数： a = 68. 5〜70. 5人、 = 1 38. 0〜： 140. 5A、 c = 68. 5〜73. OAを有し得る。他の実施態様において、上記結晶は直方体形状の単位格子を有し得、そして、単位格子定数： a = 8 1. 5〜82. 5人、 b= 133. 0〜： 1 35. OA, c = 1 1 9. 5〜： 12 1. 5Aを有し得る。また、上記アミノ酸配列は配列番号 2であり得る。 1つの局面において、本発明は結晶中のデカルバミラ一ゼ 1分子当たり少なくとも 1つ以上の重金属原子を含む結晶を提供し得る。一つの実施態様において、上記重金属原子は水銀、金、白金、鉛、イリジウム、オスミウムおよびウランのうちいずれかであり得る。他の実施態様において、本発明はデカルバミラーゼ結晶を液体窒素下で凍結させることにより調製される凍結結晶を提供し得る。

別の局面において、本発明は、デカルバミラーゼ結晶の製造方法であって、 1

~5 Omg/m 1の濃度でデカルバミラーゼの溶液を与える工程、 5〜30重量％の濃度でポリエチレングリコール（PEG) あるいはメ卜キシポリエチレングリコール（PEGMME) を含有し、かつ 6. 0〜9. 0の pHを与える濃度の緩衝剤を含有する沈澱剤溶液を与える工程、該デカルバミラーゼ溶液を該沈澱剤溶液と混合する工程、および得られる混合溶液を、該溶液中のデカルバミラーゼ結晶が既定の大きさ以上に成長するまで既定の期間放置する工程を包含する、方法を提供する。 1つの実施態様において、本発明の方法はまた、混合する工程が、デカルバミラーゼ溶液の液滴を前記沈澱剤溶液の液滴と混合させることを包含し、そして放置する工程が、混合工程で得られる混合液滴を密閉容器中で沈澱剤溶液を保持する溶液溜め部上に懸垂させることを包含し、ここで、該溶液溜め部中の該沈澱剤溶液の蒸気圧は該混合液滴の蒸気圧より低い。本発明の方法はまた、混合する工程が、前記デカルバミラーゼ溶液の液滴を上記沈澱剤溶液の液滴と混合させることを包含し、そして上記放置する工程が、混合工程で得られる混合液滴を密閉容器中で沈澱剤溶液を保持する溶液溜め部の液滴台に静置させることを包含し、ここで、該際溶液溜め部中の該沈澱剤溶液の蒸気圧は該混合液滴の蒸気圧より低い。別の実施態様において、本発明の方法における混合溶液を放置する期間は 1日から 3週間である。他の実施態様において、本発明の方法は、上記デカルパミラーゼの溶液を与える工程の後に、該デカルバミラーゼ溶液をサイズ排除半透膜内に配置させる工程をさらに包含し、そして前記混合する工程が、該半透膜を通して沈澱剤溶液を該デカルバミラーゼ溶液中に拡散させることをさらに包含する。他の実施態様において、本発明の方法における上記混合する工程が、上記沈澱剤溶液を前記デカルバミラ一ゼ溶液に徐々に添加することを包含し、そして上記放置する工程が、得られる混合溶液を密閉容器内で放置することを包含する。別の局面において、本発明は、図 1に示すタンパク質立体構造トポロジ一を有する立体構造により特徴付けられるデカルバミラ一ゼに関する。一つの実施態様において、本発明は、 4本の αヘリックスおよび 1 2本の /3ストランドの二次構造を含む 4層サンドイッチ構造を有する、デカルバミラーゼに関する。本発明の好ましい実施態様において、酵素反応に関与するアミノ酸残基は、システイン 1残基、グルタミン酸 2残基、およびリジン 1残基であり、酵素反応の基質が D— Ν—力ルバモイルー α—アミノ酸であって、図 3に示す基質結合様式を有する活性部位の立体構造により特徴付けられる。本発明の別の実施態様において、本発明は、デカルバミラーゼ活性を有する酵素分子であって、少なくとも、配列番号 1または 2における以下のアミノ酸： 4 6位の G 1 u、 1 2 6位の L y s、 1 4 5位の G 1 u、および 1 7 1位の C y sに対応するアミノ酸から形成される活性部位腔を有する、酵素分子に関する。別の実施態様において、活性部位腔において、基質である D— N—力ルバモイルーひ—アミノ酸は、反応時に前記配列番号 1または 2の 1 2 6位の L y s、 1 4 3位の1^ 5、 1 4 5位の〇 1 1：、 1 7 4 tの A T g、 1 7 5位の，および 1 9 7位の T h rに対応するァミノ酸と相互作用する。他の実施態様では、上記活性部位腔において、前記配列番号 1または 2の 4 6位の G 1 u、 1 4 5位の G 1 uおよび 1 7 1位の C y sに対応するアミノ酸は水分子を介して水素結合している。なお別の実施態様において、上記 D— N—力ルバモイルー Q!—アミノ酸は、 D— N—力ルバモイル—フエニルグリシン、 D— N—力ルバモイルーパラヒドロキシフエニルグリシン、 D— N— 力ルバモイルーフエ二ルァラニン、 D— N—力ルバモイル—パリン、 D— N—力ルバモイル—ァラニン、 D— N—力ルバモイルーシスティン、 D— N—カルバモィルーァスパラギン酸、 D— N—力ルバモイル—グルタミン酸、 D— N—力ルバモイル—グリシン、 D— N—力ルバモイル—ヒスチジン、 D— N—カルパモイル —イソロイシン、 D— N—力ルバモイルーリジン、 D— N—力ルバモイルーロイシン、 D— N—力ルバモイルーメチォニン、 D— N—力ルバモイル—ァスパラギン、 D— N—力ルバモイループ口リン、 D— N—力ルバモイルーグルタミン、 D 一 N—力ルバモイル—アルギニン、 D— N—力ルバモイルーセリン、 D— N—力ルバモイルースレオニン、 D— N—力ルバモイルートリプトフアン、 D— N—力ルバモイル―チ口シンからなる群から選択される。さらに別の実施態様において、本発明は、本発明のデカルバミラーゼの立体構造から分子設計手法により構築された、デカルバミラーゼあるいはその変異体と D - N—カルパモイルー α—アミノ酸あるいは D— α—アミノ酸との複合体立体構造により特徴付けられるデカルバミラ一ゼ複合体に関する。

本発明の一つの局面において、本発明は、デカルバミラーゼ変異体を設計する方法であって、デカルバミラ一ゼの請求項 1 4、 1 6、または 2 1のいずれか 1 項に記載の立体構造に基づいて物性および Zまたは機能を改変したデカルバミラーゼ変異体を設計する工程、を包含する、方法に関する。別の局面において、本発明は、デカルバミラーゼ変異体を設計する方法であって、デカルバミラーゼ活性を有する酵素の結晶を生成する工程、該結晶の X線結晶構造解析により立体構造を決定する工程、および決定した該結晶の立体構造に基づいて物性および Zまたは機能の向上したデカルバミラーゼ変異体を設計する工程を包含する方法に関する。さらに別の局面において、本発明は、デカルバミラ一ゼ変異体を製造する方法であって、該方法が、デカルバミラーゼ活性を有する酵素の結晶を生成する工程、該結晶の X線結晶構造解析により該結晶の立体構造を決定する工程、決定した該結晶の立体構造に基づいて物性および Zまたは機能の向上したデカルバミラ一ゼ変異体を設計する工程、および該デカルパミラ一ゼ変異体を産生する工程を包含する、方法に関する。一つの実施態様において、本発明の方法で使用される上記立体構造は、本発明のデカルパミラーゼの立体構造である。別の実施態様において、上記デカルバミラーゼ変異体を設計する工程は、酵素の基質特異性の変更、酵素比活性の変更、酵素の安定性向上、至適 p Hの最適化および酵素の水溶性の変更からなる群から選択される 1以上の酵素特性の改変を目的とする。さらに別の実施態様において、上記デカルバミラーゼ変異体の製造方法は、酵素の安定性向上を目的とする。好ましくは、酵素の安定性向上に関する変異体の設計は空気酸化による活性低下を招くアミノ酸残基を置換する変異を含む。他の実施態様において、上記酵素特性の改変は、酵素比活性の変更および至適 p Hの最適化を含む。

別の局面において、本発明は、本発明の方法によって得られたデカルバミラーゼ変異体に関する。本発明はまた、本発明の立体構造を利用してデカルバミラ一ゼのインヒビ夕一をスクリーニングおよびノまたは設計する方法を提供する。さらに別の局面において、本発明は、デカルバミラーゼ結晶の立体構造またはデカルバミラ一ゼの立体構造を利用して、アミノ酸一次配列がデカルバミラ一ゼと少なくとも 3 0 %の類似性を有する別のポリペプチド酵素またはタンパク質酵素を改変方法を提供する。図面の簡単な説明

図 1は、デカルバミラーゼのタンパク質立体構造トポロジー図である。 /3ストランド構造を三角印で、ひへリックス構造を丸印で示した。「N— t e r m」は網の末端を、「C— t e r m」はカルボキシ末端をそれぞれ示す。

図 2は、デカルバミラ一ゼのリポン一ストランド図である。）3ストランド構造を板状に、 αヘリックス構造を螺旋で示した。触媒活性に関与するアミノ酸側鎖をポールースティック表記で示した。

図 3は、デカルバミラ一ゼの活性部位における基質結合様式の模式図である。 R—は、 D—α—アミノ酸の側鎖である。残基番号および三文字表記によるアミノ酸名を示した。

図 4は、デカルバミラ一ゼの触媒活性部位の立体構造である。 /3ストランド構造を板状に、 αヘリックス構造を螺旋で示し、触媒活性に関与するアミノ酸側鎖をポールースティック表記で表し、残基番号および三文字表記によるアミノ酸名を示した。

図 5は、 1 . 0 0人ぉょび0 . 9 8 Αの回折データから計算した差パターソン図のハーカ一面である。

図 6は、 1 . 0 0入ぉょび1 . 2 7 Aの回折データから計算した差パターソン図のハーカー面である。

図 7は、 0 . 9 8 Aをァノマラス（a n o m a 1 0 u s ) デ一夕として計算したァノマラス差パターソン図のハーカー面である。

図 8は、本発明の立体構造を示す、触媒活性部分の代表的な電子密度図である。発明を実施するための最良の形態

以下、本発明を詳細に説明する。

本明細書において、「デカルバミラ一ゼ活性」とは、 D— N—力ルバモイルー α—アミノ酸を、そのアミノ酸を修飾している力ルバモイル基を除去して D— ひ —アミノ酸に変換する活性をいう。「デカルバミラ一ゼ」とは、デカルバミラーゼ活性を有する酵素をいう。デカルバミラーゼの例としては、配列番号 1または配列番号 2のアミノ酸配列を有する酵素が挙げられる。配列番号 1のアミノ酸配列を有するデカルバミラーゼは、 Ag r o b a c t e r i um s p. KN K712から単離され配列決定された。配列番号 2のアミノ酸配列を有する酵素は、配列番号 1からランダム変異によるスクリーニングにより、 E. c o l i変異株から得た酵素である。

本明細書において、デカルバミラーゼまたは他の酵素の変異体の「変異体」とは、もとの酵素のアミノ酸配列のアミノ酸が少なくとも 1つ以上置換、付加、もしくは欠失、または修飾されたアミノ酸配列を有し、もとの酵素の活性の少なくとも一部を保持する改変された酵素をいう。「活性断片」とは、あるタンパク質酵素またはポリペプチド酵素のアミノ酸配列の一部を有する断片であって、もとの酵素の活性の少なくとも一部を保持する断片をいう。ここで、「活性の少なくとも一部」とは、代表的には、もとの酵素の少なくとも 10%の比活性、好ましくは元の酵素の少なくとも 50%の比活性をいうが、所望によって、 10%未満の比活性をいう場合もある。

Φ明細書において、「ネイティブ結晶」とは、デカルバミラーゼを硫安、ポリエチレングリコールなどの沈澱剤および添加塩類等を適切な組成で含有する緩衝液中で、単結晶にまで成長させたものであって、重金属原子を含有しない結晶をいう。

本明細書において、「重原子誘導体結晶」とは、以下のいずれかの結晶をいう： (i) 調製したネイティブ結晶を水銀、金、白金、鉛、イリジウム、ォスミゥムおよびウランなどの重金属化合物を含んだ溶液に浸漬することで、結晶性を崩すことなく、結晶中のデカルバミラーゼに重金属原子を共有結合あるいは配位結合等により結合させた結晶、（i i) 硫安、ポリエチレングリコールなどの沈澱剤および添加塩類等を適切な組成で含有する緩衝液であって、さらに適切な濃度で上記重金属化合物を含有する溶液中で、デカルバミラ一ゼを単結晶にまで成長させた結晶、および（ i i i) デカルバミラーゼのメチォニンおよび Zまたはシスティン残基がセレノメチォニンおよび Zまたはセレノシスティンに置換した変異体を用いて得られる結晶。

本発明の一つの実施態様において、配列番号 1または 2のアミノ酸配列を有するデカルバミラーゼの結晶は、用いる溶液の濃度および pHを規定の範囲内（デ力ルバミラーゼの濃度については、 l〜50mgZml、ポリエチレングリコ一ルまたはメトキシポリエチレングリコールの濃度については 5〜 30重量％、 p Hについては 6. 0〜9. 0) に細心に調節しながら、ポリエチレングリコール (PEG) またはメトキシポリエチレングリコール（PEGMME) 、緩衝剤および任意の添加塩類を含有する沈澱剤溶液から成長させ得る。タンパク質の結晶成長に一般的に用いられる三種類の基本技術のいずれか、すなわち蒸気拡散法、透析法およびバッチ法（Me t h o d s i n En z ymo l ogy、第 1 1 4卷、 D i f f r ac t i on Me t h od s f o r B i o l o g i c a 1 Ma c r omo 1 e c u 1 e s P a r t A または第 276卷 Ma c r o mo 1 e c u 1 a r C r y s t a l l og r a phy P a r t A) のいずれかを用い得るが、蒸気拡散法が好ましい。

蒸気拡散法は、沈澱剤を含むタンパク質溶液の液滴を、より高濃度の沈澱剤を含む緩衝液（外液）の入った容器中に置き、密封後静置しておく方法である。液滴の置き方によって、懸滴（h a n g i n g— d r o p) 法およびシッティングドロップ（s i t t i ng d r o p) 法がある。懸滴（八ンギングドロップ）法は、タンパク質溶液の小さな液滴をカバーグラス上に配置し、カバーグラスを溶液溜め（リザーパー）上で反転させ、密封する。他方、シッティングドロップ法では、リザーパー内部にに適切な液滴台を設置し、タンパク質溶液の小滴を液滴台上に配置し、力パーグラス等でリザーパーを密封する。リザーバー中の溶液は沈澱剤を含有し、沈澱剤はタンパク質小滴中にも少量存在する。蒸気拡散法で使用する沈澱剤溶液は、以下の成分を含有するように形成させる：（a) 分子量 4000〜 9000、好ましくは平均分子量 7500と 10〜 20重量％の濃度とを有する PEGまたは PEGMME、 (b) 添加塩として 0. ：!〜 0. 5Mの濃度を有する食塩、塩化リチウム、塩化マグネシウム（最良の結果は 0. 2M塩化リチウムによって得られる）、および（c) pH6. 5〜8. 0、好ましくは pH7. 5を与えるに十分な量の緩衝剤。 0. 05〜0. 1Mの HEPES (S i gma、 S t Lou i s, MO, USA) がこの目的に使用できる。リン酸ナトリウム、リン酸カリウムおよび卜リス（ヒドロキシメチル）ァミノメタンマレー卜等の他の緩衝剤もまた用い得る。

「バッチ法」とは、タンパク質溶液に沈澱剤溶液を少しずつ加え、わずかに濁つたところ不溶物を遠心分離して除去後、上清を小さな試験管に入れて密封した後に静置しておく方法をいう。また、「透析法」とは、タンパク質溶液を沈澱剤の入った緩衝液（外液）に対して、半透膜を用いて透析する方法をいう（ Me t hod s i n En z ymo l ogy、第 1 14巻、 D i f f r a c t i o n Me t hod s f o r B i o l og i c a l Ma c r omo l e c u l e s P a r t A ) 。

本明細書において、「既定の大きさ」とは、 X線結晶構造解析で測定可能な最低限の大きさをいい、本発明のデカルバミラーゼの場合、好ましくは 0. 3X0. 3X0. 1mmであり得る。また、「既定の期間」とは、結晶の大きさが既定の大きさ以上に達するのに十分な期間をいい、本発明のデカルパミラ一ゼの場合、好ましくは 1日〜 3週間であり得る。

上記のように調製した X線結晶構造解析に適した既定の大きさを有する配列番号 1のデカルバミラーゼのネイティブ結晶は、（1) 菱形板状の外形を有し、そして（2) 同一外形を有する結晶であっても、異なる単位格子定数を有し得る。また、 X線結晶構造解析には適さないが、沈澱剤、緩衝液等の条件を適切に選択することによって、針状あるいは柱状の外形を有する小型あるいは微小結晶が得られる。このような結晶の用途に関して酵素の微小結晶をダルタルアルデヒド等の夕ンパク質架橋試薬によつて架橋することによって、有機溶媒を含む状態においても酵素反応を長期間安定に行うことを可能とする CLE C (C r o s s -L i nk e d En z yme C r y s t a l ) と呼ばれる技術が報告されている (N. L. S t. C l a i r & M. A. Nav i a、 ( 1992) J. A m. Ch em. S o c. 1 14, 7314— 7316) 。本発明によって得られるデカルバミラ一ゼの結晶は、 C L E C技術の適用範囲を拡大するものである。本発明の 1つの実施態様において、 X線結晶構造解析に有効な重原子誘導体結晶、すなわちネイティブ結晶の結晶性を保持しつつ、結晶中のタンパク質に重金属原子が結合した結晶が提供される。重原子誘導体結晶は、タンパク質の X線結晶構造解析の基本技術である重原子同型置換法および多波長異常分散法を適用する際に利用される。デカルバミラーゼの重原子誘導体結晶は、ネイティブ結晶が溶解、崩壊せず少なくとも数日以上安定に保存され得る、所要の濃度を与える重金属化合物を含有させた溶液に結晶を浸漬する浸漬法により調製し得る。浸漬法に使用される重金属化合物は、金、白金、イリジウム、オスミウム、水銀、鉛、ウラン、サマリウムなどを含む金属塩あるいは有機金属化合物である。重金属浸漬法では、 0. 1〜10 OmM濃度の重金属化合物、例えば水銀化合物である E MTS (ェチル水銀チォサリチル酸ナトリウム塩）、カリウムジシァノ金（I) などを含有し、所望の pHを与える適切な沈澱剤および添加塩組成を有する保存溶液が使用し得る。保存溶液の好ましい例は、 20〜30重量％ポリエチレングリコール 6000および 0. 2M塩化リチウムを含む 0. 01M HEPES緩衝液（PH7. 5) である。重金属原子が結晶中に導入、すなわち結晶中のタンパク質に結合しているかどうかの判定は、浸漬法により調製した結晶の X線回折強度データを収集し、あらかじめ取得しているネイティブ結晶の回折強度データと比較することによって行い得る。

あるいは、デカルバミラーゼを生産する微生物（例えば、ァグロパクテリゥム属の DNAを有する組換え E. c o l iなど）を重金属原子であるセレンを含有したセレノメチォニンあるいはセレノシスティンを含む培地で生育、培養することにより、デカルバミラ一ゼ中のメチォニンあるいはシスティン残基がセレノメチォニンあるいはセレノシスティンに置換した変異体が取得され得る。このように浸漬法を用いることなく重金属原子をタンパク質中に導入したデカルバミラーゼが取得されれば、上記条件等を用いた結晶化により重原子誘導体結晶を調製し得る。

一般に、タンパク質の結晶は、 X線によりかなり損傷を受けることが知られているので、 X線結晶構造解析を成功させるためには、損傷を受け難い結晶を取得することが重要である。近年では、結晶を凍結させ、凍結状態のままで回折デー夕を測定することで高品質、高分解能の回折データを取得する試みが行われている（Me t hod s i n ENZ YMOLOGY 第 276巻、 Ma c r om o 1 e c u 1 a r C r y s t a l l o g r a p hy. Pa r t A、 C. W. Ca r t e r, J r. および R. M. Swe e t編、 [13] P r a c t i c a 1 C ryoc r y s t a l 1 o g r a p h y (D. W. Rod ge r s) ) 。一般に、タンパク質結晶の凍結には、凍結による結晶の崩壌を防ぐ目的で、グリセ口ールなどの凍結安定化剤を含む溶液で処理するなどの工夫がなされる。本発明においては、デカルパミラ一ゼのネィティブ結晶および重原子誘導体の凍結結晶は、凍結安定化剤を添加することなく、結晶化小滴あるいは浸漬溶液中の結晶を取り出し、液体窒素に直接浸漬して瞬時に凍結させることで調製し得る。凍結結晶はまた、凍結安定化剤を添加した保存液に浸漬した結晶に対して上記瞬時に凍結させる操作を行うことによつても調製し得る。類縁夕ンパク質の立体構造が未知であり、その立体構造を利用した分子置換法による構造解析が不可能なデカルバミラーゼなどの新規タンパク質の立体構造決定においては、重原子同型置換法（Me t h o d s i n ENZ YMOLOG Y 第 1 15巻、 D i f f r a c t i p n Me t hod s f o r B i o l og i c a l Ma c r omo l e c u l e s, P a r t B、 H. W. Wy c k o f f C. H. W. H i r s、および S. N. T ima s h e f f編、ならびに Me t h od s i n ENZ YMOLOGY 第 276巻、 Ma c r omo l e c u l a r C r y s t a l 1 o g r a p h y , P a r t A、 C. W. Ca r t e r, J r. および R. M. Swe e t編）または多波長異常分散法（ S. N. T ima s h e f f編、ならびに Me t h o d s i n ENZ YMOLOGY 第 276卷、 M a c r o m o 1 e c u 1 a r C r y s t a 1 1 o g r a p h y, P a r t A、 C. W. Ca r t e r, J r. および R. M. Swe e t編）が適用され得る。すなわち、ネイティブ結晶および重原子誘導体結晶の回折データ間の回折強度差、あるいは異なる波長で測定した回折デ一夕間の回折強度差から、電子密度を計算するための初期位相を求めることにより立体構造を決定し得る。重原子同型置換法または多波長異常分散法を適用するデ力ルバミラーゼの立体構造決定においては、重金属原子として例えば水銀、金、白金、ウラン、セレン原子などを含有した重原子誘導体結晶を用い得る。好ましくは、水銀化合物 EMTSまたはカリウムジシァノ金（I) を利用した浸漬法により得られる重原子誘導体結晶が用いられる。

ネイティブ結晶および重原子誘導体結晶の回折データは、 R— AX I S I I c (理学電機）あるいは SP r i ng-8 (西播磨大型放射光施設）のタンパク質結晶構造解析用ビームラインを用いて測定し得る。多波長異常分散法を適用するための複数波長での回折データ測定は、 SP r i ng— 8のタンパク質結晶構造解析用ビームラインを用いて実施し得る。測定した回折画像データは、 R— A X I S I I c付属のデ一夕処理プログラムまたはプログラム DENZO (マツクサイエンス）または同様な画像処理プログラム（または単結晶解析用ソフトゥエア）を用いて、反射強度データに処理される。ネイティブ結晶の反射強度デー夕、複数波長での重原子誘導体結晶の反射強度データ波長の測定により得られた反射強度データから、差パターソン図を利用して結晶中のタンパク質に結合した重金属原子の位置を求めた後、プログラム PHASES (W. Fu r ey、 Un i ve r s i t y o f Pe nn s y l van i aあるい ίま CCP4 (B r i t i s h B i o t e c hno l ogy & B i o l og i c a l S c i e n c e Re s e a r c h Coun s i SERC) または同様の回折デー夕解析プログラムを用いて重原子位置パラメータを精密化することにより初期位相が決定される。決定された初期位相は、プログラム DM (C CP 4パッケ一ジ）または同様な位相改良プログラム（電子密度改良プログラム）を用いた溶媒平滑化法およびヒス卜グラムマッチング法に従って、デカルバミラーゼ結晶中の溶媒領域を 30~ 50%、好ましくは 35%として、低分解能から高分解能まで徐々に位相拡張計算を行うことにより信頼性の高い位相へと改良される。タンパク質の結晶は、その体積の 30〜60%がタンパク質以外の溶媒分子（主として水分子）で占有されている。本明細書において、溶液中の溶媒分子の占める体積を「溶媒領域」とする。一般に、得られたタンパク質結晶が非結晶学的な対称を有する場合には、非結晶学的対称（NCS) 平均化と呼ばれる電子密度の平均化を行うことにより、さらに位相の信頼性を高めることが可能である。デカルバミラーゼの結晶は、結晶の密度測定の結果から非対称単位中に 2分子が含まれることがわかっており、結晶中のデカルバミラーゼ分子は非結晶学的な 2回軸を持つことが推定される。溶媒平滑化法を適用した後の位相を用いて計算した電子密度図および精密化した重原子座標から、並進および回転を含む非結晶学的対称マトリックスが算出される。同時に溶媒平滑化法で得られた電子密度図から、マスクと呼ばれるタンパク質の分子が存在する領域を同定し得る。非結晶学的対称マトリックスおよびマスクを用いて、プログラム DMなどにより NCS平均化計算を行うことにより、信頼性の高い位相に改良され、立体構造モデルの構築に用いる電子密度図が得られる。

デカルバミラーゼの立体構造モデルは、プログラムォー（プログラム O) (A. J on e s, Upp s a l a Un i v e r s i t e t, スウェーテン) により 3次元グラフィックス上に表示した電子密度図から、以下の手順で構築し得る。まず、特徴的なアミノ酸配列を有する複数の領域（トリブトファン残基を含む部分配列など）を電子密度図上で探し出す。次に、見出した領域を起点にしてアミノ酸配列を参照しながら、電子密度に適合するァミノ酸残基の部分構造をプログラム Oを用いて 3次元グラフィックス上で構築する。、順次この作業を繰り返すことにより、デカルバミラーゼのすべてのアミノ酸残基を相当する電子密度に適合させ、分子全体の初期立体構造モデルを構築する。構築された立体構造モデルは、それを出発モデル構造として、構造精密化プログラムである XPLOR (A. T. B r u n g e r , Ya l e Un i ve r s i t y) の精密化プロトコルに従って、立体構造を記述する三次元座標が精密化される。また、デカルバミラ一ゼ（例えば、配列番号 1に示されるデカルパミラーゼ）のネイティブ結晶の立体構造およびデカルバミラーゼ変異体（例えば、配列番号 2に示される配列を有するデカルバミラーゼ変異体）ネイティブ結晶の立体構造は、得られた EMTS誘導体結晶の立体構造を用いた分子置換法により初期位相を求め、前記の電子密度改良、モデル構築、構造精密化手順に従うことにより各々の立体構造を決定し得る。このことにより、本発明のデカルバミラ一ゼの立体構造の決定が完成される。決定したデカルバミラーゼの立体構造について、タンパク質立体構造の公的デー夕バンクであるプロテインデータバンク（PDB) に登録されている種々のタンパク質（デカルバミラ一ゼと機能において類似する酵素を含む）の立体構造との比較を行い得る。デカルバミラ一ゼと同様の脱力ルバミル化反応を触媒する N— 力ルバミル—ザルコシン—アミドハイドラーゼの立体構造が知られているが（プ口ティンデータバンク I D、 1 NBA) 、デカルバミラ一ゼの立体構造は、この酵素の立体構造との構造類似性は認められない。プロテインデータバンクに立体構造が登録されているタンパク質の中では、ペニシリンアシラーゼ（1 PNK) 、ダルコサミン一 6—ホスフェイト合成酵素（1 GDO) 、グルタミンホスフ才リボシルピロホスフェイトアミドトランスフェラーゼ（1 ECF) 、およびプ口テオソーム（1 PMA) などがその立体構造に含まれるドメインと呼ばれる部分構造において、 2層に積層した) 3シートの両側に αヘリックス構造が密着した 4層サンドイッチと呼ばれる構造を有しており、デカルバミラーゼの立体構造との類似性が認められる。し力 ^し、これらドメイン構造とデカルバミラ一ゼの立体構造とでは、 αヘリックスおよび3ストランドの幾何学的な並び、いわゆるタンパク質立体構造トポロジー（T. P. F 1 o r e sら、（1994) 、 P r o t. Eng. 7、 31 -37) が異なっている。すなわち、デカルバミラ一ゼの立体構造は、 βシー卜構造内において平行 )3ストランドを有することを特徴とするものであり（図 1) 、 4層サンドイッチ構造を有するタンパク質としても、デカルバミラーゼは新規の立体構造である。このように、「トポロジー」とは、本明細書中において、タンパク質の二次構造単位の並びまたは空間配置のことをいう。本明細書において、「ひへリックス」とは、タンパク質またはポリペプチドの二次構造の一つであり、アミノ酸が 3. 6残基ごとに 1回転したピッチが 5. 4 Αの螺旋構造を有するエネルギー的に最も安定な構造の 1つをいう。ひへリックスを形成しやすいアミノ酸としては、グルタミン酸、リジン、ァラニン、およびロイシンなどが挙げられる。逆に、ひへリックスを形成しにくいアミノ酸としては、パリン、イソロイシン、プロリン、およびグリシンなどが挙げられる。また、本明細書において、「3シート」とは、タンパク質またはポリペプチドの二次構造の一つであり、ジグザグに伸びたコンホメ一ションを有する二本以上のポリべプチド鎖が平行に並び、ペプチドのアミド基およびカルボニル基が、それぞれ隣接するペプチド鎖のカルポニル基およびアミド基との間に水素結合を形成することによりエネルギー的に安定なシー卜状により合わさった構造をいう。なお、「平行) 3シート」とは、 i3シートのうち、隣接するポリペプチド鎖のアミノ酸配列の並び方が同じ方向のものをいい、「逆平行) 3シート」とは、 βシートのうち、隣接するポリペプチド鎖のアミノ酸の並び方が逆方向のものをいう。さらに、本明細書において、「/3ストランド」とは、 3シートを形成するジグザグに伸びたコンフオメーシヨンを有する 1本のペプチド鎖をいう。

デカルバミラーゼのカルボキシ末端約 3 0残基の領域（配列番号 1または 2のアミノ酸 2 8 0位付近〜カルボキシ末端 3 0 3位）は、分子間相互作用により二量体形成に関与していることが明らかとなった。また、本研究に供したデカルバミラーゼ結晶中では、二量体がさらに分子間相互作用により四量体を形成していることが明らかとなった。デカルバミラーゼの 4層サンドイッチ構造は、 4本のひヘリックスおよび 1 2本の |3ストランドの 2次構造単位よりなる。表 1においては、すべての 2次構造単位を示した。

【表 ¹】デカルバミラーゼの 2次構造単位

αヘリックス 3ストランド

Arg20 -Arg36 Gln3 -GlnlO

Glu61 -Asp65 Phe41 -Val43

Arg78 -Leu87 Gly90 -Vail 99

Glul45-Tyrl48 Argl06-Valll4

Prol77-Leul85 Ilel20-Argl25

Thr211-Asn226 Vall58-Vall61

Arg279-Arg282 Alal64-Metl68

Ilel90-Tyrl95

Trp229-Gly234

Gly237-Glu239

Cys242-Leu244

Cys249-Val251

Ile257-Leu260

Glu267-Asp274 以下、本発明のデカルバミラ一ゼの立体構造の特徴についてまとめた。

( 1 ) 6本の i3ストランドからなる ;3シートが 2層に積層し、その両側に各 2本の αヘリックスが密着した 4層サンドィツチと呼ばれる構造を有する（図 1および図 2) 。図 1において、ァミノ末端から数えて 1、 3、 5、および 6番目の α ヘリックス 4本（それぞれ、 a l、 3, ひ 5、およびひ 6と称する）が密着している。

(2) 3シートは、 6本の平行) 3ストランドから主として形成され、立体構造既知のタンパク質には見られない配向を有する（図 1) 。

(3) 酵素反応を触媒するアミノ酸残基としてシスティン 1残基、グルタミン酸 2残基、リジン 1残基、ヒスチジン 1残基およびアルギニン 2残基を含む、立体構造既知の酵素にない基質結合様式を有する（図 3) 活性部位を形成している

(図 4) 。

(4) カルボキシ末端約 30残基の領域が、分子間相互作用により二量体構造を形成している。

なお、上記立体構造の具体的な座標データは、プロテインデータバンク（PD B、 P r o t e i n Da t a B an k、 Th e Re s e a r c h Co l l a bo r a t o r y Fo r S t r u c t u a l B i o i n f o rma t i c s (RCSB) が運営）に Comp ou n d : N-C a r b amy 1 -D — Am i n o Ac i d Am i d o hyd r o l a s e 、 Ex . M e t h o d : X- r a y D i f f r a c t i onとして登録されており（登録番号： 1 ERZ) 、本明細書中でこのデータを援用する。

本発明のデカルバミラーゼの立体構造決定が完成することによって、酵素の触媒活性に関与する残基を推定し得、さらに酵素単独の立体構造だけでなく、酵素に基質（例えば、 D— N—力ルバモイル―ヒドロキシフエニルダリシン）を結合させた複合体の立体構造モデルを分子モデリングの手法（Sw i s s— PDBV i ewe r 刖出) 、 Au t o d o c k (Ox f o r d Mo l e c u l a r) 、 Gu e x、 N. および P e i t s c h, M. C. ( 1 997) SWI S S - MODEL and t h e Sw i s s -PDBV i ewe r ： An e nv i r onme n t f o r c omp a r a t i v e p r o t e i n m od e l i n g、 E l e c t r o p h o r e s i s 1 8、 27 14 -272

3 ； M o r r i s , G. Mら、 J. Compu t a t i on a l C h em i s t r y、 1 9 : 1639— 1662、 1998 ; Mo r r i s, G. M. ら、 J. Compu t a e r-A i d e d Mo l e c u l a r De s i gn、 10、 294— 304、 1996 ; Good s e l 1、 D. S. ら、 J. Mo 1. Re c ogn i t i on、 9 : 1一 5、 1996) により容易に構築し得る。本立体構造および立体構造モデルから、活性部位に存在し、触媒反応群のアミノ酸残基に関する構造および活性部位における反応機構に関する知見を入手し得る。デカルバミラーゼの活性部位は、 G l u46、 Ly s l 26、 H i s l 43、 G 1 u 145、 Cy s l 71、 Ar g l 74および A r g 175のアミノ酸残基を含む腔（窪み）から形成されている（図 4) 。アミダーゼ、二トリラーゼなど、デカルバミラーゼと弱い配列類似性を有する酵素とのアミノ酸配列比較により見出される保存されたアミノ酸残基の解析から、 G l u46、 Ly s l 26、 G 1 u 1

45、 Cy s 171が触媒反応に強く関与していることが示唆される。特に Cy s 171は、酵素反応の中間体であるァシル中間体を形成するのに必須な触媒残基と推定され（図 3) 、デカルバミラ一ゼがシスティンヒドラーゼであることを示している。本知見は、 Cy s l 71の S e r l 71への変異で触媒活性が失われる実験事実にも一致している（R. G r i f a n t i n iら、（ 1996) 、 J. B i o l . Ch em. 271, 9326— 9331) 。 Ar g l 74および Ar g l 75の役割は、基質である D— N— α—力ルバミルアミノ酸のカルボキシル基を静電相互作用によって、安定化することに寄与していると考えられる。これら立体構造より得られた知見に基づいて、デカルバミラーゼの安定性向上または酵素活性の向上を目的とした改変設計を行い得る。本明細書において、酵素の「安定性」とは、通常の生体環境よりも高い温度（例えば 70°C) で酵素を変性させた後でも、酵素活性が熱変性前と比較して、少なくとも 10%、好ましくは少なくとも 25%、より好ましくは少なくとも 50%、さらに好ましくは少なくとも 80%、最も好ましくは少なくとも 90%残存していることをいう。安定性の向上は、例えば、 ΔΤιη (変性温度の差分）で測定し得る。本明細書において「酵素活性」とは、デカルバミラーゼについて言及する場合、 D— Ν—力ルバモイルー α—アミノ酸を対応する D—α—アミノ酸に変換する活性をいう。本明細書において、変異体分子の「設計方法」または「分子設計手法」とは、変異前のタンパク質またはポリペプチド分子（例えば、天然型分子）のアミノ酸配列および立体構造を解析することによって、各アミノ酸がどのような特性（例えば、触媒活性、他の分子との相互作用など）を担うかを予測し、所望の特性の改変（例えば、触媒活性の向上、タンパク質の安定性の向上など）をもたらすために適切なアミノ酸変異を算出することをいう。この設計方法は、好ましくはコンピューターを用いて行われる。このような設計方法で用いられるコンピュータ一プログラムの例としては、本明細書において言及されるように、以下が挙げられる：構造を解析するプログラムとして、 X線回折データの処理プログラムである DENZO (マックサイエンス）；位相を決定するための処理プログラムとして、 PHASES (Un i v. o f P e nn s y l v a n i a、 PA、 US A) ；初期位相の改良のためのプログラムとして、プログラム DM (CCP4パッケージ、 SERC) ； 3次元グラフィックスを得るためのプログラムとしてプ口クラム O (U p s a l a Un i v e r s i t e t：、 U p p s a 1 a、スゥエーデン）；立体構造精密化プログラムとして、 XPLOR (Ya l e Un i v e r s i t y、 CT、 USA) ；そして、変異導入モデリングのためのプログラムとして、 Swi s s— PDBV i ewe r (前出）。

本明細書中において、変異体の設計に利用されるアミノ酸変異としては、アミノ酸の置換のほかに、アミノ酸の付加、欠失、または修飾もまた挙げられる。ァミノ酸の置換とは、もとのペプチドを 1つ以上、例えば、 1〜20個、好ましくは 1〜10個、より好ましくは 1〜5個のアミノ酸で置換することをいう。アミノ酸の付加とは、もとのペプチド鎖に 1つ以上、例えば、 1〜20個、好ましくは 1〜1 0個、より好ましくは 1〜5個のアミノ酸を付加することをいう。アミノ酸の欠失とは、もとのペプチドから 1つ以上、例えば、 1〜2 0個、好ましくは 1〜1 0個、より好ましくは 1〜5個のアミノ酸を欠失させることをいう。ァミノ酸修飾は、アミド化、カルボキシル化、硫酸化、ハロゲン化、アルキル化、グリコシル化、リン酸化、水酸化、ァシル化（例えば、ァセチル化）などを含むが、これらに限定されない。置換、または付加されるアミノ酸は、天然のァミノ酸であってもよく、非天然のアミノ酸、またはアミノ酸アナログでもよい。天然のアミノ酸が好ましい。

用語「天然のアミノ酸」とは、天然のアミノ酸の L -異性体を意味する。天然のアミノ酸は、グリシン、ァラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、メチォニン、トレォニン、フエ二ルァラニン、チロシン、トリブトファン、システィン、プロリン、ヒスチジン、ァスパラギン酸、ァスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、ァ -カルボキシグルタミン酸、アルギニン、オル二チン、およびリジンである。特に示されない限り、本明細書でいう全てのアミノ酸は L体である。用語「非天然アミノ酸」とは、タンパク質中で通常は天然に見出されないアミノ酸を意味する。非天然アミノ酸の例として、ノルロイシン、パラーニトロフエ二ルァラニン、ホモフエ二ルァラニン、パラ—フルオロフェニルァラニン、 3— アミノー 2—べンジルプロピオン酸、ホモアルギニンの D体または L体および D —フエ二ルァラニンが挙げられる。

「アミノ酸アナログ」とは、アミノ酸ではないが、アミノ酸の物性および Zまたは機能に類似する分子をいう。アミノ酸アナログとしては、例えば、ェチォ二ン、力ナパニン、 2—メチルグルタミンなどが挙げられる。

本発明のさらなる実施態様において、デカルバミラ一ゼの変異体はまた、アンモニゥム塩（アルキルまたはァリ一ルアンモニゥム塩を含む）、硫酸塩、硫酸水素塩、リン酸塩、リン酸水素塩、リン酸二水素塩、テオ硫酸塩、炭酸塩、重炭酸塩、安息香酸塩、スルホン酸塩、チォスルホン酸塩、メシレート（メテルスルホン酸）塩、エヂルスルホン酸塩、およびベンゼンスルホン酸塩のようなペプチドの塩の形態を取り得る。

以下、変異体を生成するためのタンパク質のアミノ酸の変異について議論する。アミノ酸の置換などを実施する方法は、化学合成、または遺伝子工学を利用する技術においてアミノ酸をコードする DNA配列のコドンを変化させることを含むが、これらに限定されない。

あるアミノ酸は、相互作用結合能力の明らかな低下または消失なしに、例えば、カチオン性領域または基質分子の結合部位のようなタンパク質構造において他のアミノ酸に置換され得る。あるタンパク質の生物学的機能を規定するのは、タンパク質の相互作用能力および性質である。従って、特定のアミノ酸の置換がアミノ酸配列において、またはその DN Aコード配列のレベルにおいて行われ得、置換後もなお、もとの性質を維持するタンパク質が生じ得る。従って、生物学的有用性の明らかな損失なしに、種々の改変が、開示されたペプチドまたはこのぺプチドをコードする対応する DN Aにおいて行われ得る。

上記のような改変を設計する際に、アミノ酸の疎水性指数が考慮され得る。夕ンパク質における相互作用的な生物学的機能を与える際の疎水性アミノ酸指数の重要性は、一般に当該分野で認められている（Ky t e. Jおよび Do o 1 i t t i e, R. F. J. Mo 1. B i o l . 157 (1) : 105— 132, 1 982) 。アミノ酸の疎水的性質は、生成したタンパク質の二次構造に寄与し、次いでそのタンパク質と他の分子（例えば、酵素、基質、レセプター、 DNA、抗体、抗原など）との相互作用を規定する。各アミノ酸は、それらの疎水性および電荷の性質に基づく疎水性指数を割り当てられる。それらは：イソロイシン (+4. 5) ；バリン（+4. 2) ；ロイシン（+3. 8) ；フエ二ルァラニン (+2. 8) ；システィン Zシスチン（+2. 5) ；メチォニン（+ 1. 9) ；ァラニン（+ 1. 8) ；グリシン（一 0. 4) ；スレオニン（一0. 7) ；セリン（—0. 8) ；トリブトファン（—0. 9) ；チロシン（— 1. 3) ；プロリン（一 1. 6) ；ヒスチジン（—3. 2) ：グルタミン酸（—3. 5) ；グル夕ミン（—3. 5) ；ァスパラギン酸（一3. 5) ；ァスパラギン（一 3. 5) ；リジン（—3. 9) ；およびアルギニン（—4. 5) ) である。

あるアミノ酸を、同様の疎水性指数を有する他のアミノ酸により置換して、そして依然として同様の生物学的機能を有するタンパク質（例えば、酵素活性おいて等価なタンパク質）を生じさせ得ることが当該分野で周知である。このようなアミノ酸置換において、疎水性指数が ±2以内であることが好ましく、 ± 1以内であることがより好ましく、および ±0. 5以内であることがさらにより好ましい。疎水性に基づくこのようなアミノ酸の置換は効率的であることことが当該分野において理解される。米国特許第 4、 554、 101号に記載されるように、以下の親水性指数がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（+ 3. 0) ；リジン（+ 3. 0) ；ァスパラギン酸（+ 3. 0 ± 1) ；グルタミン酸 (+3. 0± 1) ；セリン（+0. 3) ；ァスパラギン（+0. 2) ；グルタミン（+0. 2) ：グリシン（0) ；スレオニン（一0. 4) ；プロリン（一0. 5± 1) ；ァラニン（一0. 5) ：ヒスチジン（一 0. 5) ；システィン（一 1. 0) ；メチォニン（一 1. 3) ；バリン（一 1. 5) ；ロイシン（一 1. 8) ；イソロイシン（一 1. 8) ；チロシン（—2. 3) ；フエ二ルァラニン（一 2. 5) ；およびトリブトファン（—3. 4) 。アミノ酸が同様の親水性指数を有しかつ依然として生物学的等価体を与え得る別のものに置換され得ることが理解される。このようなアミノ酸置換において、親水性指数が ±2以内であることが好ましく、 ± 1以内であることがより好ましく、および ±0. 5以内であることがさらにより好ましい。

本発明において、「保存的置換」とは、アミノ酸置換において、元のアミノ酸と置換されるアミノ酸との親水性指数またはおよび疎水性指数が上記のように類似している置換をいう。保存的置換の例は、当業者に周知であり、例えば、次の各グループ内での置換：アルギニンおよびリジン；グルタミン酸およびァスパラギン酸；セリンおよびスレオニン；グルタミンおよびァスパラギン；ならびにノリン、ロイシン、およびイソロイシン、などが挙げられるがこれらに限定されない。

酵素の比活性向上および反応の至適 PHの最適化を目指した分子設計においては、立体構造から得られた触媒反応機構に関する情報は極めて有用である。本発明においては、デカルバミラーゼの Cy s 171の側鎖スルフィド（SH) 基の pKaを変化させることによって、比活性および至適 p Hの変化を伴うアミノ酸変異を設計し得る。具体的には、タンパク質の静電ポテンシャル計算（高橋ら、 (1992) 、 B i opo l yme r s 32, 897— 909) により、 SH 基の pK aに対するアミノ酸変異の効果を見積もることができ、適切なアミノ酸変異を設計し得る。例えば、 Cy s 171の硫黄原子近傍の静電場をより正の電場にし、 Cy s 171のチオール基 (SH) の解離を促進させ、かつ G 1 u46 および Zまたは G 1 u 145の側鎖カルボキシ基近傍の静電場にはあまり影響しない変異が望ましい。

本発明のデカルバミラ一ゼの立体構造から、デカルバミラーゼ中に存在する 5 つのシスティン残基は、触媒活性および空気酸化に対する耐性等の機能、物性に関与していることが推定される。デカルバミラ一ゼのシスティン残基の役割については、上記菌株（ Ag r o b a c t e r i um s p. KNK712 (カネカ菌））由来のデカルバミラーゼと比較して、高い配列相同性を有する、異なる菌株（Ag r o b a c t e r i um r ad i ob a c t e r NRRL B 1 1291) 由来のデカルバミラーゼについて、アミノ酸変異ならびに変性剤および Cy s修飾試薬の組合せによる研究がなされている（R. G r i f a n t i n iら、（1996) 、 J. B i o l . Ch em. 271, 9326 - 9331) 。この研究では、 5残基のシスティンはいずれもジスルフィド結合の形成には関与しないこと、 Cy s 171に対応する A. r ad i o b a c t e r NRRL B 1 1291由来のデカルバミラ一ゼの Cy s 1 72の S e rへの置換で触媒活性が失われるが、それ以外のシスティンの変異では触媒活性に影響がないことから、 Cy s 171が触媒活性に必須であることが推定されている。これは、他の類縁酵素においても、対応するシスティン残基が保存されていることからも強く示唆される。本明細書中において、「対応する」アミノ酸とは、あるタンパク質分子またはポリペプチド分子において、比較の基準となるタンパク質またはポリぺプチドにおける所定のアミノ酸と同様の作用を有するか、または有することが予測されるアミノ酸をいい、特に酵素分子にあっては、活性部位中の同様の位置に存在し触媒活性に同様の寄与をするアミノ酸をいう。

配列番号 1および 2のアミノ酸配列を有するデカルバミラーゼでは、また、 C y s 192および C y s 249は化学修飾を受け難く、分子内に埋もれていることが、そして Cy s 242および Cy s 278は容易に化学修飾を受け、分子表面のループ構造部分に位置していることが推定されている。配列番号 1の Cy s 242および Cy s 278に対応する、 A. r ad i o b a c t e r NR RL B 1 1291の 2残基（それぞれ、 Cy s 243および C y s 279) のシスティンをァラニンに置換することで安定性を向上した変異体が取得されている（特開平 8— 84584号公報）。上記のように、 Cy s 242および Cy s 278については、立体構造から分子表面に存在することが確認され、これら C y s残基がデカルパミラーゼの空気酸化に対する耐性に関与していることが示唆される。分子内に埋もれた Cy s 192および Cy s 249については、空気酸化に対する耐性向上への寄与は大きくないと推定されるが、側鎖体積あるいは分子内空孔を補完するように、より嵩高い疎水性アミノ酸残基に置換した変異体を作製することにより、熱または有機溶剤に対する安定性の向上したデカルノミラーゼが創製され得る。

デカルバミラーゼの空気酸化による酵素活性の低下および保存安定性には、システィン残基だけでなくメチォニン残基の関与も考えられ得る。本発明のデカルバミラ一ゼの立体構造から、デカルバミラーゼ中にある 9つのメチォニン残基のうち、完全に分子内部に埋もれたものが 5残基存在する一方で、完全に分子外部に露出したものが 2残基（M e t 2 3 8および M e t 2 4 3 ) 夕一ン構造部分に存在し、この 2残基はデカルバミラ一ゼの空気酸化に対する耐性に大きく関わつていることが推定される。本明細書において「ターン」構造または「/3ターン」構造とは、タンパク質の立体構造において、二次構造の間で、ペプチド主鎖の進み方向を大きく変化させる 3つ以上のァミノ酸残基からなる局所構造をいう。また、 M e t 4および M e t 7 2は、分子表面近傍に存在し、ほとんど分子内部に埋もれているが溶媒分子等ものの容易に接触し得る部位にあるため、これらもデ力ルバミラ一ゼの空気酸化に対する耐性に関与している可能性がある。これら構造的知見から、デカルバミラーゼの空気酸化に対する耐性向上が期待される別のアミノ酸置換を設計し得る。すなわち、 M e t 4および M e t 7 2を、側鎖体積あるいは分子内空孔を補完し、かつ空気酸化を受けない疎水性アミノ酸残基に置換した変異体を作製することにより耐性向上を達成し得る。 M e t 2 3 8および M e t 2 4 3は、完全に分子外部に露出していることから、好ましくはこれら残基を空気酸化を受けない中性あるいは親水性アミノ酸に置換することにより耐性の向上を達成し得る。さらに、デカルバミラーゼのアミノ酸 M e t 2 3 8から M e t 2 4 3までの領域により構成されるターン構造部分には、空気酸化に弱い C y s 2 4 2も含まれることから、これら 3残基を適切なアミノ酸に置換した 3重変異体を作製、あるいは 3残基を含むターン構造を欠失した変異体を作製することによって、空気酸化に対する耐性を向上し得る。また、これら残基を含む夕一ン構造の配列を他の夕ンパク質の )3ターン構造と入れ替えることによっても、空気酸化に対する耐性を向上し得る。システィンおよびメチォニンの変異体設計においては、これら残基を他のアミノ酸にコンピュータ一上で変異させ、変異体の安定性について構造エネルギーを解析することにより、最適なアミノ酸を選択し得る。

システィン残基およびメテオニン残基以外にも、タンパク質分子内の空孔（例えば、デカルバミラ一ゼのアミノ酸 A s n 9 2の近傍に形成される空孔）を補填するアミノ酸変異、エネルギー的に不利なコンフオメーションを有するアミノ酸 (例えば、デカルバミラーゼのアミノ酸 P r o 2 0 3および V a 1 2 3 6 ) の変異、および αヘリックス構造の安定化など、一般的に知られているタンパク質の安定化要因に着目した設計も行い得る。

前記アミノ酸変異による改変設計と異なる設計戦略として、デカルパミラーゼの酵素活性に関与しないと推定される領域を欠失させ、デカルバミラーゼをより低分子量の酵素へと改変することにより安定性を向上させ得る。例えば、活性部位から離れた位置にあるループ状構造領域の一部または全部を欠失させることにより、より緻密なデカルバミラ一ゼへと改変し得る。また、デカルバミラーゼのカルボキシ末端から約 3 0残基の領域は、二量体形成に関与していることが本発明者らにより推定された。デカルバミラ一ゼは、一般的な緩衝液中において触媒能を示す場合は、二量体あるいは四量体として存在すると推定される。他方、夕ンパク質の変性状態からの巻き戻り過程からは、単量体夕ンパク質の方が有利であると推定される。カルボキシ末端約 3 0残基の領域の一部または全部を欠失することにより、二量体形成を阻害し、安定な単量体を調製し得る。工業的には、デカルバミラーゼは担体に固定化したいわゆる固定化酵素として利用されるが、この場合も単量体の方が、より効率的な固定化を達成し得る。

本発明におけるデカルバミラ一ゼ変異体は、上記の方法以外にも、多くの方法により設計または調製され得る。例えば、デカルバミラーゼ活性を有する酵素の配列は、本発明を用いて変異に望ましいと同定された部位において、オリゴヌクレオチド特異的変異誘発または他の従来の技術（例えば、欠失）手段により変異され得る。あるいは、デカルバミラ一ゼの変異体は、特定のアミノ酸の、天然に存在しないアミノ酸での部位特異的置換により作製され得る。例えば、デカルバミラーゼ変異体は、特定のシスティンまたはメチォニン残基の、セレノシスティンまたはセレノメチォニンとの置換により作製され得る。これは、天然システィンまたはメチォニンのいずれか（あるいは両方）を涸渴させ、かつセレノシステインまたはセレノメチォニン（あるいは両方）を富化した増殖培地上で、野生型ポリぺプチドまたは変異体ポリぺプチドのいずれかを発現し得る宿主生物を増殖させることにより達成され得る。相同組換え法を用いる場合、合成オリゴヌクレォチドを用いて、デカルバミラ一ゼをコードする D N A配列中に変異が導入され得る。これらのオリゴヌクレオチドは所望の変異部位に隣接するヌクレオチド配列を含む。変異は、デカルバミラ一ゼの完全長 D N A配列、あるいはそのフラグメントポリペプチドをコードする任意の配列中に作製され得る。

本発明に従って、上記方法または当該分野で公知の代替方法により産生される変異デカルバミラーゼ D N A配列は、発現ベクターを用いて発現され得る。当該分野で周知であるように、発現べクタ一は、典型的には宿主ゲノムから独立した宿主細胞中での自己複製を可能にするエレメント、および選択目的のための 1 つ以上の表現型マーカ一を含む。所望のデカルパミラーゼ変異体コード配列を囲む D N A配列の挿入の前または後に、発現ベクターはまた、プロモーター、オペレーター、リボソーム結合部位、翻訳開始シグナル、および必要に応じてリプレッサ一遺伝子または種々のァクチべ一夕一遺伝子ならびに終止シグナルをコードする制御配列を含む。いくつかの実施態様において、産生された変異体の分泌が所望される場合、「シグナル配列」をコードするヌクレオチドがデカルバミラ一ゼ変異体コード配列の前に挿入され得る。制御配列の制御下での発現のためには、所望の D NA配列は、制御配列に作動可能に連結されなければならない。すなわち、制御配列の制御下にあるデカルバミラーゼ変異体をコードする配列は、この配列の発現産物の産生を可能にするために、適切なリーディングフレームを維持するように開始シグナル（すなわち A T G) を有さなければならない。

広範な周知の利用可能な発現ベクターは、いずれも本発明の変異されたデカルバミラーゼコード配列を発現するのに有用である。これらは、公知の細菌プラスミド（例えば、 P B R 3 2 2 ) 、より広い宿主域のプラスミド（例えば、 R P 4、ファージ DNA) 、 2 プラスミドまたはそれらの誘導体のような酵母プラスミドならびにプラスミドおよびファージ DN Aの組合わせから得られるベクタ —のような、染色体 DN A配列、非染色体 DN A配列および合成 DN A配列のセグメントからなるベクタ一を包含する。

さらに、 DNA配列に作動可能に連結した場合、その発現を制御する、任意の広範な発現制御配列が、本発明による変異された DN A配列を発現するためにこれらのベクター中で使用される。このような有用な発現制御配列としては、例えば、ウィルスの遺伝子発現を制御することが公知である他の配列およびこれらの組み合わせが挙げられる。

広範な種の宿主がまた、本発明によるデカルバミラーゼ変異体の産生に有用である。これらの宿主として、例えば、 E. c o l i、 Ba c i l l u sおよび S t r e p t omy c e sのような細菌、酵母のような真菌、 CHO細胞のような動物細胞、植物細胞およびトランスジエニック宿主細胞が挙げられる。

すべての発現ベクターおよび発現系が、本発明の変異 DNA配列を発現し、そしてデカルバミラ一ゼ変異体を産生するのに、同じ様式で機能するとは限らないことが理解されるべきである。全ての宿主が同一の発現系を用いて等しく良好に機能するわけではない。しかし、当業者は、過度な実験を行うことなくそして本発明の範囲を逸脱することなく、適切なベクタ一、発現制御配列および宿主を選択し得る。

例えば、選択の際は、そのベクターの複製能力が考慮されねばならない。発現制御配列の選択の際、種々の要因がまた考慮されるべきである。これらは、例えば、系の相対的強度、その制御能力、本発明のデカルバミラーゼ変異体をコードする DN A配列との適合性、特に潜在的二次構造に関する適合性がまた考慮されるべきである。宿主は、選択されたベクターとの適合性、宿主に対するデカルバミラーゼ変異体の毒性、成熟産物を分泌する能力、タンパク質を適切に折り畳む能力および適切な高次構造を形成する能力、発酵要求性、宿主からのデカルバミラ一ゼ変異体の精製の容易さおよび安全性の考察により選択されるべきである。これらのパラメ一夕一内で、当業者は有用な量の変異デカルバミラ一ゼを産生し得る、種々のベクター発現制御系ノ宿主の組合わせを選択し得る。

これらの系または他の系で産生されるデカルバミラ一ゼ変異体は、デカルバミラーゼ活性を有する天然の酵素を精製するために使用される工程を含む種々の従来の工程により、精製され得る。

一旦、デカルバミラーゼへの変異が所望の位置（例えば、活性部位、安定性に関する部位、または結合部位など）で作製されると、得られた変異体は、目的のいくつかの特性のいずれかについて試験され得る。

例えば、変異体は、生理学的 p Hにおける荷電の変化についてスクリーニングされ得る。これは変異前のデカルバミラ一ゼの等電点（p i ) と比較したデカルバミラーゼ変異体の等電点を測定することにより決定される。等電点は、 W e 1 l n e r , D . , A n a 1 y t . C h e m. 、 4 3、 5 9 7頁（1 9 7 1 ) の方法によるゲル電気泳動により測定される。表面荷電が変化した変異体は、本発明の構造情報により提供されるように、酵素の表面に位置する置換アミノ酸によって変化した P Iを有するデカルバミラ一ゼタンパク質である。

さらに、変異体は、変異前のデカルバミラーゼと比較して高い比活性についてスクリーニングされ得る。変異体の活性は、例えば、本明細書中に記載のアツセィ（下記の実施例 7を参照のこと）を用いて、 D— N—力ルバモイルー α—ァミノ酸の D— α—ァミノ酸類への変換能力を測定することにより決定される。本発明のデカルバミラーゼ変異体を利用して製造された D— α—アミノ酸類は、医薬中間体（例えば、 D—フエニルダリシンおよび D—パラヒドロキシフエニルグリシン）として、医薬（例えば、合成ペニシリンおよび合成セファロスポリン）の製造に利用し得る。このように製造した医薬を含有する薬学的組成物もまた、本発明に従って提供され得る。薬学的組成物は、賦形剤、安定剤、キャリアなどを含む薬学的に受容可能な任意の補助成分を含有し得る。本発明のデカルバミラ一ゼ変異体を利用して製造された D— α—アミノ酸類を農薬中間体（例えば、 D—パリン）として、農薬（例えば、フルバリネート）の製造に利用し得る。このように製造した農薬を含有する農薬組成物もまた本発明に従って提供され得る。本明細書中において、農学組成物は、賦形剤、安定剤、キャリアなどの農学的に受容可能な任意の補助成分を含有し得る。

本発明のデカルバミラ一ゼ変異体を利用して製造された D— α—アミノ酸類を食品添加物の中間体（例えば、 D—ァラニンおよび D—ァスパラギン酸）として、食品添加物（例えば、ァリテーム）の製造に利用し得る。

本発明のさらに他の実施態様において、デカルバミラーゼ変異体またはそれに類似する酵素のインヒビ夕一が設計され、そして製造され得る。インヒビターは、デカルバミラーゼの構造情報を利用して設計され得る。当業者は、例えば、 S e ge l , I. H. 、 En z yme K i ne t i c s, J. Wi l e y & S on s、 ( 1975) による標準式を用いるコンピューター適合酵素反応速度論データにより、インヒビ夕一が競合的、不競合的、または非競合的であることを同定し得る。さらに、デカルバミラーゼまたはその類似酵素の反応中間体（例えば、基質または反応生成物との複合体の立体構造）の情報を用いて、インヒビ夕 —を設計することが可能である。このような情報は、公知のデカルバミラ一ゼまたはその類似酵素ィンヒビターとして公知の化合物の改良アナ口グの設計、および新規クラスのインヒビターの設計に有用である。

本発明のさらに別の実施態様において、本発明のデカルバミラーゼの立体構造を利用して、デカルバミラーゼのアミノ酸配列に類似するポリペプチド酵素またはタンパク質酵素（例えば、アミダーゼまたは二トリラーゼ）を改変し得る。改変は、上記の変異体の設計と同様の指針に従って行われ得る。ここで、「類似する」ポリペプチド酵素またはタンパク質酵素は、好ましくは、そのアミノ酸配列が、配列番号 1または 2に示されるデカルバミラ一ゼのアミノ酸配列と、全長ァミノ酸配列について、代表的には少なくとも 30%、好ましくは、少なくとも 5 0%、より好ましくは、少なくとも 80%同一であり、特にデカルバミラーゼの活性部位を規定する領域（配列番号 1または 2のアミノ酸 G 1 u46、 Ly s l 26、 G 1 u 145、および Cy s 171を含む、アミノ酸番号 38〜49, 1 08〜： 127， 143〜 148および 164〜： I 77の範囲）内のアミノ酸について、代表的には、少なくとも 60%、好ましくは少なくとも 80%、より好ましくは 90%、さらに好ましくは 95%同一である。

ある酵素についての特性を、類似する酵素の立体構造を用いて変換した例には、ェクスパンダ一ゼ（Exp and a s e) と称する酵素の基質特異性変換に類似構造を有するイソべニシリン合成酵素の立体構造を利用した研究がある。国際公開 W097Z02005号パンフレットを参照のこと。この文献においては、立体構造がすでに決定されたイソペニシリン合成酵素（Ro a c h ( 1995) 、 Na t u r e、 375、 700〜 704頁）と一次構造（アミノ酸配列）に類似性があり、その立体構造が類似することが示唆されていたェクスパンダーゼの基質認識に関与するアミノ酸残基を両方の酵素の配列比較によって同定し、それらのアミノ酸残基の変異によってェクスパンダーゼの基質特異性を変換してぺニシリン Gに作用する変異酵素を作製することに成功している。

アミノ酸配列の同一性の比較は、例えば、以下の配列分析用ツールを用いて算出し得る： FASTA (W. R. Pe a r s onおよび D. J. L i pman、 PNAS 85、 2444-2448 (1 988) ) ； BLAST (S. F. A 1 t s c h u T. L. Mad d e n, A. A. S c h a f f e r, J, — H. 、 Zh ang、 Z. Zh ang、 W. M i 1 l e r、および D. J . L i pma n ( 1997) Nu c 1. Ac i d s. Re s. 25 ： 3389-3402 (1 9 97) ) ; Un i xベースの GCG W i s c o n s i n P a c k a g e (P r og r am Manu a 1 f o r t h e Wi s c on s i n P a c k age、 Ve r s i o n 8, 1994年 9月、 Ge n e t i c s Compu t e r G r ou p、 575 S c i e n c e D r i v e Ma d i s o n> Wi s c on s i n、 USA5371 1 ； R i c e、 P. ( 1996) P r og r am Ma n u a 1 f o r EGCG P a c k a g e、 P e t e r R i c e, Th e S a n g e r Ce n t r e、 H i n x t o n Ha l 1、 Camb r i d ge、 C B 10 1 RQ、 Eng l and) および t h e ExPAS y Wo r 1 d W i d e We b分子生物学用サーバー（Ge n e va Un i v e r s i t y Ho s p i t a 1 and Un i v e r s i t y o f Ge n e v a、 Ge nev a、 Sw i t z e r 1 and) および M a c V e c t o r 6. 0 (帝人システムテクノロジー）。

本発明に従って、上記方法を利用して得られた、デカルバミラーゼのアミノ酸配列に類似するポリペプチド酵素またはタンパク質酵素の変異体が提供され得る。これらの酵素の変異体は、その野生型酵素に代えて、例えばバイオリアクターなどで、使用され得る。

別の局面では、本発明は、コンピュータを用いてデカルバミラーゼ変異体を設計するシステムを提供する。このシステムは、デカルバミラ一ゼ活性を有する酵素の結晶の立体構造を、 X線結晶構造解析により決定する手段、ならびに決定した立体構造に基づいて物性および/または機能の向上したデカルバミラーゼ変異体を設計する手段を包含する。本発明に従うコンピュータシステムは、当該分野で公知のコンピュータシステムを用いて構築し得、例えば、本明細書において記載したような当該分野で公知のシステムが挙げられる。

本発明に従って、デカルバミラーゼなどの上記分子の立体構造の 3次元座標デ一夕および Zまたは分子設計手法および Zまたは改変方法のプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体もまた提供され得る。コンピュータ読み取り可能な記録媒体としては、例えば、磁気テープ、磁気ディスク（例えば、フロッピーディスクなど）、光磁気ディスク（例えば、 MOなど）、光ディスク媒体（例えば、 CD— R〇M、 CD-R, CD-RW, DVD— ROMなど）などが挙げられる。 1つの実施態様において、このようなコンピュータ読み取り可能な記録媒体は、デカルパミラ一ゼ変異体の設計処理を実行させるためのプロダラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体であり得る。ここで、この設計処理は、デカルバミラーゼ活性を有する酵素の結晶の X線結晶構造解析により決定された該結晶のデータを入力する工程、ならびに決定した立体構造に基づいて物性および Zまたは機能の向上したデカルバミラーゼ変異体を設計する工程を包含し得る。別の実施態様において、本発明は、デカルバミラ一ゼ変異体の立体構造を記述するデータを記録する記録媒体を提供する。ここで、この変異体の立体構造は、デカルバミラ一ゼ活性を有する酵素の結晶の X線結晶構造解析により決定された該結晶のデータを入力する工程、ならびに決定した立体構造に基づいて物性および Zまたは機能の向上したデカルバミラーゼ変異体を設計する工程、を包含する処理によって入手され得る。

以下の実施例にて、本発明をさらに詳細に説明するが、これらは本発明の例示の目的で提供されるものであり、なんら本発明を限定するものではない。実施例

以下の実施例で使用した試薬類は、言及した場合を除き、ナカライテスク、和光純薬、または S I GMA (S t Lou i s, M〇、 USA) から入手した。

(実施例 1) デカルバミラ一ゼのネイティブ結晶の調製

公知の方法（H. Nan b aら、 B i o s c i. B i o t e c hno l . B i o c h em. 62、 875 - 88 1 ( 1 998) を参照のこと）により得られたデカルバミラーゼを 1 0〜2 Omg/m 1の濃度に調製したデカルバミラ一ゼ溶液（0. 00 1M HE PES緩衝液、 pH7. 5) および沈澱剤として 1 5〜20重量％ポリエチレングリコール 6000 (ナカライテスク社製）、 0. 2 M塩化リチウムを含む 0. 1M HE PES緩衝液、 pH7. 5 (シグマ社製） 10 1を液滴台上で混合し、前記沈澱剤組成をもつ溶液 300 / 1をリザ一バー溶液として密封した後、蒸気拡散法により 20〜25でで結晶化を行つた。結晶化開始後、約 2日から二週間程度で 0. 3X0. 3X0. 1 mm- 0. 6X0. 6X0. 3mmの寸法にまで結晶が成長した。

(実施例 2) デカルパミラーゼの重原子誘導体結晶の調製

実施例 1で得られたネィティブ結晶を顕微鏡下、液滴台上の小滴より取り出し、水銀化合物の一つである EMTS (ェチル水銀チォサリチル酸ナトリウム塩）濃度を 0. 5〜1. OmMに調製した 20重量％ポリエチレングリコール 6000

(ナカライテスク製）、 0. 2M塩化リチウムを含む 0. 1M HEPES緩衝液（pH7. 5) に終夜浸漬させることにより重原子誘導体を調製した。

(実施例 3) デカルパミラーゼ結晶の凍結

実施例 1および 2で調製したデカルバミラ一ゼのネイティブ結晶および重原子誘導体結晶を、グリセロール等の凍結安定化剤を添加することなく、結晶化液滴から取り出し、直接液体窒素に浸漬して瞬間凍結した。

(実施例 4) デカルバミラーゼ結晶の X線回折データの収集

多波長異常分散法による解析を行うため、放射光施設 SPr i ng— 8で回折データ測定を行った。測定には、液体窒素中で凍結した EMTS誘導体結晶を用いて行った。測定は、水銀の異常分散を考慮した 3波長（0. 98、 1. 00、 1. 27 A) で行った。 3波長の回折データはすべて 1個の結晶から収集することできた。測定した 53フレーム分の回折画像データをデータ処理プログラム D ENZO (McSc i enc e) にて処理した結果を表 2に示した。デカルパミラーゼのネイティブ結晶については、 1. 0 OA波長を用いて凍結状態で回折デ —夕測定を行い、その処理結果を表 3に示した。なお、独立反射数、単位格子定数または格子定数などの用語については X線解析入門（角戸正夫ら、東京化学同人）を参照のこと。【表 2】

デカルバミラーゼの E M T S誘導体結晶の回折デ一夕の処理結果

b=135.50 c=67.30

1.00 1.8 4.7 98.5 57493 a-67.23

b=136.13 c=67.65

1.27 2.0 5.8 86.5 36870 a=67.13

b=136.00 c=67.54

R-nergeは、複数測定した各フレーム間の ¾差を表している，

【表 3】

デカルバミラーゼのネイティブ結晶の回折データの処理結果波長分解能 R-mcrge 収率独立反射数格子定数

(入） (A) (%) (%) (A)

0.93 1.7 6.4 96.1 68596 a=67.84 b=137.83 c=68.39

R-raergeは、複数測定した各フレーム間の差を表している，

(実施例 5) 重原子座標の決定および位相改良

EMTS誘導体結晶について測定した 3波長の回折データのうち 1· 00Aのデータをネイティブ結晶のデータと仮定して 0. 98Aをァノマラス（anom a 1 o u s ) , 1. 27 Αをァイソモルファス（ i s omo r ph ou s) デ一夕として、差パターソン関数およびァノマラス差パターソン関数を計算し、そのハーカー面（差パターソン図と呼ばれる。図 5〜図 7) を描き、ハーカ一面上の強度の強いピーク位置とそのクロスべクトルに相当する顕著なピーク位置から重原子位置の同定を試みた。各のハーカー面で強度の強いパターソンピークを 2つの差パターソン図（ 00 - 0. 98人のデ一夕間および 1. 00— 1. 27 人のデータ間）から選び出し、 2つの水銀原子（水銀 1および水銀 2) を同定し、その座標を求めた。確認は、まず、水銀 1のみの座標を用いて位相を計算し、その位相を使って差フーリエ計算から水銀 2の座標を計算し、水銀 2の自己ピークおよび水銀 1一水銀 2の交差ピークが差パターソン図に存在するかどうかで判定することにより行った。これら以外に結合した水銀原子の位置を見いだすために、水銀 1および 2の座標を用いて重原子位置パラメ一夕の精密化および位相計算を行い、差フーリエ計算によりその位置を求め、水銀 2を同定した場合と同様に自己ピークおよび交差ピークの確認を行った。その結果、さらに 4個の水銀原子に相当する自己ピークおよび交差ピークを確認することができ、水銀 3、水銀 4、水銀 5および水銀 6の座標を決定した。

波長し 0 OAで測定した 1. 8 A分解能の EMTS誘導体結晶のデータを用いて、求めた 6個の水銀原子座標（重原子パラメータ）をプログラム MLPHA RE (CCP4パッケージ）（SERC) を用いて精密化し、初期位相を決定した。精密化後のフィギヤ一 ·ォブ ·メリット（ f i gu r e o f me r i t) の平均値は 0. 50であった。その後、プログラム DM (CCP4パッケ一ジ、 SERC) を用いた溶媒平滑化法およびヒストグラムマッチング法をデカルバミラ一ゼ結晶中の溶媒領域を 35 %として低分解能から高分解能まで徐々に位相を拡張することで初期位相の改良を行った。また、デカルバミラ一ゼの結晶は、結晶の密度測定の結果から非対称単位中に 2分子が含まれることがわかっており、非結晶学的な対称を利用して、 NC S平均化と呼ばれる電子密度の平均化を行うことにより位相改良を行った。まず、この方法を適用するために、デカルバミラーゼ結晶中の非結晶学的な 2回軸の決定を行つた。溶媒平滑化法を適用した後の位相を用いて電子密度図を計算し、 3次元グラフィックス上で重原子位置および電子密度図を表示し、水銀原子の座標間の中点同士を結んだ 2本の線が Z軸（結晶学的な 2回軸の 1つ）上で直行していることがわかった。したがってデカルバミラーゼ分子は、この 2本の非結晶学的な 2回軸および結晶学的な 2回軸の計 3 本が（222) の対称を持っていると推定された。電子密度図の各セクションを詳細に観察し、それぞれ 2分子の中心座標を決定し、並進および回転を含む非結晶学的対称マトリックスを算出した。同時に溶媒平滑化法で得られた電子密度図からマスクと呼ばれるタンパク質の分子が存在する領域を同定した。求めた非結晶学的対称マトリックスおよびマスクを用いて、プログラム DMを用いて NC S 平均化計算を行った。その結果、 2分子間の相関係数は、 0. 92と高い相関を示し、自由 R因子 (f r e e R— f a c t o r) は 24. 5%であった。改良された電子密度図は極めて明瞭（例えば、図 8を参照のこと。図 8において、ぺプチド主鎖のつながりが連続した電子密度として観察され、図中央には 46位の G 1 u、 171位の Cy s、および 145位の G 1 uと同定されるアミノ酸側鎖に対応する電子密度が観察される。）で、 αヘリックスまたは3シートなどの二次構造部分はアミノ酸の主鎖の流れを明確に追うことができ、また芳香族アミノ酸側鎖などの電子密度も明瞭であつた。

(実施例 6 ) デカルバミラ一ゼの立体構造モデルの構築および精密ィ匕

実施例 5で得られた電子密度図からプログラムォ一（O) (Upp s a l a Un i ve r s i t e t) を用いて、 3次元グラフィックス上でデカルバミラ一ゼの立体構造デルを組み立てた。電子密度をアミノ酸配列に対応させるため、まず、トリブトファン残基など特徴的な電子密度を有する部分ァミノ酸配列に相当する電子密度を電子密度図上で見出し、アミノ酸配列を参照しながら電子密度に適合するァミノ酸残基の部分構造をプログラム Oを用いて構築し、順次この作業を繰り返すことにより、デカルバミラ一ゼのすべてのアミノ酸残基（303残基）を相当する電子密度に適合させ、分子全体の初期立体構造モデルを構築した。得られた立体構造モデルを出発モデル構造として、立体構造精密化プログラムである XPLORの精密化プロトコル（XPLORマニュアル、 Y a 1 e Un i ve r s i t y) に従って立体構造の精密化を行った。精密化は、電子密度図からのずれの大きい局所構造の修正および水分子に相当する電子密度を同定し精密化計算に水分子を含める操作を繰り返し、 R値および自由 R値（f r e e R— f a c t o r) を指標に精密化を進めた。水分子を加えたネイティブ結晶における最終モデル構造の R値は、 500— 1. 7 A分解能の反射データに対して、 1 9. 6%であった。 (実施例 7) デカルバミラーゼの安定化設計

デカルバミラーゼの安定化設計の一例として、エネルギー的に不利なアミノ酸残基を変異することにより安定性の向上が見られた例を示す。本発明の立体構造から計算した 203位のプロリン、 P r o 203の主鎖二面角（φ — 60° 、 Φ 一 44° ) は、 αヘリックス構造に特徴的な二面角を有している。一般にプ口リン残基は、ヘリックス構造を不安定化する、あるいは壊す残基として働くことが知られている。デカルバミラーゼの 203位にプロリンが存在することで、主鎖構造に歪みを生じ、構造を不安定化すると推定される。この部位は、へリツクス構造に特徴的な二面角を有することから、へリツクス構造に適したアミノ酸残基に置換することにより、天然状態の構造エネルギーを安定化しうる。例えば、 αヘリックス構造を取りやすいアミノ酸残基として、ァラニン（A l a) 、ダル夕ミン酸（G 1 u) 、ロイシン（Leu) 、セリン（S e r) などに置換しうる。 203位のアミノ酸を天然型 20種類のアミノ酸に変異し、それぞれの構造については、 AMBERのポテンシャルパラメータ一（We i n e r、 P. A. ら、 J. C omp. Ch emi s t r y 7 (2) ： 230 - 252, 1986) により構造エネルギーを算出し、構造エネルギー値の低いアミノ酸変異がより望ましい変異であるとして、この部位での最適アミノ酸変異を求めた。その結果、ァスパラギン酸〉スレオニン >セリン>バリン>ダル夕ミン酸 >ィソロイシン〉ァグルタミン〉システィン〉プロリンとなった。実施例 1で調製したアミノ酸変異体の変性温度を表 4に示す（国際公開番号 W〇 94ノ 03613) 。以下のいずれの変異においても、安定性の向上（ΔΤπι=3. 4〜8. 2で）が認められる。これらは、プロリン以外のアミノ酸に変異したことで、主鎖構造の歪みを解消したと考えるのが妥当である。また、グルタミン酸（ΔΤΐΏ=8. 2 ) に変異したものが最も高い安定性を示すが、これはグルタミン酸への変異により、グルタミン酸の側鎖カルボキシル基が近傍にある 139位のアルギニン側鎖のグァニジノ基とイオン結合あるいは水素結合を形成することができ、新たに加わった相互作用の寄与として他の変異体に比べ高い安定性を示すと考えられる。 H i s変異体の安定性の増加が、 ATm=3. 4でと他の変異体に比べて小さいのは、 pH 7. 0付近でヒスチジンが正電荷を持った場合、 139位のアルギニンとの静電的な反発により、主鎖の歪みを解消することによる安定化の寄与分を減じたためと考えられる。

計算により求めた 203位の最適アミノ酸変異の安定性の順位は、実験により求めた変性温度の向上の大きさと完全には一致しないが、いずれも天然型デカルバミラ一ゼのプロリン残基よりも構造エネルギーの低い（安定な）方から数えて上位に位置し、実験結果とよく一致した。

【表 4】

203位のァミノ酸変異による熱安定性の変化

変異株変與部位ァミノ酸変異変性温度（°C) 厶 Tm

404 Pro203 Leu 68.0 6.2

406 Pro203 Ser 66.5 4.7

429 Pro203 Glu 70.0 8.2

445 Pro203 Thr 67.5 5.7

468 Pro203 Ala 67.7 5.9

469 Pro203 He 67.2 5.4

470 Pro203 His 65.2 3.4

変性温度は、上記のように調製した（粗）酵素液を各温度にて 10分間の熱処理、熱変性による不溶物を除去した後の活性を測定し、残存比活性 50%を示す温度と定義する。残存比活性の測定は以下のように行った。 1. 0重量％になるように N—力ルバモイル— D— α—パラヒドロキシフエニルグリシンを 0. 1 Μ リン酸緩衝液 ΡΗ7. 0に溶解した基質溶液 lm 1に、酵素溶液 0. 1mlを加え、 40で、 20分間反応させ、 20%トリクロ口酢酸 0. 25mlを添加して酵素反応を停止させた後、活性を変換された D— α—パラヒドロキシフエニルダリシンを内部標準として D—フエ二ルァラニンを用いて高速液体クロマトグラフィ一により定量することにより算出した。変異株は、スクリーニングで得られた変異株の識別番号を示す。 Δ ΤΠΊは、変異前のデカルバミラ一ゼの変性温度からの差異を示す。産業上の利用可能性

本発明によれば、デカルバミラーゼおよびデカルバミラーゼ変異体の立体構造および変異体の立体構造モデルが提供される。本酵素の立体構造は、耐熱性、有機溶剤耐性、空気酸化に対する耐性等の安定性、酵素反応の至適 ρ Ηの変更および比活性向上に関するアミノ酸変異の合理的な分子設計に有用である。このことによって、工業利用に有利な改変酵素を迅速かつ効率的に取得することが可能となる。さらには、本酵素の立体構造が類縁関係にあるアミダ一ゼまたはニトリラ —ゼなどの酵素群の中で唯一決定されたものであり、これら酵素群の工業利用分野で有意義に応用され得ることは明らかである。

Claims

請求の範囲

1. 直方晶系の空間群 P 2！ 2ェ 2および配列番号 1に示されるアミノ酸配列、または直方晶系の空間群 P 2！ 2 _: 2 iおよび配列番号 2に示されるアミノ酸配列を有する、デカルバミラーゼ結晶。

2. 前記結晶が直方体形状の単位格子を有し、単位格子定数： a = 66. 5〜 68. 5人、 b= 1 35. 5- 1 38. 0人、 c = 66. 5-68. 5Aを有し、そして前記アミノ酸配列が配列番号 1である、請求項 1に記載のデカルパミラ一ゼ結晶。

3. 前記結晶が直方体形状の単位格子を有し、単位格子定数： a = 68. 5〜 70. 5人、 b= 138. 0〜140. 5A、 c = 68. 5〜73. OAを有し、そして前記アミノ酸配列が配列番号 1である、請求項 1に記載のデカルバミラーゼ結晶。

4. 前記結晶が直方体形状の単位格子を有し、単位格子定数： a==8 1. 5〜 82. 5 A, b= 133. 0〜； 1 35. 0A、 c = 1 1 9. 5〜； 1 21. 5Aを有し、そして前記アミノ酸配列が配列番号 2である、請求項 1に記載のデカルバミラ一ゼ結晶。

5. 結晶中のデカルパミラーゼ 1分子当たり少なくとも 1つ以上の重金属原子を含む請求項 1から 4のいずれか 1項に記載の結晶。

6. 重金属原子が水銀、金、白金、鉛、イリジウム、オスミウムおよびウランのうちいずれかである請求項 5に記載の結晶。

7. 請求項 1から 6のいずれか 1項に記載のデカルバミラーゼ結晶を液体窒素下で凍結させることにより調製される凍結結晶。

8. デカルバミラ一ゼ結晶の製造方法であって、 1〜5 OmgZmlの濃度でデカルバミラーゼの溶液を与える工程、 5〜30重量％の濃度でポリエチレングリコール（PEG) あるいはメトキシポリエチレングリコル（PEGMME) を含有し、かつ 6. 0〜9. 0の pHを与える濃度の緩衝剤を含有する沈澱剤溶液を与える工程、該デカルバミラーゼ溶液を該沈澱剤溶液と混合する工程、および得られる混合溶液を、該溶液中のデカルバミラーゼ結晶が既定の大きさ以上に成長するまで既定の期間放置する工程を包含する、方法。

9. 前記混合する工程が、前記デカルバミラ一ゼ溶液の液滴を前記沈澱剤溶液の液滴と混合させることを包含し、そして前記放置する工程が、混合工程で得られる混合液滴を密閉容器中で沈澱剤溶液を保持する溶液溜め部上に懸垂させることを包含し、ここで、該溶液溜め部中の該沈澱剤溶液の蒸気圧は該混合液滴の蒸気圧より低い、請求項 8に記載の方法。

10. 前記混合する工程が、前記デカルバミラーゼ溶液の液滴を前記沈緞剤溶液の液滴と混合させることを包含し、そして前記放置する工程が、混合工程で得られる混合液滴を密閉容器中で沈澱剤溶液を保持する溶液溜め部の液滴台に静置させることを包含し、ここで、該際溶液溜め部中の該沈澱剤溶液の蒸気圧は該混合液滴の蒸気圧より低い、請求項 8に記載の方法。

1 1. 前記混合溶液を放置する期間が 1日〜 3週間である、請求項 8に記載の方法。

1 2 . 前記デカルバミラ一ゼの溶液を与える工程の後に、該デカルバミラーゼ溶液をサイズ排除半透膜内に配置させる工程をさらに包含し、そして前記混合する工程が、該半透膜を通して沈澱剤溶液を該デカルバミラーゼ溶液中に拡散させることを包含する、請求項 8に記載の方法。

1 3 . 前記混合する工程が、前記沈澱剤溶液を前記デカルバミラーゼ溶液に徐々に添加することを包含し、そして前記放置する工程が、得られる混合溶液を密閉容器内で放置することを包含する、請求項 8に記載の方法。

1 4 以下の図に示すタンパク質立体構造トポロジーを有する立体構造により特徴付けられるデカルバミラ一ゼまたはその活性断片：

【化 1】

1 5 . 4本のひヘリックスおよび 1 2本の )3ストランドを含む二次構造を含む 4層サンドイッチ構造を有する、デカルバミラ一ゼまたはその活性断片。

1 6 . 酵素反応に関与するアミノ酸残基がシスティン 1残基、グルタミン酸 2残基、およびリジン 1残基であり、酵素反応の基質が D— N—力ルバモイルー α—アミノ酸であって、以下の図に示す基質結合様式を有する活性部位の立体構造により特徴付けられる、デカルバミラーゼまたはデカルバミラ一ゼ変異体、あるいはそれらの活性断片：

【化 2】

ここで、置換基 Rは、 D— N—力ルバモイルー α—アミノ酸の側鎖である。

1 7 . D— N—力ルバモイル—ひ一アミノ酸を基質とするデカルパミラーゼ活性を有する酵素分子であって、少なくとも、配列番号 1または 2における以下のアミノ酸： 4 6位の G 1 u、 1 2 6位の1 5、 1 4 5位の G 1 u、および 1 7 1位の C y s 、に対応するアミノ酸から形成される活性部位腔を有する、酵素分子またはその活性断片。

1 8 . 前記活性部位腔において、前記 D— N—力ルバモイルーひ—アミノ酸が、反応時に前記配列番号 1または 2の 1 2 6位の L y s 、 1 4 3位の H i s、 1 4 5位の G 1 u 、 1 7 4位の A r g 、 1 7 5位の A r g、および 1 9 7位の T h rに対応するアミノ酸と相互作用し得る、請求項 1 7に記載の酵素分子またはその活性断片。

1 9 . 前記活性部位腔において、前記配列番号 1または 2の 4 6位の G 1 u、 1 4 5位の G 1 u、および 1 7 1位の C y sに対応するアミノ酸が水分子を介して水素結合している、請求項 1 7または 1 8に記載の酵素分子またはその活性断片。

2 0 . 前記 D— N—力ルバモイル— α—アミノ酸が、 D— Ν—力ルバモイル一フエニルダリシン、 D— Ν—力ルバモイルーパラヒドロキシフエニルグリシン、 D— N—力ルバモイル—フエ二ルァラニン、 D— N—力ルバモイルーパリン、 D —Ν—力ルバモイル—ァラニン、 D— N—力ルバモイルーシスティン、 D— Ν— 力ルバモイル—ァスパラギン酸、 D— Ν—カルパモイルーグルタミン酸、 D— N —力ルバモイル—グリシン、 D— N—力ルバモイル—ヒスチジン、 D— Ν—カルパモイルーイソロイシン、 D— Ν—力ルバモイル—リジン、 D— Ν—力ルバモイルーロイシン、 D—N—力ルバモイルーメチォニン、 D— Ν—力ルバモイルーァスパラギン、 D— N—力ルバモイループ口リン、 D— N—カルパモイル—グル夕ミン、 D— Ν—力ルバモイルーアルギニン、 D— N—力ルバモイルーセリン、 D —Ν—力ルバモイルースレオニン、 D— Ν—力ルバモイルートリブトフアン、および D—N—力ルバモイル―チ口シンからなる群から選択される、請求項 1 6〜 1 9のいずれか 1項に記載の酵素分子またはその活性断片。

2 1 . 請求項 1 4または 1 5に記載のデカルバミラーゼの立体構造から分子設計手法により構築された、デカルバミラ一ゼまたはその変異体あるいはそれらの活性断片と D— N—力ルバモイル— α—アミノ酸あるいは D—ひ一アミノ酸との複合体立体構造により特徴付けられる、デカルバミラーゼ複合体。 2 2 . デカルパミラーゼ変異体を設計する方法であって、デカルバミラーゼの請求項 1 4、 1 6、または 2 1のいずれか 1項に記載の立体構造に基づいて物性および Ζまたは機能を改変したデカルバミラーゼ変異体を設計する工程を包含する、方法。 2 3 . デカルバミラ一ゼ変異体を設計する方法であって、デカルバミラーゼ活性を有する酵素の結晶を生成する工程、該結晶の X線結晶構造解析により該結晶の立体構造を決定する工程、および決定した立体構造に基づいて物性および Ζ または機能の向上したデカルバミラーゼ変異体を設計する工程を包含する、方法。 2 4. 前記立体構造が、請求項 1 4、 1 6、または 2 1のいずれか 1項に記載のデカルバミラ一ゼの立体構造である、請求項 2 3に記載の方法。

2 5 . デカルバミラーゼ変異体を製造する方法であって、デカルバミラーゼ活性を有する酵素の結晶を生成する工程、該結晶の X線結晶構造解析により該結晶の立体構造を決定する工程、決定した立体構造に基づいて物性およびまたは機能の向上したデカルバミラ一ゼ変異体を設計する工程、および該デカルバミラーゼ変異体を産生する工程を包含する、方法。

2 6 . 前記立体構造が、請求項 1 4、 1 6、または 2 1のいずれか 1項に記載のデカルバミラ一ゼの立体構造である、請求項 2 5に記載の方法。

2 7 . 前記デカルバミラ一ゼ変異体を設計する工程が、酵素の基質特異性の変更、酵素比活性の変更、酵素の安定性向上、酵素の至適 p Hの最適化、および酵素の水溶性の変更からなる群から選択される 1以上の酵素特性の改変を目的とする、請求項 2 6に記載の方法。

2 8 . 前記酵素特性の改変が、酵素の安定性向上を含む、請求項 2 7に記載の方法。

2 9 . 酵素の安定性向上に関する変異体の設計が、空気酸化による活性低下を招くアミノ酸残基を置換する変異を含む、請求項 2 8に記載の方法。

3 0 . 前記酵素特性の改変が、酵素比活性の変更および酵素の至適 p Hの最適化を含む、請求項 2 7に記載の方法。 ―

3 1 . 請求項 2 5〜3 0のいずれか 1項に記載の製造方法によって得られたデカルバミラーゼ変異体。

3 2 . 請求項 1〜 7のいずれか 1項に記載のデカルバミラーゼ結晶の立体構造、あるいは請求項 1 4 , 1 6または 2 1のいずれか 1項に記載のデカルバミラーゼの立体構造を利用して、アミノ酸一次配列がデカルバミラ一ゼと類似する別のポリペプチド酵素またはタンパク質酵素を改変する方法。

3 3 . コンピュータを用いて、デカルバミラーゼ変異体を設計するシステムであって、

デカルバミラ一ゼ活性を有する酵素の結晶の立体構造を、 X線結晶構造解析により決定する手段、ならびに決定した立体構造に基づいて物性および Zまたは機能の向上したデカルパミラーゼ変異体を設計する手段

を備えた、システム。 3 4 . デカルバミラ一ゼ変異体の設計処理を実行させるためのプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体であって、

該設計処理は、

デカルパミラーゼ活性を有する酵素の結晶の X線結晶構造解析により決定された該結晶のデータを入力する工程、ならびに

決定した立体構造に基づいて物性および κまたは機能の向上したデカルバミラーゼ変異体を設計する工程、

を包含する、記録媒体。

3 5 . 以下の工程：デカルバミラーゼ活性を有する酵素の結晶の X線結晶構造解析により決定された該結晶のデータを入力する工程、ならびに決定した立体構造に基づいて物性および Ζまたは機能の向上したデカルバミラーゼ変異体を設計する工程、を包含する処理によって得られたデカルバミラーゼ変異体の立体構造を記述するデ一夕を記録する、記録媒体。