WO1998031386A1

WO1998031386A1 - Procede de stabilisation de peptides et compositions medicinales lyophilisees comprenant des peptides obtenus par ce procede

Info

Publication number: WO1998031386A1
Application number: PCT/JP1998/000178
Authority: WO
Inventors: Hideyuki Furuya; Hiroyuki Morita; Yukitaka Takatsu; Kose Michibuchi; Makoto Tanigawa
Original assignee: Japan Energy Corporation
Priority date: 1997-01-20
Filing date: 1998-01-19
Publication date: 1998-07-23
Also published as: EP0998942A1; US6274553B1; RU2180218C2; CA2278199A1; EP0998942A4; ZA98438B; NO993533L; NZ336793A; AU5497698A; KR20000070338A; NO993533D0; AU721149B2

Description

明細書ぺプチドの安定化方法および当該方法を用いたぺプチド含有凍結乾燥医薬組成物技術分野

本発明は、そのアミノ酸配列中に、 -Asp-Gly-または- Asn-Gly-配列を有し、当該- Asp-Gly-または- Asn-Gly-配列が、脱水反応または脱アミド化反応によりスクシンイミド体に変化し、さらに異性化反応により -転移体に変化するべプチド、特にはディスルファトヒルジン又はヒルジン変異体について、その変化を抑制するためのぺプチドの安定化方法に関する。また、本発朋は、当該安定化方法を利用し前記変化が抑制されたべプチド含有凍結乾燥医薬組成物に関する。背景技術

ヒルジンは、薬用ヒル（Hirudo medicinalis) の唾液線から分泌される抗血液凝固因子で、抗トロンビン作用が認められるため、ヒルジンはその変異体ともども、抗血液凝固用医薬品として開発されている。

これらのヒルジン或いはヒルジン変異体のほとんどは、 -Asp-Gly-または- Asn-Gly-配列を含んでおり、時間の経過とともに、当該配列部分でスクシンイミド体に変化し、さらに yS -転移体に変化する。このため、生産ラインで十分に精製しても、保管中に、このスクシンイミド体または 3 - 転移体が生じ、純度が低下する。このスクシンイミド体または ^ -転移体自体も抗トロンビン活性を有し（特開平 5 - 3 1 0 7 8 8号公報参照）、この変化によって生じる純度低下は、一般的には特には問題とはならない力医薬品としてみた場合、好ましいものではなかった。そこで、ヒルジンの安定性を增加させることを課題として種々の試みがなされている。例えば、ヒルジンの安定性を增すため、ヒルジンに、カルシウム及び Z 又はマグネシウムの水溶性塩を添加する方法（特開平 7 - 2 6 7 8 7 7号公報）、或いはリン酸カリゥムと糖を添加する方法（国際公開 W O 9 5 2 0 3 9 9号公報）が提案されている。しかし、この方法では、未だ十分な安定性が得られない。発明の開示

本発明は上記課題を解決しょうとなされたものである。すなわち、本発明の目的は、 -Asp-Gly-または- Asn-Gly-配列のスクシンイミド体または；3 - 転移体への変化を抑制することによって、この種の配列を含むぺプチドの安定性を増大させるぺプチドの安定化方法及びその安定化方法を利用した安定性に優れたヒルジン含有凍結乾燥医薬組成物を提供することにある。本発明は、経時的に、下記一般式（ 1 )

で表されるスクシンイミド体または一般式（ 2 )

- N H -

" ノで表わされる y3 -転移体に変化する - Asp-Gly-または - Asn-Gly-配列を含むぺプチドの溶液を、有機酸を添加して p H 5〜 6 . 5に調整した後、凍結乾燥することからなるぺプチドの安定化方法である。

本発明のぺプチドとしては、ディスルファトヒルジンまたはヒルジン変異体が用いられる。

また、本発明は、上記のペプチドの安定化方法を利用して調製される医薬組成物、具体的には、組成比としてディスルファトヒルジン又はヒルジン変異体 1モルに対して、 5〜 1 0 0モルの有機酸を添加したヒルジン含有凍結乾燥医薬組成物である。さらに、本発明は、凍結乾燥を施すぺプチド溶液中に、前記有機酸に加えて 1〜 5 0 0モルの白糖、さらに必要に応じて 1 0〜 1 0 0 0モルのマンニトールをディスルファトヒルジン又はヒルジン変異体 1モルに対して添加したものである。図面の簡単な説明

図 1は、実験例 6における 4 0 のインキュベータ一内で 3 ヶ月間保存された凍結乾燥サンプルの液体ク口マトグラフィ一によるクロマトグラムを示す。図中の番号は処方番号である。発明を実施するための最良の形態

本発明の方法は、ぺプチド中に- Asp-Gly-または- Asn-Gly-からなるアミノ酸配列を含み、当該配列が、経時的に、上記一般式（ 1 ) または（ 2 ) で表されるスクシンイミド体または 3-転移体へ変化するのを抑制できるものである。従って、 Asp-Glyまたは Asn-Gly配列を有するペプチドであれば、全て本発明を適用することが可能であるが、特には、ディスルファトヒルジン H V-1 (特開昭 6 0 - 1 3 6 5 9 7号公報参照）、 H V-2

[Harvey et al, Proc. Natl. Acad. Sci. S 1084(1986)) 、または配列番号 1で表されるヒルジン変異体 HV 1 C 3(特開平 4- 1 7 3 7 9 8号公報参照）、ヒト成長ホルモンあるいはリゾチーム等、なかでも特に、ヒルジン変異体 H V 1 C 3 (配列表配列番号 1 ) に好適である。また、前記のディスルファ卜ヒルジン H V - 1あるいはヒルジン変異体 H V 1 C 3を基に、そのァミノ酸配列に更に改変が加えられ、且つ- Asp-Gly-または- Asn-Gly-の配列は保持している種々のヒルジン変異体、例えば、欧州特許公開公報

EP0625580A1 に記載される、 r HV— 1 — 9 (配列表配列番号 2 ) 、 r H V - 1 — 1 0 (配列表配列番号 3 ) 、 r H V - 1 - 1 4 (配列表配列番号 4 ) 、 r H V - 1 - 1 5 (配列表配列番号 5 ) 、 r H V - 1 - 1 6 (配列表配列番号 6 ) 、あるいは、国際公開公報 W09 2 / 1 5 6 1 0に記載される、 HV— 1 7 (配列表配列番号 7 ) に対しても、同様に好適に適用でさる。本発明においては、先ず、上記べプチドを、最終濃度において 0 . 1 〜 5 0 0 m Mの濃度になるように、水に溶解し、これに、有機酸と必要に応じて水酸化ナトリゥム等のアル力リ水溶液を加えて、 p H 5〜 6 . 5に調整する。この場合の有機酸としては、医薬品添加物として許容される種々のカルボン酸類、例えば、一塩基酸である、酢酸、乳酸、二塩基酸あるいは三塩基酸である、酒石酸、クェン酸、リンゴ酸等を用いることができる ₍ 特には、二塩基酸あるいは三塩基酸である、酒石酸、クェン酸等、あるいは、一塩基酸である、酢酸等が、ペプチドの安定性の向上効果に優れているために好ましい。より一般的には、当該カルボン酸の α位炭素上に水酸基が置換した構造を内在するもの、即ち、 C— CH(OH)— COOHの部分構造を有する鎖状のカルボン酸、特には、二塩基酸又は三塩基酸がより好ましい。尚、このペプチド溶液の p Hが 5未満、または 6 . 5を越えた状態で凍結乾燥を行うと安定性が著しく損なわれる。

尚、上記べプチドがディスルファトヒルジン又はヒルジン変異体の場合- 上記 p H 5〜 6 . 5の範囲に調整するためには、これらのヒルジン I m M に対して 5〜 1 0 0 m Mの有機酸と必要により適量のアル力リ水溶液を加えるのが好ましく、これを凍結乾燥することにより、ヒルジン含有凍結乾燥医薬組成物とすることができる。また、この場合、有機酸のみを添加した状態で凍結乾燥したものは、綿状でふわふわした状態となり、製造および投与時の操作が煩雑となるため、有機酸とともに、賦形剤としてヒルジン I m Mに対して、 l 〜 5 0 0 m Mの白糖.、さらには、ヒルジン I m Mに対して、 1 0 〜 1 0 0 0 m Mのマンニトールを加えることがより好ましい < この有機酸添加による P Hの調整、白糖の添加およびマンニトールの添加は、特に順序は問わず、何れを先に添加しても良く、また同時に行っても良い。

上記のようにして調製されたべプチド溶液は等張性であることが好ましく、これを汎用の方法により凍結乾燥させる。この凍結乾燥生成物は、再溶解することにより、投与剤として直ちに使用することができる。

次に実験例を示して本発明の特徴を具体的に説明する。なお、以下に述べる各実験例において、それぞれ医薬組成物に添加せしめる成分の含有量は、当該凍結乾燥医薬組成物の調製に用いるぺプチド溶液、即ち、凍結乾燥を施す溶液中における濃度（最終濃度）により表記する。また、 pHに関しても、凍結乾燥を施す溶液中における pHを意味する

(実験例 1 )

配列表配列番号 1で示したァミノ酸配列を有するヒルジン変異体 H V 1 C 3を 6 mg/ml ( 0.8 6 mM) 、グリシンを 6.7 mg/ml ( 8 9 mM) 、マンニトールを 3 3.5 mg/ml ( 1 8 4 mM) の濃度になるように精製水に溶解した。この溶液を 6分割し、それぞれ 3 OmMの酒石酸、リン酸、トリス緩衝液を用い、表 1に示した p Hに調整し、ペプチド溶液とした。これらの p H調整後の液および無調整の液を 0.2 2 /zmのメンブランフィルターによりろ過し、ろ液を 6 mlヴアイアルに 1 mlずつ入れ、各 p H毎に 5 0本、合計 3 5 0本を凍結乾燥した。

上記凍結乾燥サンプルを、 5 0 °Cのインキュベータ内で保存し、それぞれ、 1、 2、 4、 6、 8週間目に取り出し、 1ヴアイアルに 1 mlの精製水を加え、さらに 5 0倍に希釈した液につき、表 2の条件の液体ク口マトグラフィ一により、ヒルジン変異体 HV 1 C 3のピーク面積百分率を測定し、ィンキュベータ内で保存する前の当初の凍結乾燥サンプル中のヒルジン変異体 H V 1 C 3に対する残存百分率として求め、その結果を表 1に示した。

表 1

表 2

検出器：紫外分光光度計

カフム YMC Protein-RP 内径 7.5 mm、長さ 2 5 cm)

力ラム温度 3 0。C

移動相 A トリフルォロ酢酸水溶液（ 0.2 _V01%)

B トリフルォロ酢酸ァセトニトリル溶液（ 0.2 vol%) 移動相勾配試料注入後 4 0分間で移動相 Bの割合を 1 7 %から 2 7

%えと 1 0 %直線的に増加させる。

1.0 ml/min 上記の結果から、 p H 5〜6.5に調整した後、凍結乾燥すると、安定性が優れていることが分かる。

(実験例 2 )

ヒルジン変異体 H V 1 C 3を 6 mg/ml ( 0.8 6 mM) 、精製白糖を 1.6 mg/ml ( 4.7 mM) 、マンニトールを 1 0 mg/ml ( 5 5 mM) の濃度になるように精製水に溶解した。この溶液を 5分割し、うち 4分割分について、それぞれ 3 0 mMの酢酸、酒石酸、クェン酸、リン酸を用いて、 p Hを 5.

5のべプチド溶液に調整した。これらの p H調整後の液および無調整の液を 0.2 2〃_mのメンブランフィル夕一によりろ過し、ろ液を 6 mlヴアイアルに 1 mlずつ入れ、各 5 0本、合計 2 5 0本を凍結乾燥した。

上記凍結乾燥サンプルを、 6 0 °Cのインキュベータ内で保存し、それぞれ、 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8週間目に取り出し、 1ヴアイアルに

1 mlの精製水を加え、さらに 5 0倍に希釈した液につき、実験例 1 と同様にして、ヒルジン変異体 HV 1 C 3の残存百分率を求めた。その結果を

3§ に/；^した。表 3

これらの結果から、有機酸を添加して p Hを調整すると安定性が著しく増すが、無機酸であるリン酸の場合は劣ることが分かる。

(実験例 3 )

実験例 1 と同様にヒルジン変異体 H V 1 C 3を 6 mg/ml ( 0.8 6 mM) 、精製白糖を 1.6 mg/ml ( 4.7 mM) 、マンニ卜一ルを 1 0 mg/ml ( 5 5 m M) の濃度になるように精製水に溶解した。この溶液を 4分割し、うち 3 分割分について、 3 OmMの酒石酸を用いて、 p Hを、それぞれ 5. 0、 5. 5、 6. 0に調整しペプチド溶液とした。これらの p H調整後の液および無調整の液を 0.2 2 〃mのメンブランフィルターによりろ過し、ろ液を 6 mlヴアイアルに 1 mlずつ入れ、各 5 0本、合計 2 0 0本を凍結乾燥した。

上記凍結乾燥サンプルを、 6 0 °Cのインキュベータ内で保存し、それぞれ、 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8週間目に取り出し、 1 ヴアイアルに l mlの精製水を加え、さらに 5 0倍に希釈した液につき、実験例 1 と同様にして、ヒルジン変異体 HV 1 C 3の残存百分率を求めた。その結果を表 4に示した。表 4

これらの結果から、有機酸、特には酒石酸で p Hを 5〜 6.5の範囲に調整することにより、安定性が著しく増すことが分かる。

(実験例 4 )

ヒルジン変異体 H V 1 C 3を 6 mg/ml ( 0.8 6 mM) 、精製白糖を 1.6 mg/ml ( 4.7 mM) になるように精製水に溶解し、この溶液を 4分割し、うち 3分割分について、それぞれ 5 mM、 1 0mM、 3 0mMの酒石酸を用いて、 p Hを 5.5のペプチド溶液に調整した。無調整液にはマンニト —ルを 1 0 mg/ml ( 5 5 mM) になるよう溶解した。これらの液を 0.2 2 〃mのメンブランフィルタ一によりろ過し、ろ液を 6 mlヴアイアルに 1 mlずつ入れ、各 5 0本、合計 2 0 0本を凍結乾燥した。

上記凍結乾燥サンプルを、 6 0 °Cのインキュベータ内で保存し、それぞれ、 1、 2、 3、 4、 5、 6週間目に取り出し、 1ヴアイアルに l mlの精製水を加え、実験例 1 と同様にして、ヒルジン変異体 HV 1 C 3の残存百分率を求めた。その結果を表 5に示した。

表 5

酒石酸残存百分率（％)

濃度

m M 1週目 2週目 3週目 4週目 5週目 6週目

0 9 7.0 9 4.0 9 2.0 9 1.0 8 7.8 8 6.5

5 9 8.8 9 8.6 9 7.6 9 7.5 9 7.0 9 6.9

1 0 9 8.5 9 8.1 9 7.2 9 6.9 9 6.4 9 6.1

3 0 9 7.9 9 6.8 9 6.1 9 4.7 9 4.1 9 3.5 これらの結果から、 P Hの調整のために添加される有機酸の濃度は 5 m Mであつても十分に効果があることが分かる。

(実験例 5 )

実験例 1 と同様にヒルジン変異体 H V 1 C 3を 6 mg/ml ( 0 . 8 6 mM) 、精製白糖及びマンニトールの添加量を表 6に示した濃度になるように、それぞれ精製水に溶解し、この溶液を 5 mMの酒石酸を用いて、 11を 5 . 5 のべプチド溶液に調整した。 P H調整後の液および無調整の液を 0 . 2 2 〃mのメンブランフィル夕一によりろ過し、ろ液を 6 mlヴアイアルに 1 mlずつ入れ、凍結乾燥した。

上記凍結乾燥サンプルはいずれも安定な形態を示し、精製白糖およびマンニトールは賦形剤として有効であった。これらの凍結乾燥サンプルを、 6 0。Cのインキュベータ内で保存し、それぞれ、 4、 8週間目に取り出し. 1ヴアイアルに 1 mlの精製水を加え、さらに 5 0倍に希釈した液につき、実験例 1 と同じ条件で、液体クロマトグラフィーにより、ヒルジン変異体 H V 1 C 3以外の異性体量のピーク面積百分率を測定した。その結果を表 6に示した。

表 6

この結果から、精製白糖及びマンニトールは、安定性にはほとんど影響を与えないことが確認された。即ち、表 6に記載される 4週目と 8週目の異性体量の差違（増加）は、極僅かであり、有機酸添加による安定性の向上効果を、精製白糖及びマンニトールの添加は損なうものでないことが確認された。

(実験例 6 ) ヒルジン変異体 H V 1 C 3を含む表 7に示した処方のぺプチド溶液から凍結乾燥サンプルを調製した。

表 7

上記凍結サンプルを 4 0 のィンキュベータ一内で保存し、 3 ヶ月目に取り出して、 1 ヴアイアルに l mlの精製水を加え、さらに 5 0倍に希釈した液につき、実験例 1 と同様にして、ヒルジン変異体 H V 1 C 3の残存百分率を求めた。サンプルは 3個掛けとし、その平均を取り、その結果を表 8に示した。また、このときのクロマトグラムを図 1に示した。表 8

これらの結果から、有機酸を添加し p Hを 5〜6 . 5の範囲に調整することにより長期間の保存安定性が向上することが確認された。 W 産業上の利用可能性

本発明によると、ディスルファトヒルジンまたはヒルジン変異体のような、経時的に- Asp-Gly-または- Asn-Gly-配列のスクシンイミド体または yS 転移体へ変化するべプチドのこのような変化を効率よく抑制し、これらのぺプチドの安定性を増大させることができる。

従って、これらのペプチドの医薬としての利用を促進することができる

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Claims

請求の範囲

I . 経時的に、下記一般式（ 1 )

で表されるスクシンイミド体または一般式（ 2 )

C O- H- CH₂- C O-

C H₂ ( 2 ) H-CH- C OOH で表わされる） S -転移体に変化する - Asp-Gly-ま 'たは - Asn-Gly-配列を含むぺプチドの溶液を、有機酸を添加し、 p H 5〜 6.5に調整した後、凍結乾燥することからなるぺプチドの安定化方法。

2. ぺプチドがディスルファトヒルジン又はヒルジン変異体である請求項 1に記載のぺプチドの安定化方法。

3. 有機酸が酒石酸、クェン酸または酢酸である請求項 1または 2に記載のべプチドの安定化方法。

4. 有機酸とさらに、白糖を添加する請求項 1〜 3のいずれか 1項に記載のべプチドの安定化方法。

5. 有機酸及び白糖にさらにマンニトールを添加する請求項 4に記載のぺプチドの安定化方法。

6. 経時的に、下記一般式（ 1 ) で表されるスクシンィミド体または一般式（ 2 ) で表される 3—転移体に変化する Asp-Gly-または Asn-Gly-配列を含むぺプチドと有機酸とを含むぺプチド含有凍結乾燥医薬組成物において. 該ぺプチドと有機酸との比率をモル比として該ぺプチド 1に対して有機酸

5〜 1 0 0としてなるぺプチド含有凍結乾燥医薬組成物。 C H₂-C 0

I 〉 NH— CH₂— C O ( 1 )

- N H - C K - C 0

CO - NH - CH₂ - C O -

CH₂ (2) -NH-CH- C O OH

7. 組成比としてディスルファトヒルジンまたはヒルジン変異体 1モルに対して 5〜 1 0 0モルの有機酸を添加してなるヒルジン含有凍結乾燥医薬組成物。

8. 組成比としてディスルファトヒルジンまたはヒルジン変異体 1モルに対して、 5〜 1 0 0モルの有機酸および 1〜 5 0 0モルの白糖を添加してなるヒルジン含有凍結乾燥医薬組成物。

9. 組成比としてディスルファトヒルジンまたはヒルジン変異体 1モルに対して、 5〜 1 0 0モルの有機酸、 1〜 5 0 0モルの白糖、および 1 0〜 1 0 0 0モルのマンニト一ルを添加してなるヒルジン含有凍結乾燥医薬組成物。

1 0. ディスルファトヒルジンまたはヒルジン変異体の濃度を 0.1〜 5 0 0 mg/mlとした溶液を凍結乾燥したことからなる請求項 7〜 9のいずれか 1項に記載のヒルジン含有凍結乾燥医薬組成物。