WO1995031542A1

WO1995031542A1 - Adn mutant recepteur de l'insuline humaine

Info

Publication number: WO1995031542A1
Application number: PCT/JP1995/000906
Authority: WO
Inventors: Yosuke Ebina
Original assignee: Otsuka Pharmaceutical Co. Ltd.
Priority date: 1994-05-12
Filing date: 1995-05-12
Publication date: 1995-11-23
Also published as: EP0803570A4; US5958685A; CA2190120A1; EP0803570A1

Description

明細書

変異ヒトインスリンレセプター D N A 技術分野

本発明はインスリン非依存型糖尿病（Non-Insulin-Dependent Diabetes Melli tus：以下 N I D DMという）におけるインスリンレセプター構造遺伝子の異常に関し、さらに詳しくは特定部位に変異を含む変異ヒトインスリンレセプター D N Aおよびその断片に関する。背景技術

N I D D Mは幾つかの遺伝子異常と、肥満、ストレス、加齢などの環境因子が加わって発症すると考えられている、人類が抱える最も頻度の高い遺伝病の 1つである。現在我が国にも約 5 0 0万人の患者がいると言われており、近年、癌、脳卒中、心筋梗塞に次ぐ 4大疾患に指定され、その対策が緊急に望まれている。 N I D DMは通常、食事療法や運動療法によって症状や検査結果が改善されることが多いことから、これを早期に、できれば発症前に診断することが望ましい。現在、 N I D DMの診断は、その初期においては、空腹時にグルコース 7 5 gを経口投与し、 3 0分おきに採血して、 2時間血糖値を測定して糖尿病を診断する O G T Tなどの繁雑な検査をしなくては発見できない場合が多く、簡単かつ確実な診断法による早期発見と適切な発症予防が求められている。

現在までのところ、 N I D DMの原因遺伝子は明らかになっていないが、インスリン作用機構に関与する因子の遺伝子、またはインスリン分泌に関与する因子の遺伝子が候補遺伝子と予想されている。このうち、インスリン作用に関与する因子としては、インスリンレセプター、インスリンレセプ夕一サブストレート一 1 ( I R S— 1 ) 、グルコーストランスポータータイプ 4などが考えられており、またインスリン分泌に関与する因子の遺伝子としては、グルコーストランスポーター夕イブ 2、グルコキナーゼ、ミトコンドリア遺伝子などが考えられている。後者の 2つの遺伝子について N I D D M中での異常について検索されたが、いずれも 1 %前後に過ぎないことが報告されている（厚生省糖尿病調査研究事業発症機序班、平成 5年度中間報告）。

ィンスリンが標的細胞に作用するには、その細胞膜上に存在するインスリンレセプターと結合することが必須であり、また N I DDMの初期にはインスリン抵抗性が存在するという多くの報告がある (Taylor, S.I. Diabetes 41:1473-1490, 1992) ことから、インスリンレセプターが関与遺伝子である可能性についても検討されてきた。ィンスリンレセプターに異常が存在すると、高度のィンスリン抵抗性を示し、高インスリン血症となる重篤な糖尿病となるはずである。しかしながら、 N I DDMではそのような特徵を示す症例はほとんどないことから、ィンスリンレセプタ一異常は N I D DMとは関係しないと従来考えられてきた。 —方、最近になって本発明者を含む研究者によって多くのインスリンレセプタ一異常症が発見され、変異の種類により患者の検査結果と症状が多彩であることが明らかとなってきた ( . Taira et al. , Science 245:63-66， 1989; F. Shima da et al. , Lancet 335:1179 - 1181, 1990) 。これにより N I D DMの発症原因の一部にインスリンレセプター遺伝子異常が存在する可能性が示唆された。しかしながら、 N I DDMとの関連においてインスリンレセプター遺伝子異常を大規模かつ系統的に検索したことは今までになく、また遺伝子異常の具体的位置についても不明のままであった。

かかる状況において、本発明者はヒトインスリンレセプター遣伝子異常と N I DDMとの関連を解明すべく、日本人の典型的 N I DDM患者の血液から染色体 DNAを調製し、インスリンレセプター DNAの塩基配列を鋭意研究した結果、 N I D DM患者に有意な頻度のインスリンレセプターの質的異常が存在することを発見し、本発明を完成するに至った。図面の簡単な説明

図 1は、 N I DDM患者 5名のインスリンレセプター /3サブュニットェクソン 13の塩基配列の一部分を示す電気泳動の写真である。

図 2は、 N I D DM患者 8名のィンスリンレセプター /3サブュニットェクソン 22の塩基配列の一部分を示す電気泳動の写真である。

図 3は、野生型（ I R^WT) および変異型（ I R^A831) レセプターのィンスリン結合（A) ならびにレセプターチ口シンキナーゼ活性（B、 C) を示す。（A) ：、 I R^WT (クローン No. 12 ： 0— O； N 0. 21 : ·— ·) 、または I

R^A831 (クローン No. 10 :△ --- Δ； N 0. 17 ：▲—▲) を発現するコンフルェント CHO細胞を種の濃度の¹²⁵ I—インスリンとともに 4°Cで 12時間ィンキュベートした。結合¹²⁵ I—インスリンの放射能を測定し、スキャッチャード法によりプロットした。（B) ：インスリン依存性のレセプター自己リン酸化活性を、（A) と同じセルラインを用いてインスリンレセプタ一 3サブュニッ卜に取り込まれた³² Pの量として表した。（C) ： (A) と同じセルラインを用いて、 I RS— 1および I R 3サブュニットのィンスリン依存性のチロシンリン酸化を抗ホスホチロシン抗体によるィムノブロット（電気泳動）の図である。図 4は、正常および 2種の人工変異ィンスリンレセプター： I R^A831または I R^C1334と、 P I 3—キナーゼの p 85サブュニッ卜とのィンスリン誘導化複合体形成を示す。 P I 3—キナーゼの p 85サブユニット（P 85) を COS細胞中で、野生型（I R^WT) または人工変異型 I R ( I R^A831または I R^C1334) とそれぞれ一過性に同時発現させた。 10 -⁷Mインスリンの存在下において、細胞溶解物を I Rの抗 /3サブュニット（a I または抗 ρ 85 (α ρ 85) 抗体によって免疫沈降させた。免疫沈降物を（Α) では抗ホスホチロシン抗体（αΡ Υ) で、（Β) では I Rの抗 αサブュニット抗体 I Ra) でィムノブ口ットした得た電気泳動の図である。

図 5は、 I R^{ei 334}の変異をもつ一家系の N I DDM発症と変異の関連を示す。 (A) ： TAC (Ty r ¹³³⁴) →TGC (Cy s ¹³³ ) の置換をもつ家系分析である。四角は男性を、丸は女性を表す。黒で塗ったものは N I DDM患者であり、矢印は本人を表し、また斜線をいれたものは故人を表す。（B) ：対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーシヨン。 3名の患者または正常人のゲノム DNAから得たインスリンレセプターェクソン 22由来の P CR産物をァガロースゲルで分離し、ニトロセルロースフィルターにトランスファ一した。突然変異対立遺伝子に特異的な³² P—標識オリゴヌクレオチドプローブでハイプリダイゼーションした後、フィルターをォ一トラジオグラフィーに付した。本人（Y. Y. ) の 1つの対立遺伝子に I R^{C 1334}変異（346 b p断片）が同定されたが、兄（T. S. ) および姉（S. K. ) には観察されなかった。

図 6は、 I R^A831の変異をもつ一家系の N I DDM発症と変異の連関を示す図である。（A) ACG (Th r ⁸³¹) →GCG (A 1 a⁸³¹) の置換をもつ家系分析である。 I R^A831変異が本人（Yh. T. ) 、 2人の兄（ I. T. および Yo. Τ. ) ならびに姉（Τ. 0. ) の 1つの対立遺伝子に同定された。矢印は本人、四角は男性、丸は女性を表す。黒で塗ったものは N I DDM患者であり、黒白模様は I GT imp a r e d g l u c o s e t o l e r a n c e) でめり、また斜線をいれたものは故人を表す。（B) ：制限酵素消化による I R^A831の検出を示す電気泳動の図である。ェクソン 13の PCR断片における I R^A831変異は制限酵素 C f 0 Iの特異的部位を切断する。変異型 PCR断片の C f 0 I消化物（322bp) は 102b pと 220 b pのバンドとして出現するが、野生型ではこの切断が阻害される。

図 7は、ヒトインスリンレセプターをコードする DNA (その 1) である。図 8は、ヒトインスリンレセプターをコードする DNA (その 2) である。図 9は、ヒトインスリンレセプターをコードする DNA (その 3) である。図 10は、ヒトインスリンレセプターをコードする DNA (その 4) である。本願発明の変異ヒトインスリンレセプターの変異部位（831番目アミノ酸）を四角で囲んで示す。

図 11は、ヒトインスリンレセプターをコードする DNA (その 5) である。本願発明の変異ヒトインスリンレセプターの変異部位（1334番目アミノ酸）を四角で囲んで示す。発明の詳細な説明

本発明は、ヒトインスリンレセプター DN A中 831番目の Th rをコードする塩基配列が A 1 aをコードする塩基配列に変異および/または 1334番目の Ty rをコードする塩基配列が Cy sをコードする塩基配列に変異した変異ヒトィンスリンレセプター DNA、あるいは該変異部分を含む上記変異ヒトインスリンレセプター DN A断片を提供する。

ィンスリンレセプターはィンスリンを特異的に結合してその情報を細胞内に伝達する生体膜の受容体であって、 2本の α鎖（735残基、分子量 84, 214) と 2本の /3鎖（620残基、分子量 69, 700) から成る。ィンスリンレセプターの遺伝子は 22ェクソンから成っており、そのうち 11ェクソンは αサブュニットをコードし、他の 1 iェクソンがサブユニットをコードする（S. Seino et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:114-118, 1989) 。ヒトインスリンレセプターの塩基配列ならびにこれと対応するァミノ酸配列を配列表の配列番号 1 に示す。本願発明の変異ヒトインスリンレセプター DNAは、サブユニットェクソン 13の 831番目の Th rをコ一ドする塩基配列（^CG) が A 1 aをコードする塩基配列（ CG) に変異および/または /3サブュニットェクソン 22 の 1334番目の Ty rをコードする塩基配列（T^C) が Cy sをコ一ドする塩基配列（T^C) に変異した変異ヒトインスリンレセプター DNA、ならびに該変異部分を含む上記変異ヒトインスリンレセプター DNAの断片である。本願発明の変異ヒトインスリンレセプターの変異部位を図 7〜11に示す配列（配列表の配列番号 1の配列と同じ）中に四角で囲んで示す。

本願発明の変異ヒトインスリンレセプター DNAは、日本人の典型的な N I D DM患者 51人のインスリンレセプタ一全 22ェクソン遺伝子を PCR (ポリメラーゼチヱインリアクション）法にて増幅し、 pUC 19ベクタ一に挿入後、 D NA塩基配列を決定することによって得られた。 DNA塩基配列分析の結果、片親の遺伝子の ySサブュニットェクソン 13の 831番目の Th rが A 1 aに変異している症例が 3例と、また片親の遺伝子のサブユニットェクソン 22の 13 34番目の丁 rが Cy sに変異している症例が 1例発見された。

前者の変異（Th r⁸³¹→A 1 a⁸³¹) に見られるアミノ酸置換は従来までに報告されていないものである。 c DN A上でこの変異を作り、動物細胞で強制発現させ、レセプター機能を解析したが、顕著なレセプター機能の障害は見られなか" た。しかしながら、この変異は正常人 272人を検索したところ発見されず、また統計学的処理により N I DDM発症と関連していることが明らかとなった。さらに、この変異（I R^A831) と N I DDM発症との関連を試験するために、 I R をもつ—家系についてのデータを分析した。その結果、 I R 3iの _{h e} t e r o z y g o u s変異が N I D DM発症の原因であることが強く示唆された。 —方、後者の変異（Ty r ¹³³ →C y s ¹³³⁴) に関しても顕著なレセプター機能の障害は観察されなかった。また、一家系を解析した結果、この変異はこの家族の N I DDM発症とは関連していないと思われた。しカヽし、この変異インスリンレセプターは P I 3—キナーゼと結合できなかった。本発明者らは最近ィンスリンシグナル伝達、特にィンスリンによるグルコーストランスポーターの t r a n s 1 o c a t i o nには P I 3—キナーゼが関与していることを証明している (F. Kanai et al. , Biochem. Biophys. Res. Commun. 195:762-768, 1993) 。したがって、この変異が N I DDM発症と関連している可能性を示唆するものである。

本願発明の変異ヒトインスリンレセプター DNAは N I D DM発症原因遺伝子の少なくとも約 6%の質的変異を構成し、 N I D DMの遺伝子診断への応用を可能とする有意な数値である。 N I D DMの発症に関与する遺伝子は複数存在し、またそれぞれの遺伝子の中の変異は h o t s p o tが存在し、そのうち本願発明の変異ィンスリンレセプター DN Aの変異部分を含む数箇所が主要なものを占めると予想される。したがって、今後他の関与変異が解明されると、本願発明の変異ヒトインスリンレセプタ一 DN Aまたは該変異ヒトインスリンレセプター D N Aの断片と組み合わせることにより、簡単かつ確実な N I D DMの遺伝子診断が可能となる。さらにかかる遺伝子診断と従来の診断法を組み合わせて N I DD Mの早期診断を行うことにより適切な予防と治療に多大な貢献をするものと思われる。

また上記の診断に用いるには、本願発明の変異部分を含む変異ヒトインスリンレセプター DNA、該変異ヒトインスリンレセプター DNAの断片のみならず、これらと相補的な DNAまたはその断片も診断プローブとして有用である。したがって、

(a) ヒトインスリンレセプター DNA中、 ^サブユニットェクソン 13の 83 1番目の Th rをコードする塩基配列（ACG) が A 1 aをコードする塩基配列 (GCG) に変異した変異ヒトインスリンレセプター DN A断片、

(b) ヒトインスリンレセプター DNA中、サブユニットェクソン 22の 13 34番目の Ty rをコードする塩基配列（TAC) が Cy sをコ一ドする塩基配歹 ij (TGC) に変異した変異ヒトインスリンレセプタ一 DNA断片、

(c) 上記（a) または（b) の変異ヒトインスリンレセプター DN A断片と相補的な DNA断片、

も本願発明の N I D DMの断プローブとして有用である。

これらの診断プローブ用 DNA断片は一般に、上記変異部分を含む約 100塩基までの塩基、好ましくは変異部分を含む 10〜50塩基、より好ましくは変異部分を含む 10〜30塩基の長さの塩基配列で構成される。

本願発明の DNAまたは DNA断片は、例えば、シリカなどの支持体上での固相法を利用する DN A自動合成機を用いて本願発明の塩基配列に従って合成することができる。

本願発明にかかる上記遺伝子診断は、本願発明によって明らかにされ特徴付けられた前記特定の変異を検出するものである限りにおいて、その手法等には何らの限定もなく各種の方法を広く採用することができる。本願 ¾明によって検出すベき遺伝子変異が明らかにされこれが特定されている以上、かかる本願開示に従えば、その検出の為の方法の適宜採用は当業者に容易であろう。

例えばかかる方法は、上記特定された位置の塩基配列の解析を行うことによつても可能であり、もちろんこれを包含する。サザンハイブリダィゼ一シヨン法やドットハイブリダィゼーシヨン法（いずれも Southern, E. M. , J. Mol. Biol. , 98:503-517, 1975等参照）も採用しうる選択であろう。例えば、 PCR (Poly merase chain reaction; 一 RFLP法 (Restriction fragment length polymor phism：制限酵素断片長多型分析法）、 PCR—単鎖高次構造多型分析法（Orita, M. , Iwahana, H. , Kanazawa, Η.， Hayashi, K. and Sekiya, T. , Proc. Natl. Acad. Sci., U.S. A., 86:2766-2770, 1989等参照）、 PCR— S SO法 (Speci fic sequence oligonucleotide： P CR—特異的配列オリゴヌクレオチド法）、 PCR— SSOとドットハイブリダィゼ一ション法を用いる対立遺伝子特異的ォリゴヌクレオチド法（allele specific oligomer： A S 0； Saiki, R. K.， Bugaw an, T.L.， Horn, G. T. , Mullis, K. B. and Erlich, H. A. , Nature, 324:163-166, 1986等参照）等の PCR法を利用する DNAの増幅手法との組み合わせによる方法は、少量の DN A試料を利用して簡便かつ容易にしかも感度および精度の高い検出が可能であり好ましく例示することができる。

特に本発明においては、その簡便さから、 RF L P法およびまたは対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション法の採用を好ましく例示することができる。以下に、かかる検出法を例にとり、より詳細に説明する。

なお、本発明の検出法において採用され得る各種の操作、例えば、一部 DNA の化学合成、 DNAの切断、削除、付加または結合を目的とする酵素処理、 DN Aの単離、精製、複製、選択等はいずれも常法に従うことができる [分子遺伝学実験法、共立出版（株） 1983年発行； PCRテクノロジー、宝酒造（株） 1 990年発行等参照] 。例えば、 DNAの単離精製は、ァガロースゲル電気泳動法等に従うことができ、 DNA配列の決定は、例えばジデォキシ法（Sanger, F. , Nicklen, S. and Coulson, A. R. , Proc. Natl. Acad. Sci.， U.S.A., 74:5463- 5467, 1977) や、マクサム一ギルバート法（Maxam, A. M. and Gilbert, W. , Me thod in Enzymology, 65:499-560, 1980) 等に従うことができる。上記 DNA塩基配列の決定は、市販のシークェンスキット等を用いることによつても容易に行い得る。 DN Aの特定領域の増幅のための P CR法もまた常法（例えば、 Saiki, R. K. , Scharf, S. , Faloona, F. A. , Mullis, K. B. , Horn, G. T. , Erlich, H. A. and Arnheim, N. , Science, 230:1350-1354, 1985等参照）に従うことができる。これら各種の基本的操作は、例えば本出願に引用の各種文献においても採用されており、後述の実施例とともに参照される。

本発明の検出法において、測定対象であるゲノム DNAは、ヒト由来のサンプルであり、これを含むものであれば特に限定なく採用できる。ゲノム DNAは、これらサンプルより常法に従い抽出、精製し、調製することができる。

該ゲノム DN Aより、本発明にかかる変異部位を含む DN A領域を増幅し、多量にかつ濃縮された被検体を得ることができる。これは、例えば PC R法に従い実施でき、上記ェクソン 13または 22の変異部位を含む領域のみを特異的に增幅するように適宜選択したプライマーを採用することにより行われる。かかるプライマーの設定は常法に従えばよく、また増幅する領域の塩基長等にも制限はなく通常 l O O b pから 500 b pとすることができる。かかるプライマー設定の好適な例は、例えばフランキングイントロニック配列（flanking intronic sequ ence) に相同性のプライマー（Seino, S. , Seino, M. and Bell, Gl. , Diabetes, 39:123-128, 1990) を採用するものであり、これは後述の実施例におけるェクソン 13にかかる領域の増幅のために使用されている。また、ェクソン 22にかかる領域の増幅では、一例して、センスプライマー： 5' — CACTGACC TCATGCGCATGTGCTGG-3' とアンチセンスプライマー： 5 ' - ATTGGACCGAGGCAAGGTCAGAAT— 3' が採用されている。かかるプライマ一設定によれば、それぞれ 322 b p ( クソン 13) および 3 46 b p (ェクソン 22) の増幅された DNAフラグメントとして上記所望領域が提供される。

PCR法に従い増幅された所望 DNA領域を利用し、その領域に含まれる本願発明特定の変異を検出確認することができる。後述する実施例では、ェクソン 1 3にかかる変異の検出は RF LP法に従い実施されている。 A l a⁸³¹ (GCG) の変異は、制限酵素 C f o Iの特異的切断サイトを生じさせている。したがって、かかる変異を有する上記ェクソン 13の PC R増幅産物（322 b p) は、これを C f 0 I消化に付すことにより、 102 b pと 220 b pの 2つのフラグメントを与え、一方、この変異のない野生型ではこの切断は生じない（322 b p)。生成したフラグメントは常法に従い特定バンドとして確認される。

ェクソン 22にかかる変異の検出では、前記した診断プローブ用 DNA断片を利用する、対立遺伝子特異的ハイブリダィゼーシヨン法が採用されている。これは、前記した特定の診断プローブを採用して本願発明特定の変異を検出する限りにおいて常法に従い行うことができるが、例えば後述する実施例において採用された条件は次の通りである。

二トロセルロースフィルターに移した上記ェクソン 22の P CR増幅物（34 6 b p) のハイプリダイゼーションは、プローブ溶液（6 x S S C、 10 xD e n h a r d t ' s溶液、 1% SDS、 1 m gZm 1サケ*** DN Aおよび³² P 標識プローブを含む）中、 30°C—晩にて実施された。ハイブリダィズしたフィルターは、 2回洗浄（0. 1% SDSの 6 X S S C中、 54°C、各 20分間）後、常法によるオートラジオグラフィ一に付された。ここで採用された、野生型 (Ty r ¹³³⁴： TAC) と区別しうる I R^{C 1334}変異（Cy s ¹³³⁴ ： TGC) 特異的なプローブは、 ³²P標識プローブ： 5' - ATGTGTGTG C^AAGGG ATGT- 3' である。

上記のようにして得られたバンド（ェクソン 13の変異にかかる 102 b pと 220 b ρの 2つのバンド άたはェクソン 22の変異にかかる 346 b pのハイブリダィズしたバンド）のパターンおよび確認により、本願発明にかかる変異の存在検出をすることができる。

なお、このような遺伝子診断をするに際して、本願発明にかかる変異の存在検出をするための手段あるいは試薬を有効成分として含有する診断剤を利用するのが好適である。したがって、本願発明は、かかるインスリン非依存型糖尿病診断剤をも提供する。該診断剤は、本願発明にかかる変異の存在検出をするための方法に応じた、特異的な試薬が必須成分として含有される。かかる特異的試薬は、採用する検出方法に従い適宜設定されるが、例えば、前記した診断プローブ用 D N A断片およびまたは特定の制限酵素等の本願発明にかかる変異を特異的に検出するための手段に必要な試薬として特徴付けられる。また、本願発明の変異にかかる領域を特異的に P CR増幅するための試薬、例えばそのために設定されたプライマ一等は、本発明診断剤の必須成分とは考えられないが、これらは、ハイブリダィゼ一シヨンのための試薬類と同様に、本発明診断剤に含ませることもでさる。

以下の実施例において本願発明を詳しく説明するが、本願発明はこれに限定されるものではない。実施例

実施例 1 ：ヒト染色体 DN Aの分離

千葉大学医学部第 2内科牧野博士らのグループより日本人の典型的 N I DDM 患者約 100名の血液 10m 1ずつを恵与された。ヒト染色体 DNAの分離は以下の手順で行った。

1) 2本の 5 Om 1ブルーキャップチューブにそれぞれ 45m 1の A液（0. 3 2M S u c r o s e, 10 mM T r i s— HC l (pH7. 5) 、 5mM MgC l ₂、 1%T r i t o nX- 100) を 10m lのコマゴメピぺットを用いて入れた。

2) 約 1 Om 1の血液を採取した。

3) 血液約 5m 1ずつを A液の入った 2本のブルーキヤップチューブに移して、転倒混和した。

4) 4°Cにて 3， 000 r pmで 10分遠心した。

5) 上清を注意深く捨てて、さらにこのチューブをキムワイプの上に逆さに立てて液を除いた。

6) このチューブに 5m 1のコマゴメピペットで 4m 1の B液（0. 075M NaC l、 0. 024M EDTA (pH8. 0) ) を加えて混合し、ペレットを底から剥がした。これをもう 1本のチューブに移して、ボルテックスミキサーでよく混合した。

7) この混合液にォートビぺットにて 1 m 1の C液（5%S D Sと 2mgZm 1 の P r o t e i n a s e Kを等量加えたもの）を加え、よく混合して一晚 37 °Cで反応させた。

8) 5m 1のコマゴメピペットで 5 m 1のフヱノール溶液を加え、キャップをして充分混合した。これにさらに 5mlのクロ口ホルム：イソアミルアルコール (24 ： 1) 混合液を加えてキャップをして 30分混合した。

9) 15m 1のオレンジキャップのコニカルチューブに全液を移し、 3， 000 r pm、 10分間遠心した。

10) 先端を切ったパスツールピぺッ卜で上清を注意深く取り、新しいオレンジキャップチューブに移した。 5mlのフヱノール ·クロ口ホルム混合液（1 ： 1) を加え、 30分混合した。

11) 3, 000 r pmで 10分間遠心した。

12) 先端を切ったパスツールピぺッ卜で上清を注意深く取り、 1本の 50m 1 のブルーキャップチューブに移した。

13) オートピペットで 0. 5m lの D液（3M酢酸ナトリウム）を加え、キヤップを締めて混合した後、コマゴメピペットで 10m 1の冷エタノール（99. 9 %) をゆつくり重層した。

14) キャップを締めてゆつくり転倒混和すると、染色体 DNAは白い不溶物として出現した。これをパスツールピペットの先を曲げたものですくいとり、そつと lm 1の 70%エタノール溶液中に約 1 5秒間浸した後、該不溶物を 200/ί 1の Ε液（1 0mM T r i s— HC 1 (p H 7. 5) 、 1 mM EDTA) が入ったエツペンドルフチュブに移した。

1 5) エツペンドルフチューブにキャップをして、ボルテックスミキサーで数回混合し、 DN Aをよく溶かした。

また、非糖尿病者 272名から同様にして染色体 DNAを分離した。実施例 2 ： P CR法によるインスリンレセプタ一遺伝子ェクソンの増幅とサブクローニングおよびプラスミド DNAの分離

清野ら（S. Seino et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:114-118. 1989; S. Seino et al. , Diabetes 39:123-128， 1990) の方法により、インスリンレセプタ一遺伝子のすべての 22ェクソンを増幅できるプライマー DN Aを用いて P CR法によって、ィンスリンレセプター遺伝子を増幅した。

すなわち、 0. 5m 1のチューブに下記組成の混合 F液 99// 1を加えてから DNA l/i l (1/ig) を加えて混合した：

(液量）（final)

10 X Reaction Buffer 10.0 //1 1 x

dNTPs mix (2.5mM) 8.0 βΐ 200 iiM

Upstream primer 0.5 ill 50 pmol/100 //1

Downstream primer 0.5 //1 50 pmol/100 βΐ

H₂0 79.5 ill

Ampli Taq™ polymerase 0.5 //1 2.5 U/Assay _

Total 99.0 ill 上記混合物にサンプルの蒸発防止のためにミネラルオイルを重層し、また熱伝導率をよくするために、ヒートボックスのゥエルにもミネラルオイルを 1滴ずつ入れた。これを用いて以下の件で P C Rを実施した。

1. initial denature 94°C、 3分 2. denature 94°C、 1分

3. anneal 53°C、 1. 5分 x 30サイクル

4. extension 72°C、 2. 5分

72°C、 4分にて終わる。

P CRで増幅されたサンプルにクロ口ホルム 100// 1を加えて、よくボルテツクスミキサーで混合し、 1分間遠心した。下層をパスツールピペットで充分に除いて、上層から DNAを得た。

このようにして得た P CR増幅 DN Α断片をァガロースゲル電気泳動に付して精製し、アル力リホスファターゼ処理した pUC 19の H i n c I I部位へライゲーシヨンさせ、大腸菌へこの組換え体を導入した。数百個のアンピシリン耐性コロニーから 12個のコロニーを拾いだし、 50%以上のコロニーに P CR D N A断片が入っていることを各ェクソンごとに確認した。残り数百個のコロニー全部を寒天培地からかきとり、液体培地で増殖後、アルカリ法により粗プラスミド DN Aを分離し、さらにポリエチレングリコール沈殿法を用いて RN Aを除いた。本実施例の方法のように多数の大腸菌トランスフォーマントを用いると、父方、母方両遺伝子からの PC R産物はほぼ同量含まれると考えられ、したがってこのような方法で分離した DN Aの塩基配列には父方と母方の遺伝子配列が出現してくることになる。実施例 3 ： DN A塩基配列の決定

アイソトープを用いた d i d e 0 X y法（Maxam， A.M. and Gilbert, W. , Pro c. Natl. Acad. Sci. USA 74:560-564, 1977) により実施例 2で得られた DNA 断片の塩基配列を決定した。簡単にのべると、 PCRによる DNA増幅に用いたプライマーを DNA断片にハイプリダイゼーションさせ、アイソトーブラベルした d CTPを用いてシーケネースで DNA合成させ、電気泳動後、オートラジオグラフィ一を行った。

その結果、アミノ酸置換を伴わない DNA塩基配列の変異が 10力所と、アミノ酸置換を伴う変異が 4例発見された。

上記アミノ酸置換を伴う変異のうち 3例はインスリンレセプタ一 ^サブュニットェクソン 1 3の 83 1番目のアミノ酸 Th rが A 1 aに変異した以下の変異をもつものであった。

V a 1⁸³⁰ -Th r⁸³¹ 一 H i s ⁸³²

正常体 5' — GTG - ACG - CAT -3'

3' 一 C AC 一 TGC 一 GTA 一 5' 変異体 5' 一 GTG ― GCG 一 CAT 一 3'

3' - CAC - CGC 一 GTA 一 5'

V _a 1830 一八 1 a⁸³¹ -H i s ⁸³²

この変異を有する N I D DM患者を含む 5名の N I D DM患者のィンスリンレセプター; Sサブュニットェクソン 1 3の DN A塩基配列の一部分を示す電気泳動の写真を図 1に示す。 3番目のレーンの患者は Th r ⁸³¹ (ACG) と A l a⁸³¹ (GCG) の両配列をもつ h e t e r o z y g o t eであことが判明した。これと同じ配列をもつ患者が他に 2名存在した。

また、アミノ酸置換を伴う変異の他の 1例はィンスリンレセプター 3サブュニットェクソン 22の 1334番目のアミノ酸 Ty rが C y sに変異した以下の変異をもつものであった。

P γ Q 1333― Ύ y 1334— Th f ¹³³⁵

正常体 5' - C CT 一 TAC 一 ACA —3'

3' 一 GGA 一 ATG 一 TGT 一 5' 変異体 5' 一 C CT ― TGC 一 ACA 一 3'

3' 一 GGA 一 ACG 一 TGT 一 5'

p _{R 0} 1333_ _{C V S} 1334_ _{T H R} 1335

この変異を有する N I DDM患者を含む 8名の N I DDM患者のィンスリンレセプター βサブュニツトェクソン 22の DN Α塩基配列の一部分を示す電気泳動の写真を図 2に示す。 7番目のレーンの患者は Ty r ¹³³⁴ (TAC) と C y s ¹³ ³⁴ (TGC) の両配列をもつ h e t e r o z y g o t eであることが判明した。実施例 4 ：哺乳動物細胞で発現させた変異インスリンレセプターの機能的性状の検討

試験方法

(1) 発現プラスミドの構築

c DNA上で P CR法を用いて 2種の人工変異 c DNAであるィンスリンレセプタ一： I R^A831 (Th r⁸³¹が A 1 a⁸³¹に変異したもの）および I R^cis3₄ (Ty r ¹³³⁴が Cy s ¹³³⁴に変異したもの）を作製した。

次いで人工変異 c DN Aである I R^A831、 I R^{C 1334}を哺乳動物発現ベクター SR (Y. Takebe et al., Mol. Cell Biol. 8:466-472, 1988) (それぞれ S Rな I R^A831および SRa I R^C1334) にサブクローニングした。対照として用いた野生型インスリンレセプターは文献記載の方法（F. Kanai et al. , J. Biol. Chem. 268:14523-14526, 1993) で構築し、 SRな I R^WTとした。

(2) 野生型インスリンレセプターおよび人工変異インスリンレセプタ一を発現する CHO細胞の樹立

リン酸カルシウム沈殿法により、 CHO細胞を SRa I R^WT、 SR« I R^A831 または SR ^C1334 (各 10 z g) 、および p S V2— n e o (1 // g) でトランスフヱクシヨンした。 G418 (S i gma社製） 400 gZm 1で選択した後、ヒトインスリンレセプターを発現する細胞を、文献記載の方法（H. Hayas hi et al. , Biochem. J. 280:769-775, 1991) を用いて¹²⁵ I—標識インスリン結合により同定した。細胞表面のレセプターの数はスキャッチャード（S c a t c h a r d) 分析（G. Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51:660-672, 1949) によつて s「算した。

(3) レセプターチ口シンキナーゼ活性の測定

文献記載の方法（H. Hayashi et al.， Biochem. J. 280:769-775, 1991) を用いて、 96ゥエルプレートで I R^WTおよび I R^A831のインスリン刺激したレセプター自己リン酸化を実施した。レセプター 3—サブュニッ卜への³² Pの取り込みは 6%SDS— PAGEで検出し、 B i o— i ma g e— a n a l y z e r B AS 2000で測定した。 (4) インスリンレセプターと P I 3—キナーゼのひ一タイプ p 85サブュニッ卜とのインスリン誘導複合体の形成

P I 3—キナーゼの一タイプ p 85サブュニット、ならびに野生型または人ェ変異インスリンレセプ夕- ( I R) を一過性に発現させるために、 L i p 0 f e c t a m i n e ^TM試薬 (B e t h e s d a R e s e a r c h L a b o r a t o r i e s) を用いて、 C OS— 7細胞を S p 85 a (1. 5 β g と S Ra I R、 S R I R^A831または SRa I R^C1334 (各 1.. 5 g) でトランスフエクシヨンした。 1 0 -⁷Mィンスリンで 1 0分間刺激した後、細胞溶解物を調製し、 I Rのサブユニットを認識する抗 I R抗体 1 G2、またはゥサギポリク口一ナル抗 ρ 85 α抗体、ならびにタンパク質 G—セファロースとともにインキュペートした。免疫沈降物を 6%SD S— PAGEで電気泳動した。抗ホスホチロシン抗体（PY20) または I Rの αサブュニットを認識する抗ィンスリンレセプタ一抗体 3 Β 1 1を用いてィムノブ口ットを行った。

糸口^

(1) Α83 1変異

上記試験方法（2) によって得られた I R^WT (クローン No. 12、 21) および I R^A831 (クローン No. 1 0、 1 7) を安定に発現する 2つのクローンを検討した。

図 3 Aは I R^WT (クローン 12、 2 1) および I R^A831 (クローン 10、 1 7) のスッキャッチヤード分析を示す。各クローンのインスリン結合部位の数を測定した。高親和性結合部位の数は I R^WTおよび I R^A831のそれぞれについて 1細胞当たり 1. 1、 1. 5 x l 0⁶および 0. 5、 0. 9 X 10⁶であり、解離定数 (Kd) は 2. 8、 3. 5 nMおよび 1. 7、 2. 7 nMであった。レセプターからの¹²⁵ I —インスリンの pH依存性解離を試験したところ、 I R^WTおよび I R^A831のいずれにおいても、 pHが 7. 5から 5. 5に減少するのに応じて解離が起こることが観察され、野生型と人工変異型で差はなかった。

また、上記（3) の試験方法によりこれらのレセプター自己リン酸化活性を測定した。得られた結果を図 3 B示す。図から明らかなように、レセプター自己リン酸化活性はレセプター数に応じて増加した。 50%最大（11 & 1 f — ma x i ma 1 ) 刺激は I R^WTおよび I R^A831それぞれにおいて、 5. 5、 5. 4x 10 -¹⁰Mおよび 5. 0、 4. 9 x 10—^1ϋΜであり、野生型と人工変異型の間で顕著な差はなかった。

さらに、内在基質 I RS— '1に対するチロシンキナーゼ活性を抗ホスホチロシン抗体（ΡΥ— 20) を用いるィムノブロットで測定した。得られた結果を図 3 Cに示す。図から明らかなように、 I RS— 1 (分子量 160, 000) は、レセプタ一^ユニット（分子量 95, 000) の自己リン酸^:速度と平行してチロシン残基においてィンスリン依存的にリン酸化された。

次いで各 I Rを安定に発現する CHOクローン間の相違を排除するために、 I R^WTおよび I R^A831を一過性に発現する COS細胞を用いてインスリン結合とレセプタ一自己リン酸化を試験した。その結果、野生型と人工変異レセプターとの間にィンスリン結合親和性およびレセプターキナーゼ活性の顕著な相違は見られなかった。また、レセプタープロセシング、インターナリゼ一シヨン、分解、ィンスリン刺激によるグルコース取り込み、グリコーゲン合成、および DN A合成などにおいても野生型と人工変異レセプターとの間に顕著な相違は観察されなかつた。したがって、 A831変異に顕著なレセプタ一機能の障害は見いだされなかつた。

(2) C 1334変異

A831と同様の実験を C 1334変異について実施して、 I R^C1334のレセプター機能障害を検討した。

I Rを安定に発現する CHOクローンを用いる試験では、 I R" ³³⁴と I R^WT との間の顕著な相違は観察されなかった。

ただし、 P I 3—キナーゼに対する親和性では相違が見られた。 I Rの自己リン酸化された Ty r ¹³³⁴は、ホスファチジルイノシトール 3—キナーゼの 85— k Da制御サブユニット（p 85) の SH 2 ドメインとの推定的結合モチーフ (Y (P) XXM) に位置していることが知られている（D. J. Van Horn et al. , J. Biol. Chem. 269:29-32, 1994) 。インスリンに応答する P I 3—キナーゼへの自己リン酸化 I Rの結合によってこの酵素が活性化されるので、このメカ二ズムは I RS— 1による P I 3—キナーゼの活性化の別経路であるかも知れない。本発明者らは先に、 P I 3—キナーゼがグルコーストランスポータータイプ 4

(GLUT 4) の転移を媒介することを報告している（例えば、 F. Kanai et al. , Biochem. Biophys. Res. Comniun. 195:762-768, 1993参照）ので、 I RC 13 34と P I 3_キナーゼの 85との直接的相互作用を試験した。

まず、 P I 3—キナーゼの p 85サブユニットを I R^WT、 I R^A831および I R ^C1334を用いて COS細胞中で一過性に発現させた。インスリン処理の後、細胞溶解物を抗 I R 3抗体（α I R^) または抗 p 85抗体（α ρ 85) のいずれかで沈降させた（図 4) 。免疫沈降物を抗ホスホチロシン抗体（ ΡΥ) (図 4Α) または抗 I Rのサブュニット抗体（な I Rc (図 4 B) を用いるィムノブ口ットにより試験した。一過性発現系においては、インスリン処理によって、 P I 3 —キナーゼの p 85サブュニットのチ口シンリン酸化、ならびに ρ 85の I R^WT への結合が刺激された。抗 I Rひ抗体を用いるィムノブロッ卜で測定したところ、抗 I R 3抗体は、 I R^WT、 I R^A831および I R^{C 1334}をほぼ同定度に沈降させた (図 4B) 。抗 p 85抗体を用いるィムノブロッ卜で測定したところ、抗 p 85 抗体は I R^WT、 I R^A831および I R^C1334をほぼ同定度に沈降させた。

次いで、 p 85および I RiSのチロシンリン酸化、ならびに p 85の I R^WT、 I R^A831および I R^C1334への結合を試験した。抗ホスホチロシン抗体（図 4A) を用いるィムノブ口ッ卜で測定したところ、すべての I Rは同定度に p 85をチ口シン残基でリン酸化した。 I R^C1334のチロシンリン酸化は I R^WTおよび I R^A ⁸³¹と比較して減少しており（図 4A) 、この減少は I R^C1334のチロシンキナーゼ活性の減少と関連していなかった。基質への³² Pの取り込み試験によると、 I R^C1334は自己リン酸化部位および内在基質ポリ（G l u, Ty r) 4 ： 1に対して、 I Rを安定的に発現する CHO細胞中での I R^WTや I R^A831とほとんど同定度のチロシンキナーゼ活性を示すので、抗ホスホチロシン抗体は I のその他の自己リン酸化部位よりも自己リン酸化 Y ¹³³⁴の部位をより良く認識するように思われる。抗 p 85抗体は I R^WTおよび I R^A831を共沈させたが、 I Rdsa は共沈させなかった（図 4B) 。このことは、 I R^C1334が p 85とは結合しないこと、ならびに p 85に対する I Rの主要結合部位は Y ¹³³⁴残基であることを示唆する。実施例 5 ：統計学的処理

正常人 272名を解析して本願発明のヒトインスリンレセプター DN A中 83 1番目の Th rが A 1 aに異した変異ィンスリンレセプター D N Aをもつ者を検索したところこの変異部位をもつ者は見いだされなかつた。そこで力ィ二乗検定による統計学的処理によって本願発明の変異ィンスリンレセプタ一 DNAと N I DDMとの関連性を試験した。この結果を以下の表 1に示す。

インスリンレセプター 3サブュニット T ⁸³ i→ A ⁸³¹変異の

I D DMおよび非糖尿病者における頻度の解析

N I DDM 非糖尿病者 " 計

A⁸³¹ 3²) 0 3

丁831 48 272 320

計 51 272 323

1) 非糖尿病者は OGTTなどの検査を行って診断したものではなく、問診により自身を含め、両親、兄弟姉妹、両祖父母が糖尿病の症状がなく、また糖尿病と診断され通院などもしていな、者を非糖尿病者として扱った。

2) T⁸³¹→A⁸³¹の変異は Ya t e sの連続補正を行ったカイ二乗検定により P (危険率） <0. 05で N I D DM発症に有意に差がある。また N I DDMの自然発症率が 5%と仮定して非糖尿病者 272名のうち 5% (14名）が N I DD Mの T⁸³¹のグループに移行したとしてもなお上記検定にて有意の差がある。実施例 6 ：家系解析

(1) I R^C1334と N I DDM発症との関連

I R^{ei 334}と N I DDM発症との関連を試験するために、 I R^C1334をもつ一家系についてのデータを分析した。

この家系では、母親と次男が糖尿病と診断され、また他の 2人の子供（T. S. および S. K. ) と本人（Y. Y. ) も糖尿病であった（図 5A) 。しかしながら、 T^C (Ty r ¹³³⁴) →TGC (Cy s ¹³³⁴) における対立遺伝子特異的ハイブリダィゼ一シヨンで試験した（図 5B) ところ、このうちの 2人（T. S. および S. K. ) は正常な I R ( I R" 33₄₎ をもっており、本人（γ. γ. ) だけが I R^C1334をもっていた。したがって、この家系解析では、突然変異 I R^c ¹³³⁴がこの家系においては N I DDMの発症の共通原因ではないことを示唆した c

(2) I R^A831と N I DDM発症との関連

I R^A831と N I DDM発症との関連を試験するために、 I R^A831をもつ一家系についてのデータを分析した。父親は死亡しているため変異については確認できなかったが、 N I DDMであったことが分かっている。母親は、高齢のため検査不能であった。また本人を含むその 4人の兄弟のうち、 3人が N I D DMで、 1 人が正常と糖尿病の中間型である I GT ( i mp a r e d g l u c o s e t o l e r an c e) であり、これら 4人すべてが 11^⁸³¹の116 1 6 1* 0 272 0 t eであった。（図 6参照）。なお、 I R^A831の検出は前述した制限酵素 C f 0 Iの特異的切断サイトを生じさせる方法によって行った（図 6B) 。家族間の結婚は除外した。 I R^A831の対立遺伝子は父親に由来すると思われた。この家系解析は、 I R^A831の h e t e r o z y go u s変異が N I DDM発症の原因であることを強く示唆するものである。

【配列表】

配列番号： 1

配列の長さ： 4723 (139-4287) 配列の型：核酸

鎖の数：二本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類： c DNA

配列の特徴

特徴を表す記号： m a t e p t i d e 存在位置： 221. . 4284

配列

140 150 160 170 180

ATGGGCACCGGGGGCCGGCGGGGGGCGGCGGCCGCGCCGCTG

MetGlyTnrGlyGlyArgArgGlyAlaAlaAlaAlaProLeu

190 200 210 220 230 240

CTGGTGGCGGTGGCCGCGCTGCTACTGGGCGCCGCGGGCCACCTGTACCCCGGAGAGGTG

LeuValAlaValAlaAlaLeuLeuLeuGlyAlaAlaGlyHisLeuTyrProGlyGluVal

250 260 270 280 290 300

TGTCCCGGCATGGATATCCGGAACAACCTCACTAGGTTGCATGAGCTGGAGAATTGCTCT

310 320 330 340 350 360

GTCATCGAAGGACACTTGCAGATACTCTTGATGTTCAAAACGAGGCCCGAAGACTTCCGA

VallleGluGlyHisLeuGlnlle!LeuLeuMetPheliysThrArgProGluAspPheArg

370 380 390 400 410 420

GACCTCAGTTTCCCCAAACTCATCATGATCACTGATTACTTGCTGCTCTTCCGGGTCTAT

AspLeuSerPheProLysLeuIleMetlleThrAspTyrLeuLeuLeuPheArgValTyr

430 440 450 460 470 480

GGGCTCGAGAGCCTGAAGGACCTGTTCCCCAACCTCACGGTCATCCGGGGATCACGACTG

GlyLeuGluSerLeiiLysAspLeuPheProAsnLeuThrVallleArqGlySerArqLeu

490 500 510 520 530 540

TTCTTTAACTACGCGCTGGTCATCTTCGAGATGGTTCACCTCAAGGAACTCGGCCTCTAC

PhePheAsnTyrAlaLeuValllePheGluMetValHisLeuLysGluLeuGlyLeuTyr

550 560 570 580 590 600

AACCTGATGAACATCACCCGGGGTTCTGTCCGCATCGAGAAGAACAATGAGCTCTGTTAC

AsnLeuMetAsrilleThrArgGlySerValArglleGluLysAsnAsnGluLeuCysTyr

610 620 630 640 650 660

TTGGCCACTATCGACTGGTCCCGTATCCTGGATTCCGTGGAGGATAATCACATCGTGTTG

LeuAlaThrlleAspTrpSerArqlleLe AspSerValGluAspAsriHisIleVallieu

670 680 690 700 710 720

AACAAAGATGACAACGAGGAGTGTGGAGACATCTGTCCGGGTACCGCGAAGGGCAAGACC

AsnLysAspAspAsnGluGluCysGlyAspIleCysProGlyThrAlaLysGlyLysThr

730 740 750 760 770 780

AACTGCCCCGCCACCGTCATCAACGGGCAGTTTGTCGAACGATGTTGGACTCATAGTCAC

AsnCysProAlaThrVallleAsnGlyGlnPheValGlrArgCysTrpThrHisSerHis

790 800 810 820 830 840

TGCCAGAAAGTTTGCCCGACCATCTGTAAGTCACACGGCTGCACCGCCGAAGGCCTCTGT

850 860 870 880 890 900

TGCCACAGCGAGTGCCTGGGCAACTGTTCTCAGCCCGACGACCCCACCAAGTGCGTGGCC

CysHisSerGluCysLeuGlyAsnCysSerGlnProAspAspProThrLysCysValAla

910 920 930 940 950 960

TGCCGCAACTTCTACCTGGACGGCAGGTGTGTGGAGACCTGCCCGCCCCCGTACTACCAC

CysArgAsnPheTyrLe iAspGlyArgCysValGluThrCysProProProTyrTyrHis 970 980 990 1000 1010 1020

TTCCAGGACTGGCGCTGTGTGAACTTCAGCTTCTGCCAGGACCTGCACCACAAATGCAAG

1030 1040 1050 1060 1070 1080

AACTCGC GAGGCA GGCTG CA CAATA GTCATTCACAACAA AAGTGCATCCCTGAG

1090 1100 1110 1120 1130 1140

TGTCCCTCCGGGTACACGATGAATTCCAGCAACTTGCTGTGCACCCCATGCCTGGGTCCC

CysProSerGlyTyrThrMetAsnSerSerAsnLexaLeuCysThrProCysLeuGlyPro

1150 1160 1170 1180 1190 1200

TGTCCCAAGGTGTGCCACCTCCTAGAAGGCGAGAAGACCATCGACTCGGTGACGTCTGCC

CysPro!LysValCysHisIieuLeuGluGlyGluLysThrlleAspSerValThrSerAla

1210 1220 1230 1240 1250 1260

CAGGAGCTCCGAGGATGCACCGTCATCAACGGGAGTCTGATCATCAACATTCGAGGAGGC

GlnGluLeuArgGlyCysThrVallleAsnGlySerLeuIlelleAsrilleArgGlyGly

1270 1280 1290 1300 1310 1320

AACAA.TCTGGCAGCTGAGCTAGAAGCCAACCTCGGCCTCATTGAAGAAATTTCAGGGTAT

1330 1340 1350 1360 1370 1380

CTAAAAATCCGCCGATCCTACGCTCTGGTGTCACTTTCCTTCTTCCGGAAGTTACGTCTG

LeixLysIleArgArgSerTyrAlaLeuValSerLeuSerPhePheArgLysLeiaArgLeu

1390 1400 1410 1420 1430 1440

ATTCGAGGAGAGACCTTGGAAATTGGGAACTACTCCTTCTATGCCTTGGACAACCAGAAC

ェ leArgGlyGluThrLeuGluIleGlyAsnTyxSerPheTyrAlaLeuAspAsnGlnAsn

1450 1460 1470 1480 1490 1500

CTAAGGCAGCTCTGGGACTGGAGCAAACACAACCTCACCACCACTCAGGGGAAACTCTTC

LeiiArgGlnLeuTrpAspTrpSerLysHisAsnLeuThrThrThrGlnGlyLysLeuPhe

1510 1520 1530 1540 1550 1560

TTCCACTATAACCCCAAACTCTGCTTGTCAGAAATCCACAAGATGGAAGAAGTTTCAGGA

PheHisTyrAsnProLysLeuCysLeuSerGluIleHisLysMetGluGluValSerGly

1570 1580 1590 1600 1610 1620

ACCAAGGGGCGCCAGGAGAGAAACGACATTGCCCTGAAGACCAATGGGGACAAGGCATCC

ThrLysGlyArgGlnGluArgAsnAspIleAlaLeuLysThrAsnGlyAspLysAlaSer

1630 1640 1650 1660 1670 1680

TGTGAAAATGAGTTACTTAAATTTTCTTACATTCGGACATCTTTTGACAAGATCTTGCTG

CysGluAsnGluLeuLeuLysPheSerTyrlleArg rSerPheAspLysIleLeuLeu

1690 1700 1710 1720 1730 1740

AGATGGGAGCCGTACTGGCCCCCCGACTTCCGAGACCTCTTGGGGTTCATGCTGTTCTAC

Arg rpGluProTyrTrpProProAspP eArgAspLeuLeuGlyPheMetLeuP eTyr

1750 1760 1770 1780 1790 1800

AAAGAGGCCCCTTATCAGAATGTGACGGAGTTCGATGGGCAGGATGCGTGTGGTTCCAAC

LysGluAlaProTyrGlnAsnValThrGluPheAspGlyGlnAspAlaCysGlySerAsn 1810 1820 1830 1840 185Q 1860

AGTTGGACGGTGGTAGACATTGACCCACCCCTGAGGTCCAACGACCCCAAATCACAGAAC

SerTrpThrValValAspェ leAspProProLeuArgSerAsnAspProLysSerGlnAsn

1870 1880 1890 1900 1910 1920

CACCCAGGGTGGCTGATGCGGGGTCTCAAGCCCTGGACCCAGTATGCCATCTTTGTGAAG

HisProGlyTrp!LeuMetArgGlyLeuLysProTrpThrGlnTyrAlallePheValLys

1930 1940 1950 1960 1970 1980

ACCCTGGTCACCTTTTCGGATGAACGCCGGACCTATGGGGCCAAGAGTGACATO^TTTAT Thr!LeuValThrPheSerAspGluArgArg hrTyrGlyAlaLysSerAspェ lelleTyr

1990 2000 2010 2020 2030 2040

GTCCAGACAGATGCCACCAACCCCTCTGTGCCCCTGGATCCAATCTCAGTGTCTAACTCA

2050 2060 2070·. 2080 2090 2100

TCATCCCAGATTATTCTGAAGTGGAAACCACCCTCCGACCCCAATGGCAACATCACCCAC

SerSerGlnllelleiLeuLysTrpIiysPiroPj oSerAspPrOAsnGlyAsi IleThirHis

2110 2120 2130 2140 2150 2160

TACCTGGTTTTCTGGGAGAGGCAGGCGGAAGACAGTGAGCTGTTCGAGCTGGATTATTGC

2170 2180 2190 2200 2210 2220

CTCAAAGGGCTGAAGCTGCCCTCGAGGACCTGGTCTCCACCATTCGAGTCTGAAGATTCT

LeuLysGlyLeuLysLeuProSerArg hrTrpSerProProPheGl SerGluAspSer

2230 2240 2250 2260 2270 2280

CAGAAGCACAACCAGAGTGAGTATGAGGATTCGGCCGGCGAATGCTGCTCCTGTCCAAAG

GlnLysHisAsnGlnSerGluTyrGluAspSerAlaGlyGluCysCysSerCysProLys

2290 2300 2310 2320 2330 2340

ACAGACTCTCAGATCCTGAAGGAGCTGGAGGAGTCCTCGTTTAGGAAGACGTTTGAGGAT

ThrAspSerGlnlleLeuLysGliiLeuGluGluSerSerPheArqLYSThrPheGliaAsp

2350 2360 2370 2380 2390 2400

TACCTGCACAACGTGGTTTTCGTCCCCAGAAAAACCTCTTCAGGCACTGGTGCCGAGGAC

TyrLeuHisAsnValValPheValProArgLysThrSerSerGlyThrGlyAlaGluAsp

2410 2420 2430 2440 2450 2460

CCTAGGCCATCTCGGAAACGCAGGTCCCTTGGCGATGTTGGGAATGTGACGGTGGCCGTG

ProArgProSerArgLysArgArgSerLeuGlyAspValGlyAsnValThrValAlaVal

2470 2480 2490 2500 2510 2520

CCCACGGTGGCAGCTTTCCCCAACACTTCCTCGACCAGCGTGCCCACGAGTCCGGAGGAG

ProThrValAlaAlaPheProAsnThrSerSerThrSerValProT rSerProGluGlu

2530 2540 2550 2560 2570 2580

CACAGGCCTTTTGAGAAGGTGGTGAACAAGGAGTCGCTGGTCATCTCCGGCTTGCGACAC

HisArgProPheGluLysValValAsnLysGluSerLeuVallleSerGlylieuArgHis

2590 2600 2610 2620 2630 2640

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CTCCGTTCTCTGCGGCCAGAGGCTGAGAATAATCCTGGCCGCCCTCCCCCTACCCTTCAA

3550 3560 3570 3580 3590 3600

GAGATGATTCAGATGGCGGCAGAGATTGCTGACGGGATGGCCTACCTGAACGCCAAGAAG

3610 3620 3630 3640 3650 3660

TTTGTGCATCGGGACCTGGCAGCGAGAAACTGCATGGTCGCCCATGATTTTACTGTCAAA

3670 3680 3690 3700 3710 3720

ATTGGAGACTTTGGAATGACCAGAGACATCTATGAAACGGATTACTACCGGAAAGGGGGC

IleGlyAspPheGlyMetThrArgAspIleTy GluThrAspTyjrTyrArgLysGlyGly

3730 3740 3750 3760 3770 3780

AAGGGTCTGCTCCCTGTACGGTGGATGGCACCGGAGTCCCTGAAGGATGGGGTCTTCACC

3790 3800 3810 3820 3830 3840

ACTTCTTCTGACATGTGGTCCTTTGGCGTGGTCCTTTGGGAAATCACCAGCTTGGCAGAA

3850 3860 3870 3880 3890 3900

CAGCCTTACCAAGGCCTGTCTAATGAACAGGTGTTGAAATTTGTCATGGATGGAGGGTAT

GlnProTyrGlnGlyLeuSerAsnGluGlnValLeioLysPheValMetAspGlyGlyTyr

3910 3920 3930 3940 3950 3960

CTGGATCAACCCGACAACTGTCCAGAGAGAGTCACTGACCTCATGCGCATGTGCTGGCAA

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3970 3980 3990 4000 4010 4020

TTCAACCCCAAGATGAGGCCAACCTTCCTGGAGATTGTCAACCTGCTCAAGGACGACCTG

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CACCCCAGCTTTCCAGAGGTGTCGTTCTTCCACAGCGAGGAGAACAAGGCTCCCGAGAGT

HisProSerPheProGluValSerPheP eHisSerGluGluAsnLysAlaProGluSer

4090 4100 4110 4120 4130 4140

GAGGAGCTGGAGATGGAGTTTGAGGACATGGAGAATGTGCCCCTGGACCGTTCCTCGCAC

GluGl xLeuGlij etGluPheGluAspMetGluAsnValProLeuAspArgSerSerHis

4150 4160 4170 4180 4190 4200

TGTCAGAGGGAGGAGGCGGGGGGCCGGGATGGAGGGTCCTCGCTGGGTTTCAAGCGGAGC

CysGlnArgGluGluAlaGlyGlyArgAspGlyGlySerSerLeuGlyPheLysArgSer

4210 4220 4230 4240 4250 4260

TACGAGGAACACATCCCTTACACACACATGAACGGAGGCAAGAAAAACGGGCGGATTCTG

4270 4280

ACCTTGCCTCGGTCCAATCCTTCCTAA

ThrLeuProArgSerAsnProSer***

Claims

請求の範囲

1. ヒトインスリンレセプター DN A中 831番目の Th rをコードする塩基配列が A 1 aをコードする塩配列に変異および/または 1334番目の Ty rをコードする塩基配列が C y sをコードする塩基配列に変異した変異ヒトインスリンレセプター DNA、あるいは該変異部分を含む上記変異ヒトインスリンレセプター DNA断片。

2. ヒ卜インスリンレセプター DNA中、 /3サブユニットェクソン 13の 831 番目の Th rをコードする塩基配列（ACG) が A 1 aをコードする塩基配列 (GCG) に変異した請求項 1記載の変異ヒトインスリンレセプター DNAまたは該変異部分を含むその断片。

3. ヒトインスリンレセプター DNA中、サブユニットェクソン 22の 133 4番目の Ty rをコードする塩基配列（TAC) が C y sをコードする塩基配列 (TGC) に変異した請求項 1記載の変異ヒトインスリンレセプター DNAまた 'は該変異部分を含むその断片。

4. P I 3—キナーゼと結合しない請求項 1記載の変異ヒトインスリンレセプタ —DN Aまたは該変異部分を含むその断片。

5. 請求項 1記載の変異ヒトインスリンレセプタ一 DNAと相補的な DNAまたは該変異部分を含むその断片。

6. 請求項 1から 5のいずれか 1項に記載の変異ヒトインスリンレセプター断片よりなるインスリン非依存型糖尿病診断用プローブ。

7. 請求項 1から 5のいずれか 1項に記載の変異ヒトインスリンレセプタ一断片を含むィンスリン非依存型糖尿病診断剤。