WO1995009009A1 - Excipient constitue d'acides polyamines pour oligonucleotide - Google Patents

Excipient constitue d'acides polyamines pour oligonucleotide Download PDF

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Minenobu Okayama
Yosuke Suzuki
Akira Wada
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Hisamitsu Pharmaceutical Co., Inc.
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    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)

Definitions

  • the present invention relates to a polyamino acid oligonucleotide carrier. More specifically, the present invention relates to a plasmid DNA vector that integrates a drug oligonucleotide into a chromosome and expresses it as RNA in cells, A novel and novel method useful in the transport of drugs containing an oligonucleotide as an active ingredient, which has a specific inhibitory function against mRNA transcribed from the viral gene. It relates to a polyamino acid carrier.
  • oligonucleotides for example, antisense oligomers
  • in vitro tests have included chemical studies on the stability of oligonucleotides to solvents and the selection of target base sequences for antisense sesame, etc.
  • Numerous results of basic research on membrane permeability, longevity, nuclease resistance, intracellular distribution, etc. of oligonucleotides using E. coli have been reported.
  • the selection of the carrier substance is extremely important along with the progress of these basic researches.
  • this carrier is a product of Carrier Complex, which is disadvantageous in the pharmacokinetics of administration routes such as intravenous injection. Eliminating positive charges, establishing an efficient targeting system including cell membrane permeability, improving the longevity and stability of oligonucleotide drugs by carriers, and Increasing the efficiency of uptake into cells has become an important issue.
  • oligonucleotides are very unstable themselves and are susceptible to decomposition by external conditions, so that they are stable and efficient. Research is also being actively conducted on the development of a drug delivery carrier (Drug Delivery Carrier) for transporting to other locations.
  • Drug Delivery Carrier Drug Delivery Carrier
  • Liposome is a structure having a lipid bilayer structure similar to a biological membrane.
  • a chemical modification of the liposome can improve this chemical. Or increased specificity for cells
  • ribosome microparticles have the disadvantage of having a short half-life in blood. Therefore, recently, chemical stability such as oxidative stability, biological stability, and the chemical stability of colloids have been improved, and new half-lives have been developed. Generation ribosomes and imino ribosomes (with antibodies embedded in the surface of the ribosome) are being developed, but they still have practical problems. Has not been resolved.
  • oligonucleotides are anionic, they can be used to convert cationic natural proteins or cationic synthetic poly- orides.
  • oligonucleotides can be used to convert cationic natural proteins or cationic synthetic poly- orides.
  • poly-L-Lys is a well-known drag carrier (H.J.P.Ryser and W.S.
  • PLL with a molecular weight of 14,000 or less has no cytotoxicity (JP Leone 11i, et al., Bioconjugate Chem. 1, 149-153 (1990)), but this case is not suitable as a drug carrier due to metabolic problems.
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and a cationic polymer such as PLL is capable of binding to anionic oligonucleotides.
  • a cationic polymer such as PLL is capable of binding to anionic oligonucleotides.
  • the complex is cationic and more cytotoxic.
  • the present invention solves the above-mentioned problems, and provides a polyamino acid oligoamino acid consisting of a polylysine: a serine random copolymer. Provide creative careers.
  • the carrier has a lysine: serine composition ratio of 5: 1 to 1: 3, and a weight average molecular weight of 3,000. To 35,000 polyamino acids are also provided as such embodiments.
  • the polyaminoacidic carrier of the present invention forms a stable complex in a homogeneous state by binding to oligonucleotides, and furthermore, it is possible to obtain human cells. In the middle (pH 5.0), it releases oligonucleotide drugs efficiently.
  • FIGS. 1 (a) and 1 (b) are primary structural formulas showing oligonucleotides DRD12 and R32 used in the examples.
  • FIG. 2 shows the relationship between the absorbance and the concentration of a polyamino acid formed in an ionic complex with an oligonucleotide.
  • FIG. 3 shows the results of electrophoresis of the oligonucleotide complexed with the PLS carrier of the present invention.
  • FIG. 4 shows the complex formation concentrations of the polyamino acid carrier and the oligonucleotides R32 and DRD12.
  • Figure 5 shows a polyamino acid carrier and an oligonucleotide. 2 shows the concentration of complex formation with pU119.
  • FIGS. 6 (a), (b), and (c) show the results of capillary electrophoresis of a polyamino acid carrier, respectively.
  • FIGS. 7 (a) and 7 (b) show the results of electrophoresis of PLS (3Z1) and R32 reacted with PLS (1/1), respectively.
  • FIG. 8 shows the undegraded rate of oligonucleotide complexed with a polyamino acid carrier in human serum over time.
  • FIG. 9 shows the relationship between pH and the release rate of oligonucleotide R32 complexed with a polyamino acid carrier.
  • FIG. 10 shows the relationship between the release rate of the oligonucleotide pU 19 complexed with the polyamino acid carrier and pH.
  • This polyamino acid is a poly (amino acid) compound composed of a random copolymer of polylysine and serine, and is an oligonucleoside. It is useful for in vivo carrier such as an otide drug, particularly an antiviral agent.
  • the polyamino acid carrier of the present invention is characterized in that the side chain of serine (Ser) is rich in hydrophilicity, and the cationic polyamino acid into which it has been inserted is a polyamino acid carrier. It forms a stable zwitterionic complex without forming precipitates with lignonucleotides. Even at acidic pH, once bound oligonucleotides are efficiently released.
  • Ser serine
  • Such a polyamino acid carrier is, for example, It can be expressed by the general formula (1).
  • the number of Ser residues and the place of introduction are not limited, and m and n are integers.
  • the Lys: Ser composition ratio is about 5: 1 to 1: 3, but about 3: 1 or 1.:1 is more preferable.
  • This compound can be prepared by known methods (Rajendra, BR, et al., Human Genetics, 55, 3633 (1980)., Lim, F. and Sun, A, M., Science, 210, 908 (1980)). It can be manufactured.
  • oligonucleotides forming a complex with a carrier.
  • Fig. 1 (a, b) were converted to a DNA synthesizer (Applied Biosystems, Type 3). Synthesized using 8 OB or type 39.2).
  • A is for Adenine Nucleotide
  • G is for Guanin Nucleotide
  • C is for Cytosine Nucleotide
  • Peracil Nucleotide is Is written as U.
  • FIG. 1 shows a linear chimera oligonucleotide (DRD12) consisting of 12 bases. A significant part of the main chain consists of DNA, but only three bases of GUC near the center consist of RNA.
  • Figure 2 shows a 32 base force, such as a ribonucleotide (R32), which is expected to form a partially dense secondary structure.
  • R32 ribonucleotide
  • a known plasmid pUl19 (3162 base pairs) was used as the high molecular weight oligonucleotide.
  • the oligonucleotide electrophoreses in the positive charge direction due to its negatively charged phosphate group.
  • a positively charged polyamino acid is added to a negatively charged oligonucleotide
  • the oligonucleotide is added with an increase in the concentration of the addition. Negative charge And the mobility of oligonucleotides is consequently reduced.
  • PLS 3/1 was added to the oligonucleotide DRD12 and allowed to bind, followed by electrophoresis, and the mobility was evaluated.
  • Figure 3 shows the results. All experimental manipulations on the complex were performed after mixing the polyamino acid and the oligonucleotide solution, followed by a sufficient reaction with stirring for about 15 minutes.
  • oligonucleotides that form secondary structures such as stem-loop structures, when compared to linear ones, have an antisense that targets the stem region, for example. It is known that it hardly binds to molecules. This is to be expected in the case of the carrier of the present invention. Therefore, it was examined to what extent the molecular weight and the three-dimensional structure of the oligonucleotide influence the binding of the oligonucleotide to the polyamino acid. This is shown in Fig. 1 (a).
  • oligonucleotides (b) are used to determine the concentration of these and the polyamino acids and how many complexes they form by membrane separation. Performed by measurement method
  • the binding of the oligonucleotide to the PLS of the present invention has no effect on the conformation of the oligonucleotide.
  • the binding of PLS to any of the oligonucleotides increases with increasing PLS concentration, and ultimately the amount of PLS-DRD12 or PLS-R32 complex formed is increased. It was 100%.
  • PLS (1/1) containing equivalent amounts of Lys and Ser formed a 100% complex with DRD12 or R32 in speed and power. This is because the insertion of Ser residues with a flexible backbone increases the flexibility of the entire PLS, and as a result, the oligonucleic acid has a specific tertiary structure.
  • the novel carrier of this invention is the drug oligonucleotide. It was clear that we didn't limit our. This result suggests that the carrier of the present invention is particularly useful for the intracorporeal transport of antisense drugs and ribosome drugs, for which research data is rapidly increasing in recent years. It shows.
  • the evaluation of the carrier system emphasizes the effect of charges on the living body (mainly positive charges), so the PLS carrier without the charges of the present invention is important.
  • the toxicity is particularly low for cells, suggesting that it is significant as a novel in vivo drug carrier.
  • PLS (3/1) and PLS (1Z1) solutions (1/1 Z1) were prepared by diluting the PLS stock solution adjusted to IE-4M with a phosphate buffer in the same buffer. concentration: 1 was produced X 1 0 one 4 M). Subsequently, 3 2 P - solution of ATP labeled with o re Gore j click Les Ochi de (Li Bozai arm R 3 2) (Concentration: 0. 25 ⁇ g / 1) to the above solution was added, various Mixing ratio of complex solution It was made.
  • the mixture After adjusting and mixing the added amount of the complex solution of PLS and oligonucleotide so that the final concentration of the human serum solution is 90%, the mixture is mixed at 37 ° C. Incubated with The sampling solution at the appropriate time is adjusted for pH to about 5.0 by adding the required amount of 1N hydrochloric acid, and then used for ultrafiltration with a molecular weight of 10,000 in the membrane fraction. Transferred to a tube (Millipore / Limited Drift Free C3 — GCUFC3 TGC00 0 centrifugal tube with a finalizer). After removing the RNase by centrifugation at 5,000 rpm for 15 minutes, the filtered solution is used for analysis.
  • FIG. 7 (a) shows the results for PLS (3/1), and lane 5 shows the degradation pattern of R32 present in human serum over time.
  • the knob visible at the top of the gel is undegraded R32, and the slight knob at the bottom is R3 degraded by ribonucleases. It is 2.
  • PLS (3/1) was used, no degradation of R32 was observed until 0.08 hours, but as time passed. Accompanying this, the amount of decomposition of R32 increased. Undegraded R32 after 24 hours was less than half of that after 0.08 hours.
  • FIG. 7 (b) shows a similar result for PLS (1/1), and the band intensity of undecomposed R32 after 24 hours is almost the same as that after 0 hour. The lower band indicating the presence of R32 dissociated from the carrier was hardly observed.
  • the remaining RNA is measured by a bio-imaging analyzer (FUJIFILM; BA100), and the remaining RNA is analyzed. The amount of oxide was used. As a control, a PLL solution was also tested in the same manner.
  • FIG. 8 shows the results of these studies.
  • oligonucleotides In human serum at a final concentration of 90%, free (uncomplexed) oligonucleotides are usually degraded in a very short time, but polyamino It was confirmed that the oligonucleotide which formed a complex with the acid carrier was hardly decomposed. However, oligonucleotides complexed with PLL degraded with time, and complete oligonucleotides were not observed 24 hours later.
  • the cationic PLS carrier of the present invention produced a precipitate due to the binding to the oligonucleotide drug. Not only that, it also shows that it greatly contributes to the stabilization of the oligonucleotide drug administered to the living body. In addition, it was strongly suggested that an increase in the content of Ser residues effectively affects the function of PLS as a carrier.
  • a PLL has a 100% helix structure under strong alkaline conditions, but it is unlikely to have a random coil structure of approximately 100% under acidic conditions.
  • PLS a random copolymer of PLL
  • PLS induces more helical structures near PH7 than PLL, but the helical content below pH 5 is higher than PLL. It was almost the same. This is because in blood (pH 7.0), many of the PLS helix structures protect oligonucleotides from nucleases and become intracellular. It shows the potential to release oligonucleotide drugs as soon as the lysosome (pH 5.0) is reached.
  • the oligonucleotide R labeled with PLS ( 31 ) and PLS (11) solution and 32 P_ATP 3 2 Solution (5 pmo 1 / mI) to prepare these complex solutions.
  • 1N hydrochloric acid or 1N Na ⁇ ⁇ H is added to adjust the pH, and the complex is brought under the environment of about 3 powers of PH and up to about 10 pH.
  • the composite solution was prepared as follows. These solutions are used in ultrafiltration tubes (Centrifugal tubes with Nippon Millipore Limited Limited C3-GCUFC 3 TGCOO Fluorescent Tube). And centrifuged at 5,000 rotations for 15 minutes.
  • Oligonucleotides complexed with the polyamino acid carrier begin to be released from the carrier at a pH of 6 or less, and the acidic p-type In the vicinity of H 3, the PLS carrier of the present invention has an oligonucleotide dissociation of 100%, whereas the dissociation of the PLL carrier is 75%. %.
  • the difference between PLL and PLS was remarkable when the pH was about 5.0, which is the same condition as the lysosome.
  • oligonucleotides such as the viral disease suppressor gene delivered into cells by the PLS carrier of the present invention are lysosomal. Due to the pH of the room, it can be separated from the PLS carrier and exert its own function.
  • a high molecular weight oligonucleotide pU119 was also examined in the same manner. The results are shown in Figure 10. In the acidic region (PH 3), only PLS (1: 1) released 100% of pU 199. Also, although the PLS (31) was not 100%, it exhibited better emission performance than the PLL. At pH 5, which is the same as that of the lysosomes, the difference between PLS and PLL was remarkable. Based on these results, the carrier PLS of the present invention can be used not only for antisense drugs and ribozyme drugs, but also for intracorporeal transport of plasmid expression vectors. It was confirmed that it was useful.
  • the oligonucleotide carrier of the present invention binds to oligonucleotide without causing precipitation, and binds only once. To release the oligonucleotides into cells in a smooth manner, so that it can be used for various genetic diseases or for viral diseases such as AIDS. It is useful as a carrier for in vivo delivery of therapeutic drugs. In addition, it greatly contributes to the creation of various useful plants and animals by genetic engineering technology, including virus-resistant plants o

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Description

明 細 書 ポ リ ア ミ ノ 酸オ リ ゴ ヌ ク レ オチ ドキ ヤ リ ャ一 技術分野
こ の発明は、 ポ リ ア ミ ノ 酸オ リ ゴ ヌ ク レ オチ ドキ ヤ リ ャ — に関す る も のであ る。 さ ら に詳 し く は、 こ の発明は、 薬 物ォ リ ゴ ヌ ク レ オチ ドを染色体に組み込ま せて細胞内で R N A と して発現さ せる プラ ス ミ ド D N Aベ ク タ ーや、 ウ イ ルス遺伝子よ り 転写さ れる m R N Aに対 して特異的な抑制 機能を有す る ォ リ ゴ ヌ ク レ オチ ドを有効成分 とする薬物を 輸送す る場合等において有用な、 新規な ポ リ ア ミ ノ 酸キ ヤ リ ヤー に関す る も のであ る。
背景技術
近年、 オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド （た と えば、 ア ン チ セ ン ス ォ リ ゴマー ： Ant i sense oligomer) を医薬品 と して用 い る た めの基礎研究が活発に展開 さ れて き てお り 、 その可能性を 具体的に探索す る段階に入 っ てい る。 実際に、 試験管内試 験では、 オ リ ゴ ヌ ク レ オチ ドの対溶媒安定性やア ン チセ ン スォ リ ゴマ 一等に対す る標的塩基配列の選択な どに関する 化学的研究や、 細胞株を使用 したオ リ ゴ ヌ ク レ オチ ドの膜 透過性、 寿命、 ヌ ク レ ア ーゼ耐性、 細胞内分布等に関す る 基礎的研究の成果が数多 く 報告さ れてい る。 オ リ ゴ ヌ ク レ オチ ドの医薬品 と しての利用 については、 こ れ らの基礎的研究の進展 と と も に、 そのキ ヤ リ ヤ ー物質 の選択が極めて重要であ る こ とが考慮さ れて き てお り 、 こ のキ ヤ リ ヤ ー物質の開発 と そのための問題点の解決は現実 的に不可避の課題にな っ てい る。 た と えば具体的に も、 こ のキ ヤ リ ヤ ー については、 静注な どの投与経路の体内動態 上不利にな る キ ヤ リ ャ一 コ ン プ レ ツ ク ス（Carri er Complex) の正電荷の排除、 細胞膜透過性を含めた効率の良いタ ー ゲ ッ ティ ン グシステムの確立、 キ ヤ リ ヤー に よ る オ リ ゴ ヌ ク レ オチ ド薬物の寿命 と安定性の向上お よ び細胞への取 り 込 み効率の増加等が重要な課題にな っ ている。
こ れま でに、 オ リ ゴ ヌ ク レ オチ ドはそれ自身が非常に不 安定であ り 、 外的条件に よ り 分解さ れやすい こ とか ら、 こ れを安定かつ効率よ く 目 的の場所へ運ぶための ドラ ッ グデ リ ノく リ ーキ ャ リ ヤ ー （Drug Delivery Carrier) の開発のた めの研究が精力的に行われて も い る。
こ れ ま での研究や開発の経緯を概観する と、 従来の技術 に は生体膜類似の脂質二分子膜構造を有する構造体であ る リ ボ ソ ー ム （Li posome)に よ る も のが多い。 た とえば、 リ ポ ソ ー 厶 にオ リ ゴ ヌ ク レ オチ ド薬物を封入 して安定性をはか る と 同時に、 リ ボ ソ ー ムの化学修飾に よ り こ れの化学的 も し く は細胞に対す る特異性を増すな どの報告例があ る
(Alain R . Thierry and Ana t o 1 y Dr i t schi 1 o, Nucleic Acids Research, 20， 5691-5698(1992). ) 0
しか しなが ら、 こ れ ら リ ボ ソ ー ム の微粒子は血液中での 半減期が短い と い う 欠点があ る。 そ こ で、 最近では、 酸化 安定性な どの化学的安定性や生物的安定性、 さ ら に コ ロ イ ド化学的安定性の改良がな さ れて き てお り 、 半減期の長い 新世代 リ ボ ソ ー ム.やィ ム ノ リ ボ ソ ー ム （抗体を リ ボ ソ ー ム 表面に埋め込んだ も の） な ど も 開発 さ れつつあ る が、 依然 と して実用上の問題は解消 さ れていない。
一方、 オ リ ゴ ヌ ク レ オチ ドがァ二オ ン性であ る こ と を利 用 して、 こ れをカ チオ ン性の天然蛋白質 も し く はカ チオ ン 性の合成ポ リ ア ミ ノ 酸へ結合 さ せ、 生成さ れた イ オ ン性複 合体を 目 的の細胞 も し く は細胞内へデ リ バ リ ー し ょ う とす る研究報告が急速に増えてい る （Nature, 271, 130- 135 (1978). , J. Biol. Chem. , 262， 4429-4432(1987). , J. Biol. Chem. , 263, 14621 - 14624 ( 1988). , Pro Natl.
Acad. Sci. USA, 87, 87， 3410-3414(1990). ) 。 こ れ ら の 研究は、 オ リ ゴ ヌ ク レ オチ ドが、 た とえば リ ジ ン （ L y s ) 残基の ε ァ ミ ノ 基の よ う な ァ ミ ノ 酸の力 チオ ン性側鎖に電 荷的に結合 し、 比較的安定な複合体を形成す る （Lemai tre， M.， et aに Pro Natl. Acad. Sci. USA 84， 648-651 ( 1987). )こ と に着 目 してレ、 る も のであ る。 し力、 しな力 ら、 こ れ らの複合体はその形成に よ り 沈澱を生 じ る と い う 問題 があ る。 こ のため、 全ての検討においてカ チオ ン性の不均 一複合体 と して行われて い る と い う 限界があ っ た。
た と え ば、 ポ リ — L — L y s ( P L L ) は良 く 知 ら れ る ド ラ ッ グ . キ ヤ リ ヤ ー であ る （H. J. P. Ryser and W.
Shen, Pro Natl. Acad. Sci, USA. , 75, 3867-3870 ( 1978).：)。 ま た、 P L L と オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド と の複合体 は生物学的 に非常 に安定であ り 、 P L L と の複合体形成に よ り オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ドは ヌ ク レ ア ー ゼに対 して安定に存 在す る こ と が知 ら れて い る （B. Bayard, et al.， Eur. J. Biochem. 151 , 319-325 ( 1985). ) 。 しか しなが ら、 P L L と ォ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ドの結合 に関す る 両者の混合濃度は、 沈澱の問題に よ っ て限定 さ れ る こ と にな る 。 も ち ろ ん、 こ の こ と は他方で、 複合体の沈澱の問題解消が両者の混合濃 度の増加を可能 と し、 結果的に オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ドの安定 性を上げ る 可能性を意味 して い る 。
ま た、 オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ドは P L L と の複合体形成に よ り 細胞への取 り 込みが促進 さ れ る と の報告があ り （Wu, G. Y. and Wu， に H. , J. Biol, Chem, 27， 887-892(1988). ) P L L の部分的な化学修飾に よ り 種 々 の細胞に対す る 特異 性力 増加す る （E. Wanger, et al . , Pro Natl. Acad.
Sci. USA, 87， 3410-3414 ( 1990). ) こ と も 報告 さ れて い る ， そ の作用機構は未だ明 らかでな いが、 P L L が細胞膜に作 用 してオ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ドの進入を助 け る と い う 報告や、 P L L と オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ドが共有結合 に よ り 形成 し た複 合体は結果 と して細胞膜への親和性を高め る な どの報告 も あ る （M. Fechhe imer , e t a 1. , Pro Natl. Acad. Sc i . USA, 84， 8463-8467 ( 1987)) 。 しか しなが ら、 先の沈澱生 成等の問題は こ の よ う な報告がな さ れていて も、 依然 と し て解消 さ れていない。
さ ら に問題 と しては、 P L L の細胞毒性に関す る報告が 多い（J. P. Leone 11 i , e t a 1. , Bio-conjugate Chem.
1, 149- 153(1990).)こ と も指摘さ れる。 Zhouら は P L し の 立体異性体であ る ポ リ — D — L y s ( P D L ) を使 っ て、 こ れ とオ リ ゴ ヌ ク レ オチ ド と の複合体を、 P L L と のそれ に比較 している。 その結果、 P D L と オ リ ゴ ヌ ク レ オチ ド の複合体は P L L と のそれに比べて生物学的に安定であ る が、 細胞に対する毒性が高い こ と を報告 してい る （X. Zhou et al. , Bi ochim. Bi ophys. Acta, 1065， 8 - 1 ( 1991 ) . ) 0 細胞毒性に関 しては、 P L L と の複合体が P D L と のそれ よ り 低い こ と は こ の よ う に確認さ れる が、 依然 と して細胞 毒性の問題は解消 さ れていない。 ま た、 細胞毒性の観点か ら は、 分子量 1 4 ， 0 0 0 以下の P L L は細胞毒性を も た ない と の幸艮告（J. P. Leone 11 i , et al . , Bio- conjugate Chem. 1， 149- 153 ( 1990) . )も あ る が、 こ の場合は、 代謝の 問題か ら薬物キ ヤ リ ヤ ー と して は不適当であ る。
Degolsら は H I V (Human Immunodeficiency Virus) - 1 の t a t の m R N Aに相補的なア ン チ セ ン ス鎮を合成 し、 こ れ と P L L と の複合体の t a t 遺伝子抑制効果を検討 し た。 そ の結果、 in vitroでは、 複合体はア ンチセ ン ス単独 の場合に比べて 1 0 0 倍以上の活性を示 した こ と を確認 し て レヽ る （P. Degols, et a 1. , Antiviral Res. , 17， 279-28 1 ( 1992). ) 。 こ の よ う に、 P L L の併用 は、 確かに遺伝子 抑制効果があ る とみなす こ とができ る。
し力、 しな力 ら、 現状では、 P L L と オ リ ゴ ヌ ク レ オチ ド と の複合体は非常に凝集 しやすい（J. P. Leonetti, et al. GENE, 72， 323-332( 1988). ) と い う 大き な問題があ る。 こ の理由か ら、 こ れ ら カ チオ ン性の天然夕 ンパ ク 質お よ び力 チオ ン性の合成ポ リ ア ミ ノ 酸を、 薬剤キ ヤ リ ヤ ー （Drug Carrier)な どの生体に関わ る用途に使用す る こ と は考え難 い と さ れて き た。 それ故、 こ の よ う な状況か ら、 安定な複 合体形成後 も沈澱する こ と のな い、 新 しい生体内輸送オ リ ゴ ヌ ク レ オチ ドキ ヤ リ ヤー の開発が待たれていた。
発明の開示
こ の発明は以上の通 り の事情に鑑みてな さ れた も のであ つ て、 P L Lな どのカ チオ ン性高分子化合物はァニオ ン性 のオ リ ゴ ヌ ク レ オチ ド と の結合に よ り たやす く 沈澱物を生 じやす く 、 沈殿物が生 じない両者の低い混合濃度で形成 し た複合体の場合にはカ チオ ン性であ り 細胞毒性を もっ と レ、 う 従来技術の欠点を克服 し ·、 均一系で形成さ れる複合体を 構成 し、 かつ薬物キ ヤ リ ヤ ー と しての機能を効果的に高め る こ と ので き る 、 新 し レ、 ポ リ ア ミ ノ 酸オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド キ ヤ リ ヤ ー を提供す る こ と を 目 的 と して い る 。
こ の発明は、 上記の課題を解決す る も の と して、 ポ リ 一 リ ジ ン ： セ リ ン ラ ン ダム コ ポ リ マ ーか ら な る ポ リ ア ミ ノ 酸 オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ドキ ヤ リ ャ 一 を提供す る 。
そ して、 こ の発明 に お いて は、 こ のキ ヤ リ ャ 一 と して、 リ ジ ン ： セ リ ン構成比が 5 ： 1 〜 1 ： 3 、 重量平均分子量 が 3 ， 0 0 0 〜 3 5 ， 0 0 0 の ポ リ ア ミ ノ 酸をそ の態様 と して も 提供す る 。
こ の発明の ポ リ ア ミ ノ 酸性のキ ヤ リ ャ 一 は， オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド と の結合に よ り 、 均一状態で安定な複合体を形成 し、 ま た ヒ ト 細胞中 （ p H 5 . 0 ) では、 オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド薬物を効率 よ く 放出す る 。
図面の簡単な説明
図 1 ( a ) ( b ) は、 実施例に用 いた オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド D R D 1 2 お よ び R 3 2 を示 した一次構造式であ る 。 図 2 は、 オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド と イ オ ン性複合体形成 した ポ リ ア ミ ノ 酸の濃度 と 吸光度 と の関係 を示す。
図 3 は、 こ の発明の P L S キ ヤ リ ヤ ー と複合体形成 した ォ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ドを電気泳動 し た結果を示す。
図 4 .は、 ポ リ ア ミ ノ 酸キ ヤ リ ヤ ー と オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド R 3 2 お よ び D R D 1 2 と の複合体形成濃度を示す。
図 5 は、 ポ リ ア ミ ノ 酸キ ヤ リ ヤ ー と オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド p U 1 1 9 と の複合体形成濃度を示す。
図 6 ( a ) ( b ) ( c ) は、 各 々 、 ポ リ ア ミ ノ 酸キ ヤ リ ヤーをキ ヤ ビラ リ 一電気泳動 した結果を示す。
図 7 ( a ) ( b ) は、 各々 、 P L S ( 3 Z 1 ) お よ び P L S ( 1 / 1 ) と反応さ せた R 3 2 を電気泳動 した結果を 示す。
図 8 は、 ポ リ ア ミ ノ 酸キ ヤ リ ヤー と複合体形成 したオ リ ゴ ヌ ク レ オチ ドの人血清中にお ける経時的未分解率を示す。
図 9 は、 ポ リ ア ミ ノ 酸キ ヤ リ ヤー と複合体形成 したオ リ ゴ ヌ ク レ オチ ド R 3 2 の放出率 と p H と の関係を示す。
図 1 0 は、 ポ リ ア ミ ノ 酸キ ヤ リ ヤー と複合体形成 したォ リ ゴ ヌ ク レ ォチ ド p U 1 9 放出率 と p H と の関係を示す。
発明を実施する ための最良の形態
こ の ポ リ ア ミ ノ 酸は、 ポ リ 一 リ ジ ン ： セ リ ン の ラ ン ダム コ ポ リ マ ーか らな る ポ リ ア ミ ノ 酸化合物 と して、 オ リ ゴ ヌ ク レ オチ ド薬物、 特に抗ウ ィ ルス剤等の生体内キ ヤ リ ヤー に有用な も のであ る 。
こ の発明の ポ リ ア ミ ノ 酸キ ヤ リ ャ 一 は、 セ リ ン （ S e r ) の側鎖が親水性に富み、 こ れを挿入 したカ チオ ン性ポ リ ア ミ ノ 酸がォ リ ゴ ヌ ク レ オチ ド と沈澱を生成さ せ る こ と な く 安定なィ ォ ン性複合体を形成する。 しか も酸性 p Hでは一 度結合 したオ リ ゴ ヌ ク レ オチ ドを効率よ く 放出する。
こ の よ う な ポ リ ア ミ ノ 酸キ ヤ リ ャ 一 は、 た と えば次の一 般式 （ 1 ) で表わす こ とができ る。 こ の場合、 S e r 残基 の数お よ び導入個所は限定さ れず、 m , n は整数であ る。 L y s ： S e r 構成比は 5 ： 1 〜 1 ： 3 程度 とするが、 3 ： 1 ま たは 1. ： 1 程度がよ り 好適で も あ る。
NH3 + -CH-C0-C NH-CH-CO )m 一（ NH-CH-CO )n -NH-CH-COO-
(CH2)4 (CH2) OH (CH2)'
Figure imgf000011_0001
こ の化合物は公知の方法（Rajendra, B. R. , et al. , Human Genetics, 55, 3633 (1980). , Lim, F. and Sun, A, M.， Science, 210, 908 ( 1980). ) に よ っ て製造す る こ とが でき る。
実施例
以下、 実施例を示 し、 こ の発明を よ り 具体的に説明す る（ も ち ろん、 こ の発明は こ れ らの例に よ っ て制限 さ れ る も の ではない。
なお、 以下の実施例において、 キ ヤ リ ヤ ー と複合体を形 成す る オ リ ゴ ヌ ク レ オチ ド と して以下を用 いた。 すなわち、 図 1 ( a ， b ) に示 した 2 種類のオ リ ゴ ヌ ク レ オチ ドを、 D N A合成機 （ア プラ イ ドバイ オ シ ス テ ム社製 タ イ プ 3 8 O B ま た は タ イ プ 3 9 2 ) を用 いて合成 した。 図 1 で は、 ア デニ ン ヌ ク レ オ チ ドを A、 グァ ニ ン ヌ ク レ オ チ ドを G、 シ ト シ ン ヌ ク レ オ チ ドを C、 ゥ ラ シル ヌ ク レ オ チ ドを U と記載 して い る 。 こ れ ら は、 2 ' — 水酸基の保護基に t 一 プチ ル ジ メ チ ル シ リ ル基を用 いた ホ ス ホ ロ ァ ミ ダイ ト 法 (Nucleoc Acid Res. , vol.17, 7059-7071 ( 1989) . ) で合成 した。 図 1 ( a ) は 1 2 塩基か ら な る 直鎖状のキ メ ラ 体ォ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド （ D R D 1 2 ) を示す。 主鎖のかな り の 部分 は D N Aか ら な る が、 中央付近の G U C の 3 塩基のみ が R N Aか ら な る 。 図 2 ( b ) は 3 2 塩基力、 ら な る リ ボ ヌ ク レ オ チ ド （ R 3 2 ) で、 部分的 に密な二次構造を形成す る こ と が予想 さ れ る 。
こ れ ら のモ デルオ リ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ドの精製 は文献（Nuc lei c Acid Res. , vol. 19, 5125 - 5130 ( 1991 ) . )に言己載 さ れ た方法 に従 っ た。
さ ら に、 高分子量のオ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド と して、 公知の プラ ス ミ ド p U l 1 9 ( 3 1 6 2 塩基対） を用 いた。
く ポ リ ア ミ ノ 酸 と オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ドの標識 >
比較の た めの P L L に は、 主 と して シ グマ社の L 0 t . 1 1 1 H - 5 5 2 0 ； M W = 3 , 0 0 0 Poly-L-Lys- Hydrobromi de ( P L L ® ) を用 い、 さ ら に、 L o t .
5 1 H - 5 5 1 6 ; M W = 4 , 6 0 0 ( P L L②） 、
L o t . 7 2 H - 5 5 3 0 ； M W = 2 0 , 5 0 0 ( P L L ③） 、 L o t . 1 1 1 H - 5 5 0 6 ； M W = 3 7 , 2 0 0 ( P L L ® ) の Poly— L一 Lys— Hydrobromide を用 レ、た。 ま た、 こ の発明の ポ リ — L y s ： S e r の ラ ン ダム コ ポ リ マ ー ( P L S ) の例 と して は、 同社の L o t . 3 0 H - 5 5 2 5 ； M W = 2 1 , 8 0 0 Poly- (Lys ： Ser = 3 ： 1 ) - Hydrobromide C P L S ( 3 / 1 ) 〕 お よ び化学合成 し た M W = 3 0 ， 0 0 0 poly-CLys： Ser = 1 : 1 -Hydrobromide 〔 P L S ( 1 ノ 1 ) 〕 を用 いた。
こ れ ら全ての ポ リ ア ミ ノ 酸は イ オ ン 強度 0 . 0 2 の リ ン 酸緩衝液 （ P H = 7 . 2 ) で溶解 した。 ま たオ リ ゴ ヌ ク レ ォ チ ドの 3 2 P標識は、 オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド （ 1 . 8 3 〇 D、 5 p m 0 1 ) の 2 7 . 3 〃 1 、 オ ー ト ク レ ー プ した精製水 の 1 5 . 7 〃 1 、 1 0 X キ ナ ーゼ緩衝液 （ 2 5 0 m M ト リ ス塩酸緩衝液 ： P H 7 . 6 、 l O O m M D T T、
1 0 0 m M M g C 1 2 ) の 5 1 、 T 4 ポ リ ヌ ク レ ア 一 ゼ （ 1 O u n i t / fi \ ) の 1 〃 1 、 r - 32 P A T P の 1 1 の混合後、 3 7 °Cにて 1 時間反応 さ せて行 っ た。
< 吸光度測定 と複合体形成お よ び沈澱生成 >
ポ リ ア ミ ノ 酸 と ォ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド と の イ オ ン性複合体 形成に よ る 濁 り も し く は沈殿物生成の検討は、 そ の溶液の 3 6 0 n m にお け る 吸光度測定に よ り 分光学的 に行 っ た。 そ の結果を示 し た も のが、 図 2 ( a ) ， ( b ) であ る 。 ォ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ドの濃度は、 5 p m o 1 / 1 と した。 ィ オ ン性複合体形成にお け る各々 の電荷的中和の濃度は、 ポ リ ア ミ ノ 酸 と オ リ ゴ ヌ ク レ ォチ ドの分子量か ら求 ま る 電荷 の個数よ り 計算 した。
吸光度測定の結果、 ポ リ ア ミ ノ 酸に P L L① （ MW = 3 ， 0 0 0 ) を用いた場合、 複合体形成が予想 さ れる P L L濃度付近か ら濁 り も し く は沈澱が観測さ れた （図 2 ， a ) ま た、 P L L の分子量を変えた場合 （ 4 ， 6 0 0 、 2 0 , 5 0 0 、 3 7 ， 2 0 0 ) 、 すなわち、 P L L②、 ③、 ④の 場合について も 同様に検討 したが結果は同 じであ っ た。 こ れに対 して、 親水性 S e r を P L L 内に 3 0 %程度含むこ の発明の ラ ン ダム コ ポ リ マ—の P L S ( 3 / 1 ) を用 いた 場合には、 電荷的に中和 さ れ、 完全な イ オ ン性複合体形成 が'予想さ れる濃度で も濁 り は全 く 観測さ れなか っ た （図 2 , b ) 。 ま た、 それ以上の濃度で も そ の混合溶液系は均一で あ っ た。 こ れは、 P L Lへの S e r 残基の挿入に よ り 、 形 成さ れた複合体の親水性が増加 したためであ り 、 こ の発明 の P L Sが生体系キ ヤ リ ャ一 と して非常に有効であ る こ と を示唆 してい る。
ぐ 電気泳動 >
オ リ ゴ ヌ ク レ オチ ドはそれの負 に帯電 した リ ン酸基が理 由で正電荷方向に電気泳動す る。 ま た、 負電荷のオ リ ゴ ヌ ク レ オチ ドに対 して正電荷のポ リ ア ミ ノ 酸を加え る と、 こ れの添加濃度の増加に伴 つ てオ リ ゴ ヌ ク レ オチ ドの負電荷 が抑え られ、 結果的にォ リ ゴ ヌ ク レ オチ ドの移動度は減少 す る。 そ こ で 、 オ リ ゴ ヌ ク レ オチ ド D R D 1 2 に P L S ( 3 / 1 ) を添加 して結合 さ せた後に電気泳動 さ せ、 移動 度を評価 した。 そ の結果を示 した も のが図 3 であ る。 複合 体に関する全ての実験操作は、 ポ リ ア ミ ノ 酸 と オ リ ゴ ヌ ク レ オチ ド溶液の混合後、 約 1 5 分間の攪はんに よ る十分な 反応後に行つ た。
図 3 に例示 した通 り 、 電気泳動の結果、 P L S の濃度増 加に伴っ て、 オ リ ゴ ヌ ク レ オチ ドの移動度は減少 した。 そ して、 電荷的に中和 さ れる谆合体形成時には、 オ リ ゴ ヌ ク レ オチ ドの泳動は観測さ れなか っ た。 こ れ ら結果を基に、 複合体形成時にお け る両者の混合濃度を見積 も っ た。
ぐ膜分離 と複合体形成濃度 〉
形成さ れた複合体が透過 しない膜分画能を も つ限外濾過 用チ ュ ー ブ （ 日 本 ミ リ ポア · リ ミ テ ツ ドウ ノレ ト ラ フ リ ー C 3 - G C U F C 3 T G C 0 0 フ ィ ル タ 一付き遠心 チ ュ ーブ） に、 あ らか じめ 32 P — A T Pで標識 し、 32 P i を測定 したォ リ ゴ ヌ ク レ オチ ドを入れた。 こ の溶液 と ポ リ ア ミ ノ 酸溶液を種 々 の比率で混合後、 先のチ ュ ーブへ入れ て遠心分離 し、 濾過溶液中の遊離 したオ リ ゴ ヌ ク レ オチ ド の 32 P量を測定 した。 そ して、 2 P の初期量に対す る濾過 溶液の 32 P量を考慮 し、 最終的に、 形成 した複合体量を直 接求めた。 その結果を示 した も のが図 4 であ り 、 P L L①、 P L S ( 3 / 1 ) お よ び P L S ( 1 / 1 ) について、 図 1 に示 したオ リ ゴ ヌ ク レ オチ ド D R D 1 2 お よ び R 3 2 との 複合体形成の結果を示 してい る。
求め られた複合体形成濃度は上記の吸光度測定お よ び電 気泳動測定か ら求め られた結果 と よ く 一致 した。 ま た、 P L S を使 っ た場合、 複合体溶液に 白濁は一切見 られなか つ た。
れ らの結果か ら、 オ リ ゴ ヌ ク レ オチ ド と のポ リ ア ミ ノ 酸の複合体形成濃度を限定 した。
般に、 ス テム · ルー プ構造な どの二次構造を形成する ォ リ ゴ ヌ ク レ オチ ドは、 直鎖状のそれに比べる と、 た と え ばステム領域を標的 と したァ ン チセ ン ス分子に対 して結合 しに く し、 こ とが知 られる。 こ の こ と は、 こ の発明のキ ヤ リ ャ一の場合に も 当然予想 さ れる。 そ こ でォ リ ゴ ヌ ク レ オチ ドの分子量お よ び立体構造が、 それ と ポ リ ア ミ ノ 酸 と の結 合に どの程度影響する かを検討 した。 こ れは、 図 1 ( a )
( b ) の 2 種類のオ リ ゴ ヌ ク レ オチ ドを用 いて、 こ れ ら と ポ リ ァ ミ ノ 酸が どの濃度か ら どれだけの複合体を形成す る かを膜分離に よ る測定手法で行つ た
P L L と の複合体形成において 、 2 種類のオ リ ゴ ヌ ク レ ォチ ドの間で違いが見 られた。 P の濃度増加に伴い D R D 1 2 と P L L の複合体形成は進み、 最終的に複合体形 成量 (Association/ % ) は 8 0 % とな つ た。 こ れに対 して P L L と R 3 2 と の複合体量は、 P L L の高濃度付近で 5 0 %程度であ つ た。 L y s を主鎖 と した ポ リ ア ミ ノ 酸に 対 して、 二次構造を と る オ リ ゴ ヌ ク レ ォ チ ドは、 直鎖状の そ れに比べて結合 し に く レ、 こ と がわか る o
一方、 こ の発明の P L Sへのオ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ドの結合 に は、 オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ドの コ ン フ ォ メ 一 シ ヨ ン は全 く 影 響 しなか っ た。 いずれの オ リ ゴ ヌ ク レ ォ チ ドへの P L S の 結合 も 、 P L S濃度の増加 に伴 っ て進み、 最終的 に P L S - D R D 1 2 ま た は P L S — R 3 2 の複合体形成量は 1 0 0 % と な っ た。 特に、 L y s と S e r を等量含む P L S ( 1 / 1 ) は、 D R D 1 2 ま た は R 3 2 と速やカヽ に 1 0 0 % の複合体を形成 した。 こ れは フ レ キ シブルな骨格を も つ S e r 残基の挿入 に よ り 、 P L S全体の 自 由度が増 し、 結 果 と して特異的立体構造を も つオ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド と の結 合の妨害が避 け ら れ る た め と考え ら れ る 。 少な く と も オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ドの コ ン フ オ メ 一 シ ヨ ン に関 して、 こ の発明 の新規な キ ヤ リ ャ 一 は薬物オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ドを限定 しな い こ と 明 ら 力、 にな っ た。 こ の結果は、 近年研究デー タ が 急増 しつつあ る ァ ン チセ ン ス薬物ゃ リ ボザィ 厶薬物等の体 内輸送に こ の発明のキ ヤ リ ヤ ー が特に有用 であ る こ と を示 して い る 。
さ ら に、 上記のオ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド D R D 1 2 ( 1 2 塩 基） お よ び R 3 2 ( 3 2 塩基） よ り も は る かに高分子量の プラ ス ミ ド p U l 1 9 ( 3 1 6 2 塩基対） と ポ リ ア ミ ノ 酸 キ ヤ リ ヤ ー と の複合体形成について も 同様に検討 し た。 結 果は図 5 に示 し た と お り であ り 、 こ の発明のキ ヤ リ ヤ ー P L S は、 高分子量のオ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド （ p U l 1 9 ) に 対 して、 低分子量の D R D 1 2 や R 3 2 に比べ る と複合体 形成率は低い も のの、 従来の P L L キ ヤ リ ヤ ー （約 3 0 % ) よ り も 有意に高い形成率 （ 4 0 %前後） を示 した。 こ の 結果は、 こ の発明のキ ヤ リ ヤ ーが、 プ ラ ス ミ ド発現べ ク タ 一系 の体内輸送等に も 十分利用可能であ る こ と を示 して い o
< キ ヤ ビ ラ リ 一 電気泳動 >
前記の電気泳動試験の結果 （図 3 ) か ら、 P L S と オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド と の複合体は電荷を持たな い こ と が予想 さ れ る 。 そ こ で、 こ の結果を、 複合体をキ ヤ ピ ラ リ ー 電気泳 動 （マ ルチ チ ャ ン ネ ルキ ヤ ビ ラ リ 一 電気泳動装置 ： C A P 1 — 3 0 0 0 ， M C P D — 3 6 0 0 SPECTRO MULTI CHANNEL DETECTOR装備， 大塚電子株式会社） す る こ と で さ ら に明 ら か に した。 キ ヤ ビ ラ リ 一管 に は S i コ ー テ ィ ン グ し た も の (Anion charged) を用 いた o
そ の結果を示 し た も のが図 6 ( a ) ( b ) ( c )
(Pherogram at 2 0 0 n m ) であ る 。 こ の条件下では、 電 荷を も たな い フ エ 二.ルァ ラ ニ ン （ P h e ) の ピー ク は 4 . 3 5 分の保持時間で検出 さ れた （ a ) 。 P L L と オ リ ゴ ヌ ク レ オチ ドの ピー ク は、 2 9 . 4 6 分で検出 さ れた （ b ) こ れは、 こ の複合体が正に帯電 してい る ため に こ れのキ ヤ ピラ リ ーへの結合が生 じ、 その結果 と して ピー ク 検出時間 の P h e に対す る遅れが生 じた こ と を意味 してい る。
こ れに対 して、 P L S ( 3 / 1 ) と オ リ ゴ ヌ ク レ オチ ド の複合体の ピー ク は、 電荷を も たない P h e のそれに近い 保持時間 （ 4 . 5 2 分） で観測さ れた （ c ) 。 こ の結果か ら、 P L S と オ リ ゴ ヌ ク レ オチ ド と の複合体は電荷を も た なレ、 こ とが明 らかにな つ た。
キ ヤ リ ヤー シ ス テム の評価 と して、 生体への電荷の影響 (主 と して正電荷） が重要視さ れる こ とか ら、 こ の発明の 電荷を も たない P L S キ ヤ リ ャ一 は、 特に細胞に対す る毒 性が低い こ と も予想さ れ、 新規の生体内薬物キ ヤ リ ヤ ー と して有意であ る こ とが示唆さ れてい る。
< ォ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ドの安定性 >
ィ ォ ン性複合体形成のォ リ ゴ ヌ ク レ オチ ドの安定性への 効果の検討は以下の手法に よ り 人血清中で評価 した。
すなわち、 リ ン酸緩衝液で I E — 4 Mに調製 した P L S ス ト ッ ク 溶液を同 じ緩衝液で希釈する こ とで P L S ( 3 / 1 ) 溶液お よ び P L S ( 1 Z 1 ) 溶液 （濃度 ： 1 X 1 0 一4 M ) を作製 した。 続いて、 3 2 P — A T P で標識 したオ リ ゴ ヌ ク レ オチ ド （ リ ボザィ ム R 3 2 ) の溶液 （濃度 ： 0. 25〃 g/ 1 )へ先の溶液を添加 し、 種々 の混合比の複合体溶液を 作製 した。
人血清溶液の終濃度が 9 0 % にな る よ う に、 P L S と ォ リ ゴ ヌ ク レ オチ ド と の複合体溶液の添加量を調製 して混合 した後、 こ れを 3 7 °Cでイ ンキ ュ ベー ト した。 適時のサ ン プ リ ン グ溶液は、 1 Nの塩酸の必要量の添加に よ り p Hを 約 5 . 0 に調整 した後、 分子量 1 万の膜分画分子量を も つ 限外濾過用 チ ュ ーブ （ 日 本 ミ リ ポア · リ ミ テ ツ ドゥ ル ト ラ フ リ ー C 3 — G C U F C 3 T G C 0 0 フ イ ノレ タ ー付き 遠心チ ュ ーブ） に移 した。 5 ， 0 0 0 回転にて 1 5 分間の 遠心に よ り RNase の除去後、 濾過溶液は分析す る ま で
一 8 0 °Cにて保存 した。 分析時には、 こ れ らのサ ン プルを 室温で融解後、 2 0 %のポ リ ア ク リ ルア ミ ド変性ゲルにて 電気泳動 （ 2000 Vの一定電圧 ： 2 4 時間） した。
結果は図 7 ( a ) ( b ) に示 した通 り であ る。 図 7 ( a ) は P L S ( 3 / 1 ) についての結果であ り 、 5 レ ー ン は各 時間経過において人血清中に存在 した R 3 2 の分解パタ ー ンを示す。 ゲルの上方に見え るノく ン ドは未分解の R 3 2 で あ り 、 下方にみえ る わずかなノく ン ドは リ ボ ヌ ク レ ア ーゼ類 に よ り 分解さ れた R 3 2 であ る。 こ の電気泳動の結果か ら 明 らかな よ う に、 P L S ( 3 / 1 ) を用 いた場合に は、 0. 08時間後 ま では R 3 2 の分解は見 られないが、 時間の経過 に伴っ て R 3 2 の分解量が増加 した。 そ して、 2 4 時間後 の未分解 R 3 2 は 0.08時間後のそれの半分以下であ っ た。 一方、 図 7 ( b ) は P L S ( 1 / 1 ) についての同様の結 果であ り 、 2 4 時間後の未分解 R 3 2 のバ ン ド強度は 0 時 間後 と ほぼ同一であ り 、 キ ヤ リ ヤ ーか ら解離 した R 3 2 の 存在を示す下方のバ ン ド も ほ とん ど観察さ れなか っ た。 最終的に、 バイ オ · ィ メ 一ジ ン グァ ナ ラ イ ザ （ フ ジ フ ィ ル ム ； B A 1 0 0 ) に よ り 残存 R N Aを測定 し、 こ れを未 分解ォ リ ゴ ヌ ク レ オチ ド量 と した。 ま た、 対照 と して P L L 溶液について も 同様に検 H"† した。 こ れ らの検討結果を示 した も のが図 8 であ る。
最終濃度 9 0 % の人血清中では、 通常、 フ リ ー の （複合 体形成 していな い） ォ リ ゴ ヌ ク レ オチ ドは非常に短い時間 で分解す る が、 ポ リ ア ミ ノ 酸キ ヤ リ ヤ ー と複合体を形成 し たォ リ ゴ ヌ ク レ オチ ドは分解さ れに く く な る こ とが確認さ れた。 ただ し、 P L L と複合体形成 したオ リ ゴ ヌ ク レ オチ ドは経時的に分解 し、 2 4 時間後に完全なオ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ドは観測さ れなカヽ つ た
こ れに対 して、 P L S ( 3 ハ ） と の複合体形成に よ り 保護さ れたオ リ ゴ ヌ ク レ ォチ ドの場合、 2 4 時間後 も 5 0 %が安定に存在 した。 ま た、 S e r 残基の含有量が多い P L S ( 1 / 1 ) と複合体形成 したォ リ ゴ ヌ ク レ オチ ドは、 2 4 時間後 も 9 0 %以上が安定に存在 した。
こ の結果か ら、 こ の発明のカ チォ ン性 P L S キ ヤ リ ャ一 は、 オ リ ゴ ヌ ク レ オチ ド薬物 と の結合に よ り 沈澱物を生 じ ないばか り でな く 、 生体内へ投与 したオ リ ゴ ヌ ク レ オチ ド 薬物の安定化へ も大き く 寄与する こ とがわか る。 ま た、 S e r 残基の含有量増加が、 P L S のキ ヤ リ ャ 一 と しての 機能向上に有効に作用する こ とが強 く 示唆さ れた。
く オ リ ゴ ヌ ク レ オチ ドの放出 〉
一旦形成 したイ オ ン性複合体か らのオ リ ゴ ヌ ク レ オチ ド の放出は、 その系の p Hを変え る こ とで可能 と した。
P L L は強ア ルカ リ 条件下では 1 0 0 %のへ リ ッ ク ス構 造を と るが酸性条件下ではほぼ 1 0 0 %の ラ ン ダム コ イ ル 構造を と る こ と は よ く 知 られている。 P L L力 p Hに敏感 (sensitive) であ る と の特徴に着 目 し、 P L L の ラ ン ダム コ ポ リ マ ーであ る P L S も p Hに敏感であ る と予想 した。 円偏向二色性測定の結果、 P H 7 付近では P L L に比べて P L S の方が多 く のヘ リ ッ ク ス構造を誘起す る が p H 5 以 下でのヘ リ ッ ク ス含量は P L L と ほぼ同 じであ っ た。 こ れ は、 血液中 （ p H 7 . 0 ) では P L S の多 く のへ リ ッ ク ス 構造がオ リ ゴ ヌ ク レ オチ ドを ヌ ク レ ア ーゼか ら保護 し、 細 胞内に取 り 込ま れ る ラ イ ソ ソ ー 厶 （ p H 5 . 0 ) に達す る と ォ リ ゴ ヌ ク レ オチ ド薬物をすみやかに放出する可能性を 示 してい る。
前記の吸光度測定、 電気泳動、 膜分離測定等の結果を も と に、 P L S ( 3 1 ) お よ び P L S ( 1 1 ) 溶液 と 32 P _ A T Pで標識 したオ リ ゴ ヌ ク レ オチ ド R 3 2 溶液 （ 5 p m o 1 / m I ) を混合 し、 こ れ らの複合体溶液を調製 し た。 こ れに、 1 Nの塩酸 も し く は 1 Nの N a 〇 Hを添加 し て p Hを調整 し、 複合体が P H の約 3 力、 ら約 1 0 ま での環 境下におかれる複合体溶液 と した。 こ れ ら溶液は限外濾過 用チ ュ ーブ （ 日 本 ミ リ ポア ' リ ミ テ ッ ド ウ ノレ ト ラ フ リ ー C 3 - G C U F C 3 T G C O O フ ィ ノレ夕一付き遠心チ ュ ーブ） に移 し、 5 ， 0 0 0 回転にて 1 5 分間遠心 した。
濾過溶液の 32 P量を測定 し、 32 P の初期量に対する濾過 溶液の 32 P 量を考慮 し、 遊離 したォ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド量を 求めた。 こ れ ら の結果を図 9 に示 した。
ポ リ ア ミ ノ 酸キ ヤ リ ヤー と複合体形成 したオ リ ゴ ヌ ク レ ォチ ドは p H 6 以下でキ ヤ リ ヤーか ら放出 さ れ始め る が、 さ ら に酸性側の p H 3 付近でこ の発明の P L S キ ヤ リ ヤ ー はオ リ ゴ ヌ ク レ オチ ドの解離が 1 0 0 % と な る の に対 して P L L キ ヤ リ ヤ ー での解離は 7 5 % に と ど ま っ た。 特に、 ラ イ ソ ソ ー ム と 同様の条件であ る P H約 5 . 0 の場合 に は P L L と P L S と の差は顕著であ つ た。 以上の こ とか ら、 こ の発明の P L S キ ヤ リ ヤ ー に よ つ て細胞内へ送達さ れた ウ ィ ルス病抑制遺伝子等のォ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ドは、 ラ イ ソ ソ ー 厶 の p H に よ り P L S キ ヤ リ ャ 一か ら離れ、 それの も つ機能を発揮する こ とができ る。
さ ら に、 高分子量のオ リ ゴ ヌ ク レ ォ チ ド p U 1 1 9 につ いて も 同様に検討 した。 結果は図 1 0 に示 した と お り であ り 、 酸性領域 （ P H 3 ) で P L S ( 1 ノ 1 ) のみ力 p U 1 9 9 を 1 0 0 %放出 した。 ま た、 P L S ( 3 1 ) も 1 0 0 %ではない も のの、 P L L よ り は優れた放出性能を示 し た。 し力、 も、 ラ イ ソ ソ ー ム と 同一の p H 5 では、 P L S と P L L と の差は顕著であ つ た。 こ の結果か ら、 こ の発明の キ ヤ リ ヤ ー P L S は、 ァ ン チ セ ン ス薬物ゃ リ ボザィ ム薬物 のみな らず、 プラ ス ミ ド発現べ ク タ 一等の体内輸送に も有 用であ る こ とが確認さ れた。
産業上の利用可能性
こ の発明のポ リ ア ミ ノ 酸オ リ ゴ ヌ ク レ オチ ドキ ヤ リ ヤ ー は、 沈殿を生 じ さ せる こ と な く ォ リ ゴ ヌ ク レ オチ ド と結合 し、 しか も一度結合 したォ リ ゴ ヌ ク レ オチ ドを細胞内でス ム ー ス に放出する ため、 各種遺伝子疾患、 あ る いはエイ ズ 等の ウ ィ ルス病に対す る ォ リ ゴ ヌ ク レ オチ ド遺伝子治療薬 の生体内輸送キ ャ リ ヤ ー と して有用であ る。 ま た、 ウ ィ ル ス耐性植物をは じめ と して、 遺伝子工学技術に よ る種々 の 有用動植物の創出 に も大き く 寄与す o

Claims

請 求 の 範 囲
1 ボ リ 一 リ ジ ン ： セ リ ン ラ ン ダム コ ポ リ マ ー力、 ら な る ポ リ ア ミ ノ 酸オ リ ゴ ヌ ク レ オチ ドキ ヤ リ ヤ ー。
2 . リ ジ ン ： セ リ ン構成比が 5 ： 1 〜 1 ： 3 の請求項 1 の ポ リ ア ミ ノ 酸オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ドキ ヤ リ ヤ ー。
3 . 重量平均分子量が 3， 0 0 0 〜 3 5 ， 0 0 0 の請求 項 1 ま た は 2 の ポ リ ア ミ ノ 酸オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ドキ ヤ リ ャ一。
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