TW201726149A - 用於免疫療法之組合方法 - Google Patents
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Abstract
本發明包括治療有需要之人類個體中***癌之方法,其包含向該個體投與有效量之包含介白素-2(interleukin-2;IL2)之組合物及向該個體投與表現特異性結合***特異性膜抗原(prostate specific membrane antigen;PSMA)之嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor;CAR)之細胞,由此治療需要其之該人類個體中的***癌。
Description
在2012年,估計美國有241,740例***癌的新病例且28,170例死亡[1]。在患有晚期疾病之患者中,5年存活期在2001-2007年為29%[1]。雄激素去除療法(Androgen deprivation therapy;ADT)對於1-3年係有用的,其最近利用藥劑阿比特龍(abiraterone)及恩雜魯胺(enzalutamide)增強[2,3]。在患有去勢抗性***癌(castrate resistant prostate cancer;CRPC)之患者中,利用化學治療劑多西他賽(docetaxel)及卡巴他賽(cabazitaxel)可獲得增加之益處[4,5]。西普魯塞-T(Sipuleucel-T)(一種自體「治療性疫苗」)進一步更增加幾個月的存活期[6]。尚無治療證明在轉移性環境中具有治癒性。
因此,業內仍需要可用於治療癌症之治療目的之療法。
本申請案主張於2015年10月23日提出申請之美國臨時專利申請案第62/245,961號之優先權,其整個內容以引用之方式併入本文中。
本發明提供使用IL2療法及設計者T細胞(亦稱為CAR-T細胞)治療癌症(例如***癌)之組合療法。
本發明包括治療有需要之人類個體中***癌之方法,其包含向該個體投與有效量之包含介白素-2(IL2)之組合物,及向該個體投與表現特異性結合***特異性膜抗原(PSMA)之嵌合抗原受體(CAR)之細胞,由此治療需要其之該人類個體中***癌。
在一個實施例中,***癌與PSMA之高表現含量相關聯。
在一個實施例中,***癌係轉移性胰臟癌、復發性***癌或激素難治性***癌。
在一個實施例中,該方法進一步包含向該人類個體投與環磷醯胺(cyclophosphamide)。
在一個實施例中,該方法進一步包含向該人類個體投與氟達拉濱(fludarabine)。在一個實施例中,氟達拉濱係在環磷醯胺投與人類個體之後投與該人類個體。在一個實施例中,表現特異性結合PSMA之CAR之細胞係在氟達拉濱投與人類個體之後投與該人類個體。
在一個實施例中,包含IL2之組合物係藉由連續靜脈內輸注以約75000IU/kg/d之劑量投與該人類個體達3天至48天、7天至44天、10天至40天、14天至36天、20天至32天、約7天、約3個月(或90天)或約28天。所列舉彼等之中間的範圍亦包括在IL2投與之可能頻率中。
在一個實施例中,包含IL2之組合物係阿地介白素(aldesleukin)(普留淨(Proleukin))。
在一個實施例中,人類個體投與1×109個至1×1011個表現特異性結合PSMA之CAR之細胞。
在一個實施例中,該表現特異性結合PSMA之CAR之細胞在投與該人類個體之前已利用抗CD3抗體活化。
在一個實施例中,CAR包含抗PSMA抗體之PSMA結合區及T細胞受體之CD3 ζ信號傳導鏈。
在一個實施例中,抗PSMA抗體係3D8。
在一個實施例中,細胞係自個體獲得之T細胞。
在一態樣中,本文提供治療有需要之人類個體之***癌之方法,其包含向該個體投與表現特異性結合***特異性膜抗原(PSMA)之嵌合抗原受體(CAR)之細胞群及投與介白素-2(IL2),由此治療該人類個體之***癌,其中該IL2係藉由連續靜脈內輸注以約75000IU/kg/d之劑量投與人類個體且係在投與表現CAR之細胞群之後投與。
在一個實施例中,該方法進一步包含向該人類個體投與環磷醯胺及/或氟達拉濱。
在一個實施例中,IL2藉由連續靜脈內輸注投與個體達約28天。
在一個實施例中,CAR包含抗PSMA抗體之PSMA結合區及T細胞受體之CD3 ζ信號傳導區。
在一個實施例中,抗PSMA抗體係3D8或其抗原結合片段。
在另一態樣中,本文提供治療患有***癌之人類個體之方法,該方法包含向該人類個體投與表現抗PSMA CAR之細胞群及向該人類個體投與IL2,其中該IL2係經靜脈內以100kIU/kg/8h或更多之劑量藉由團劑輸注投與人類個體且係在投與表現抗PSMA CAR之細胞群之後投與,且其中抗PSMA CAR包含抗PSMA scFv、跨膜結構域及CD3 ζ信號傳導區。
在一個實施例中,IL2之劑量係100kIU/kg/8h至720kIU/kg/8h。在另一實施例中,IL2之劑量係約300kIU/kg/8h。
在一個實施例中,該IL2自投與細胞群之日開始藉由團劑輸注投與人
類個體達連續四天。
在一個實施例中,該IL2自投與細胞群之日開始藉由團注投與人類個體達連續五天。
在一個實施例中,細胞群包含1×108個至1×1011個細胞。
在一個實施例中,在投與細胞群之前將非清髓性(NMA)化學療法投與人類個體。
在一個實施例中,細胞群包含自該個體獲得之T細胞。
在一態樣中,本文提供治療已輸注表現抗PSMA CAR之細胞群之個體之***癌的方法,該方法包含根據投藥時間表向該個體投與IL2,使得在將細胞群投與個體後在個體中維持高於500pg/ml之IL2血漿含量達至少一週,其中抗PSMA CAR包含含有抗PSMA scFv之細胞外區、跨膜結構域及CD3 ζ信號傳導區。
在一個實施例中,IL2血漿含量在將細胞群投與個體後維持1至2週。
在一個實施例中,投藥時間表包含藉由團劑輸注將100kIU/kg/8h至720kIU/kg/8h IL2投與個體。
在一個實施例中,IL2血漿含量在將細胞群投與個體後維持1個月。
在一個實施例中,投藥時間表包含向個體投與25,000IU/kg/d至300,000IU/kg/d IL2。在一個實施例中,個體具有至少10%之經活化細胞植入。
在一個實施例中,個體具有至少50%之經活化細胞植入。
在另一態樣中,本文提供治療業經輸注表現特異性針對癌症抗原之CAR之細胞群之個體之癌症的方法,該方法包含根據投藥時間表向該個體投與IL2,使得在將細胞群投與個體後在個體中維持高於500pg/ml之IL2
血漿含量至少一週,其中在將該細胞群投與該個體之前,該個體已接受淋巴細胞清除療法。
在又一態樣中,本文提供治療個體之癌症的方法,該方法包含向患有癌症之個體投與表現特異性針對癌症抗原之CAR之細胞群且隨後藉由包含投與100kIU/kg/8h或以上之劑量的IL2之團劑輸注、或藉由包含向個體投與25,000IU/kg/d至300,000IU/kg/d IL2之連續輸注向該個體投與IL2,其中在將該細胞群投與該個體之前,該個體已接受淋巴細胞清除療法。
在一個實施例中,淋巴細胞清除療法包含投與環磷醯胺及氟達拉濱。
在一個實施例中,癌症選自由以下組成之群:結腸癌、乳癌、腦癌、肺癌、卵巢癌、頭頸癌、膀胱癌、黑色素瘤、結腸直腸癌及胰臟癌。
在一個實施例中,癌症抗原選自由以下組成之群:癌胚抗原(CEA)、CD19、GM2、GD2、唾液酸Tn(STn)、HER2、EGFR、GD3、IL13R、MUC-1及EGFRvIII。
在一個實施例中,IL2係阿地介白素(普留淨)。
在一個實施例中,抗PSMA scFv包含含有SEQ ID NO:1中所述胺基酸序列之輕鏈可變區,且包含含有SEQ ID NO:2中所述胺基酸序列之重鏈可變區。
在一個實施例中,抗PSMA CAR包含CD8鉸鏈區。在一個實施例中,CD8鉸鏈區包含SEQ ID NO:4中所述之胺基酸序列或其功能片段。
在一個實施例中,CD3 ζ信號傳導區包含SEQ ID NO:5中所述之胺基酸序列或其功能片段。
在一個實施例中,***癌與PSMA表現相關聯。在一個實施例中,***癌係轉移性***癌、復發性***癌或激素難治性***癌。
在一個實施例中,細胞群在投與人類個體之前已利用抗CD3抗體活化。
圖1A至1F闡述調整之影響。圖1A.調整後之周圍白血球表示為絕對嗜中性球(ANC,o)及絕對淋巴球(ALC,‧)計數。化學療法係自第-8天至第-2天。在第0天輸注T細胞(1e9)。IL2係在第0天藉由連續靜脈內輸注起始。圖1B闡述在第14天(骨髓恢復之日)之dTc植入。在患者輸注前dTc劑量之流式細胞輪廓及在第14天之血液之流式細胞輪廓。CAR+細胞係於劑量中之61%CD3+ T細胞及在骨髓恢復之日於血液中之7.3%CD3+ T細胞。圖1C闡述dTc恢復之時程。隨時間流失患者血液中CD8+ T細胞中之dTc分率(上部)及CD8+ dTc之絕對數量(下部)。第5天係WBC足夠高(0.2e6/ml)而實際流動之第一天。所有數據均來自Pt 2。圖1D闡述在有或沒有預先調整之情況下dTc藥物動力學之比較。將Pt 4中之總WBC及dTc之血液含量(實心符號)藉由PCR在輸注後之多個時間與在第二研究中利用未實施調整之不同CAR(抗CEA)之患者之彼等(開放符號)相比較。兩個患者均接受類似大小劑量之1-2e10 T細胞,其中具有40-50%CAR修飾。總白血球係由正方形符號指示且CAR+ T細胞由圓形符號指示。圖1E及圖1F.由淋巴球減少性調整所致之IL15及IL7含量。細胞介素含量(條柱)係在血清中如方法中一樣在所指示取樣時間點量測。基線係在化學療法之前獲得。繪製ALC值(實心圓,‧)用於比較。
圖2A至2C提供涉及利用介白素2組合治療之結果。圖2A.患者中血漿中之IL2顯著不同。血清樣品係在T細胞輸注後之多個時間藉由ELISA分析,以pg/ml表示。亦表示以IU/ml計之濃度,如方法中所提及。Pt 1在敗
血症時期期間之第3天後具有暫停之IL2,其隨後在第5天以半速率恢復且在第6天以全速率恢復直至第28天。在Pt 3-5中輸注袋中之IL2在輸注後產生小的血清峰,該等峰迅速消散。圖2B.降低之血漿IL2含量伴隨較高之活化T細胞植入。數據來自表2B.(B1)。患者特異性IL2含量及植入。自Pt 1-5開始自左至右,隨著植入之aTc(藍色)增加,IL2含量(紅色)降低;當aTc植入降低時,IL2增加。圖2C.血漿IL2隨所植入aTc變化之圖表。插圖:對數回歸:aTc越多,IL2越少,其中相關係數=-0.94且p<0.01。
圖3A-3C. PSA反應.圖3A及3B.dTc輸注後在兩個部分反應者(圖3A:Pt 1;圖3B:Pt 2)中之PSA。在第-8天與第-2天之間進行化學療法調整。第0天(箭頭)係dTc輸注之日。圖3C.PSA在dTc輸注後延遲。藉由半對數圖表分析所有患者在dTc投藥前之PSA數據以確定治療前之PSA軌線(實線)。此係未被任何新療法中斷之時期。(ADT時進展之患者繼續ADT。)標有「Chemo」之箭頭係在因環磷醯胺進入醫院時、在化學療法投與之前所抽取之PSA的血液樣品。標有「T細胞」之箭頭係在因dTc輸注進入醫院時、但在輸注之前所抽取之PSA的血液樣品。dTc輸注之後,僅表示在其他介入之前獲得之彼等值;箭頭指示開始新療法(「酮康唑(Ketoconazole)」)。PSA延遲係估計為在新治療之前自投影於實線上等於最終PSA值之值的時間間隔。PSA延遲僅在患者1、2及5中明顯。
圖4A及4B闡述顯示患者血清中抗CAR反應缺乏之數據。圖4A提供顯示針對CAR+對照之對照染色之數據。抗CEA CAR+ Jurkat細胞與人類CEA-Fc反應,利用山羊抗人類Ig二級抗體(Ab)檢測以顯示二級Ab是否檢測與CAR+細胞反應之人類Fc。抗PSMA CAR+ Jurkat細胞與抗V5 Ab(小鼠)反應,利用山羊抗大鼠Ig二級Ab檢測以顯示用以預計在實例中所述之研
究中治療之患者中是否存在陽性血清之輪廓。圖4B提供顯示來自針對抗CAR抗體篩選之患者之治療後血清樣品之結果的數據。患者1-5(P1至P5)血清係在dTc輸注後1至6個月之多個時間收集並與抗PSMA CAR+ Jurkat細胞一起培育並藉由流式細胞術檢查。未檢測到抗CAR反應性。Jurkat PSMA CAR利用血清且然後抗人類Ig PE進行染色。
圖5提供顯示針對PSMA+靶標之dTc之增殖數據。在第0天將未經修飾(T)或經IgTCR修飾之T細胞與經輻照腫瘤細胞1:1混合。在所指示之多個時間記錄T細胞計數。左側面板顯示PC3且右側面板顯示PC3-PSMA。dTc與PC-PSMA之共培養導致所有靶標之溶解及清除,但對抗原陰性PC3靶標無效應。
圖6闡述抗PSMA dTc(左)及白蛋白(右)之qPCR結果。上部面板闡述標準物及未知物之螢光輪廓對循環。中間面板闡述熔融曲線,其顯示高品質PCR產物。下部面板闡述未知物對標準曲線之測定值。
圖7提供實例中所用抗PSMA CAR之示意圖。
為了可更容易地理解本揭示內容,首先定義某些術語。該等定義應根據本揭示內容之剩餘部分來理解且如熟悉此項技術者所理解。除非另有定義,否則本文所用之所有技術及科學術語皆具有與熟習此項技術者通常所理解相同之含義。
如本文所用術語「嵌合抗原受體」或「CAR」係指重組融合蛋白,其包含至少細胞外抗原結合蛋白、跨膜結構域及源自刺激分子之細胞內信號傳導結構域(亦稱為細胞質信號傳導結構域),如下文所定義。在一個實施
例中,細胞外抗原結合結構域由包含抗體之可變重鏈區及可變輕鏈區之單鏈可變片段(scFv或sFv)組成。
術語「信號傳導結構域」或「信號傳導區」在本文中可互換使用,係指蛋白質之功能部分,其藉由在細胞內傳送資訊經由所定義信號傳導途徑藉由產生第二信使或藉由因應該等信使發揮效應物作用來起調控細胞活性之作用。
如本文所用,術語「PSMA」係指***特異性膜抗原,其係***組織(包括癌)上之可檢測抗原性決定子。人類胺基酸及核酸序列可在共用資料庫(例如,基因庫、UniProt及Swiss-Prot)中找到。舉例而言,人類PSMA之胺基酸序列可作為UniProt/Swiss-Prot登錄號Q04609.1找到且人類PSMA之胺基酸序列之NCBI參照序列ID編號係NP_004467.1。編碼人類PSMA之核苷酸序列可在登錄號NM_004476.1找到。人類PSMA之細胞外區之胺基酸序列如下作為SEQ ID NO:6提供。
(SEQ ID NO:6)
在一個態樣中,CAR之抗原結合部分識別並結合PSMA蛋白質或其片段之細胞外結構域內之表位。如本文所用,「PSMA」包括全長野生型PSMA之包含突變(例如,點突變)之蛋白質、片段、***、缺失及剪接變體。
如本文所用術語「抗原結合蛋白」係指可特異性結合靶標分子(例如***特異性膜抗原(PSMA))之蛋白質或多肽。抗體係抗原結合蛋白之實
例。scFv係抗原結合蛋白之另一實例。較佳地,CAR之細胞外區包含抗原結合蛋白。
如本文所用,術語「癌症抗原」可為此項技術中已知之任何類型的癌症抗原。較佳癌症抗原係細胞表面抗原,例如(但不限於)PSMA。在一些實施例中,術語癌症抗原係指於癌細胞中異常表現、於癌細胞中突變或特定針對癌細胞之抗原。
「表位」係由抗原結合蛋白(例如,由抗體或scFv)結合之分子部分。在一個實施例中,表位包含分子之非連續部分(例如,在多肽中,在多肽之一級序列中不連續、但在多肽之三級及四級結構背景下彼此充分靠近以由抗原結合蛋白結合之胺基酸殘基)。通常,抗原結合蛋白之可變區、特定而言CDR與表位相互作用。
術語「抗體」係指免疫球蛋白(Ig)分子,其包含4條多肽鏈(兩條重鏈(H)及兩條輕鏈(L))、或其任一功能片段、突變體、變體或衍生物,其保留Ig分子之基本表位結合特徵。
通常,每一抗體鏈之胺基末端部分包括主要負責抗原識別之可變區。抗體之每一重鏈及輕鏈的羧基末端部分包含(例如)負責效應物功能之恆定區。人類輕鏈分類為κ或λ輕鏈。重鏈分類為μ、δ、γ、α或ε,且將抗體的同種型分別定義為IgM、IgD、IgG、IgA及IgE。在輕鏈及重鏈內,可變區及恆定區由約12或更多個胺基酸之「J」區連接,其中該重鏈亦包括約10或更多個胺基酸之「D」區。通常參見Fundamental Immunology Ch.7(Paul,W.編輯,第2版,Raven Press,N.Y.(1989))。每一輕鏈/重鏈對之可變區形成抗體結合位點,使得完整免疫球蛋白具有兩個結合位點。單一VH或VL結構域可足以賦予抗原結合特異性。
抗體重鏈及輕鏈(分別為VH及VL)之可變區展現由三個超變區(亦稱為互補決定區或CDR)連接之相對保守框架區(FR)之相同一般結構。輕鏈及重鏈二者自N末端至C末端包含結構域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。胺基酸至每一結構域之指派已為此項技術熟知,包括(例如)Kabat等人在Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,US Dept.of Health and Human Services,PHS,NIH,NIH出版號91-3242,1991(在本文中稱為「Kabat編號」)中所述之定義。舉例而言,抗體之CDR區可根據Kabat編號確定。
「抗體片段」、「抗體部分」、「抗體之抗原結合片段」或「抗體之抗原結合部分」係指不同於完整抗體之包含完整抗體之一部分且結合完整抗體所結合抗原之分子。抗體片段之實例包括(但不限於)Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2;Fd;及Fv片段以及dAb;雙價抗體;線性抗體;單鏈抗體分子(例如scFv);多肽,其含有足以賦予多肽特異性抗原結合之抗體之至少一部分。抗體之抗原結合部分可藉由重組DNA技術或藉由完整抗體之酶或化學裂解產生。Fab片段係具有VL、VH、CL及CH1結構域之單價抗體片段;F(ab')2片段係具有兩個在鉸鏈區由二硫橋鏈接之Fab片段之二價片段;Fd片段具有VH及CH1結構域;Fv片段具有抗體之單一臂之VL及VH結構域;且dAb片段具有VH結構域、VL結構域或VH或VL結構域之抗原結合片段(美國專利6,846,634;6,696,245、US App Pub 20/0202512;2004/0202995;2004/0038291;2004/0009507;2003/0039958及Ward等人,Nature 341:544-546,1989)。
在一個實施例中,抗原結合蛋白係單鏈抗體(scFv或sFv)。scFv係指包含至少一個包含輕鏈可變區之抗體片段及至少一個包含重鏈可變區之抗
體片段之融合蛋白,其中輕鏈及重鏈可變區經由短撓性多肽鏈接體以鄰接方式鏈接。scFv能夠表現為單鏈多肽,其中scFv保持衍生其之完整抗體之特異性。除非說明,否則如本文所用之scFv可具有例如關於多肽之N末端及C末端呈任一順序之VL及VH可變區,scFv可包含VL-鏈接體-VH或可包含VH-鏈接體-VL。
如本文所用,關於抗原結合蛋白之術語「特異性結合」係指抗原結合蛋白(例如scFv)與在生理條件下相對穩定之抗原形成複合物之能力。
術語「抗PSMA抗體」或「抗PSMA scFv」分別係指特異性結合PSMA之抗體或scFv。類似地,術語「抗PSMA CAR」係指特異性結合PSMA之CAR。較佳地,PSMA係人類PSMA。
如本文所用,術語「核酸」或「多核苷酸」在本文可互換使用,係指呈單鏈或雙鏈形式之去氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其聚合物。除非明確限制,否則該術語涵蓋含有與參考核酸具有類似結合性質且以類似於天然核苷酸之方式代謝之天然核苷酸之已知類似物的核酸。除非另外指明,否則特定核酸序列亦隱含地涵蓋其保守修飾變體(例如,簡併密碼子取代)、等位基因、直向同源物、SNP及互補序列以及明確指示之序列。具體而言,簡併密碼子取代可藉由產生其中一或多個所選(或全部)密碼子之第三位經混合鹼基及/或去氧次黃嘌呤核苷殘基取代的序列達成(Batzer等人,(1991)Nucleic Acid Res.19:5081;Ohtsuka等人(1985)J.Biol.Chem.260:2605-2608;及Rossolini等人(1994)Mol.Cell.Probes 8:91-98)。
兩個多核苷酸或兩個多肽序列之「一致性百分比」或「同源性百分比」係藉由使用GAP電腦程式(GCG Wisconsin Package之一部分,10.3版
(Accelrys,San Diego,Calif.))使用其缺省參數比較序列來測定。
若兩個單鏈多核苷酸之序列可以反平行定向對齊使得在未引入空隙且在任一序列之5'或3'端無成對核苷酸之情況下一個多核苷酸中之每一核苷酸與另一多核苷酸中之其互補核苷酸相對,則該兩個單鏈多核苷酸係彼此之「補體」。若兩個多核苷酸可在適當嚴格條件下彼此雜交,則多核苷酸與另一多核苷酸「互補」。因此,多核苷酸可與並非其補體之另一多核苷酸互補。
「載體」係可用於將與其連接之另一核酸引入細胞中之核酸。一類載體為「質體」,其係指額外核酸區段可連接至其中之直鏈或環形雙鏈DNA分子。另一類載體係病毒載體(例如,複製缺陷性反轉錄病毒、腺病毒及腺相關病毒),其中額外DNA區段可引入病毒基因體中。某些載體能夠在已將其引入其中之宿主細胞中進行自主複製(例如,包含細菌複製起點之細菌載體及附加型哺乳動物載體)。其他載體(例如,非附加型哺乳動物載體)可在引入宿主細胞中時整合至宿主細胞之基因組中,並藉此隨宿主基因組一同複製。「表現載體」係可引導所選多核苷酸之表現之一類載體。
若調控序列影響核苷酸序列之表現(例如,表現之程度、定時或位置),則核苷酸序列「可操作地鏈接」至調控序列。「調控序列」係影響與其可操作連接之核酸之表現(例如,表現之程度、定時或位置)的核酸。調控序列可(例如)直接對調控核酸發揮其效應,或經由一或多個其他分子(例如,結合至調控序列及/或核酸之多肽)之作用發揮其效應。調控序列之實例包括啟動子、增強子及其他表現控制元件(例如,多聚腺苷酸化信號)。調控序列之其他實例闡述於(例如)Goeddel,1990,Gene Expression Technology:Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,
Calif.及Baron等人,1995,Nucleic Acids Res.23:3605-06。
除非另有說明,否則「編碼胺基酸序列之核苷酸序列」包括為彼此之簡併形式且編碼相同胺基酸序列之所有核苷酸序列。就編碼蛋白質之核苷酸序列可在某一形式中含有內含子而言,片語編碼蛋白質或RNA之核苷酸序列亦可包括內含子。
如本文所用,術語「宿主細胞」係指已以任何方式經修飾、轉染、轉變及/或操縱以表現本文所揭示之抗PSMA-CAR之任何細胞。舉例而言,在一些實施例中,宿主細胞已經修飾以包含編碼本文所揭示抗PSMA-CAR之外源性多核苷酸(例如,載體、線性DNA分子、mRNA)。在一個實施例中,宿主細胞係人類細胞。在一些實施例中,宿主細胞係免疫細胞。在一些實施例中,免疫細胞選自由以下組成之群:樹突細胞、肥胖細胞、嗜酸性球、T細胞(例如,調控性T細胞)、B細胞、細胞毒性T淋巴球、巨噬細胞、單核球及自然殺傷(NK)T細胞。在一些實施例中,宿主細胞係T細胞,例如自患有癌症(例如***癌)之個體獲得之T細胞。在一個實施例中,宿主細胞係自體T細胞。
如本文所用,術語「轉染」或「轉化」或「轉導」係指將外源性核酸轉移或引入宿主細胞中之過程。「轉染」或「轉化」或「轉導」細胞係經外源性核酸轉染、轉化或轉導之細胞。該細胞包括原代個體細胞及其子代。
如本文所用,術語「高表現含量」係指相對於正常含量(即,不患有疾病之健康個體)在處於患病狀態之個體(或其樣品)中增加之分子標記物(例如,蛋白質及/或RNA(例如,mRNA))之含量。在一個實施例中,高表現含量係指與個體中之癌症相關之含量(例如,高表現含量之癌症抗原)。
術語「重組蛋白」係指自經包含蛋白質之編碼序列(例如,編碼蛋白
質之DNA序列)之表現載體(或可能一個以上表現載體)轉染之細胞或細胞株表現之蛋白質。在一個實施例中,該編碼序列並非天然與該細胞相關聯。舉例而言,人類蛋白質(例如人類IL2)可於細菌(例如大腸桿菌(E.coli))中產生,且因此具有不同於在人類中所發現之IL2之醣基化模式。在一個實施例中,重組蛋白係重組體人類IL2。
如本文所用,術語「個體」包括人類及非人類動物。非人類動物包括所有脊椎動物(例如,哺乳動物及非哺乳動物),例如小鼠、大鼠、兔子、人類、非人類靈長類動物、綿羊、馬、狗、貓、牛、雞、兩棲動物及爬行動物。除非在指出時,否則術語「患者」或「個體」在本文中可互換使用。在較佳實施例中,個體係男性個體。
如本文所用,術語「約」或「大約」意指由熟習此項技術者所確定之特定值之可接受誤差,其部分地取決於如何量測或測定該值。在某些實施例中,術語「約」或「大約」意味著在1、2、3或4個標準偏差內。在某些實施例中,術語「約」或「大約」意指在既定值或範圍之20%、15%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%或0.05%內。
術語「治療有效量」係指研究者、獸醫師、醫生或其他臨床醫師所尋求之將引發組織、系統或個體之生物或醫學反應之目標化合物之量。術語「治療有效量」包括在投與時足以阻止所治療病症或疾病之一或多種徵候或症狀之發展或在一定程度上緩解之化合物的量。
如在本文中使用之術語,「治療」疾病意指降低個體所患疾病或病症之至少一種徵候或症狀之頻率或嚴重性。
如本文所用,術語「癌症」係指或闡述哺乳動物中通常以細胞生長失調為特徵之生理學病狀。癌症類型之實例係***癌。
應注意,在自始至終闡述胺基酸序列之情形中,其亦涵蓋編碼該等蛋白質之核酸包括於本發明中。此外,在指示宿主細胞表現具有特定胺基酸序列之CAR之情形中,本文亦涵蓋該宿主細胞經編碼該CAR之核酸轉導。
本發明提供組合療法,其基於使用介白素-2(IL2)及設計者T細胞(在本文中亦稱為嵌合抗原受體(CAR)T細胞)來治療患有癌症(例如***癌)之人類個體。本發明至少部分地基於以下令人驚訝地發現:在投與表現針對癌症抗原(例如PSMA)之CAR的T細胞群之後,個體中之IL2血漿含量與經活化T細胞植入之含量之間存在相關性。應注意,在闡述表現癌症特異性CAR之細胞群之情形中,意欲指其中個別細胞表現CAR之細胞群。
本發明包括治療已輸注表現特異性針對癌症抗原之CAR之細胞群之個體之癌症的方法。個體根據投藥時間表投與IL2使得在將細胞群投與個體後在個體中維持高於500pg/ml之IL2血漿含量達至少一週。在一個實施例中,在將CAR表現細胞之群投與個體之前,個體接受淋巴細胞清除療法。
在一個實施例中,本發明之特徵係治療癌症之方法,該方法包含向患有癌症之個體投與表現特異性針對癌症抗原之CAR之細胞群且隨後藉由包含以100kIU/kg/8h或更多之劑量投與之團劑輸注或藉由包含向該個體投與25000IU/kg/d至300000IU/kg/d IL2之連續輸注向該個體投與IL2。
在一個實施例中,個體亦接受淋巴細胞清除療法(例如NMA調整)與CAR細胞轉導及IL2療法之組合。如下文實例中所述,該調整與CAR/IL2組合療法一起提供治療優點。因此,患有癌症之個體可接受包含投與環磷醯胺及氟達拉濱之淋巴細胞清除療法。該療法通常係在將CAR表現細胞之群投與個體的前幾天實施。
本文所揭示之方法可用於治療可由CAR(即,細胞表面抗原)靶向之任何癌症。可使用本文所揭示方法治療之癌症實例包括(但不限於)結腸癌、***癌、乳癌、腦癌、肺癌、卵巢癌、頭頸癌、膀胱癌、黑色素瘤、結腸直腸癌及胰臟癌。此外,本發明中所用CAR可結合之癌症抗原實例包括(但不限於)癌胚抗原(CEA)、CD19、GM2、GD2、唾液酸Tn(STn)、HER2、EGFR、GD3、IL13R、MUC-1、PSMA及EGFRvIII。
儘管下文實例及本文說明涉及抗PSMA CAR及***癌,但此CAR及癌症類型並不意欲限制。如上所述,本文所述之方法及組合物可用於與細胞表面抗原以及可結合該癌症抗原之CAR相關聯之許多類型之癌症。
本文所述之治療方法至少部分地在患有***癌之個體中在植入設定中提供持續IL2含量。使用IL2之連續輸注或IL2之團注投與以在高植入設定中維持PSMA-CAR轉導細胞之活化狀態,同時保存方案之患者耐受性。如下文實例中所述,數據顯示,某些劑量之IL2有益於維持抗PSMA CAR-T細胞之活性,此產生陽性臨床反應。因此,本發明提供用於治療***癌之組合方法,其包含向個體投與經編碼抗PSMA CAR之核酸轉導之細胞群及向該個體投與IL2,其中IL2之量足以維持輸注於患者中之抗PSMA CAR T細胞的活性。
IL2係參與T及B淋巴球之免疫調節及增殖之分泌細胞介素。IL2已顯示對腫瘤細胞具有細胞毒性效應且重組體人類IL2(阿地介白素/普留淨TM)已經FDA批准用於治療轉移性腎癌及轉移性黑色素瘤。IL2作為治療劑對***癌幾乎沒有影響;其主要效用已在腎細胞癌及黑色素瘤中證實。本文所述之試驗闡述血漿IL2之含量與接受針對***癌之抗PSMA CAR治療之患者的臨床反應之間的相關性。因此,在本發明之方法中使用IL2(例如阿
地介白素(普留淨))以支援特異性針對PSMA之經基因修飾T細胞之存活及擴增。在一個實施例中,本文所述之方法使用如下文提供之SEQ ID NO:8之胺基酸序列中所述之IL2蛋白質。
去丙胺醯基-1,絲胺酸125人類IL2之胺基酸序列.
(SEQ ID NO:8)
成熟人類IL2之胺基酸序列闡述於下文所提供之SEQ ID NO:7中,且可在Swiss Prot資料庫作為P60568公開獲得。
人類IL2之胺基酸序列
(SEQ ID NO:7)
本發明中所用之IL2可包含SEQ ID NO:7中所示IL2胺基酸序列之全部或功能片段之序列。可使用SEQ ID NO:7胺基酸序列之變體,例如由人類等位基因編碼之天然變體及/或具有一或兩個胺基酸突變之變體。突變可為胺基酸殘基之缺失、取代、添加或***。在一個實施例中,本文所用IL2係重組IL2。
本發明中所用之IL2或其功能片段可與SEQ ID NO:7中所述之成熟人類IL2序列具有至少90%序列一致性、至少95%序列一致性或至少98%序列一致性。序列一致性通常根據演算法GAP(Wisconsin GCG包,Accelerys Inc,San Diego USA)來定義。GAP使用Needleman and Wunsch演算法來比對兩個完整序列以最大化匹配數量且最小化空隙數量。通常,使用缺省參數,其中空隙產生罰分=12且空隙延伸罰分=4。使用GAP可係較佳的,但可使用其他演算法,例如BLAST。序列一致性可關於本文所述序列之全長確定。
IL2之功能片段或變體形式(例如,95%一致性或更多)較佳地保留全長人類IL2之活性。舉例而言,在一個實施例中,本文所用之IL2之功能片段或變體能夠誘導殺手細胞活性(例如,淋巴因子活化(LAK)及天然(NK)活性)或能夠誘導干擾素γ產生。
在本發明之一個實施例中,在投與抗PSMA CAR表現細胞之後,將IL2之連續輸注投與患有***癌之人類個體。舉例而言,IL2可藉由連續靜脈內輸注以25000IU/kg/d至300000IU/kg/d之劑量投與人類個體。在一個實施例中,IL2係藉由連續靜脈內輸注以50000IU/kg/d至200000IU/kg/d之劑量投與人類個體。在一個實施例中,IL2係藉由連續靜脈內輸注以50000IU/kg/d至200000IU/kg/d之劑量投與人類個體。在一個實施例中,IL2係藉由連續靜脈內輸注以75000IU/kg/d至100000IU/kg/d之劑量投與人類個體。在一個實施例中,IL2係藉由連續靜脈內輸注以約75000IU/kg/d之劑量投與人類個體。IL2可藉由連續靜脈內輸注投與人類個體。在一個實施例中,IL2係作為輸注液連續投與約20-30天;21-31天;21-29天;或22-28天。在一個實施例中,IL2係作為連續輸注投與7天、28天、一個月、兩個月或三個月。估計IL2藉由連續輸注之劑量含量以將血液含量維持在25-40IU/ml範圍內,其中假設經活化CAR T細胞上之高親和性IL2R之飽和度>98%。本文所述之方法可用於在T細胞投藥之後將IL2維持在容許含量達一個月,使得可達成更持久之抗腫瘤T細胞反應,此導致(例如)臨床反應,例如***特異性抗原(PSA)含量之降低。
或者,IL2可經靜脈內以100kIU/kg/8h或更多之劑量投與患有***癌之人類個體,其中IL2係在投與表現抗PSMA CAR之細胞群之後投與。在一個實施例中,IL2之劑量係100至720kIU/kg/8h或約300kIU/kg/8h。
當以此較高劑量投與時,IL2可經靜脈內作為團劑投與連續四天或更長(若耐受)。IL2之團劑亦可以100kIU/kg/8h或更多之劑量(例如,100至720kIU/kg/8h)投與連續五天、連續六天、連續七天等。在一個實施例中,IL2之劑量係200kIU/kg/8h至720kIU/kg/8h;200kIU/kg/8h至500kIU/kg/8h;250kIU/kg/8h至400kIU/kg/8h;300kIU/kg/8h至500kIU/kg/8h;或300kIU/kg/8h至400kIU/kg/8h。
在一個實施例中,向個體投與IL2係在投與表現PSMA-CAR之細胞群之同一天起始。在替代實施例中,IL2投與係在將PSMA-CAR表現細胞輸注至個體之後1天、2天、3天、4天、5天或6天開始。
在一些實施例中,在與PSMA-CAR表現細胞(例如,T細胞)之組合療法中所投與IL2之劑量係在起始IL2治療後之第一週內有效達成至少2000pg/ml之峰值血漿濃度之IL2的量。在替代實施例中,向人類個體投與在利用IL2治療期間有效維持500pg/ml、750pg/ml或1000pg/ml或更多之血漿含量之量的IL2。
實際上,本發明至少部分地基於表現PSMA-CAR之T細胞在人類個體中在某一血漿含量之IL2的存在下維持抗腫瘤活性及活化之發現。如下文實例中所述,個體(投與表現PSMA-CAR之T細胞者)之IL2的血漿含量低於約500pg/ml導致降低之抗腫瘤活性。該活性可藉由(例如)量測與***癌相關之標記物(例如***特異性抗原(PSA))來測定。PSA亦係測定臨床反應之標記物。
本文所述之方法有益於達成至少10%、至少20%、至少30%之經活化細胞植入或在某些實施例中至少50%之經活化細胞植入。如在下文實例中所觀察到,個體中IL2之血漿含量與***癌治療之臨床反應之間存在直接
相關性,其中1500pg/ml或更高之峰值血漿含量與正性臨床反應相關。因此,接受PSMA-CAR表現細胞輸注之個體中IL2之血漿含量可在(例如)CAR T細胞輸注後起始IL2療法之一天內或一週內評價。若經測定峰值含量較低(例如小於500pg/ml),則應將額外IL2投與個體。
IL-2可使用此項技術中已知之方法投與個體。舉例而言,IL-2可經動脈、皮下、真皮內、腫瘤內、結內、髓內、肌內、藉由靜脈內(i.v.)注射或腹膜內投與個體。在一個實施例中,IL-2係藉由皮下注射投與個體。在另一實施例中,IL-2係經靜脈內投與個體。IL-2亦可經由連續輸注或藉由團劑輸注投與個體。
在一個實施例中,本發明之特徵係治療已輸注表現抗PSMA CAR之細胞群之個體之***癌的方法,其中該方法包含根據投藥時間表向該個體投與IL2,使得在將細胞群投與個體後在個體中維持高於500pg/ml之IL2血漿含量達至少一週。在一個實施例中,個體之IL2血漿含量在將細胞群投與個體後維持1至2週。在另一實施例中,投藥時間表包含將100kIU/kg/8h至720kIU/kg/8h IL2投與個體,以維持所觀察到有利於維持表現PSMA-CAR之活化T細胞之期望IL2血漿含量。在又一實施例中,投藥時間表包含將約75000IU/kg/d IL2投與個體。
在一態樣中,本發明提供用於抑制個體中表現PSMA之癌細胞之增殖或減少癌細胞群之方法,該方法包含使癌症相關抗原表現細胞或細胞群與包含抗PSMA CAR之宿主細胞接觸,隨後將IL2投與個體,由此抑制表現PSMA之癌細胞之增殖或減少癌細胞群。在某些態樣中,該方法使得與投與宿主細胞之前之個體中的惡性及/或癌細胞之數量、數目、量或百分比相比,個體中的惡性及/或癌細胞之數量、數目、量或百分比減少至少25%、
至少30%、至少40%、至少50%、至少65%、至少75%、至少85%、至少95%或至少99%。
本發明方法包括投與表現抗PSMA CAR之宿主細胞群以治療***癌。細胞群(或包含該群之組合物)包括在用於本發明組合方法中時有效提供***癌治療之許多細胞。在一個實施例中,細胞群包含約1×108至約5×1011個細胞;或者,該群包含約5×108至約5×1011個細胞;約1×109至約1×1011個細胞;約5×109至約1×1011個細胞;約5×109至約5×1010個細胞;或約5×109至約5×1011個細胞。在一些實施例中,將約102個、103個、104個、105個、106個、107個、108個、109個、1010個、1011個、1012個或更多個本文所述包含編碼抗PSMA CAR之核酸之宿主細胞投與個體。宿主細胞組合物亦可以該等劑量投與多次。
經轉導宿主細胞之群可藉由此項技術中已知之任何方式投與個體,包括轉輸、植入或移植。在較佳實施例中,表現抗PSMA CAR之宿主細胞群係藉由輸注(例如團注或緩慢輸注)投與個體。
在一個實施例中,細胞群在投與人類個體之前已經抗CD3抗體活化。在另一實施例中,細胞係經抗CD3抗CD28珠粒活化。
在一個實施例中,細胞群在投與人類個體之前已經IL-12調整(例如,參見Emtage等人(2003)J.Immunother.16(2):97-106,其以引用的方式併入本文中)。
本文所揭示之組合方法包括投與治療劑與包含含有編碼抗PSMA CAR之表現載體之經轉導宿主細胞之組合物的組合,其中治療劑係在轉導細胞之組合物之前、之後或與其同時投與。治療劑之實例係IL2。替代額外治療劑係化學治療劑。
在一個實施例中,在投與細胞群之前,將非清髓性(NMA)化學療法投與人類個體。NMA調整用於誘導所輸注自體抗PSMA CAR細胞之穩定植入。此植入然後提供支援持久抗腫瘤反應之機會。因此,在NMA調整後輸注細胞提供癌症之改良治療的優點。該等NMA方法為業內已知,包括Dudley等人(2002)Science.298:850-4。因此,在一個實施例中,人類個體在輸注抗PSMA-CAR細胞之前經歷NMA調整。NMA調整包括在輸注細胞之前投與環磷醯胺及氟達拉濱。在較佳實施例中,環磷醯胺及氟達拉濱各自係在向個體輸注抗PSMA-CAR細胞之前10天內投與人類個體。舉例而言,環磷醯胺可投與2天(例如在輸注前之第-8天及第-7天)(輸注之日為0)且氟達拉濱可自第-6天至第-2天向個體投與連續五天。在一個實施例中,將60mg/kg環磷醯胺投與個體。在一個實施例中,將25mg/m2氟達拉濱投與個體。在一個實施例中,在第-1天(即將將抗PSMA CAR細胞輸注於個體之前的一天)係無治療之日。在一個實施例中,個體投與環磷醯胺及氟達拉濱之組合療法(作為單獨藥劑),其中環磷醯胺及氟達拉濱係在輸注轉導細胞之日(其亦係起始IL2療法之日)之前在個別天投與個體(即,係在當不投與另一藥劑之日投與個體)。
在本發明之一些態樣中,將表現抗PSMA CAR之宿主細胞投與個體,使得在將宿主細胞投與個體之後,宿主細胞(或其後代)在個體中存留既定天數,包括(但不限於)至少0.5天、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、31天或更長。
本文所揭示之方法可用於治療***癌。在一個實施例中,***癌
與PSMA之高表現含量相關聯。可使用本文所揭示之方法治療之***癌類型之實例包括(但不限於)轉移性***癌、復發性***癌或激素難治性***癌。
本文所揭示之方法至少部分地係基於投與表現特異性針對癌症抗原之嵌合抗原受體(CAR)之宿主細胞。在一個實施例中,本文所揭示之方法至少部分地係基於投與表現PSMA特異性嵌合抗原受體(CAR)之宿主細胞。
CAR係可靶向呈其天然構象之表面分子的合成工程化受體。不像TCR那樣,CAR獨立於藉由靶細胞之抗原處理且獨立於MHC而接合分子結構。CAR通常經由源自抗體之單鏈可變片段(scFv)接合靶標。
CAR通常含有識別腫瘤抗原(例如PSMA)之抗體的細胞外區(例如單鏈可變片段(scFv)、跨膜結構域及細胞內區(例如模擬TCR活化之T細胞受體(TCR)ζ鏈))。CAR亦可進一步包含源自CD28或4-IBB之細胞內信號傳導結構域以模擬共刺激。因此,CAR通常藉由將抗體之抗原識別結構域與T細胞之受體的信號傳導結構域連接而構築。用編碼CAR之核酸序列修飾T細胞使T細胞配備有重靶向抗體型抗腫瘤細胞毒性。由於殺死係MHC非限制性的,故該途徑提供用於具有相同抗原之所有患者的一般療法。經人工CAR工程化之該等T細胞通常稱為「設計者T細胞」、「CAR-T細胞」或「T體(T-body)」(Eshhar等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(2):720-724,1993;Ma等人Cancer Chemother.Biol.Response Modif.20:315-41,2002)。
在一個實施例中,在本發明方法中使用US 2007/0031438(其以引用
的方式併入本文中)中所述之抗PSMA CAR。
用於本發明中之實例性CAR亦提供於圖7中。
本發明部分地關於使用結合癌症抗原(例如PSMA,例如人類PSMA)之CAR治療之方法。因此,在一態樣中,CAR之抗原結合區包含結合至癌症抗原之抗原結合蛋白。舉例而言,本發明方法中所用CAR之細胞外區可包含結合選自以下中之一者之癌症抗原的抗原結合蛋白(例如scFv):進一步,癌胚抗原(CEA)、CD19、GM2、GD2、唾液酸Tn(STn)、HER2、EGFR、GD3、IL13R、MUC-1、PSMA及EGFRvIII。在一個實施例中,抗PSMA CAR之抗原結合區包含結合至PSMA之抗原結合蛋白。
在一個實施例中,本發明提供包含含有結合至PSMA之抗原結合蛋白之細胞外區之抗PSMA CAR,其中抗原結合蛋白包含含有與SEQ ID NO:2之胺基酸序列具有至少95%一致性之胺基酸序列之重鏈可變(VH)結構域。在一個實施例中,抗PSMA CAR包含細胞外區,該細胞外區包含含有與SEQ ID NO:2之胺基酸序列具有至少96%一致性之胺基酸序列之VH結構域。在一個實施例中,抗PSMA CAR包含細胞外區,該細胞外區包含含有與SEQ ID NO:2之胺基酸序列具有至少97%一致性之胺基酸序列之VH結構域。在一個實施例中,抗PSMA CAR包含細胞外區,該細胞外區包含含有與SEQ ID NO:2之胺基酸序列具有至少98%一致性之胺基酸序列之VH結構域。在一個實施例中,抗PSMA CAR包含細胞外區,該細胞外區包含含有與SEQ ID NO:2之胺基酸序列具有至少99%一致性之胺基酸序列之VH結構域。在一個實施例中,抗PSMA CAR包含細胞外區,該細胞外區包含含有SEQ ID NO:2之胺基酸序列之VH結構域。在又一實施例中,
抗PSMA CAR包含含有SEQ ID NO:2中所述CDR之細胞外區(根據Kabat編號)。
在一個實施例中,本發明提供包含含有結合至PSMA之抗原結合蛋白之細胞外區之抗PSMA CAR,其中該抗原結合蛋白包含含有與SEQ ID NO:1之胺基酸序列具有至少95%一致性之胺基酸序列之輕鏈可變(VL)結構域。在一個實施例中,抗PSMA CAR包含細胞外區,該細胞外區包含含有與SEQ ID NO:1之胺基酸序列具有至少96%一致性之胺基酸序列之VL結構域。在一個實施例中,抗PSMA CAR之細胞外區包含含有與SEQ ID NO:1之胺基酸序列具有至少97%一致性之胺基酸序列之VL結構域。在一個實施例中,抗PSMA CAR之細胞外區包含含有與SEQ ID NO:1之胺基酸序列具有至少98%一致性之胺基酸序列之VL結構域。在一個實施例中,抗PSMA CAR之細胞外區包含含有與SEQ ID NO:1之胺基酸序列具有至少99%一致性之VL結構域。在一個實施例中,抗PSMA CAR之細胞外區包含含有SEQ ID NO:1之胺基酸序列之VL結構域。
在一個實施例中,本文所用CAR之細胞外部分包含含有來自抗體3D8之抗原結合區的細胞外結構域。
在一個實施例中,抗PSMA CAR包含抗PSMA scFv或其功能部分;CD8鉸鏈區或其功能部分;及CD3 ζ信號傳導區或其功能部分;其中該抗PSMA scFv包含含有SEQ ID NO:1中所述胺基酸序列之輕鏈可變區及包含SEQ ID NO:2中所述胺基酸序列之重鏈可變區;其中CD8鉸鏈區或其功能部分包含SEQ ID NO:4中所述之胺基酸序列;且其中CD3 ζ信號傳導區或其功能部分包含SEQ ID NO:5、11、12、13及14中所述胺基酸序列中之任一者。視情況,抗PSMA CAR可包括V5標籤,例如包含SEQ ID NO:3或
SEQ ID NO:9中所述胺基酸序列之V5標籤。視情況,抗PSMA CAR可包括N-末端信號肽,例如SEQ ID NO:10中所述之信號肽。
在一個實施例中,抗PSMA CAR包含抗PSMA scFv或其功能部分;CD8鉸鏈區或其功能部分;及CD28信號傳導區或其功能部分;其中抗PSMAscFv包含含有SEQ ID NO:1中所述胺基酸序列之輕鏈可變區及包含SEQ ID NO:2中所述胺基酸序列之重鏈可變區;其中CD8鉸鏈區或其功能部分包含SEQ ID NO:4中所述之胺基酸序列;且其中CD28信號傳導區或其功能部分包含SEQ ID NO:15、16、17、18及19中所述胺基酸序列之任一者。
視情況,抗PSMA CAR可包括V5標籤,例如包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:9中所述胺基酸序列之V5標籤。視情況,抗PSMA CAR可包括N-末端信號肽,例如SEQ ID NO:10中所述之信號肽。
在一個實施例中,在重鏈或輕鏈內進行之具有至少95%一致性(或至少96%一致性、或至少97%一致性、或至少98%一致性、或至少99%一致性)之取代係保守胺基酸取代。「保守胺基酸取代」係胺基酸殘基由具有具有類似化學性質(例如,電荷或疏水性)之側鏈(R基團)的另一胺基酸殘基取代者。一般而言,保守胺基酸取代將不會實質上改變蛋白質之功能性質。倘若兩個或更多個胺基酸序列因保守取代而彼此不同,則可向上調整序列一致性百分比或類似性程度以校正取代之保守性質。進行此調整之方式為彼等熟習此項技術者所熟知。參見(例如)Pearson(1994)Methods Mol.Biol.24:307-331,其以引用方式併入本文中。具有類似化學性質之側鏈之胺基酸之基團的實例包括(1)脂肪族側鏈:甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸及異白胺酸;(2)脂肪族-羥基側鏈:絲胺酸及蘇胺酸;(3)含有醯胺之側鏈:
天冬醯胺及麩醯胺酸;(4)芳香族側鏈:***酸、酪胺酸及色胺酸;(5)鹼性側鏈:離胺酸、精胺酸及組胺酸;(6)酸性側鏈:天冬胺酸鹽及麩胺酸鹽及(7)含硫側鏈係半胱胺酸及甲硫胺酸。
單鏈抗體可藉由經由胺基酸橋(短肽鏈接體)鏈接重鏈及輕鏈可變結構域(Fv區)而形成,此產生單一多肽鏈。此等單鏈Fv(scFv)已藉由在編碼兩個可變結構域多肽(VL及VH)之DNA之間融合編碼肽鏈接體之DNA製備。所得多肽自身可向後摺疊以形成抗原結合單體,或其可形成多聚體(例如,二聚體、三聚體或四聚體),此取決於兩個可變結構域之間之撓性鏈接體長度(Kortt等人,1997,Prot.Eng.10:423;Kortt等人,2001,Biomol.Eng.18:95-108)。
在一個實施例中,scFv包含在其VL及VH區之間具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50個或更多個胺基酸殘基之鏈接體。鏈接體序列可包含任何天然胺基酸。在一個實施例中,鏈接體序列包含胺基酸甘胺酸及絲胺酸。在一個實施例中,鏈接體序列包含甘胺酸及絲胺酸重複,例如(Gly4Ser)n,其中n係等於或大於1之正整數(SEQ ID NO:31)。在一個實施例中,鏈接體係(Gly4Ser)4(SEQ ID NO:23)或(Gly4Ser)3(SEQ ID NO:22)。鏈接體長度之變化可保留或增強活性,從而在活性研究中產生優異效能。在一個實施例中,鏈接體序列係胺基酸序列GGSGSGGSGSGGSGS(SEQ ID NO:21)。
藉由組合包含不同VL及VH之多肽,可形成結合不同表位之多聚體scFv(Kriangkum等人,2001,Biomol.Eng.18:31-40)。所研發用於產生單鏈抗體之技術包括闡述於以下中者:美國專利4,946,778;Bird,1988,
Science 242:423;Huston等人,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879;Ward等人,1989,Nature 334:544,de Graaf等人,2002,Methods Mol.Biol.178:379-87。
在一個實施例中,本發明提供包含細胞外區之抗PSMA CAR,該細胞外區為包含以下之抗PSMA scFv:具有包含SEQ ID NO:1中所述胺基酸序列之可變結構域之輕鏈;及具有包含SEQ ID NO:2中所述胺基酸序列之可變結構域之重鏈。SEQ ID NO:1及2之胺基酸序列提供於下文中。
抗體3D8之輕鏈可變區之胺基酸序列
(SEQ ID NO:1)
抗體3D8之重鏈可變區之胺基酸序列
(SEQ ID NO:2)
在一個實施例中,本發明提供包含抗原結合蛋白(例如scFv)之抗PSMA CAR,其包含具有對應於包含SEQ ID NO:1中所述胺基酸序列之可變結構域之互補決定區(CDR)組(意指CDR1、CDR2及CDR3)之輕鏈;及對應於具有包含SEQ ID NO:2中所述之胺基酸序列之可變結構域之重鏈的CDR組。
互補決定區(CDR)稱作輕鏈及重鏈可變結構域二者中之超變區。可變結構域之保守程度較高之部分稱為框架(FR)。既定抗體之互補決定區(CDR)及框架區(FR)可使用由Kabat等人(見上文)、Lefranc等人(見上文)及/或Honegger及Pluckthun(見上文)所述之系統鑑別。熟習此項技術者亦熟悉者係Kabat等人(1991,NIH Publication 91-3242,National Technical Information Service,Springfield,Va.)中所闡述之編號系統。就此而言,Kabat等人定義用於可變結構域序列且適用於任一抗體之編號系統。熟習此
項技術者可明確地將此「Kabat編號」系統指派給任何可變結構域胺基酸序列,除序列本身外不依賴於任何實驗數據。
除負責結合抗原(即,PSMA)之CAR之細胞外區外,CAR包含跨膜結構域。本發明抗PSMA CAR之跨膜結構域可為此項技術中已知且如下文所述之任何形式。
如本文所用,術語「跨膜結構域」係指在細胞膜、較佳真核細胞膜(例如,哺乳動物細胞膜)中熱力學穩定之任一多肽結構。
可與用於本文所揭示之抗PSMA CAR中相容之跨膜結構域可自任何天然跨膜蛋白或其片段獲得。或者,跨膜結構域可係合成、非天然跨膜蛋白或其片段,例如在細胞膜(例如,哺乳動物細胞膜)中熱力學穩定之疏水蛋白質片段。
在一些實施例中,跨膜結構域係源自I型膜蛋白,即,具有經定向使得蛋白質之N末端存於細胞之脂質雙層的細胞外側上且蛋白質C末端存於細胞質側之單一跨膜區之膜蛋白。在一些實施例中,跨膜蛋白可源自II型膜蛋白,即,具有經定向使得蛋白質之C末端存於細胞之脂質雙層的細胞外側上且蛋白質之N末端存於細胞質側上之單一跨膜區之膜蛋白。在其他實施例中,跨膜結構域係源自III型膜蛋白,即,具有多個跨膜片段之膜蛋白。
用於本文所述抗PSMA CAR中之跨膜結構域亦可包含合成、非天然蛋白質片段之至少一部分。在一些實施例中,跨膜結構域係合成、非天然α螺旋或β褶疊。在一些實施例中,蛋白質片段之長度係至少大約20個胺基酸,例如至少18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30
個或更多個胺基酸。合成跨膜結構域之實例為業內已知,例如美國專利第7,052,906 B1號及PCT公開案第WO 2000/032776 A2號中(其內容係以引用方式併入本文中)、且特定而言關於合成跨膜結構域之揭示內容中。
在一個實施例中,抗PSMA CAR包含具有SEQ ID NO:12、13或18中任一者之胺基酸序列之跨膜結構域。
在一些實施例中,抗PSMA CAR之跨膜結構域包含CD3 ζ之跨膜結構域或其功能部分,例如包含胺基酸序列LCYLLDGILFIYGVILTALFL(SEQ ID NO:12)或與SEQ ID NO:12之胺基酸序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或以上序列一致性之胺基酸序列之跨膜結構域。
在一些實施例中,抗PSMA CAR之跨膜結構域包含CD3 ζ之跨膜結構域或其功能部分,例如包含胺基酸序列LDPKLCYLLDGILFIYGVILTALFLRVK(SEQ ID NO:13)或與SEQ ID NO:13之胺基酸序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或以上序列一致性之胺基酸序列之跨膜結構域。
在一些實施例中,抗PSMA CAR之跨膜結構域包含人類CD28(例如,登錄號P01747.1)之跨膜結構域或其功能部分,例如包含胺基酸序列FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV(SEQ ID NO:18)或與SEQ ID NO:18之胺基酸序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或以上序列一致性之胺基酸序列之跨膜結構域。
在一個實施例中,抗PSMA CAR中所用之跨膜結構域係源自選自以下
之膜蛋白:CD8α、CD8β、4-1BB/CD137、CD28、CD34、CD4、FcεRIγ、CD16、OX40/CD134、CD3 ζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、TCRα、TCRβ、TCRζ、CD32、CD64、CD64、CD45、CD5、CD9、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD137、CD154、LFA-1 T細胞輔受體、CD2 T細胞輔受體/黏著分子、CD40、CD4OL/CD154、VEGFR2、FAS及FGFR2B。在一些實施例中,跨膜結構域係源自CD8α。在一些實施例中,跨膜結構域係源自4-1BB/CD137。在其他實施例中,跨膜結構域係源自CD28或CD34。
通常,CAR係作為某一代(例如「第一」或「第二」代)而提及。CAR之「代」通常係指細胞內信號傳導結構域。第一代CAR僅包括CD3 ζ作為細胞內信號傳導結構域,而第二代CAR包括通常源自CD28或4-1BB之共刺激結構域。第三代CAR包括兩個共刺激結構域,例如CD28、4-1BB及其他共刺激分子。
本文所揭示用於本發明方法之抗PSMA CAR包含細胞內信號傳導結構域。信號傳導結構域通常負責活化表現抗PSMA CAR之細胞(例如,免疫細胞,例如T細胞)之至少一種正常效應物功能。術語「效應物功能」係指細胞之特殊功能。例如,T細胞之效應物功能可包括細胞溶解活性或輔助活性,包括(例如)分泌細胞介素。因此,術語「信號傳導結構域」係指轉導效應物功能信號且引導細胞以實施特殊功能之蛋白質部分。儘管通常可採用整個細胞內信號傳導結構域,但在許多情形下無需使用整條鏈或結構域。因此,就使用細胞內信號傳導結構域之截短部分而言,可使用該截短部分(或功能部分)來替代完整結構域,只要其轉導效應物功能信號即可。
適用於本發明抗PMSA CAR中之細胞內信號傳導結構域之實例包括T
細胞受體(TCR)及在抗原受體接合後協同起起始信號轉導作用之共受體的細胞質序列,以及該等序列之任何衍生物或變體及具有相同功能性能力之任何重組序列。
在較佳實施例中,本發明方法中所用之抗PSMA CAR包含人類CD3 ζ信號傳導區或其功能部分。在一個實施例中,人類CD3 ζ信號傳導區包含下文所提供之SEQ ID NO:5中所述之胺基酸序列或與SEQ ID NO:5之胺基酸序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或以上序列一致性之胺基酸序列
(SEQ ID NO:5)。
在一個實施例中,CD3 ζ信號傳導區或其功能部分包含胺基酸序列LDPK(SEQ ID NO:11)或與SEQ ID NO:11之胺基酸序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或以上序列一致性之胺基酸序列。在一個實施例中,CD3 ζ信號傳導區或其功能部分包含胺基酸序列LCYLLDGILFIYGVILTALFL(SEQ ID NO:12)或與SEQ ID NO:12之胺基酸序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或以上序列一致性之胺基酸序列。在一個實施例中,CD3 ζ信號傳導區或其功能部分包含胺基酸序列LDPKLCYLLDGILFIYGVILTALFLRVK(SEQ ID NO:13)或與SEQ ID NO:13之胺基酸序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、
92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或以上序列一致性之胺基酸序列。在一個實施例中,CD3 ζ信號傳導區或其功能部分包含胺基酸序列
(SEQ ID NO:14)或與SEQ ID NO:14
之胺基酸序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或以上序列一致性之胺基酸序列。
在較佳實施例中,本發明方法中所用之抗PSMA CAR包含人類CD28信號傳導區或其功能部分。在一個實施例中,人類CD28信號傳導區包含下文所提供之SEQ ID NO:16中所述之胺基酸序列或與SEQ ID NO:16之胺基酸序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或以上序列一致性之胺基酸序列
(SEQ ID NO:
16)。
在一個實施例中,CD28信號傳導區或其功能部分包含胺基酸序列RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(SEQ ID NO:15)或與SEQ ID NO:15之胺基酸序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或以上序列一致性之胺基酸序列。在一個實施例中,CD28信號傳導區或其功能部分包含胺基酸序列KIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP(SEQ ID NO:17)或與SEQ ID NO:17之胺基酸序列具有至少85%、86%、87%、88%、
89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或以上序列一致性之胺基酸序列。在一個實施例中,CD8區或其功能部分包含胺基酸序列FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV(SEQ ID NO:18)或與SEQ ID NO:18之胺基酸序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或以上序列一致性之胺基酸序列。在一個實施例中,CD28信號傳導區或其功能部分包含胺基酸序列RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(SEQ ID NO:19)或與SEQ ID NO:19之胺基酸序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或以上序列一致性之胺基酸序列。
本發明之抗PSMA CAR之細胞內結構域可包括之信號傳導結構域之實例包括(但不限於)TCR ζ、FcR γ、FcR β、CD3 γ、CD3 δ、CD3 ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b及CD66d之信號傳導結構域。在一些實施例中,本發明之抗PSMA CAR包含人類CD3 ζ之信號傳導結構域。在其他實施例中,抗PSMA CAR包含人類CD28之信號傳導結構域。上述實例之功能片段亦包括在本發明中。在一些實施例中,抗PSMA CAR之細胞內結構域中包括多個信號傳導結構域(例如,一個、兩個、三個、四個或多個)。
在一些實施例中,本發明之抗PSMA CAR之細胞內結構域進一步包含共刺激信號傳導結構域。在一些實施例中,本發明之抗PSMA CAR之細胞內結構域包含信號傳導結構域及共刺激結構域。如本文所用,術語「共刺激信號傳導結構域」係指在細胞內調介信號轉導以誘導反應(例如效應物功能)之蛋白質之一部分。本發明之抗PSMA CAR之共刺激信號傳導結構域可
係共刺激蛋白質之細胞質信號傳導結構域,其轉導信號並調節藉由免疫細胞(例如,T細胞或NK細胞)調介之反應。
嵌合受體中所用共刺激信號傳導結構域之實例可係共刺激蛋白質之細胞質信號傳導結構域,包括(但不限於)B7/CD28家族之成員(例如,B7-1/CD80、B7-2/CD86、B7-H1/PD-L1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H6、B7-H7、BTLA/CD272、CD28、CTLA-4、Gi24/VISTA/B7-H5、ICOS/CD278、PD-1、PD-L2/B7-DC及PDCD6);TNF超家族之成員(例如,4-1BB/TNFSF9/CD137、4-1BB配體/TNFSF9、BAFF/BLyS/TNFSF13B、BAFF R/TNFRSF13C、CD27/TNFRSF7、CD27配體/TNFSF7、CD30/TNFRSF8、CD30配體/TNFSF8、CD40/TNFRSF5、CD40/TNFSF5、CD40配體/TNFSF5、DR3/TNFRSF25、GITR/TNFRSF18、GITR配體/TNFSF18、HVEM/TNFRSF14、LIGHT/TNFSF14、淋巴毒素-α/TNF-β、OX40/TNFRSF4、OX40配體/TNFSF4、RELT/TNFRSF19L、TACI/TNFRSF13B、TL1A/TNFSF15、TNF-α及TNF RII/TNFRSF1B);介白素-1受體/類鐸受體(TLR)超家族之成員(例如,TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9及TLR10);SLAM家族之成員(例如,2B4/CD244/SLAMF4、BLAME/SLAMF8、CD2、CD2F-10/SLAMF9、CD48/SLAMF2、CD58/LFA-3、CD84/SLAMF5、CD229/SLAMF3、CRACC/SLAMF7、NTB-A/SLAMF6及SLAM/CD150);及任何其他共刺激分子,例如CD2、CD7、CD53、CD82/Kai-1、CD90/Thy1、CD96、CD160、CD200、CD300a/LMIR1、HLA I類、HLA-DR、ikaros、整聯蛋白α 4/CD49d、整聯蛋白α 4 β 1、整聯蛋白α 4 β 7/LPAM-1、LAG-3、TCL1A、TCL1B、CRTAM、DAP10、
DAP12、MYD88、TRIF、TIRAP、TRAF、Dectin-1/CLEC7A、DPPIV/CD26、EphB6、TIM-1/KIM-1/HAVCR、TIM-4、TSLP、TSLP R、淋巴球功能相關抗原-1(LFA-1)及NKG2C。在一些實施例中,共刺激結構域包含選自由以下組成之群之活化受體蛋白質之細胞內結構域:α4β1整聯蛋白、β2整聯蛋白(CD11a-CD18、CD11b-CD18、CD11b-CD18)、CD226、CRTAM、CD27、NKp46、CD16、NKp30、NKp44、NKp80、NKG2D、KIR-S、CD100、CD94/NKG2C、CD94/NKG2E、NKG2D、PEN5、CEACAM1、BY55、CRACC、Ly9、CD84、NTBA、2B4、SAP、DAP10、DAP12、EAT2、FcRγ、CD3 ζ及ERT。在一些實施例中,共刺激結構域包含選自由以下組成之群之抑制性受體蛋白質之細胞內結構域:KIR-L、LILRB1、CD94/NKG2A、KLRG-1、NKR-P1A、TIGIT、CEACAM、SIGLEC 3、SIGLEC 7、SIGLEC9及LAIR-1。
在一些實施例中,抗PSMA CAR包含含有至少一個選自由以下組成之群之共刺激信號傳導結構域之細胞內結構域:CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD1、ICOS、淋巴球功能相關抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C及B7-H3。
在一些實施例中,抗PSMA CAR包含CD3 ζ之細胞內結構域或其功能部分。在一些實施例中,CD3 ζ之細胞內結構域或其功能部分包含胺基酸序列
(SEQ ID NO:14)或與SEQ ID NO:14
之胺基酸序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、
93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或以上序列一致性之胺基酸序列。
在一些實施例中,抗PSMA CAR包含CD28之細胞內結構域或其功能部分。在一些實施例中,CD28之細胞內結構域或其功能部分包含胺基酸序列RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(SEQ ID NO:15)或與SEQ ID NO:15之胺基酸序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或以上序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中,CD28之細胞內結構域或其功能部分包含胺基酸序列RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(SEQ ID NO:19)或與SEQ ID NO:19之胺基酸序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或以上序列一致性之胺基酸序列。
在一些實施例中,抗PSMA CAR包含4-IBB之細胞內結構域或其功能部分。在一些實施例中,4-IBB之細胞內結構域或其功能部分包含胺基酸序列KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(SEQ ID NO:20)或與SEQ ID NO:20之胺基酸序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或以上序列一致性之胺基酸序列。
在一些實施例中,本發明之抗PSMA CAR可包含一個以上共刺激信號傳導結構域(例如,2、3、4、5、6、7、8或更多個共刺激信號傳導結構域)。在一些實施例中,抗PSMA CAR包含兩個或更多個來自不同共刺激蛋白質(例如本文所述之任兩個或更多個共刺激蛋白質)之共刺激信號傳導結構
域。在一些實施例中,抗PSMA CAR包含兩個或更多個來自相同共刺激蛋白質之共刺激信號傳導結構域(即,重複)。
共刺激信號傳導結構域類型之選擇可基於諸如以下因素:將表現抗PSMA CAR之宿主細胞之類型(例如,T細胞、NK細胞、巨噬細胞、嗜中性球或嗜酸性球)及期望之細胞效應物功能(例如,免疫效應物功能)。
細胞內結構域中之信號傳導序列(即,信號傳導結構域及/或共刺激信號傳導結構域)可以隨機或特定順序彼此鏈接。抗PSMA CAR之細胞內結構域可包含一或多個佈置於信號傳導序列之間之鏈接體。在一些實施例中,鏈接體可為短的寡肽或多肽鏈接體,例如長度介於2個與10個胺基酸之間(例如,2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸)。在一些實施例中,鏈接體之長度可多於10個胺基酸。本文所揭示或對於彼等熟悉此項技術者顯而易見之任何鏈接體均可用於本發明抗PSMA CAR之細胞內結構域中。
在一些實施例中,抗PSMA CAR進一步包含鉸鏈區。在一些實施例中,鉸鏈區位於scFv抗體區與跨膜結構域之間。鉸鏈區係通常於蛋白質之兩個結構域之間發現之胺基酸片段且可允許抗PSMA CAR之撓性及一個或兩個結構域相對於彼此移動。
在一些實施例中,鉸鏈區包含約10個至約100個胺基酸,例如約15個至約75個胺基酸、約20個至約50個胺基酸或約30個至約60個胺基酸。在一些實施例中,鉸鏈區之長度係10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100個胺基酸。在一些實施例中,鉸鏈區之長度多於100個胺基酸。
在一些實施例中,鉸鏈區係天然蛋白質之鉸鏈區。此項技術中任何習知包含鉸鏈區之蛋白質的鉸鏈區皆可用於本文所述抗PSMA CAR。在一些實施例中,鉸鏈區係天然蛋白質之鉸鏈區的至少一部分且賦予抗PSMA CAR之細胞外區撓性。在一些實施例中,鉸鏈區係CD8鉸鏈區。在一些實施例中,鉸鏈區係CD8α鉸鏈區。在一些實施例中,鉸鏈區係CD8鉸鏈區之一部分,例如含有CD8鉸鏈區之至少15個(例如,20、25、30、35或40)連續胺基酸之片段。在一些實施例中,鉸鏈區係CD8α鉸鏈區之一部分,例如含有CD8α鉸鏈區之至少15個(例如,20、25、30、35或40)連續胺基酸之片段。
在一些實施例中,抗PSMA CAR包含CD8鉸鏈區或其功能部分。在一些實施例中,CD8鉸鏈區或其功能部分包含胺基酸序列KPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFA(SEQ ID NO:4)或與SEQ ID NO:4之胺基酸序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或以上序列一致性之胺基酸序列。
在一些實施例中,鉸鏈區係抗體(例如,IgG、IgA、IgM、IgE或IgD抗體)之鉸鏈區。在一些實施例中,鉸鏈區係連接抗體之恆定結構域CH1及CH2之鉸鏈區。在一些實施例中,鉸鏈區係抗體且包含抗體之鉸鏈區及抗體之一或多個恆定區。在一些實施例中,鉸鏈區包含抗體之鉸鏈區及抗體之CH3恆定區。在一些實施例中,鉸鏈區包含抗體之鉸鏈區及抗體之CH2及CH3恆定區。
在一些實施例中,鉸鏈區係非天然肽。在一些實施例中,鉸鏈區係(GlyxSer)n鏈接體,其中x及n可獨立地為3與12之間之整數(包括3、4、5、
6、7、8、9、10、11、12)或以上。在一些實施例中,鉸鏈區係(Gly4Ser)n,其中n可係3與60之間之整數或以上,包括3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60。在一些實施例中,鉸鏈區包含甘胺酸及絲胺酸重複,例如(Gly4Ser)n(其中n係等於或大於1之正整數)(SEQ ID NO:31)。在一些實施例中,鉸鏈區係(Gly4Ser)3(SEQ ID NO:22)。在一些實施例中,鉸鏈區係(Gly4Ser)6(SEQ ID NO:24)。在一些實施例中,鉸鏈區係(Gly4Ser)9(SEQ ID NO:25)。在一些實施例中,鉸鏈區係(Gly4Ser)12(SEQ ID NO:26)。在一些實施例中,鉸鏈區係(Gly4Ser)15(SEQ ID NO:27)。在一些實施例中,鉸鏈區係(Gly4Ser)30(SEQ ID NO:28)。在一些實施例中,鉸鏈區係(Gly4Ser)45(SEQ ID NO:29)。在一些實施例中,鉸鏈區係(Gly4Ser)60(SEQ ID NO:30)。
在一些實施例中,鉸鏈區係延伸重組多肽(XTEN),其係由可變長度之親水性殘基(例如,10-80個胺基酸殘基)組成之未結構化多肽。XTEN肽之胺基酸序列為業內已知(例如,參見美國專利第8,673,860號,其內容係以引用方式併入本文中)。在一些實施例中,鉸鏈區係XTEN肽且包含60個胺基酸。在一些實施例中,鉸鏈區係XTEN肽且包含30個胺基酸。在一些實施例中,鉸鏈區係XTEN肽且包含45個胺基酸。在一些實施例中,鉸鏈區係XTEN肽且包含15個胺基酸。
在一些實施例中,鉸鏈區係非天然肽。在一些實施例中,鉸鏈區係佈置在CAR之scFv之C末端及跨膜結構域之N末端之間。
在一些實施例中,CAR包含用於鑑別CAR之標籤。舉例而言,抗PSMA
CAR可包括V5標籤。V5表位標識係源自副黏液病毒猿猴病毒5(SV5)之P及V蛋白上存在之小的表位(Pk)。V5標籤通常以所有14個胺基酸(GKPIPNPLLGLDST;SEQ ID NO:3)使用,但其亦可以較短的9胺基酸序列(IPNPLLGLD;SEQ ID NO:9)使用。
在一些實施例中,CAR包含信號肽。信號肽促進細胞表面之CAR的表現。與用於本文所述CAR中相容之信號肽(包括天然蛋白質之信號肽或合成、非天然信號肽)對於彼等熟悉此項技術者將顯而易見。在一些實施例中,信號肽佈置於CAR之抗原結合部分的N末端。在一些實施例中,信號肽包含胺基酸序列MEWSWVFLFFLSVTTGVHS(SEQ ID NO:10)或與SEQ ID NO:10之胺基酸序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或以上序列一致性之胺基酸序列。
本發明包括投與表現CAR(例如本文所述之抗PSMA CAR)之宿主細胞群或經編碼本文所述之抗PSMA CAR之核酸分子轉導之宿主細胞群。在一些實施例中,宿主細胞性免疫細胞(例如,T細胞、NK細胞、巨噬細胞、單核球、嗜中性球、嗜酸性球、細胞毒性T淋巴球、調控性T細胞或其任一組合)。在一些實施例中,宿主細胞係T細胞。在一些實施例中,宿主細胞係自然殺傷(NK)T細胞或胎盤源NK細胞。
在一個實施例中,本發明中所用之細胞係自體細胞。術語「自體」係指源自同一個體且隨後再引入該個體中之任何材料。因此,在某些實施例中,抗PSMA CAR表現細胞係取自患有***癌之人類個體,經編碼抗PSMA CAR之DNA載體轉導,並再引入(例如,輸注)返回至個體用於治療。
用於本發明之免疫細胞群可自任何來源獲得,例如末梢血單核細胞(PBMC)、骨髓、組織(例如脾、淋巴結、胸腺或腫瘤組織)。適於獲得所期望宿主細胞類型之來源對於熟習此項技術者將係顯而易見的。在一些實施例中,免疫細胞群係源自PBMC。
本文所用之細胞(例如,T細胞或天然殺傷(NK)細胞)經工程化以表現抗PSMA CAR。為產生表現本文所揭示抗PSMA CAR之宿主細胞,可經由習用方法構築用於穩定或瞬時表現抗PSMA CAR之表現載體並引入經分離之宿主細胞中。舉例而言,可將編碼抗PSMA CAR之核酸(例如,DNA或mRNA)選殖於可操作地鏈接至適宜啟動子之適宜表現載體(例如,病毒載體)中。可向細胞提供呈病毒載體形式之表現載體。病毒載體技術已為此項技術熟知且闡述於(例如)Sambrook等人(2012)MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,第1-4卷,Cold Spring Harbor Press,NY及其他病毒學及分子生物學手冊中。可用作載體之病毒包括(但不限於)逆轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、皰疹病毒及慢病毒。一般而言,適宜載體含有至少一種生物體中之複製功能起點、啟動子序列、方便的限制性核酸內切酶位點及一或多個可選標記物(例如,PCT申請案第WO 01/96584號;第WO 01/29058號;及美國專利第6,326,193號中所述揭示)。適宜載體及產生含有轉基因之載體之方法已為此項技術熟知且可獲得。在一些實施例中,載體係病毒載體。在一些實施例中,病毒載體選自由以下組成之群:反轉錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體及腺相關載體。
可使用各種啟動子來表現本文所述之抗PSMA CAR,其包括(但不限於)巨細胞病毒(CMV)立即早期啟動子、病毒LTR(例如,勞斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)LTR、HIV-LTR、HTLV-1 LTR)、猿猴病毒40(SV40)
早期啟動子、單純皰疹tk病毒啟動子。用於表現抗PSMA CAR之額外啟動子包括哺乳動物細胞(例如,免疫細胞)中之任何組成型活性啟動子。或者,可使用任何可調控啟動子,使得其表達可在宿主細胞內調節。
用於本發明之載體可含有(例如)以下中之一或多者:可選標記物基因(例如,用於選擇穩定或瞬時轉染子之新黴素基因);來自人類CMV之立即早期基因用於高轉錄含量之增強子/啟動子序列;來自SV40用於mRNA穩定性之轉錄終止及RNA處理信號;複製之SV40多瘤起源及用於適當游離型複製之ColE1;內部核糖體結合位點(IRESe)、通用型多選殖位點;用於正義及反義RNA之活體外轉錄的T7及SP6 RNA啟動子;「自殺開關」或「自殺基因」,其當觸發時造成攜帶載體之細胞死亡(例如,HSV胸苷激酶、可誘導性半胱天冬酶,例如iCasp9),及用於評價抗PSMA CAR之表現的報導基因。
遞送編碼抗PSMA CAR之核酸(例如,載體)至宿主細胞之方法已為業內所熟知。編碼抗PSMA CAR之核酸(例如,DNA或mRNA)可使用許多不同方法中之任一者引入宿主細胞中,例如市售方法,其包括(但不限於)電穿孔(Amaxa Nucleofector-II(Amaxa Biosystems)、ECM 830(BTX)(Harvard Instruments)或Gene Pulser II(BioRad)、Multiporator(Eppendorf))、使用脂轉染之陽離子脂質體介導之轉染、聚合物囊封、肽介導之轉染或生物彈道學(biolistic)粒子遞送系統(例如,「基因槍」)(參見例如Nishikawa等人(2001)HUM GENE THER.12(8):861-70)。
在一些實施例中,編碼本發明抗PSMA CAR之載體係藉由病毒轉導遞送至宿主細胞。用於遞送之實例性病毒方法包括(但不限於)重組反轉錄病毒(例如,參見PCT公開案第WO 90/07936號;第WO 94/03622號;第WO
93/25698號;第WO 93/25234號;第WO 93/11230號;第WO 93/10218號;第WO 91/02805號;美國專利第5,219,740號及第4,777,127號;GB專利第2,200,651號;及EP專利第0 345 242號)、基於α病毒之載體及腺相關病毒(AAV)載體(例如,參見PCT公開案第WO 94/12649號、第WO 93/03769號;第WO 93/19191號;第WO 94/28938號;第WO 95/11984號;及第WO 95/00655號)。
本發明中所包括之宿主細胞可表現一種以上類型之抗PSMA CAR(例如,兩種類型之抗PSMA CAR)。一種以上類型之抗PSMA CAR之表現特定而言對於治療目的係有利的。
本發明亦提供包含一或多種本文所揭示組合物之套組。本發明之套組包括一或多個容器,其包含含有本文所揭示抗PSMA CAR之宿主細胞群,且在一些實施例中進一步包含跟進本文所述之任一方法使用之說明書。套組可進一步包含選擇適於治療之個體(例如患有與PSMA表現相關聯之癌症的個體)之說明。本發明套組中供應之說明書通常係標記或包裝插頁(例如,套組中包括之紙頁)上之書面說明書,但機讀說明書(例如,載於磁或光儲存碟上之說明書)亦係可接受的。
在一些實施例中,套組包含a)包含含有抗PSMA CAR之宿主細胞群,其中抗PSMA CAR包含抗PSMA scFv、跨膜結構域及細胞內信號傳導結構域,及b)將宿主細胞群投與個體用於有效治療癌症之說明書。在一些實施例中,該癌症係***癌。
在一個實施例中,本發明提供包含表現抗PSMA CAR之宿主細胞群之套組。在一些實施例中,包含本發明之抗PSMA CAR之宿主細胞群包含約
1×101個宿主細胞至約1×1012個宿主細胞。或者,包含抗PSMA CAR之宿主細胞群包括約1×102個宿主細胞至約1×1012個宿主細胞;約1×103個宿主細胞至約1×1012個宿主細胞;約1×104個宿主細胞至約1×1012個宿主細胞;約1×105個宿主細胞至約1×1012個宿主細胞;約1×106個宿主細胞至約1×1012個宿主細胞;約1×107個宿主細胞至約1×1012個宿主細胞;約1×108個宿主細胞至約1×1012個宿主細胞;約1×109個宿主細胞至約1×1012個宿主細胞;約1×108個宿主細胞至約1×1011個宿主細胞;約1×108個宿主細胞至約1×1010個宿主細胞;或約1×107個宿主細胞至約1×1010個宿主細胞。
在其他實施例中,套組包含a)包含編碼抗PSMA CAR之核酸分子之組合物,其中該抗PSMA CAR包含抗PSMA scFv抗體、跨膜結構域及細胞內信號傳導結構域;及b)將編碼抗PSMA CAR之核酸分子引入經分離宿主細胞之說明書。
本發明之套組呈適宜包裝。適宜包裝包括(但不限於)小瓶、瓶、廣口瓶、撓性包裝(例如,密封Mylar或塑膠袋)及諸如此類。套組可視情況提供額外組份,例如緩衝液及解釋性資訊。
關於本文所揭示組合物之使用的說明書包括關於用於期望治療之劑量、投藥時間表及投與途徑之資訊。容器可為單位劑量、體包裝(例如,多劑量包裝)或亞單位劑量。
藉由以下實例進一步說明本發明,無論如何不能將其視為以任何方式進行限制。所有所引用之參考文獻(包括整個說明書中所引用之文獻參考、授權專利及公開專利申請案)之內容由此明確地以引用的方式併入本文中。進一步應瞭解,所附之所有圖及表之內容亦明確地以引用的方式併入
本文中。
設計者T細胞(dTc)途徑係對疫苗之創新,其繞過免疫並藉由工程化提供高親和性受體[7]。通常,該等受體(嵌合抗原受體或CAR)係抗體(Ab)結合結構域與T細胞受體(TCR)之信號傳導鏈之融合。此策略之變化形式最近證實抑制並可能治癒CLL[8,9]。
CAR預先經工程化以產生抗***特異性膜抗原(PSMA)dTc,其在活體外及活體內模型中特異性靶向並殺死***癌[10](參見Ma,Q、Safar M、Holmes E等人Anti-prostate specific membrane antigen designer T cells for prostate cancer therapy.Prostate 2004;61:12-25)。抗PSMA CAR之示意圖提供於圖7中。儘管此係第一代(1st gen)僅ζ之CAR,但其與抗原接觸時具有與利用其他1st gen CAR在dTc中所觀察到之細胞凋亡/AICD相反之增殖性質,此促使更好的治療影響。IL2先前已在使用1st或2nd gen dTc之動物模型中顯示消除已建立腫瘤,此證實IL2與TIL在人類研究中之重要性。
I期臨床試驗經設計且闡述於下文中。為增強所輸注dTc之存活,在T細胞輸注之前利用非清髓性(NMA)化學療法(「調整」)產生「造血空間」。此策略顯示在黑色素瘤中利用腫瘤浸潤淋巴球(TIL)益處,此經由增加之TIL數目有效增加患者「藥物暴露」[11]。T細胞劑量遞增經計畫以達成骨髓恢復後所輸注活性細胞之最小20%植入。投與低劑量IL2(LDI)以維持所輸注dTc之活化。
量測到5-56%植入,其中2w後T細胞擴增20-600倍。血漿IL2在兩個個體中處於預計含量,但因高植入而低於預計多達20倍,其中認為擴增數量之經活化T細胞消耗IL2。在臨床上,毒性係可接受的,且在2/5個體中獲得
臨床部分反應(PR)。意外地,臨床反應與T細胞植入(「藥物暴露」)逆相關且與IL2含量正相關。此係假設生成觀察結果,其表明需要較高IL2以達成利用較高dTc暴露所預計之更顯著臨床反應。
患者. 將患有轉移性或復發性***癌及激素難治性(去勢抗性)疾病之患者入選研究中。
載體. GMP品質載體係與National Gene Vector Lab(NCRR資源)合作製備。將1mg用於抗PSMA CAR之質體DNA[Ma等人,2004a]供應至NGVL。VPC係利用PG13細胞株再生,生成100個單細胞純系,生長並針對293及經活化正常人類T細胞測試效價。將較佳純系擴增成種源細胞庫(MCB)並用於載體產生,在32℃下進行24小時收穫。獲得18L上清液。最終效價對於293細胞係2×106/ml且對於經活化T細胞係0.5×106/ml。
劑量準備. 患者經歷白血球分離術達3-5h以收集富含末梢血單核細胞(PBMC)之部分,獲得2-12×109個細胞,其60%通常係T細胞。將Leukopak輸送至RWMC基因療法設施(Gene Therapy Facility),其中將1-2×109 PBMC以4×106個細胞/ml置於含有5%人類血清以及30-60ng/ml抗CD3抗體OKT3[Ortho]之AIM V培養基中,其中將過量細胞冷凍儲存用於可能的重複修飾。在活化後第+2天,藉由利用1:1稀釋之上清液以2ml/107個T細胞/6-孔板之孔離心感染(spinfection)使細胞經歷轉導(Td)[Beaudoin等人,2007],在第+2天兩次且在第+3天一次。在Td後48-72h針對CAR表現評價T細胞(下文)。10%之最小分率係用於患者投藥之規格。在擴增滿足劑量時收穫細胞並冷凍保藏。在微生物學安全測試返回時,將劑量釋出用於患者投與。
治療計畫. 在入選時,患者經歷白血球收集及單核細胞分離。將T細胞活化,經表現抗PSMA CAR之反轉錄病毒轉導並擴增[10]。初始計畫劑量水平為:109、1010及1011個T細胞,其中目標係所輸注T細胞之20%植入。此研究目標在5名患者之後滿足且研究係以不再投與1011細胞劑量結束。
非清髓性化學療法(CyFlu)係由以下組成:d-8至d-7住院環磷醯胺60mg/kg/d(含有美司鈉),隨後d-6至d-2門診氟達拉濱25mg/m2/d。在第0天,使患者進行dTc投與(經15-30分鐘),然後藉由連續靜脈內輸注(civi)以75,000IU/kg/d開始門診低劑量IL2(LDI)[普留淨®,Novartis Corporation]達4w。此低劑量IL2方案接近門診MTD用於延長之持續暴露。
「救援包」. 收集幹細胞用於在此較年長、通常經輻照患者群中化學療法後發育不全之情形下進行骨髓救援。為避免dTc之Th2偏差,在T細胞收集之後開始G-CSF[非格司亭(Neupogen),Amgen]誘導(10ug/d sc x 5 d)並實施單獨的白血球分離術。繼續收集直至收到最少2×106 CD34+個細胞/kg為止。將細胞輸送至RWMC Stem Cell Lab,然後根據標準方法進行處理並冷凍保藏。若絕對嗜中性球計數未能恢復,則在第21天輸注備用幹細胞以觸發。患者均不需要救援包輸注。
細胞介素評估. 藉由ELISA(Invitrogen)分析血清IL2。
流式細胞術. 藉由CD3、CD4或CD8及V5抗體之雙色染色分析設計者T細胞樣品之轉導[Invitrogen]。
dTc藥物動力學. 如上所述藉由流式細胞術針對dTc對肝素化血液樣品進行分析。
Q-PCR藥物動力學. 在指定時間,將5mL全血(WB)樣品收集於經肝素塗佈或檸檬酸化之BD真空採血管(BD Biosciences)中。自200uL樣品使
用AxyPrep blood miniprep套組(Axygen Biosciences)分離基因體DNA並稀釋於100uL TE緩衝液中。由於在PCR反應中來自肝素之干擾,故將含肝素之樣品利用肝素酶(以下)預先處理以避免在隨後患者中僅使用檸檬酸化管用於樣品收集。
即時PCR係使用BioRad CFX96 PCR檢測系統(BioRad)實施。反應物含有11uL經溶析樣品、14uL Maxima SYBR Green/ROX qPCR混合母液(Fermentas)及0.75uL每一引子(10uM)。引子係使用Primer-Select(DNAStar)特定針對CAR抗PSMA(5-aggctgaggatttgggagtt-3/5-agacgctccaggcttcacta-3,182-bp,跨越SD38 GS鏈接體)及抗CEA(5-gcaagcattaccagccctat-3/5-gttctggccctgctggta-3,91-bp,跨越嵌合CD28-CD3z區)及白蛋白來設計以量化絕對白血球(WBC)數目(5-accatgcttttcagctctgg-3/5-tctgcatggaaggtgaatgt-3,81-bp)。擴增係在95℃下10min,在95℃下40個循環持續15s,在60℃下20s及72℃下20s。在72℃延伸期獲取螢光資料。藉由熔融曲線分析及凝膠電泳證實產物特異性。自質體標準曲線計算絕對CAR拷貝及WBC數目並相對於基線預篩選(PS)收集點來表示。參見圖6之結果。
樣品之肝素酶處理. 肝素收集管含有肝素,一種結合DNA並藉由佔用聚合酶結合位點抑制PCR之硫酸化醣胺聚醣碳水化合物的聚合物。為去除肝素,將75ul樣品用15uL肝素酶I肝素黃桿菌(Sigma)在37℃處理2h。肝素酶I係以1mg/mL溶於20mM Tris-HCl pH 7.5、50mM NaCl、4mM CaCl2及0.01%BSA中。使用11uL經肝素酶處理之DNA用於Q-PCR。
針對dTc檢測對抗CAR之免疫反應. 將在療法後1至6個月自患者收集之血清與Jurkat或Jurkat CAR+ T細胞株以1:5稀釋一起於冰上培育45
min。將細胞洗滌並然後與螢光標記之山羊-抗人類Ig一起培育,並藉由流式細胞術評估。使包括抗CEA CAR+ Jurkat細胞之陽性對照與人類CEA-Fc反應[Ma等人,2004b],利用相同二級Ab檢測以顯示是否二級Ab檢測與CAR+細胞反應之人類Fc,且抗PSMA CAR+ Jurkat細胞與抗V5 Ab(小鼠)反應,利用山羊抗大鼠二級Ab檢測以顯示對於此研究中之患者具有此細胞株之陽性血清之預期輪廓。
在9/2008與4/2010之間,六名患有轉移性***癌且升高PSA之患者入選於所準備劑量(表1),其中五名接受治療。中值年齡係61歲(範圍51-75),其中自診斷出復發性或轉移性疾病之中值時間係21個月(範圍8-51)。所有患者均接受盆底(prior pelvic)輻射且5/6雄激素去除失敗。(一名患者要求研究登記,其在住院之前一年已完成6個月佐劑柳菩林(Lupron),但隨後不具有所展示激素抵抗性狀態。)
治療計畫係以自體細胞收集開始用於dTc製備。單獨的非格司亭動員及白血球分離術用於製備用於在通常較年長且一些亦接受骨盆輻照之此***癌群體中在過量骨髓毒性事件中之「救援包」。用於dTc製造之單獨收集用以避免由可能妨礙所衍生dTc之細胞毒性功能之G-CSF誘導的Th2偏差。非清髓性(NMA)化學療法係在第-8天開始,其中2天環磷醯胺,且隨後5天氟達拉濱。在休息1天以允許氟達拉濱清除之後,在第0天投與細胞,其中經由中央線藉由連續靜脈內輸注(civi)同時起始28d之IL2。除2天的Cy用於美司鈉投與且在dTc投與之日過夜觀察以外,治療完全係門診。
研究具有I期劑量遞增設計以評價抗PSMA dTc之耐受性,其中目標係3名患者在輸注後具有所輸注T細胞之20%或更高之植入。若未遇到劑量限制性毒性,則認為此目標植入係最佳生物學「暴露」,此指示細胞產物極成功地***淋巴樣區室中。產生此植入之劑量將界定最佳生物劑量。植入意外地強有力(下文),且根據遞增計畫(表2A,劑量及植入)由恰好5名患者達成此目標,此產生研究結論。
表2A. 劑量及植入.測定劑量轉導(Td)分率及在2w時血液中之%dTc,如圖1B中。經植入之活化T細胞(aTc)佔總T細胞之百分比估計為在2w/劑量%Td之dTc%比率。倍數增加係總植入aTc/劑量。對於完全重建之造血空間,在骨髓、脾、肝、淋巴結、腸及血液中施加標稱總數為1012之T細胞,如在注釋2中所推導出。總植入aTc估計為植入%×1012總T細胞。表2B.介白素2.來自圖2A之在第一週期間之峰值IL2含量。表2C.反應.來自圖3之PSA變化及PSA延遲。總體:PR,部分反應;mR,微小「生物」反應;NR,無反應。
調整之目的係促進dTc植入及擴增。圖1顯示Pt2在109劑量水平下之臨床輪廓。白血球計數在化學療法期間會迅速下降,其中dTc輸注第0天時,白血球減少幾乎到最低(圖1A)。ANC在d10之前恢復至500/ul(所有患者之範圍為d8-13)且在d11之前ALC恢復至>80%基線(範圍d10-15)。根據圖1B,最初輸注T細胞係61%CAR+(「劑量」)。在d14,此時患者通常恢復其內源性淋巴球,其血液dTc分率為總T細胞之7.3%。在d14得到7.3/61=12%之植入效率,考慮到最初劑量<100%修飾,其中所輸注之經活化未修飾T細胞亦經植入。
所有患者中均證實確有植入,其中在重建後2週,2.5-22%之循環T細胞為dTc,此對應於5-56%之植入效率(表2A)。然而處於109劑量水平之Pt 1及2具有5-12%之總植入分率,亦處於109下之Pt3植入達56%。利用1010細胞劑量之Pt 4及5分別植入達52%及20%。三名患者達成20%之植入,一名是劑量水平1及兩名是劑量水平2,此達到了累積目標。據估計,該等值相當於輸注後5×1010至>5×1011個經植入T細胞,此代表20倍至接近600倍之擴增(參見表2A)。利用較高劑量將使相對擴增降低,正如利用重建可達成之上限(即,正常T細胞在血液中為約1000/ul且全身約1012)所預期。
藉由流式細胞術評價植入之動力學。在細胞足以進行分析(在d5,wbc=0.2)之第一天,CAR+細胞處於其最高百分比,且此後隨著化學療法後內源性T細胞恢復而下降(圖1C上部)。CAR+細胞之峰值絕對數量係在d14時,其中在較低總劑量下具有在d21至在d28研究時期結束時穩定之平穩狀態(圖1C下部)。此模式通常針對所有患者。
調整並不影響初始藥物動力學,但藥效學(植入)顯著改變。圖1D係在經調整及未調整之情況下利用類似大小dTc劑量藉由PCR比較兩個不同患者。自剛輸注後之第一點(時間=0h)直至8h,兩個設定顯示類似初始藥物動力學,其中隨著細胞分佈於血液與組織之間,循環中之dTc具有迅速的10倍損失。隨後,繼續簡單輸注,自8h至d7進一步5倍下降(總體50倍下降),此後數目相對穩定達1個月之持續時間。與此相比,具有預先調整之患者自8h時間點直至d4維持血液中之細胞數目,此後血液中之細胞爆發式擴增而在d7獲得50倍增加。在d14血液中dTc含量之比較顯示接近200倍之調整優勢。此模式在所有患者中均明顯。
已認為IL7及IL15(而非IL2)在淋巴球減少性調整後會驅動T細胞恢復[12,13]。值得注意的是,認為IL2並非必須且不足以促進植入。相同IL2方案先前已應用於先前CEA臨床試驗中[Junghans等人,2001]且未注意到植入,在利用高劑量IL2共投與之Rosenberg的TIL研究中亦未注意到植入[Rosenberg等人,1994]。鼠類研究顯示植入不需要IL2[Bracci等人,2007]。相反,此研究中IL2之目的係支援T細胞之活化狀態以維持其活體內細胞毒性活性。
顯著地,IL15在所有個體中在基線處為零,在dTc輸注之時伴隨淋巴細胞清除而升高,然後隨著ALC增加至正常而返回至基線,如圖1E中所示。同一個體中之IL7開始時無法量測,但在恢復後不會下降,如圖1F中所示。一般而言,IL7不會呈現一致模式,在一些情形中在開始時不為零,其中調整後具有最小增加且在一些情形中在淋巴樣重建後達到峰值。
在dTc輸注後1至6個月之多個時間,針對對抗CAR+ T細胞之反應性對血清進行篩選。在治療後,在任何個體中均未檢測到抗CAR免疫反應,
如圖4中所示。
由於在最初研究設計期間認為IL2係成功介入之關鍵組份,故監測IL2以確保獲得足夠含量。根據所計畫之方案,血液含量預計在1900 +/- 600pg/ml(約30IU/ml)之範圍內[14]。然而當分析患者IL2輪廓時,注意到顯著差異(圖2A、表2B、介白素2):Pt 1及2二者在起始療法後之幾天內均達成高血漿IL2(>2000pg/ml),而Pt 3及4在療法之關鍵第一週期間具有低得多的峰值IL2(100-200pg/ml),其中在Pt 5中具有中間峰值(600pg/ml)(圖2A)。Pt 1及2之高含量在預計範圍內,而較低值遠低於預期。(沒有IL2共投與,即使利用極高dTc劑量,IL2在血漿中亦係不可檢測的。)重要的是,所觀察到之100-2000+pg/ml(1.5-35IU/ml)之血液含量跨越臨界範圍,其中高含量足以維持T細胞活性且低劑量可能係亞治療的,尤其對於需要其作用之組織中的T細胞而言。
注意:根據Konrad等人(1990),藉由civi之1 MIU/m2/6h(4 MIU/m2/d)獲得39.2±13.8IU/ml之穩態血液含量。本文中劑量係表示為每kg,75kiu/kg/d。對於患者1及2,將劑量轉換為BSA單位且然後根據Konrad等人之資料計算為預計值(±標準偏差):
來自表2B之患者1及2之量測值係2300pg/ml及2100pg/ml。基於18MIU/1.1mg之普留淨的功效標準,該等值分別相當於37.6IU/ml及34.4IU/ml。因此,Pt 1及2之量測IL2峰值均在預計範圍內,且Pt 3-5(100至600pg/ml;1.6至9.8IU/ml)遠低於該範圍。
應注意,在圖2A中圖表之軸上係單位量測值之位置(IU/ml)。1 BRMP單位之IL2定義為引起IL2依賴性細胞株CTLL-2之半最大增殖。Novartis應用之國際單位係關於刺激活性之BRMP單位之大約1/6th[Hank等人,1999]。亦即利用30IU/ml,高於1/2最大刺激劑量5倍,而利用1-6IU/ml,處於或低於1/2刺激劑量。該等含量可能在組織中仍有所降低,且在血漿中為邊界線之含量坦率地說在需要維持活化之腫瘤中可係不足的。因此,合理的猜測係低IL2妨礙dTc有效性,僅利用高IL2才看出效能。
檢查IL2差異之原因。重複測試排除量測人工因素,且混合研究排除抑制劑。此外,藥物批次生物活性、藥物遞送及在分解代謝方面之患者差異作為差異源被消除。利用分析,將作為原因之藥物及患者差異去除,注意力轉向唯一剩餘組份:T細胞自身。假設經植入之活化T細胞(aTc)會消
耗IL2以介導IL2耗盡,如圖2B中所探索。劑量中之所有細胞(經轉導(dTc)及未經轉導T細胞相似)在表現IL2之受體(IL2R)之載體暴露之前藉由抗CD3 Ab活化,且全身性植入且亦結合IL2。
IL2受體(IL2R)在活化後時期中上升至極高含量(高達100,000/細胞),其中複雜的低、中等及高親和性受體隨時間改變以滿足不同作用,然後在隨後幾天及幾週逐漸下降[Jacques等人,1987]。aTc輸注後之擴增與結合位點/細胞之下降可係平行的以維持IL2之穩定「槽」,此在整個監測時期獲得相對穩定之低血漿含量及淨高植入。在2週時最終高植入分率與利用高-IL2R+細胞在最初幾天中之高擴增速率可係平行的。此因此給出結果:在前1-2天之IL2穩態(平臺期)已經較低且與在隨後時間(例如,第14天)所看到者相當。(參見下文之計算)。
在實施此分析時,獲得顯著結果:在關鍵0-1週時期中峰值IL2變化與植入分率成反比:查看序列中之Pt 1-5(表2AB;圖2B),伴隨最低植入分率(5-12%),IL2較高;伴隨最高植入(>50%)‧IL2降至較低;然後伴隨中間植入(20%)‧IL2上升至中間。當繪製為IL2對植入分率時,反比關係明確且顯著(p<0.01)(圖2C)。該等資料與IL2被植入至高含量之aTc消耗一致,其中計算支援此設想之真實性。
計算:具有1000 IL2R/細胞(170皮莫耳)之10%植入或1011個T細胞(假設成年人中總共1012個T細胞;表2A)可結合3ug IL2。假設IL2之分佈容積為8L[Konrad等人,1990],且根據本發明之輸注方案標稱IL2含量為2000pg/ml(無aTc之IL2結合),則估計在穩態時全身含量為16ug IL2。結合3ug IL2將導致3/16或約20%消耗、或約400pg/ml降低。相應地,若植入為50%,則IL2之消耗將為約15/16或94%消耗,達到100pg/ml。在用100倍IL2R輸
注後之早期1%細胞將具有相同的結合能力。端視植入之實際含量、IL2R含量、IL2內化率、PK參數及IL2之異化率,根據本發明之方案所輸注之10ug IL2/每小時之總量可降低50%或90%或更高並產生關於輸注dTc之該等阻礙效應。在此估計中存在許多不確定之變量,但計算證實其在真實性範圍內。
毒性係自化學療法自IL2及dTc自身來評價。自化學療法,主要(3/4級)毒性係血液學的,如所預計:嗜中性球減少及嗜中性球減少性發熱(5/5患者)及血小板減少(3/5患),如表5中所述。根據醫院方案,嗜中性球減少性發熱患者允許並iv投與抗生素直至退熱且嗜中性球恢復。一名患者在嗜中性球減少期間需要闌尾切除術。所有患者在14天內恢復ANC>500,且沒有患者需要幹細胞救援。歸因於IL2之毒性係1-2級疲勞、間歇性低熱及肌痛。一名患者在3週後因2級皮疹而中斷IL2。沒有毒性歸因於靶向表現PSMA之正常組織(例如,腎、腦;參見下文之討論)之dTc。顯著地,並未如先前在白血病研究中記錄的那樣觀察到「細胞介素風暴(cytokine storm)」[8,9,15,16],且與該活性相關之細胞介素(IL6、TNF-α、干擾素-γ)藉由Kochendorfer等人[15]準則一致地未升高(例如,<100pg/ml)。
在具有嗜中性球減少性發熱之患者中,3/5沒有可鑑別源,一名患者具有副血鏈球菌(Streptococcus parasanguinis)菌血症伴隨糞腸球菌(Enterococcus faecalis)***,且一名患者具有草綠色鏈球菌(Streptococcus viridians)菌血症。所有均入院並利用廣譜抗生素進行治療,其中成功恢復。一名患者在療法之第4週發展急性闌尾炎,需要腹腔鏡闌尾切除術且順利恢復。一名在胸部x-射線上不存在呼吸道症狀或肺發現之情況下患者發生周圍嗜酸性球增多至51%;嗜酸性球增多在IL2輸注完成時得到解決。
儘管僅I期研究用以測試安全性及植入,但注意到臨床反應。顯示Pt 1及2之PSA輪廓(圖3A及3B)。在調整時期期間(d-8至d0),PSA持續上升,此顯示,如所預計,T細胞輸注時間不對化學療法產生淨影響。
在該兩名患者中,PSA在dTc輸注後迅速降低,在接下來的1-2個月在其最低點下降50%及70%,此滿足PR關於***癌之準則(表2C,反應)。此後,患者之PSA繼續其向上軌線。沒有其他患者滿足關於臨床反應之準則。亦檢查PSA延遲作為益處之度量,此乃因此在其他免疫療法中已建議作為存活替代物[17-21]。估計Pt 1及2之PSA延遲為78天及150天(圖3C)。Pt 3及4未明顯偏離PSA投影且未估計PSA延遲。Pt5經歷持續低於投與之PSA,此在本文中稱為「生物」微反應(mR),其中估計PSA延遲為25天。(術語「生物反應」用於指指示對抗腫瘤之免疫作用、而不符合習用反應準則之標記物變化。)
Pt1缺少疾病之放射證據。Pt2具有在dTc後一個月讀取之陽性骨掃描,此顯示穩定或改良(一個病灶)。不存在目標PSA下降之Pt 3-5未進行後
續掃描。
注意:Cy在***癌中具有差的活性:作為單一藥劑測試時,其在48名個體中僅產生1 PR[Chlebowski等人,1978;Muss等人,1981;Saxman等人,1992]。然而,為儘可能將化學療法效應與dTc輸注分開,將Cy部分置於調整前面(d-8至d-7)且在輸注(d0)之前完成一整個星期,據推斷此時將顯現藥物之任何抗腫瘤活性。然而,在所有5個個體中,PSA停留在其預調整軌線上而無化學效應之證據。氟達拉濱係高度特異性針對淋巴樣細胞及其惡性病之抗代謝物;預計將對實體腫瘤無影響。最後,在此研究中所觀察到之2 PR/5個個體之反應率由於Cy而不一致(1 PR/48)(p=0.02;Fisher精準檢定),此表明所觀察反應係dTc衍生的。
尋找患者差異以解釋反應/非反應,體能狀態、年齡、身體狀態、疾病狀態或治療歷史中無任何暗示。當相對於T細胞劑量判斷反應時,與劑量水平無明顯關係(p=0.6;表6A,反應對劑量大小)。但當相對植入判斷反應時,現在關係接近顯著(p=0.06;表6B,反應對植入)-但仍在與預期相反之方向上:越多的植入導致越少之反應。此模式係非典型腫瘤學藥物反應:越高的劑量通常產生越高的反應,但其可受平行增加之毒性約束。(利用本發明之dTc無需考慮毒性。)當相對IL2考慮反應時,關係係直接且顯著的(p=0.03),此表明IL2之缺乏限制dTc之較高暴露以介導活體內抗腫瘤功效之可能性。
反應資料來自表2C。表6A.藉由雙邊Fisher精準檢定測試「反應對劑量大小」之相關性(H1:高劑量誘導更多反應或低劑量誘導更多反應;H0,反應與劑量無關)。劑量水平:低=1e9;高=1e10。表6B.藉由雙邊Fisher精準檢定測試「反應對植入」之相關性(H1:高植入誘導更多反應或低植入誘導更多;H0:反應與植入無關)。植入含量:低=<15%;中等=20%;高=>40%。表6C.藉由雙邊Fisher精準檢定測試「反應對IL2」之相關性(H1:IL2誘導越多,反應越多[若存在IL2效應,由於不存在關於低IL2給予更多反應之生物學基礎,因此測試適當地係單邊];H0:反應與IL2含量無關)。使用第0-1週之峰值IL2(表2B)作為指標:低<300;中等400-800;高>1500。
一旦3名患者在預先設定最佳生物「暴露」下安全地經治療並建立高植入與低IL2之關係(p<0.01),伴隨其可預見地對dTc效能之負面影響,則證明按原計畫招募在較高dTc劑量下之額外患者係正當的成為道德問題。亦即,最佳療法似乎不僅需要已藉由本發明之定義達成之dTc之最佳生物劑量,而且需要藉由其相互作用之藥效學調控之IL2之匹配最佳生物劑量。
因此終止此研究,如下文所述。
實施若干證實藥物之正確遞送、排除抑制劑及其他可能干擾因素之分析,最終支援IL2差異係真實的。實施以下分析以確定在IL2差異之此結論中是否存在缺陷或干擾因素:
1.重複研究一起:已在一個月收集點之後依序及分批針對每一患者分析IL2含量。然後在同一分析中運行所有樣品連同患者。獲得相同結果。此排除分析性能之變化性。
2.混合研究,以檢測遮蔽真實IL2含量之抑制劑:將具有低IL2之患者血清添加至具有高IL2之患者血清並重複ELISA。未觀察到高IL2之抑制作用。此排除可干擾分析並低估存在IL2之抑制劑物質,例如高含量之可溶性IL2受體(sCD25)或抗IL2 Ab。
3.醫院臨床藥學評價:檢查所有患者之劑量計算。記錄證實IL2藥匣每週更換一次,且殘餘泵劑量指示適當遞送。針對準確度對泵進行重新測試且合格。沒有關於投藥或遞送問題之證據。
研究之主要結果係利用dTc靶向PSMA之表面安全性。此並非已確定之事。PSMA表現於腎近端小管中及腦及其他位點中之II型星狀膠質細胞上[22,23]。在先前dTc試驗中,甚至藉由簡單輸注第一代(僅ζ)構築體亦可辨別出嚴重的靶向/脫靶毒性[24],此在利用第二代dTc(納入共刺激)之植入設定中可係致死性的[25],認為係最具侵襲性暴露[26]。因此,使人安心的係在抗PSMA功效在其他方面足以賦予抗腫瘤益處之情況中,未出現CNS、腎或其他位點毒性。鑒於調整自身係可造成死亡之嚴重幹預[11,
27],且認為基因毒性係基因療法之危害[28],故知情同意書中詳細闡述之該等風險對於面臨早逝之該等CRPC患者係可接受的。
第二目標係研究所輸注藥物dTc及IL2之藥物動力學/藥效學。以與將曲線下面積(AUC)應用於卡鉑之藥物暴露相同的方式,調整後之植入程度可視為利用dTc之「藥物暴露」之度量。更高、更長期效應細胞暴露之益處推動最近對於利用提供本發明之研究設計之TIL方案[11]植入之偏好。類似地,調整似乎將dTc暴露放大100倍(圖1D)。
然而,與其中藉由劑量及腎功能預計AUC之卡鉑相比,此研究著重於調整之奇妙想法,此乃因相同dTc劑量(Pt1對Pt3)在植入(「暴露」)方面達成10倍差異,且同樣地利用10倍不同劑量出現類似「藥物暴露」(Pt3對Pt4)(表2A)。此使得植入設定中之常用劑量遞增策略成為潛在地危險性冒險,其中暴露可控制不良,破壞管控風險之概念。甚至最低計畫劑量(109個細胞)亦可重建總人體T細胞的一半(例如,Pt3),若其對正常組織起作用,則利用此自定向CAR可產生致命性結果[25]。此暴露不可預測性將係關於在進行植入方案之前利用簡單輸注之初始安全性測試之進一步論證,特定而言其中CAR納入其中可抵抗抗抑制措施以逆轉毒性之共刺激結構域[26,29]。
在CLL中之CD19 CAR的情形中,據推測遇到大體積腫瘤時,抗原推動其擴增甚至遠超過本發明達成之擴增[8,9]。儘管活體外研究指示在足夠IL2之存在下利用第一代抗PSMA CAR dTc在腫瘤上達成選擇性擴增[30],但本發明之最佳植入在臨床上具有關於腫瘤靶向及最低IL2之最少證據,此表明對於患者之相對較小體積之***癌靶標在促進其dTc擴增方面幾乎沒有作用。或者,將建議在本發明之實例中植入之變化可源自不同程度的淋巴細胞清除,其中較少或較多殘餘T細胞以在恢復/重建期間稀釋
dTc,且基於每一患者可係不可預測的。
注意:亦即,利用109個輸注aTc及1010個存活內源性T細胞(殺死99%或2個對數),約10%之重建分率(例如,Pt 2;表2A)係可能的。對於藉由利用僅109個存活內源性T細胞(殺死99.9%或3個對數)之調整進行更有效抑制,利用相同109劑量可達成約50%之重建分率(例如,Pt 3,表2A)。
有趣地,儘管存在鼠類Fv序列,但在任何個體中均未檢測到抗CAR免疫反應[10],亦排除免疫排斥在植入中作為變化性源。Fv區係人類中小鼠抗體之最小免疫原性組份且在其誘導反應方面有所變化[31]。可能調整亦有助於此耐受性。
此方法之期望係基於TIL在植入時在黑色素瘤中之經改良有效性,且基於更高之植入導致更高之反應率[13]。儘管在兩個患者中獲得將支援植入之益處的反應,但本發明之結果與此後一預期相矛盾,反應與植入呈 逆 相關(p=0.06;表6B,反應對植入)。然而,高植入與低IL2含量相關(p<0.01),IL2含量在療法之關鍵第一週中低於預計多達20倍。假設表現升高IL2R之經輸注活化T細胞(aTc)消耗投與之IL2(參見以上注釋5),其中低殘餘含量不足以維持腫瘤細胞殺傷所需之彼等T細胞之活化狀態。一旦實施此轉換,即看到反應與所得IL2含量呈 正 相關(p=0.03)(表6C),藉此現在可以理解反應與植入之逆關係。
作為治療劑,IL2在除腎細胞腫瘤(RCC)以外之腺癌中未顯示任何重要性,其中在患有多樣化、非RCC腺癌(包括***癌)之97名患者中是0個反應[32]。相比之下,IL2係細胞(TIL)療法之關鍵組份[33],包括TIL植入方案[11]。在鼠類***癌模型中,IL2同樣地不具有益處,但係成功的過繼細胞療法之必需附加物[34]。由於此模型亦包括調整T細胞擴增,故對
IL2之抗腫瘤效應之持續需要證實對自我平衡細胞介素(例如,IL7/IL15)之增殖性、非活化「恢復」反應可與仍需要IL2之活化/溶胞反應分開。本發明之患者資料顯示缺乏抗腫瘤活性,儘管利用低IL2之強力活體內擴增與此判斷一致。最後,已證明IL2係dTc所必需的,以在動物模型中利用外源性供應之IL2[35]或藉由補充分泌IL2之CD4+ dTc至劑量中之高含量[36]消除已建立實體腫瘤,用以在過繼細胞療法模型中補充其他資料[37]。
因此,在本發明之反應者中高IL2值認為在輸注後活化之殘留時期期間支援經轉移T細胞。先前已顯示活化狀態以及劑量大小以預計與TIL之反應[38]。如上所提及,黑色素瘤-TIL研究類似地顯示較高反應率以及淋巴細胞清除後之較高TIL植入,但根據手術方案同時支援足以在T細胞活化及植入之所有條件下飽和IL2R之高劑量IL2(HDI)[13]。利用足夠IL2,同樣地在***癌之dTc治療中可預期經改良之反應以及較高植入。
等該將結果與上述無IL2之CLL研究比較[8,9],其中闡述3名患者:2/3達成CR且1/3 PR,相對本發明之2/5 PR。支援此更深反應之因素可包括:a.液體/淋巴樣腫瘤對實體,b.3信號對1信號,及c.分散的腫瘤維持大多數dTc活化(注釋10)。然而,利用具有1/5 PR之第二代dTc之進一步抗CD19 CLL研究[39]客觀上並不比本發明的結果好,儘管具有2個信號且共用CLL腫瘤類型及分散之良好特徵,此看起來吸引對信號-3(4-1BB)作為關鍵區分者之關注。(4-1BBz dTc中之CD28信號2係經由CLL靶標上之B7免費生成。)但是,已見證在***癌中利用次最佳抗PSMA dTc介入之PR,可能該等質性差異可藉由利用足夠IL2之較高dTc暴露/植入來克服。
最近,Slovin等人[40]報告在針對PSMA之單獨dTc試驗時利用300mg/m2 Cy進行預先淋巴球減少性調整之後使用2nd gen(28z)CAR治療之
一系列7名患者。CAR+細胞在血液中持續長達2週。存在0/7 PR,但在2個個體中疾病穩定。許多差異將其研究與本發明研究相區分,包括CAR中之不同抗PSMA Ab、本發明更密集之調整方案、其包括胸苷激酶安全的基因(其可經靶向)且本發明使用IL2。本發明之研究具有健壯植入(可在治療後一年或更長時間(或直至死亡)在所有患者中藉由流式細胞術量測)及2/5 PR。原則上,可有利於Slovin等人研究之差異係存在於本發明之1st gen構築體中不存在之CD28信號2結構域,但此益處根據其試驗並未明顯體現。可減輕對本發明構築體之偏好的一個因素在於本發明之CAR儘管係1st gen,但其使具有持續的腫瘤細胞殺傷之PSMA+細胞增殖(補充圖2)[30]而非屈服於如無CD28常見之AICD[41,42]。本發明1st gen dTc之此增殖可係由於本發明dTc中之CAR或腫瘤靶標之特定特徵(如類似地在神經膠質瘤中利用1st gen IL13-zetakine構築體所見[43]),且當時未能回答。在任何情形中,利用甚至於最低暴露之此藥劑來自此臨床研究之陽性結果對於更完整的探索此作為抗***癌治療劑之潛力係令人鼓舞的。
總之,此I期試驗顯示藉由設計者T細胞靶向PSMA之安全性,量化淋巴細胞清除促進dTc植入之益處,在患有轉移性***癌之患者中產生反應,且將全身性IL2含量(如藉由與經植入T細胞之相互作用所測定)定義為臨床反應之合理預測因子。此報告呈現對其共同施加之效能具有關鍵影響之藥物-藥物相互作用之藥效學的獨特實例。關於藉由高植入消耗IL2之可能性暗示限制利用較高dTc暴露所預期之收益,此促進利用增強之IL2重新設計研究(注釋11;SOM)。在5-12%之低植入與足夠IL2可誘導PSA降低50-70%之情形中,高達60%之高植入與增強之IL2可提供癌症治療所尋求之100%PSA降低及腫瘤根除。
患者經歷化學療法調整,隨後根據I期遞增利用連續輸注低劑量IL2(LDI)經歷dTc投藥。dTc遞增之目標係達成經輸注活化T細胞20%植入。
六名患者入選於所準備劑量,其中五名接受治療。患者接受109或1010自體dTc,經2w達成20-560倍擴增及5-56%之植入。藥物動力學及藥效學分析已建立調整對促進所輸注T細胞之擴增及植入之影響。意外地,所投與IL2而消耗高達20倍,其與高活化T細胞植入呈逆相關性(p<0.01)。臨床上,未注意到抗PSMA毒性,且未檢測到抗CAR反應性。五名患者中的兩名達成部分臨床反應,其中PSA經1-2+個月下降50%及70%且PSA延遲78天及150天,加上第三患者中之微小反應。反應與劑量大小無關(p=0.6),而是與植入呈逆相關(p=0.06)且與血漿IL2正相關(p=0.03),此表明利用本發明LDI方案之不足IL2以在最佳植入下支援dTc抗腫瘤活性。
總之,在***癌之I期劑量遞增下,20%植入在三個個體中得以滿足且具有足夠安全性,此產生研究結論。獲得臨床反應,但暗示在活化T細胞植入達高含量以結合並消耗IL2時受到約束。此研究呈現「藥物-藥物」相互作用之藥效學可如何對其共同施加之效能具有關鍵影響之獨特實例。
前述實例亦闡述於Junghans等人(2016)The Prostate 76:1257中。
ADT 雄激素去除療法
aTc 經活化T細胞
CAR 嵌合抗原受體
CRPC 去勢抗性***癌
civi 連續靜脈內輸注
Cy 環磷醯胺
dTc 設計者T細胞
Flu 氟達拉濱
IL2/7/15 介白素2/7/15
LDI 低劑量IL2
MDI 中等劑量IL2
PSA ***特異性抗原
PSMA ***特異性膜抗原
SOM 補充的在線材料
TIL 腫瘤浸潤淋巴球
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<223> Gly4Ser重複n次,其中n係等於或大於1之正整數
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<223> 合成:白蛋白引子之核酸序列
<400> 37
Claims (33)
- 一種治療有需要之人類個體中***癌之方法,其包含向該個體投與表現特異性結合***特異性膜抗原(PSMA)之嵌合抗原受體(CAR)之細胞群及投與介白素-2(IL2),由此治療該人類個體中的***癌,其中該IL2係藉由連續靜脈內輸注以約75000IU/kg/d之劑量投與該人類個體且係在投與表現該CAR之細胞群之後投與。
- 如請求項1之方法,其進一步包含向該人類個體投與環磷醯胺(cyclophosphamide)及/或氟達拉濱(fludarabine)。
- 如請求項1之方法,其中該IL2係藉由連續靜脈內輸注投與該個體約28天。
- 如請求項1之方法,其中該CAR包含抗PSMA抗體之PSMA結合區及T細胞受體之CD3 ζ信號傳導區。
- 如請求項4之方法,其中該抗PSMA抗體係3D8或其抗原結合片段。
- 一種治療患有***癌之人類個體之方法,該方法包含向該人類個體投與表現抗PSMA CAR之細胞群及向該人類個體投與IL2,其中該IL2係藉由團劑輸注經靜脈內以100kIU/kg/8h或更多之劑量投與該人類個體且係在投與表現該抗PSMA CAR之細胞群之後投與,且其中該抗PSMA CAR包 含抗PSMA scFv、跨膜結構域及CD3 ζ信號傳導區。
- 如請求項6之方法,其中IL2之劑量係100至720kIU/kg/8h。
- 如請求項6之方法,其中IL2之劑量係約300kIU/kg/8h。
- 如請求項6或8之方法,其中該IL2自投與該細胞群之日開始藉由團劑輸注投與該人類個體達連續四天。
- 如請求項6或8之方法,其中該IL2自投與該細胞群之日開始藉由團注投與該人類個體達連續五天。
- 如請求項1或6之方法,其中該細胞群包含1×108至1×1011個細胞。
- 如請求項1或6之方法,其中非清髓性(non-myeloablative;NMA)化學療法在投與該細胞群之前投與該人類個體。
- 如請求項1或6之方法,其中該細胞群包含獲自該個體之T細胞。
- 一種治療經以輸注表現抗PSMA CAR之細胞群之個體中***癌的方法,該方法包含根據投藥時間表向該個體投與IL2,使得在將該細胞群投與該個體後在該個體中維持高於500pg/ml之IL2血漿含量至少一週,其中該抗PSMA CAR包含含有抗PSMA scFv之細胞外區、跨膜結構域及CD3 ζ 信號傳導區。
- 如請求項14之方法,其中該IL2血漿含量在將該細胞群投與該個體後維持1至2週。
- 如請求項15之方法,其中該投藥時間表包含藉由團劑輸注向該個體投與100kIU/kg/8h至720kIU/kg/8h之IL2。
- 如請求項14之方法,其中該IL2血漿含量在將該細胞群投與該個體後維持一個月。
- 如請求項17之方法,其中該投藥時間表包含向該個體投與25000IU/kg/d至300000IU/kg/d之IL2。
- 如請求項14之方法,其中該個體具有至少10%之經活化細胞植入。
- 如請求項14之方法,其中該個體具有至少50%之經活化細胞植入。
- 一種治療業經以輸注可表現特異性針對癌症抗原之CAR之細胞群之個體中癌症的方法,該方法包含根據投藥時間表向該個體投與IL2,使得在將該細胞群投與該個體後在該個體中維持高於500pg/ml之IL2血漿含量至少一週,其中在將該細胞群投與該個體之前,該個體已接受淋巴細胞清除療法。
- 一種治療個體中癌症的方法,該方法包含將表現特異性針對癌症抗原之CAR之細胞群投與患有癌症之個體,且隨後藉由以下向該個體投與IL2:團劑輸注包含投與100kIU/kg/8h或以上之劑量的IL2,或連續輸注包含投與25,000IU/kg/d至300,000IU/kg/d之IL2,其中在將該細胞群投與該個體之前,該個體已接受淋巴細胞清除療法。
- 如請求項21或22之方法,其中該淋巴細胞清除療法包含投與環磷醯胺及氟達拉濱。
- 如請求項21或22之方法,其中該癌症選自由以下組成之群:結腸癌、乳癌、腦癌、肺癌、卵巢癌、頭頸癌、膀胱癌、黑色素瘤、結腸直腸癌及胰臟癌。
- 如請求項21或22之方法,其中該癌症抗原選自由以下組成之群:癌胚抗原(carcino-embryonic antigen;CEA)、CD19、GM2、GD2、唾液酸Tn(STn)、HER2、EGFR、GD3、IL13R、MUC-1及EGFRvIII。
- 如請求項1、6、14、21或22中任一項之方法,其中該IL2係阿地介白素(aldesleukin)(普留淨(Proleukin))。
- 如請求項4、6、14中任一項之方法,其中該抗PSMA scFv包含以下: 含有SEQ ID NO:1所示胺基酸序列之輕鏈可變區,及含有SEQ ID NO:2所示胺基酸序列之重鏈可變區。
- 如請求項4、6、14中任一項之方法,其中該抗PSMA CAR包含CD8鉸鏈區。
- 如請求項29之方法,其中該CD8鉸鏈區包含SEQ ID NO:4所示胺基酸序列或其功能片段。
- 如請求項4、6、14中任一項之方法,其中該CD3 ζ信號傳導區包含SEQ ID NO:5所示胺基酸序列或其功能片段。
- 如請求項1、6或14之方法,其中該***癌與PSMA表現相關聯。
- 如請求項1、6或14之方法,其中該***癌係轉移性***癌、復發性***癌或激素難治性***癌。
- 如請求項1、6或14之方法,其中該細胞群在投與該人類個體之前已經抗CD3抗體活化。
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