TW200813223A - High-yield transgenic mammalian expression system for generating virus-like particles - Google Patents

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200813223 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於產生類病毒微粒（VLPs)用之哺乳動物表 現系統，及該哺乳動物表現系統所產生之VLPs之 【先前技術】 ' 新近肩化出之虺狀病毒（c〇v)的傳播，使得2〇的年急 性嚴重呼吸道感染症候群（SARS)之疫情暴發成為全球性的 威脅（Kuiken, T·等人，2〇〇3，362: 263·27〇)。鑑於其 ，因組織及複製策略，冠狀病毒在分鮮上係歸類於尼多病 毒目（Nidovirales)。如同其他冠狀病毒，SARS_c〇v之外形 為被膜微粒，病毒表面遍佈著典型的表面突出物，稱為「冠」 或「刺」（Ksiazek，T· G·等人，2003，Y 五叹/ j 348: 1953-1966 ； Πη? ^ 2004 ^ Antivir Ther 9: 287-289) 〇 ^ 狀病毒微粒核心外是一層脂質被膜，並且包含三種蛋白質： 數I最多之Μ (膜）蛋白，小的E(被膜）蛋白及s (刺）蛋 白。丽述之「冠」是由三個s蛋白分子聚體構成，其涉及病 毋與但主又體之結合、供病毒進入之膜融合、細胞對細胞之 傳播、及冠狀病毒之組織向性。被膜内之病毒核心稱為殼包 核酸’内含一約3〇kb之正鏈病毒基因組RNA，以N(殼包核 酸）蛋白包裝。 感染其他人類冠狀病毒，如·· Hc〇V-229E及HCoV-OC43 等’僅會造成類似一般感冒之症狀，然而感染SARS_C0V會 造成高傳染性、嚴重且劇烈的呼吸道疾病，對成人—尤其是 老人致命性高。由於SARS_cov的傳染性及致命性高，在研

ACA0005TW 200813223 發展有效 究及臨床上受重視。為防止SARS可能捲土重 且安全之SARS疫苗也因而重要。 以 大多數目前使用之抗病毒疫苗包含去活化％、主 病毒。去活化（或去毒）病毒係經化學性=減毋之全 而使其失去複製能力，—般而言係安全且易於制^射處理 能夠誘發巾和性抗體，料赫無法將病=、，。雖然 質以活化CD8+T淋巴球(毒殺τ細胞、或二㈣至細胞

物防禦感染上扮演關鍵角色。活減毒疫苗相較於去主产#動 效很多。然而’活減毒病毒的危險性在於逆轉或 野生型病毒重組成產生高毒性品系。此外，使用全病毒製造 疫苗亦有病毒逃漏之風險。 為避免使用全病毒（例如去毒或減毒病毒）作為疫苗之 危險性，重組病毒蛋白質不僅被視為研究工具，更被視為具 潛力之先進次單元疫苗。然而，已知次單元疫苗通常免疫增 強性不佳，這是由於摺疊不正確、抗原展示不佳、或碳水化 合物及脂質組成不同所致。類病毒微粒（VLPs)係自我組裝 之顯微抗原結構，其大小及形狀與原本的病毒相似但缺少遺 傳物質。VLPs可以相似且逼真的構造同時展示多個病毒蛋白 質、碳水化合物及脂質，因而被視為理想的抗病毒疫苗 (McGuigan，L· C·等人，1993，11: 675-678 )。VLP 在 表面以重複排列方式展示完整的病毒抗原，因而能重建病毒 般的巨大分子實體來促進與抗原呈現細胞（APCs)之表面受 體結合，尤其是樹狀細胞（DCs)。因此，以DC為標靶之VLPs 可有效刺激抗VLP相關抗原之CD4+ T細胞。除了誘發體液 ACA0005TW 6 200813223 免疫外，VLPs在DC中能經由抗原交叉呈現，因而使VLPs 相關抗原起動CTL反應（Moron，G·等人，Met/195: 1233-45) 〇 利用昆蟲及哺乳類細胞的表現系統，已經能產生出超過 三十種病毒之VLPs供作疫苗研發用途（Noad，R.及Roy，P.， 2003，7)^2办11: 438-44)。已知組裝冠狀病毒 VLPs 之至少需要Μ蛋白及E蛋白同時表現於同一細胞（Vennema，Η· 等人，1996，五Μ50 J 15: 2020-2028)。雖然 S 蛋白在 VLPs 的形成上可有可無，若與Μ及E蛋白同時表現於同一細胞也 會嵌入 VLPs 中（Godeke，G· J·等人，2000，《/ 74: 1566-1571) 〇 研究者曾使用巴氏病毒表現系統產生SARS-VLPs(Ho，Y. 專人 ’ 2004 ’ 318: 833-838 ;

Mortola，Ε·及 R0y，ρ·，2004，LeM 576: 174-178 )。然而， 由於昆蟲細胞與哺乳動物細胞間，至少蛋白質醣化修飾上不 同’在昆蟲細胞（SF9)中產生之SARS-VLPs直徑110 nm， 大於SARS-CoV真病毒顆粒之78 nm直徑（Lin，γ·等人，2〇〇4, 同上’及Ηο, Υ·等人，2004，同上）。此外，昆蟲細胞產生之 SARS-VLP之致免疫性尚未經研究調查。其他研究者亦曾試圖 使用哺乳類細胞的表現系統產生Sars-VLPs ( Huang，Υ·等 人 ’ 2004 ’ JFzro/78: 12557-65)。然而，其 VLPs 之胞外釋出 產率不佳，有待改進。 因此’仍然需要研發可大規模產生SARS-VLPs之有效方 法，俾提供有效且安全之抗SARS疫苗。

ACA0005TW 1 200813223 【發明内容】 本發明提供一種產生VLPs之有效方法，其中所產生之 VLPs致免疫性③’可作為有效之疫苗；特別是用作抗sars 疫苗之 SARS-VLPs。 在本發明某些具體實例中，提供一種產生哺乳動物病毒 之類病毒微粒（VLPs)之方法，該方法包含·· 建構一貝體，該質體包含一核苷酸序列，該序列編 碼至少兩種的病毒結構性蛋白質之組合； 以该質體轉染維羅（Vero )細胞；及 於經轉染之細胞中表現該等病毒結構蛋白質以產生 該病毒之VLPs。 在本發明其他具體實例中，提供一種產生抗SARS-CoV 抗體之方法，包含以依據本發明所產生之SARS_VLPs免疫哺 乳類或鳥類動物，及由該哺乳類或鳥類之血液中收取抗 SARS-VLPs 抗體。 在本發明更進一步之具體實例中，提供一種偵測一個體 是否受SARS-CoV感染之方法，包含以依據本發明所產生之 S ARS-VLP接觸該個體之血清樣本，及測定該樣本中是否有能 結合SARS-VLPs抗原之專一性抗體，其中該抗體之存在表示 陽性結果。 在本發明更進一步之具體實例中，提供一種偵測一個體 中是否受SARS-CoV感染之方法，包含以利用本發明之 SARS-VLPs所產生之專一性抗體接觸該個體之組織樣本，及 測定該樣本中SARS-CoV抗原之存在，其中該抗原之存在表

ACA0005TW 200813223 不陽性結果。 在本發明更其他之具體實例中，提供一種預防個體受 SARS-CoV $ $之方&，包含以依據本發明所產生之 SARS-VLP免疫該個體。 在本發明更其他之具體實例中，提供一種高致免疫性的 組合物’包含依據本發明所產生之SARS_VLPs。 【實施方式】 欲產生作為SARS疫苗之VLPs的關鍵技術在於病毒蛋白 質的轉譯後修飾、正確摺疊，及精細地嵌入脂質被膜中，以 及提供實際應用上所需之持續、大量生產。SARS_S蛋白據推 測為一巨大的醣蛋白，包含1255個胺基酸殘基、23個推定的 N-連結醣化位點、其中至少12個N•聚糖已經鑑定存在 (Krokhin，0·等人，2003，Afo/ Ce// Proieomh 2: 346-56 )。在 受SARS-CoV感染之細胞中及純化後之病毒顆粒中，Μ蛋白 帶一個高甘露糖類型之Ν-聚糖（Voss，D.等人，2006，L故 580·· 968-73)。因此，本案發明人採取哺乳類表現系統及細胞 培養方式達到SARS-VLPs之量產。 一方面，本發明提供一種產生哺乳動物病毒（如 SARS-CoV)之類病毒微粒（VLPs)之方法，該方法包含： 建構一質體，該質體包含一核苷酸序列，該序列編 碼至少兩種的病毒結構性蛋白質之組合； 以該質體轉染維羅（Vero)細胞；及 於經轉染之細胞中表現該等病毒結構蛋白質以產生 該病毒之VLPs。

ACA0005TW 200813223 限於適用於產生各種哺乳動物病毒，包括但不 、冠狀病毒、肝炎絲、祕病毒、正黏病毒、 ^瓦赫、小病毒及反轉錄病毒。在本發明之 二=偏=實例中’該哺乳動物病毒為冠狀病毒。更佳者， °玄南礼動物病毒為SARS_CoV。

士本文所用之「病毒結構蛋白質」或「病毒之結構蛋白質」 =及Γιί詞係指形成病毒結構之蛋白質由病毒基因序列所 、=。例t冠狀病毒之結構性蛋白質包括Μ (膜），Ε (被 =主、鱼/及Ν (殼包核酸）蛋白。病毒之基因序列亦攜 ▼病毋進仃複製所需之功能性、非結構性之蛋白質。 -依據本發明產生S娜VLPs之方法之—具體實例中，在 經轉染細胞中表現之結構性蛋白f可為源自8燃心V之 Ε Μ N及S蛋白之任何組合，例如μ+ε、μ册$、m+s、 Μ E N+M+E+S及N+M+S °在-較佳具體實例中，該結 構性蛋白質之組合為M+E。最佳者，該結構性蛋白質之組合 為 M+E+S 〇 本毛明中利之質體可為任何適於在哺乳動物細胞中表 現異源蛋白質之質體或載體。本發明可採科多已經商業化 , #Ησ Invitrogen /aV51 (carisbad^ ca， USA)之 pcDNATM系列。 本發日种所狀重纟謂體，可將編碼赫結構性 蛋白貝組合之核麵序列分組為—或個「表觀（等essi〇n rrttes)」，財軸表現。本文卿之「表觀」乙詞係指 糟由歷纽或合絲生之核酸序列，得以在宿主細胞中進

ACA0005TW 200813223 行基因表現。表現匣可嵌入質體或染色體中。典型上而言， 表現載體之表現匣部分除其他序列外尚包含一欲轉錄之核 苷酸序列、一啟動子及一聚腺苷化指令。在本發明中，「表現 一 匣」乙詞與「轉殖基因」乙詞可互換使用。 、 為調控本發明病毒蛋白質之表現，以達最佳化，表現匣 包含一操縱子，以俾經誘發後達到高度表現。在本發明一較 佳具體貫例中係利用四環素誘發性表現系統調控病毒蛋白質 (^ 之南度表現’其中係於培養基中添加強力黴素（doxycycline) 以達到誘發。商業化的誘發性表現系統之實例包括但不限於

Invitrogen 公司之"[ΐρ£χτΜ系統及 GeneSwitchTM系統，以及

Clontech Laboratories 公司（Mountain View，CA，USA)之 BD

Tet-〇nTM& BD Tet 〇ffrM基因表現系統。 依據本發明之一具體實例，用於產生VLPs之細胞為維羅 細胞。維羅細胞株，亦即ATCC編號CCWiTMi細胞株，係 由位於日本千葉之千葉大學之Y· Yasumura及Y. Kawakita，於 ^ 1962年3月27日當初，自一正常成年非洲綠猴之腎臟取得。 . B· SlmizuK 1964年6月15日將該細胞株之第93代，自千葉 大學帶至美國國家衛生院之國家過敏及感染性疾病研究院之 熱帶病毒學實驗室。除了用作疫苗細胞基質外，此細胞株曾 被廣泛用於病毒複製研究及溶菌斑分析。在本發明中，「維羅 細胞」乙詞不僅包含來自原始維羅細胞株之細胞，亦包含衍 生自維羅-衍生細胞株，如維羅76 (ATCC編號CRL-1587TM) 及維羅E6 ( ATCC編號CRL-1586™)者。 轉染可藉由任何已知方法進行，且可造成暫時性或穩定

ACA0005TW v\ 200813223 性之轉染。缺性轉染對於建立產製目標VLPs之細胞株而古 較佳。獲得穩定性轉染之方法係熟知者，例如_自發性: 穩定性轉染細胞株、以永生性基因轉染、及選擇提供抗生素 (如新Μ素、嘌呤黴素、zeocin、潮黴素B及保米黴素s 性之基因。 ~ 如下列實例中所示，藉由本發明方法所產生之 SARS-VLPs可在小鼠中誘發高力價之§八113_(：：〇%專一性抗 體。因此，本發明亦提供一種產生抗SARS_c〇v抗體之方法， 包含以依據本發明所產生之SARS_VLPs免疫哺乳動物或鳥 類，及由該哺乳動物或鳥類之血液中收取抗VLPs抗體。 依據下列實例，除了誘發體液免疫反應外，藉由本發明 方法所產生之SARS-VLPs亦可刺激輔助丁（τΗ)細胞的全身 性活化。因此，本發明亦提供一種預防一個體中SARS_c〇v 感染之方法’包含以依據本發明所產生之SARS-vlPs免疫該 個體。較佳者，該個體為哺乳動物，如狗、貓、兔、大鼠、 小既、豬、綿羊、山羊及牛，更佳為人類。 免疫可依傳統方式進行。可包含初次投藥及隨後之數次 加強投藥’但劑量可依各種不同療程而調整。SARS_VLps之 投藥量取決於欲免疫之個體，包括例如該個體之免疫系統產 生抗體、甚至產生細胞媒介免疫反應之能力。需投藥之VLps 正確$取決於從業者。然而，熟習本技術者鑑於本案揭示即 可無須過度貫驗而輕易決定適當劑量範圍。劑量亦可能取決 於投樂途徑，且依宿主之大小而異。非限制性之例示劑量包 括例如：約0.01 mg/kg至約10 mg/kg體重之較佳劑量，及約

ACA0005TW 200813223 0·1 mg/kg至約1 mg/kg體重之更佳劑量。 另一方面，本發明提供一種偵測一個體是否受SARS_c〇v 感染之方法，包含以依據本發明所產生之SARS_VLp接觸該 個體之血清樣本，及測定該樣本中是否有能結合SARS_VLPs 抗原之專一性抗體，其中該抗體之存在表示陽性結果。 較仏者，違方法包含免疫分析。在本發明一特佳具體實 例中，該方法包含酵素連結免疫吸附分析（]£]：]^人）。在EUSA 分析中，VLPs係吸附於一選取之材質表面，例如：聚苯乙烯 微滴定盤之凹槽。沖洗去除不完全吸附之物質後，可令一已 知對受试樣本為抗原中性之非專一性蛋白質，如牛血清白蛋 白（BSA) ’補吸附該選取之表面。如此可阻斷該表面上的非 專一性吸附區，藉以降低因抗血清中之蛋白質與該表面之非 專一性結合所造成的背景訊號。 然後在有利於抗原/抗體結合之條件下，令吸附有 SARS-VLPs之材質表面與體液樣本進行培養（例如··取自疑 似受SARS-CoV感染之個體之血清樣本）。樣本可加入稀釋劑 (如BSA溶液、牛r-球蛋白（BGG)及/或磷酸鹽緩衝生择 鹽水（PBS) /Tween-20)稀釋。然後在適當反應溫度（例如 介於約25。(1；至約37 C)下使樣本反應約2至約4小時。反鹿 後，以一溶液（例如PBS/TweenTM-20或硼酸鹽緩衝液）沖洗 去除未結合之物質。再與對一級抗體具專一性之二級抗體進 行培養，再沖洗後，呈色測定陽性反應程度。若受試樣本係 源自人類，則二級抗體為對人類免疫球蛋白（一般而言為 IgG、IgA、IgM)具專一性之抗體。為便於偵測，該二級抗體 ACA0005TW ,¾ 200813223 可具有相關之活性，例如與適當呈色性受質反應後可產生呈 色效果之酵素活性。然後即可使用例如分光光度計測量顏色 深淺以達到定量之目的。 本發明亦提供另一種偵測一個體是否受SARS-CoV感染 之方法，包含以利用本發明之SARS-VLPs所產生之專一性抗 體接觸該個體之組織樣本，及測定該樣本中SARS-CoV抗原 之存在，其中該抗原之存在表示陽性結果。 較佳者’該方法包含免疫分析。在本發明一特佳具體實 例中，違方法包含間接性免疫螢光染色。間接性免疫螢光染 色包括以抗體染色細胞内之特定蛋白質，及分別經由螢光標 記之二級抗體追蹤訊號。例如，首先將目標細胞固定化、滲 透及清洗，然後以1%明膠/PBST將細胞阻斷一小時，以1% 明膠/PBST適當稀釋後令其與一級抗體（如抗j、M、E及 GFP)在4 C下反應隔夜。以PBST清洗三次後，使細胞與螢 光標記之二級抗體反應，清洗，並於共軛焦顯微鏡下掃描之。 再一方面，本發明提供一種由SARS_VLPs構成，具致免 疫性的組合物，個體在投藥後會產生免疫學反應，例如抗體 或T-細胞反應。 、依據本發明所產生之SARS-VLPs在由培養基或細胞懸浮 液收取後及麟致免疫性組合物前可純純化。可使用任何 已知可由周圍蛋白質、脂質、核酸、膜、完整細胞等分離出 VLPs或病毒之方法。特佳者為親和層析法，例如可使用對 SARS-VLPs具專-性之固定化單株抗體。額外的適合方法為 凝膠職層躲、離子錢朴法及雜梯度沉殿法。

ACA0005TW 200813223 當與佐劑共同投予時，依據本發明所產生之SARS_VLPs 之致免疫性可長:南。佐劑可促進抗原之致免疫性，但本身未 必具有抗原性。佐劑之作用可為將抗原維持於投藥處附近以 產生補給站效應，以便將抗原緩慢且持續地釋放給免疫系統 之細胞。佐劑亦可將免疫系統之細胞吸引至抗原補給站附 近，並刺激該等細胞而引起免疫反應。 例如，可促進致免疫性組合物之有效性之較佳佐劑包括 但不限於：（1)紹鹽（明蓉），如氫氧化銘、填酸銘、硫酸銘 等；（2)水包油乳液配方（含或不含其他特定免疫刺激劑如胞 壁醯肽（見下文）或細菌細胞壁組分），如(a) MF59tm，包含 5%角寬烯TM、0.5% Tween™ 80 及 0.5% SpanTM 85 (視需要包 含不同量之MTP-PE (見下文），雖然非必須），使用微流化器， 如型號 1 10Y 之微流化器（Microfluidics，Newton，Mass·， U.S.A·)調配成次微米顆粒，（b) SAFTM，包含10%角鯊烷TM、 0.4% Tween™ 80、5% pluronic 嵌段聚合物 L121 及 thr-MDP (見下文），可微流化為次微米乳液或渦流震盪以產生顆粒較 大之乳液，及(c) RibiTlv^劑系統（RAS) (Ribi Immunochem， Hamilton, Mont·，U.S.A·)，包含 2%角鯊烯ΤΜ、0·2% Tween™ 80 及選自由下列所組成之群之一或多種細菌細胞壁組分：單磷 酸酯A (MPL)、海藻糖二黴菌酸鹽（TDM)及細胞壁骨架 (CWS)，較佳為 MPL+CWS (DetoxTM) ; (3)皂苷佐劑，可 使用如 StimulonTM (Cambridge Bioscience，Worcester，Mass·， U.S.A·)或由其產生之顆粒如ISCOM (免疫刺激複合物）；（4) 完全弗氏（Freundfs)佐劑（CFA)及不完全弗氏佐劑（IFA);

ACA0005TW 200813223 (5)細胞激素，如介白素（如 IL-l、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、 IL-7、IL-12等）、干擾素（如7 -干擾素）、巨嗟細胞群落刺激 因子（M-CSF )、腫瘤壞死因子（TNF )等；⑹細菌ADP-核糖化毒素，如霍亂毒素（CT)、百日咳毒素（PT)或大腸桿 菌熱易變毒素（LT)，特別是LT-K63、LT-R72、CT-Si09、 PT-K9/G129;及00其他作用如免疫刺激劑而促進組合物有 效性之物質。 如前所述，胞壁醯肽包括但不限於N-乙醯基-胞壁醯基-L-蘇胺醯基-D-異麵胺酸醯胺（thr-MDP)、N-乙醯基-正胞壁醯基 -L-丙胺醯基-D-異麩胺酸醯胺（nor-MDP)、N-乙醯基-胞壁醯 基丙胺醯基-D-異麩胺酸醯胺基丙胺酸-2-(Γ-2’-二棕櫚 醯基-s-n-甘油醯基-3-羥基磷醯氧基)-乙胺（ΜΤΡ-ΡΕ)等。 亦可於本發明之致免疫性組合物中使用醫藥上可接受之 鹽類。例如礦物鹽如氫氯酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽或硫酸鹽， 以及有機酸鹽如乙酸鹽、丙酸鹽、丙二酸鹽或苯甲酸鹽。 本發明之致免疫性組合物一般包含醫藥上可接受之賦形 劑，例如水、生理鹽水、甘油及乙醇，且可包含如濕潤劑、 乳化劑或pH緩衝劑等物質。 本發明之致免疫性組合物可製備為注射物、液態溶液、 懸浮液或乳液，並以非經腸方式作皮下、皮内或肌肉内注射 投樂。或者，本發明之致免疫性組合物可以某種方式調配及 遞达以於黏膜表面誘發免疫反應。因此，該致免疫性組合物 可=例如鼻腔或口腔（胃内）途徑投予至黏膜表面。或者 可能需要其他投藥方式，包括栓劑及口服配方。口服配方之

ACA0005TW 200813223 形式可為溶液、懸浮液、錠劑、片劑、膠囊、持續釋放配方 或粉劑。 本發明之致免疫性組合物可進一步包含來自其他病原體 之抗原而成為多價之致免疫性組合物。

本發明進一步以下列實例闡述，其目的係供說明而非限 實例1 SARS-VLP之表現及組裝 細胞株及質體 維羅E6細胞係得自美國菌種保存中心（atcc編號 CRL-1586TM)，依常規培養於添加有1〇%胎牛血清之Mem培 養基中。衍生自維羅E6之四環素-可誘發性基礎細胞維羅 /TR，係以pcDNA6/TR質體（Invitrogen)作穩定轉染而得。 可誘發性之M-GFP及E表現匣之建構，係將冷-球蛋白/IgG 之合成内子（來自pCI載體，Promega)、M-GFP序列、來自 腦心肌炎病毒（ECMV)之内部核糖體進入位點（iRES)之 序列、及E序列依序以PCR連接，然後將該構築體嵌入 pcDNA4/TO質體（Invitrogen)之骨架中。可誘發性之s表現 匣之建構，係將TW1品系之S蛋白cDNA***pcDNA5/TO 質體（Invitrogen)中。隨後，將整個S表現匣嵌入]yj-GFP及 E之表現質體中而產生pCDNA4/TO-S-MG-E之多遺傳單位載 體。整個質體的序列已經DNA定序確認。 質體的構築 如圖1A中所示，帶三種sARS_CoV被膜蛋白質，S、 M-GFP (亦即與用以追蹤VLP之綠色螢光蛋白（GFP)融合

ACA0005TW 200813223 之Μ蛋白）及E之轉殖基因係建構於同一質體 (pcDNA4/TO-S-MG_E)中。在一質體中，該載體含有兩個表 現匣。CMV/TO-MG-E表現匣（序列識別編號：1)轉錄為一 RNA轉錄體，包含兩個編碼m-GFP及E蛋白之開放譯讀架， 由一内部核糖體進入位點（IRES)連接，而CMV/TO-S表現 匣（序列識別編號·· 2)僅表現s蛋白。兩個轉錄單位均由四 環素-可誘發性啟動子調節。 VLP的表現

將PCDNA4./TO-S-MG-E載體穩定轉染入先前由維羅E6 衍生之基礎細胞，以獲得SARS-VLP表現。該基礎細胞係以 穩定轉染表現一四環素抑制因子（pcDNA6/TR)，因此重組 SARS-CoV基因在誘發前不會表現。依據GFp之螢光強度選 出兩個細胞株用於量產SARS_VLp，亦即維羅/S_MG_匕55及 維羅/S-MG_E_68。病毒基因之表現储由添加強力黴素（i pg/ml)至細胞培養物，並以RT_pCR確認帶s、M及e序列 之RNA之可誘發性表現（不出示數據）。VLp在維羅 /S-MG-E-55才朱中之表現量最高，轉/請αΕ68株次之，因 此VLP之製備主要使用維羅/S_MG_E_55株。 為供共滅顯微鏡分析，將受試細胞培養於12讓蓋玻 片上並以強力彳放素（1 pg/mi)處理丨天。將細胞以挪多聚甲 酸於冰上固定2G分鐘，以〇·2% (v/v) TritQn χτΜ·/ρΒ§穿 透，然後以PBS清洗三次。以1% (v/v)魚凝膠·叮（含 0.1% TweenTM-20 之 pbs、r日齡c T _ 阻斷一小日守後，將樣本於4°C下以 特疋抗體處理18小時，隨德以、主、土 — l T 1通傻以PBST清洗二次，然後以相關 ACA0005TW V? 200813223 的螢光共軛二級抗體於室溫下偵測一小時。最後，將樣本以 PBST清洗三次，並以封片膠（Vect〇r)封片。掃描樣本中之 GFP及抗體螢光標記訊號，隨後以製造商之軟體 510META)分析共同之局部化現象。 如顯微鏡影像圖示（圖1B)，一經誘發，在一天内GFp 點即明顯地出現在生產細胞中，且GFP螢光之表現延續超過 五天。在細胞質中由細胞核周圍區域延伸向細胞膜之各種大 小之GFP點，狀似哺乳動物細胞中由内質網（ER)至細胞膜 之分泌途徑。此胞内分布符合SARS及其他冠狀病毒之組裝， 係位於ER-高基之間的區域。 以下藉免疫螢光染色檢視各VLP組成蛋白（S、M、E及 GFP)於細胞内之表現，並與GFp之螢光轨跡進行重疊來分 析VLP之組裝，如圖1B中所示誘發一天後之VLps生產細 胞。以抗Μ蛋白或GFP抗體染色造成與（}FP軌跡完全重合 之訊號，因此表示GFP融合忠實地標記了 M蛋白（圖1B)。 除了細胞核周圍（高基氏體位置）之染色外，s蛋白有強烈之 ER網狀形態染色（此外尚有高基氏體及分泌液泡之輪廓，圖 1B)。然而，S蛋白與μ-GFP之重合點主要限於高基氏體及 分泌液泡。較多s蛋白累積於ER*，表示其在ERt滯留期 較長，其新合成及醣化可能需要較長的時間。雖然多數分泌 f生Μ-GFP點與E蛋白之染色呈重合分布，細胞核附近之 Μ-GFP有的與e蛋白重合，有的不與£蛋白重合。以上數據 共同顯不E蛋白一旦轉譯出來，旋即加入高基氏體附近之 Μ-GFP及s蛋白進行組合，因此形成m_gfp、β及s蛋白間

ACA0005TW 200813223 精確地重合於分泌液泡處（圖1B)。在作為負對照組之維羅 E6母細胞中，相同的S、Μ或E抗體免疫染色並未偵測到任 何訊號，亦未見到GFP之螢光軌跡（不出示數據）。與先前對 SARS-CoV及其他冠狀病毒之芽生及VLP組裝之研究一致 者，本案之數據指出SARS-M、E及S係於細胞核附近組裝， 並於分泌液泡中重合分布。三種蛋白質組裝為類SARs_c〇v 顆粒，在以下的蔗糖梯度實驗中共同沉降及電顯影象中呈多 刺球狀顆粒得到進一步證明（圖2D)。 實例2 SARS-VLP之純化與定性 進行VLP之純化，首先於45%蔗糖緩衝物上以200,000 xg 之超高速離心，將釋放有VLP的細胞培養液於4°C下濃縮2 小時。收集介面，再以25%、35%蔗糖之階梯式梯度超高速離 心，以200,000 xg於4°C下進一步分離48小時。由試管底部 往上每0.5 mL分割取樣。以考馬西（Coomassie) (Bradford) 蛋白質分析套組（Pierce)分析各分割之蛋白質濃度，並以 VICTOR2tm螢光光度計（perkinElmer)測量GFP螢光。 利用西方墨點分析作蛋白質鑑定，抗體是以大腸桿菌表 現之Μ蛋白（序列識別編號：3之第53至221個胺基酸）及 Ε蛋白（序列識別編號：4之第1至76個胺基酸）為抗原， 於由兔子脾臟注射產生。抗S蛋白多株抗體係使用大腸桿菌 表現之S蛋白（序列識別編號：5之第679至888個胺基酸） 為抗原於注射鴨子產生，並由卵黃純化IgY抗體（Wu，Η· S· 專人 ’ 2004，J 11 · 117-126 )。 如圖2A所示，蛋白質與GFP的分布，一致地集中於25%

ACA0005TW 200813223 嚴糖層（苐9至15分吾彳樣本）。令人意外地，本研究亦發現 一集中於35%庶糖層（弟2至6分割樣本）之次要蛋白質峰， 此一次要蛋白質峰並未見於維羅/S-MG-E-68株。以SDS-PAGE 及考馬西藍染色作蛋白貝分析，顯示該兩個明顯區分之蛋白 質峰顯然具有不同的蛋白質組成（圖2B)。圖2B中標示之各 種預期大小之VLP組成蛋白質，係使用抗s、μ、E及GFP 蛋白之特定抗體作西方墨點分析確認（圖2C)QSARS-VLp包 1 含多型之s蛋白，主要是有分子量18Gk(0)之成熟形式， 較少的是170k(*)及140k( + )(圖2B)。依據先前針對s 及Μ蛋白於哺乳動物細胞中個別表現之研究，18〇k (〇）型 代表一複合醣化型（EndoH|性但PNGaseF-敏感性）；17〇 kDa (★)型代表一咼-甘絡糖醣化型（EndoH-敏感性）；而140 kDa (+ )型代表一未醣化型。經純化之SARS_c〇V包含兩型之 Μ。數量較多是分子量22 k的未醣化型，而數量較少之27 k 的帶一 EndoH-可切、高-甘露糖型之N_聚醣，連接於八犯_4 ' 殘基（Wss，D•等人，20〇6，同上）。SARS-VLP中GFP融合 • 提高分子量27 k，SARS-VLP中M_GFP之分子量主要為65k (#)與70k(*)兩型，於SDS電泳中不知為何均額外的 增加16卜651^型（#)多於紙型（氺），這點與前人研究 一致（圖2B)。E蛋白在蔗糖梯度沉澱中與M蛋白一起，且 其分子量9k可能表示缺乏醣化。 SARS-VLP除了有預期之主要型式。$預期的次要型式則 主要含170 k型之S蛋白及較少65 k型之M_GFp，但沒有E 蛋白，因此未於此進一步定性。主要的SARS_VLp (亦即圖

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體化之前。就其於SDS 变曰苟主要的180 k型， 一般逐為其熟成係發生於s蛋白三聚 )S電泳中之移動率估計，分泌型 SARS-VLP中所含之所有s蛋白均未受蛋白酶切割。 進一步以穿透式電子顯微鏡（EM)觀察SARS_VLp之外 形。為供EM，將-滴1() μ1經純化之SARS_VLp點至碳膜上， 3分鐘靜置後’ α 2%乙酸鈾醯染色2分鐘，在電子顯微鏡下 直接觀察。由® 2D可見’㈣之VLP外形為具有多刺表面 之球狀顆粒，類似於SARS_c〇v顆粒，且直徑範圍介於5〇 nm 及70nm間。維羅E6細胞所釋放之空心VLP，其直徑比釋放 細於胞外之SARS-CoV真病毒（介於60 nm及100 nm間）小。 值得注意者，上述SARS-VLP之蛋白質產量很高，對所 有相關應用而言，本案的VLP表現系統極具吸引力。以圖2 所示為例，誘發後3天及5天時收集之共750 ml培養液，其 經常性的純化VLP產能，第9至15分割（每一分割樣本有3 ml)加總共產出250 mg之純化VLP蛋白質（圖2A)。發明人 使用哺乳動物細胞為本之維羅/S-MG-E-55株生產 SARS_VLP，經常性產量為449.7土69.3 mg/L培養基（如12) (使用1·2χ108個生產細胞），較文獻中以昆蟲細胞為本之 SARS-VLP產量高了超過ι，〇〇〇倍（200 pg/LxlO9個宿主細 胞，估計為0.5至1 L細胞培養液XMortolaE.及Roy，P.，2〇〇4, 同上）。發明人相信本研究中SARS-VLP空前的高表現量可能

ACA0005TW 200813223 肇因於以下之最佳搭配：維羅E6作為宿主細胞表現SARS病 毒蛋白質，及轉殖基因在染色質中嵌入一基因表現上高度活 躍的區域；因為發明人亦分離出許多其他基因轉殖維羅E6細 胞株，其GFP點之細胞内表現程度顯然較低。然而，這也可 能涉及用於本研究細胞株中之可誘發性CMV啟動子帶來的 強力表現。就發明人所知，在維羅E6細胞中以穩定轉染生產 SARS-VLP提供最高的產量，且生產過程不難修改作大規模生 產，本系統具潛力發展經濟有效之疫苗。 實例3 疫苗接種實驗 有了可由上述哺乳動物表現獲得之大量sars-vlp，下一 個重要課題係其致免疫性及SARS-C〇V-中和抗體反應。針對 此課題，本案發明人設計了 —㈣小鼠疫苗接種試驗並檢查 王身|±免疫反應（圖3A)。以四隻6至8週齡之C57BL/6雌 鼠為、、且於皮下主射20 pg SARS-VLP (溶於1〇〇 生理 食鹽水中，不含額外之佐劑），並於兩週後以不同劑量（〇、5 阳20 Hg)加強。對照組小鼠則注射1〇〇叫生理食鹽水。 接種SARS_VLP可在小鼠中誘發抗原專一性之IgGi反 E加強免疫後兩週時，用原本的SARS-VLP為吸附抗原作 七A疋里血清IgG之抗原專一性。自尾靜脈採血後，於4〇c 血1^夜、離心澄清、取得樣本血清。以1问sars-vlp 下吸附ELISA盤（Nunc)隔夜，並以生理食鹽水含5% 二礼進订阻斷。然後加入圖中指示之稀釋血清樣本於37。。 "養小時’ PBST沖洗五次、再以HRP-二級抗體培養，

ACA0005TW 200813223 再PBST沖洗、加入TMB受質（PIERCE)呈色。最後，以微 量盤吸光侧定儀（PowerWaveXS, Bio-Teck)讀取450 nm波 長（Amo)之吸光值。扣除空樣本之背景讀值作VLP-專一性 IgG 定量（A450 )。 如圖3B所示，單劑20 pg VLP確實誘發50倍高之抗體 反應。加強免疫一次，專一性抗體力價隨劑量增加而提高， 可超過6250倍（圖3B)。偵測各IgG亞型之ELISA，發現抗 體反應主要限於IgGl亞型，其一般功能在中和抗原（圖3B)。 反之，在該等實驗中IgG2a亞型之VLP·專一性抗體力價則非 常低（圖3B)。總之，抗體亞型之反應顯示SARS-VLP針對 其表面之抗原決定點之誘發TH2-型免疫細胞之功能與效應。 最重要的是，使用世界衛生組織網站建議之商業化ELISA檢 驗套組化驗，SARS-VLP所誘發的IgG抗體能有效辨識經7_ 射線及加熱去活化之SARS-CoV真病毒顆粒（圖3C)。在加 強免疫後，在小鼠血中之高力價專一性抗體至少可維持4週， 指出施打SARS-VLP可造成長期持續之抗體免疫反應（圖 3D)。圖3B至3C中之ELISA結果，SARS-VLP疫苗所誘發 的抗體能辨識、結合VLP及完整病毒之表面，顯示可能中和 SARS病毒。以上結果亦證明VLP與完整SARS病毒的表面 十分相似。 SARS-VLP誘發S及Μ蛋白專一性抗體之金清IgG抗體。 小鼠施打SARS-VLP後之抗體反應，我們利用西方墨點 分析轉潰有三個不等量之SARS-VLP來了解抗體是針對哪些 VLP蛋白質。如圖3E所示，VLP-專一性抗體對M-GFP結合

ACA0005TW 200813223 隶強’其次為S蛋白’最後才是E蛋白。VLP-專一性抗體有 效率地結合各型S及Μ蛋白。以上數據指出在SARS-VLP中 S及Μ蛋白較Ε蛋白的致免疫性高很多，這亦符合在saRS 病患中發現之抗體專一性。 施打SARS_VLP可在小鼠中誘發抗原專一性辅助τ (TH)細胞反應。 接種SARS-VLP疫苗產生之TH反應類型，我們以IFN-γ 及IL-4 ELISPOT (酵素連結免疫墨點分析）檢查脾臟細胞之 TH1及TH2是否活化而分泌細胞激素。為供ELISPOT分析， 先以 0.1 mlIFN-γ 及 IL-4 抗體（1 ·· 60 ; R&D systems)於 4°C 下吸附於PVDF底之微量盤（Millipore)、隔夜。以PBS沖洗 兩次後，加入含1%BSA之生理食鹽水於室溫下阻斷4小時。 在加強投藥後14天時自受試小鼠中取出脾臟、分離細胞並溶 破紅血球。脾臟細胞體外培養於INF-γ或IL-4 ELISPOT盤中， 呈單一細胞懸浮，每孔加入3χ105細胞與1 pg VLP，於含10% 加熱去活化FBS及50 μΜ0-酼基乙醇之RPMI中，培養40 小時。ELISPOT之各步驟間以PBST沖洗五次。將盤以0.1 mL 1/60稀釋之生物素接合之INF-γ或IL-4偵測抗體（R&D systems)於4°C下培養隔夜，沖洗後，加入1/60稀釋之 streptavidin-alkaline phosphatase (R&D systems)於室溫下處 理1.5小時，沖洗，並以水沖洗兩次。於黑暗中以BCIP/NBT 溶液（R&D systems)使ELISPOT呈色30分鐘。以水沖洗俾 停止呈色並風乾。以ImmunoSpot分析器計數訊號並以 ImmunoSpot 軟體（CTL)分析之。

ACA0005TW 200813223 ί : 當小鼠施打SARS-VLP後，脾細胞之初代培養於活體外 再次接觸SARS-VLP時，會釋放INF-γ與IL-4之族群均隨著 SARS-VLP之注射劑量而上升，顯示SARS-VLP疫苗接種在 活體内，隨劑量增加而誘導出更多脾臟中具VLP-專一性的 ThI細胞及Th2細胞（圖4A及4B )。然而，血清中以jgGi 為主之抗體反應偏向TH2之免疫反應，又當DC對TH1及CTL 呈現VLP抗原時，二者均可分泌INF-r，故推測τΗ1細胞在 經疫苗接種之小鼠中之功能應為活化CTL。（圖3B及3C)。 總體而言，以上數據指出SARS-VLP本身即為強力的疫苗， 其可誘發體液及細胞免疫反應。 熟習本技藝者當暸解針對上述具體實例可於不偏離本發 明寬廣之發明概念下進行改變化。應瞭解本發明並不限於所 揭示之特定具體實例，旨在涵蓋如所附申請專利範圍所定義 本發明之精神及範圍内。 【圖式簡單說明】 上述發明内容及實施方式與所附圖式—併_將更增瞭 =發明。關明本發明之目的，圖式中所示具體實例為目 剛較佳者。然而，減解本發明並不限於所示之仙配置及 在圖式中：

♦現二匕3圖1A及1B圖1A包含建構勞光SARS-VLP 體之圖解。圖1B包含螢光影像，顯示所表現之ip 之位置。圖1A係將兩個受四環素操縱早 子斷表現刚於同-質雜中，俾==:

ACA0005TW 200813223 Μ-GFP融合蛋白（亦即與綠色螢光蛋白（GFP)融合之Μ蛋 白）及Ε蛋白，及另一表現匣中之s蛋白之可誘發性表現。 圖1Β顯示螢光sARS_VLPs在維羅E6/S-MG-E_55生產細胞株 中之表現及組裝，其中細胞的誘發係添加1 pg/ml強力黴素 (Dox)至培養基經一天，固定，然後以特別針對μ、GFP、 S及Ε蛋白之抗體（如標示）作間接染色。掃描經染色細胞中 來自GFP之綠色螢光並重疊之，以觀察生產細胞中VLP所含 各種蛋白質之共同局部化現象。 圖2包含圖2Α至2D，顯示維羅Ε6分泌之SARS-VLPs 之純化及定性結果。圖2A係以蔗糖梯度超離心純化分泌之 VLPs。如標示般繪出各級分中蛋白質濃度（以Bradf0rd分析 測量）及GFP螢光之圖表。圖2B係以SDS-PAGE及考馬西 藍染色分析各級分中所含蛋白質。圖2C係使用抗S、Μ、E 或GFP蛋白之抗體，以西方墨點分析確認圖2Β中標示之蛋 白質條帶之身分。圖2D係經負染色之SARS_VLPs (圖2B之 級分9至15)之電子顯微鏡影像，該等SARS-VLps係以蔗糖 梯度由細胞培養基中純化而得（條狀物表示5〇 nm之尺度）。 圖3包含圖3A至3E，顯示SARS_VLPs免疫於小鼠中誘 發體液免疫反應之結果。圖3A係免疫程序之示意圖，如標示 般於兩個時間點對每組四隻小鼠皮下注射不同劑量之 SARS_VLPs。以ELISA檢查系列稀釋後之血清樣本，俾瞭解 受試小鼠中之VLP-專一性抗體反應。圖3B顯示之圖表係關 於VLP-專一性IgG、IgG1及IgG2a之ELISA滴定量，使用 SARS-VLP作為捕捉抗原。於初次免疫後第28天收集血清樣

ACA0005TW 200813223 本。x_軸標示受試樣本之稀釋度。扣除背景之吸收度（45〇nm) 係以平均值±鮮差（綠條）作圖。所减據為三次不同實 驗結果之總和。圖3C之圖表係關於vu>_專一性Ig(}抗體與 真貝SARS-CoV之父叉反應。於pBS中稀釋圖3B中所示之 抗血清（1 · 250 )。以商業SARS EUSA測試套組 (Euroimmun)，依據製造商之程序說明偵測SARs_vLp疫苗 接種所誘發之SARS·專-性抗體較量，唯—修飾在於以抗· 小鼠IgG取代抗-人類吵二級抗體。總結各組免疫小鼠中之 平均滴疋量及標準差並以平均值±標準差作圖。圖3D之圖表 係關於VLP所誘發之抗體反應之時程。於所指示之時間點收 集經免疫小鼠之血清樣本。於PBS中稀釋抗血清（1 : 250)， 並如圖3B般以ELISA分析測量VLP-專一性IgG。圖3E係關 於VLP所誘發之抗體之抗原決定位。裝載三種劑量（1⑻、1〇、 1 ng)之經純化VLP作為西方墨點抗原。於pBs中稀釋圖3B 中所示之抗血清（1 ·· 1000)並從事西方墨點分析。 圖4包含圖4A及4B，係關於SARS-VLPs免疫於小鼠中 所誘發之細胞免疫反應。脾細胞係得自如圖3B所示初次免疫 後28天之受試小鼠，將其初代培養物以SARS-VLP重新刺激 40小時。以ELISPOT分析測定分泌干擾素(圖4A)及介 白素-4 (圖4B)之有反應細胞。所示數據為三次不同實驗結 果之總和以平均值士標準差（誤差條）表示。

ACA0005TW 200813223 序列表 <11〇> 蕭培文 楊寧蓀 黃銓珍 林恩豪 <120〉 產生類病毒微粒之高產率轉殖基因哺乳動物表現系統 <140> 095146898 <141〉 2006.12.14 <150> USSN 11/515,843 <151> 2006.9.5 <160> 5 <170> Patentln 3·3版 <210> 1 <211〉 3484 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> 表現匣 <300> <301> Ya〇,F., Svens joA Τ·, Winkler,- Τ., Lu, Μ·' Eriksson, C.，及 Eriksson, E. <302> 四環素抑制子tetR，而非tetR-哺乳動物細胞轉錄因子融合衍生物，在哺乳動物細胞 中調節可誘發性基因表現 <303> Hum. Gene Ther. <304> 9 <305> 13 <306〉 1939-1950 <307> 1998-09-01 <313〉 （1) ·· (770)

200813223 <300〉 <308〉 £111:〜2核苦酸 / AY27 8741 <309> 2005-10-04 <313> (1004) . . (1666) <300> <308〉 Entrez核苦酸 / AY278741 <309> 2005-10-04 <313〉 (2992) .. (3222) <300〉 <308〉酸 / U57 609 <309〉 2003-08-29

<313> (1673) .. (2389) <400> 1 . gttgacattg gcccatatat ccaacgaccc ggactttcca atcaagtgta cctggcatta tattagtcat agcggtttga tttggcacca aaatgggcgg atagagatct tcgcctggag gcctccggac ttggtcgtga atagaaactg tcttactgac ctcttaaggc tattaccgtt attcctagcc cataataaag tgctgctgtc tgtaggcttg ctcaatgtgg aattgtgacc attattgact ggagttccgc ccgcccattg ttgacgtcaa tcatatgcca tgcccagtac cgctattacc ctcacgggga aaatcaacgg taggcgtgta ccctatcagt acgccatcca tctagcgttt ggcactgggc ggcttgtcga atccactttg tagagtactt gaggagctta tggattatgt cttgttttcc tacagaatta atgtggctta tcattcaacc agaccgctca agttattaat gttacataac acgtcaataa tgggtggagt agtacgcccc atgaccttat atggtgatgc tttccaagtc gactttccaa cggtgggagg gatagagatc cgctgttttg aaacttaagc aggtaagtat gacagagaag cctttctctc aatacgactc aacaactcct tactacaatt tctggctctt attgggtgac gctacttcgt cagaaacaaa tggaaagtga agtaatcaat ttacggtaaa tgacgtatgt atttacggta ctattgacgt gggactttcc ggttttggca tccaccccat aatgtcgtaa tctatataag gtcgacgagc acctccatag ttggtaccga caaggttaca actcttgcgt cacaggtgtc actataggct ggaacaatgg tgcctattct gtggccagta tggcgggatt tgcttccttc cattcttctc acttgtcatt tacggggtca tggcccgcct tcccatagta aactgcccac caatgacggt tacttggcag gtacatcaat tgacgtcaat caactccgcc cagagctctc tcgtttagtg aagacaccgg gctcggatcc agacaggttt ttctgatagg cactcccagt agcatggcag aacctagtaa aatcggaaca acacttgctt gcgattgcaa aggctgtttg aatgtgcctc ggtgctgtga ttagttcata ggctgaccgc acgccaatag ttggcagtac aaatggcccg tacatctacg gggcgtggat gggagtttgt ccattgacgc cctatcagtg aaccgtcaga gaccgatcca cttgcagaag aaggagacca cacctattgg tcaattacag acaacggtac taggtttcct ggtttttgta gttttgtgct tggcttgtat ctcgtacccg tccgggggac tcattcgtgg 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 144 0 200813223

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^ W W ^ W W cgtgaccgcc ctctccctcc gtttgtctat acctggccct gcaaggtctg aacgtctgta cggccaaaag tgtgagttgg gctgaaggat catgctttac acgtggtttt ttcgtttcgg gtggtattct tgcaatattg aatctgaact acccgctgat cccgtgcctt gaaattgcat gacagcaagg atgg atggccggac gctacatcac tcaggttttg gccggtagca ctgttcaccg ttcagcgtgt atctgcacca ggcgtgcagt gccatgcccg aagacccgcg ggcatcgact agccacaacg atccgccaca cccatcggcg gccgggatca ccccccccta atgtgatttt gtcttcttga ttgaatgtcg gcgacccttt ccacgtgtat atagttgtgg gcccagaagg atgtgtttag cctttgaaaa aagaaacagg tgctagtcac ttaacgtgag cttctgaagg cagcctcgac ccttgaccct cgcattgtct gggaggattg accccctagg gaacgctttc ctgcatacaa acgacaatat gggtggtgcc ccggcgaggg ccggcaagct gcttgagccg aaggctacgt ccgaggtgaa tcaaggagga tctatatcat acatcgagga acggccccgt accccaacga ctctcggcat acgttactgg ccaccatatt cgagcattcc tgaaggaagc gcaggcagcg aagatacacc aaagagtcaa taccccattg tcgaggttaa acacgatgat tacgttaata actagccatc tttagtaaaa agttcctgat tgtgccttct ggaaggtgcc gagtaggtgt ggaagacaat gcgctgtgac ttattacaaa ccgctaccgt tgctttgcta catcctggtc cgagggcgat gcccgtgccc ctaccccgac ccaggagcgc gttcgagggc cggcaacatc ggccgacaag cggcagcgtg gctgctgccc gaagcgcgat ggacgagctg ccgaagccgc gccgtctttt taggggtctt agttcctctg gaacccccca tgcaaaggcg atggctctcc tatgggaatc aaaaacgtct aatatggcca gttaatagcg cttactgcgc ccaacggttt cttctggtct agttgccagc actcccactg cattctattc agcaggcatg attaaggacc ttaggagcgt attggaaact gtacaggagc gagctggacg gccacctacg tggcccgccc cacatgaagc accatcttct gacaccctgg ctggggcaca cagaagaacg cagctcgccg gacaaccact cacatggtcc tacaagtaag ttggaataag ggcaatgtga tcccctctcg gaagcttctt cctggcgaca gcacaacccc tcaagcgtag tgatctgggg aggccccccg caaccggatc tacttctttt ttcgattgtg acgtctactc aatctagagg catctgttgt tcctttccta tggggggtgg ctggggatgc tgccaaaaga cgcagcgtgt ataaattaaa tcgtgagcaa gcgacgtaaa gcaagctgac tcgtgaccac agcacgactt tcaaggacga tgaaccgcat agctggagta gcatcaaggt accactacca acctgagcac tgctggagtt aattccgccc gccggtgtgt gggcccggaa ccaaaggaat gaagacaaac ggtgcctctg agtgccacgt tcaacaaggg cctcggtgca aaccacgggg tatgtactca tcttgctttc tgcgtactgc gcgtgttaaa gcccgtttaa ttgcccctcc ataaaatgag ggtggggcag ggtgggctct 1500 1560 1620 1680 1740 1800 I860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2280 2340 2400 2460 2520 2580 2640 2700 2760 2820 2880 2940 3000 3060 3120 3180 3240 3300 3360 3420 3480 3484 <210〉 2 <211> 4837 <212> DNA <213> 人工序列 200813223 <220> <223> 表現匣 <300> <301〉 Yao' Fw Svensjo, T., Winkler, Τ·, Lu, Μ·, Eriksson, C·,及 " Eriksson, E. <302〉 四環素抑制子tetR，而非tetR-哺乳動物細胞轉錄因子融合衍生物，在哺乳動物細胞 中調節可誘發性基因表現 <303> Hum. Gene Ther. <304> 9 <305> 13 γ 、 <30β> 1939-1950 f <307> 1998-09-01 <313> (1)..(770) <300> <3〇8> Entrez核苷酸 / AY291451 <309> 2004-02-25 <313〉 (771) .. (4538) <400> 2 gttgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata 60 gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc 120 ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag 180 _ ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac 240 (/atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg 300 ^ cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg 360 tattagtcat cgctattacc atggtgatgc ggttttggca gtacatcaat gggcgtggat 420 agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt 480 tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa caactccgcc ccattgacgc 540 aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag cagagctctc cctatcagtg 600 atagagatct ccctatcagt gatagagatc gtcgacgagc tcgtttagtg aaccgtcaga 660 tcgcctggag acgccatcca cgctgttttg acctccatag aagacaccgg gaccgatcca 720 gcctccggac tctagcgttt aaacttaagc ttggtaccga gctcggatcc atgtttattt 780 tcttattatt tcttactctc actagtggta gtgaccttga ccggtgcacc acttttgatg 840 atgttcaagc tcctaattac actcaacata cttcatctat gaggggggtt tactatcctg 900 atgaaatttt tagatcagac actctttatt taactcagga tttatttctt ccattttatt 960 ctaatgttac agggtttcat actattaatc atacgtttgg caaccctgtc atacctttta 1020 aggatggtat ttattttgct gccacagaga aatcaaatgt tgtccgtggt tgggtttttg 1080 200813223

J gttctaccat ttatacgagc tgggtacaca tatctgatgc agtttgtgtt atgtagttcg ttggtattaa tttggggcac tcaagtatga ctgaactcaa atttcagggt cttttggaga aaatttctaa ttaagtgcta cagattci-^t ttattgctga atactaggaa gacatggcaa gcaaaccttg acaccactac taaatgcacc gtgtcaattt gatttcaacc atcctaaaac ttacacctgg ctgatgtttc ctggaaacaa cttcttatga ctttattacg atagttcaat ttactacaga tctgcggaga aactaaatcg tcgctcaagt tttcacaaat tctttaataa gtgatattaa cacctctgct ccactgctgg tggcatatag aaatcgccaa gaacaacaag atgtaacttt gacacatact cttttcgctt taaaaataaa tgatctacct cattacaaat gtcagctgca tgaaaatggt atgctctgtt tgttccctca ggtttttaat ttgtgttgct tggcgtttct tgtagtcaag ttataattat cattgatgct gcttaggccc caccccacct tggcattggc ggccacggtt taattttaat atttcaacaa atctgaaata aacaaatgct tacagcaatt tgtattccag gtgcgacatt tagtactagc tgcttactct agtaatgcct ttctactgaa tgcactctca caaacaaatg attacctgac ggtgacactc tgctagagat cactgatgat atggacattt gttcaatggc ccaatttaac tcacagtcgg gaattgtgtg atgatattcg gatgtttcag gatgggtttc tctggtttta tttagagcca gcctattttg acaatcacag aagagctttg ggagatgttg gctactaaat gattactctg gccactaagt ggagatgatg aaattgccag acttcaactg tttgagagag gctcttaatt taccaacctt tgtggaccaa ggactcactg tttggccgtg ttagacattt tcatctgaag catgcagatc actcaagcag cctattggag caaaaatcta aataacacca gtttctatgg tgtgctaatt ggtattgctg tacaaaaccc cctctaaagc gctgatgctg ctcatttgtg atgattgctg ggtgctggcg attggagtta aaggcgatta tgattattat acaacccttt ataatgcatt aaaagtcagg tctatgttta acactttgaa ttcttacagc ttggctattt atgctgttga agattgacaa tgagattccc tcccttctgt tgctctacaa tgaatgatct taaqacaaat atgatttcat gtaattataa acatatctaa gttattggcc acagagttgt aattatccac gtactggtgt atgtttctga caccttgctc ttgctgttct aactcacacc gctgtcttat ctggcatttg ttgtggctta ttgctatacc ctaaaacctc tgcttctcca ctgaacagga caactttgaa caactaagag gcttcatgaa cgcagaagtt cctacactgc ctgctcttca cccaaaatgt gtcaaattca taacaattct ctttgctgtt taattgcact taattttaaa taagggctat acctattttt cttttcacct aaagccaact ttgttctcaa aggaatttac taatattaca ctatgcatgg ctcaacattt ttgcttctcc agcgccagga gggttgtgtc ttataaatat tgtgcctttc attaaatgat agtactttct tgaccttatt gttaactcct tttcactgat ttttgggggt atatcaagat agcttggcgc aggagctgag tgctagttac tactatgtct tactaacttt cgtagattgt atatggtagc tcgcaacaca atattttggt gtcttttatt gcaatatggc caatggactt tgctctagtt aatacctttt tctctatgag agaatcactt actaatgttg tctaaaccca ttcgagtaca cacttacgag caacctatag aagttgcctc gctcaagaca acatttatgc aatccacttg cagacctcta aacttgtgtc gagagaaaaa ttttcaacct aatgtctatg caaactggtg cttgcttgga aggtatctta tcccctgatg tatggttttt tttgaacttt aagaaccagt tcttcaaaga tccgttcgag gtaagtgtaa gttaactgca atatattcta catgtcgaca catacagttt ttaggtgctg tcaattagca aatatgtaca ttttgcacac cgtgaagtgt ggttttaatt gaggacttgc gaatgcctag acagtgttgc agtggtactg gctatgcaaa aaccaaaaac acaacaacat 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 I860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2280 2340 2400 2460 2520 2580 2640 2700 2760 2820 2880 2940 3000 3060 3120 3180 3240 3300 3360 3420 3480 3540

200813223 caactgcatt gggcaagctg caagacgttg ttaaccagaa tgctcaagca ttaaacacac ttgttaaaca acttagctct aattttggtg caatttcaag tgtgctaaat gatatccttt cgcgacttga taaagtcgag gcggaggtac aaattgacag gttaattaca ggcagacttc aaagccttca aacctatgta acacaacaac taatcagggc tgctgaaatc agggcttctg ctaatcttgc tgctactaaa atgtctgagt gtgttcttgg acaatcaaaa agagttgact tttgtggaaa gggctaccac cttatgtcct tcccacaagc agccccgcat ggtgttgtct tcctacatgt cacgtatgtg ccatcccagg agaggaactt caccacagcg ccagcaattt gtcatgaagg caaagcatac ttccctcgtg aaggtgtttt tgtgtttaat ggcacttctt ggtttattac acagaggaac ttcttttctc cacaaataat tactacagac aatacatttg tctcaggaaa ttgtgatgtc gttattggca tcattaacaa cacagtttat gatcctctgc aacctgagct tgactcattc aaagaagagc tggacaagta cttcaaaaat catacatcac cagatgttga tcttggcgac atttcaggca ttaacgcttc tgtcgtcaac attcaaaaag aaattgaccg cctcaatgag gtcgctaaaa atttaaatga atcactcatt gaccttcaag aattgggaaa atatgagcaa tatattaaat ggccttggta tgtttggctc ggcttcattg ctggactaat tqr.n^tcgtc atggttacaa tcttgctttg ttgcatgact aqttqttqca gttgcctcaa gggtgcatgc tcttgtggtt cttgctgcaa gtttgatgag gatgactctg agccagttct caagggtgtc aaattacatt acacataaaa gcttgcaatc actagtgaat tcgcggccgc tcgagtctag agggcccgtt taaacccgct gatcagcctc gactgtgcct tctagttgcc agccatctgt tgtttgcccc tcccccgtgc cttccttgac cctggaaggt gccactccca ctgtcctttc ctaataaaat gaggaaattg catcgcattg tctgagtagg tgtcattcta ttctgggggg tggggtgggg caggacagca agggggagga ttgggaagac aatagcaggc atgctgggga tgcggtgggc tctatgg <210〉 3 <211〉 221 <212〉 蛋白質 <213> SARS 冠狀病毒 Urbani <300〉 <308〉 Entrez蛋白質 / AAP13444 <309〉 2005-10-04 <313〉 (1) .. (221) <400> 3 3600 3660 3720 3780 3840 3900 3960 4020 4080 4140 4200 4260 4320 4380 4440 4500 4560 4620 4680 4740 4800 4837

Met Ala Asp Asn Gly Thr 1 5 Glu Gin Trp Asn Leu Val 20 lie Thr Val Glu Glu Leu Lys Gin 10 lie Gly Phe Leu Phe Leu Ala Trp

Leu Leu 15 工le Met 25 30 200813223

Leu Leu Gin Phe Ala Tyr Ser Asn Arg Asn Arg Phe Leu Tyr lie lie 35 40 45

Lys Leu Val Phe Leu Trp Leu Leu Trp Pro Val Thr Leu Ala Cys Phe 50 55 60

Val Leu Ala Ala Val Tyr Arg lie Asn Trp Val Thr Gly Gly 工le Ala 65 70 75 80 工le Ala Met Ala Cys 工le Val Gly Leu Met Trp Leu Ser Tyr Phe Val 85 90 95

Ala Ser Phe Arg Leu Phe Ala Arg Thr Arg Ser Met Trp Ser Phe Asn 100 105 110

Pro Glu Thr Asn lie Leu Leu Asn Val Pro Leu Arg Gly Thr lie Val 115 120 125

Thr Arg Pro Leu Met Glu Ser Glu Leu Val lie Gly Ala Val lie lie 130 135 140

Arg Gly Hi? Lph Arg Met Ala Gly His Pro Leu Gly Arg Cys Asp lie 145 150 155 160

Lys Asp Leu Pro Lys Glu lie Thr Val Ala Thr Ser Arg Thr Leu Ser 165 170 175

Tyr Tyr Lys Leu Gly Ala Ser Gin Arg Val Gly Thr Asp Ser Gly Phe 180 185 190

Ala Ala Tyr Asn Arg Tyr Arg 工le Gly Asn Tyr Lys Leu Asn Thr Asp 195 200 205

His Ala Gly Ser Asn Asp Asn 工le Ala Leu Leu Val Gin 210 215 220

<210> 4 <211> 76 <212> 蛋白質 <213〉 SARS 冠狀病毒 Urbani <300> <308> Entrez蛋白質 / AAP13443 <309> 2005-10-04 <313〉 （1)..(76) <400> 4

Met Tyr Ser Phe Val Ser Glu Glu Thr Gly Thr Leu lie Val Asn Ser 15 10 15 200813223

Val Leu Leu Phe Leu Ala Phe Val Val Phe Leu Leu Val Thr Leu Ala 20 25 30 lie Leu Thr Ala Leu Arg Leu Cys Ala Tyr Cys Cys Asn lie Val Asn 35 40 45 Val Ser Leu Val Lys Pro Thr Val Tyr Val Tyr Ser Arg Val Lys Asn 50 55 60 Leu Asn Ser Ser Glu Gly Val Pro Asp Leu Leu Val 65 7 0 75 <210〉 5 <211〉 1255 <212> 蛋白質

/ <213> SARS冠狀病毒TW1 <300> <308〉 Entrez蛋白質 / AAP37 017 <309> 2004-02-25 <313> (1)..(1255) <400> 5

Met Phe lie Phe Leu Leu Phe Leu Thr Leu Thr Ser Gly Ser Asp Leu 15 10 15

Asp Arg Cys Thr Thr Phe Asp Asp Val Gin Ala Pro Asn Tyr Thr Gin 20 25 30

His Thr Ser Ser Met Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Glu lie Phe Arg 35 40 45

Ser Asp Thr Leu Tyr Leu Thr Gin Asp Leu Phe Leu Pro Phe Tyr Ser 50 55 60

Asn Val Thr Gly Phe His Thr lie Asn His Thr Phe Gly Asn Pro Val 65 70 75 80 lie Pro Phe Lys Asp Gly lie Tyr Phe Ala Ala Thr Glu Lys Ser Asn 85 90 95

Val Val Arg Gly Trp Val Phe Gly Ser Thr Met Asn Asn Lys Ser Gin 100 105 110

Ser Val lie lie lie Asn Asn Ser Thr Asn Val Val 工le Arg Ala Cys 115 120 125

Asn Phe Glu Leu Cys Asp Asn Pro Phe Phe Ala Val Ser Lys Pro Met 130 135 140 200813223

Gly Thr Gin Thr His Thr Met lie Phe Asp Asn Ala Phe Asn Cys Thr 145 150 155 160

Phe Glu Tyr lie Ser Asp Ala Phe Ser Leu Asp Val Ser Glu Lys Ser 165 170 175

Gly Asn Phe Lys His Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Lys Asp Gly 180 185 190

Phe Leu Tyr Val Tyr Lys Gly Tyr Gin Pro 工le Asp Val Val Arg Asp 195 200 205

Leu Pro Ser Gly Phe Asn Thr Leu Lys Pro lie Phe Lys Leu Pro Leu 210 215 220

Gly lie Asn lie Thr Asn Phe Arg Ala lie Leu Thr Ala Phe Ser Pro 225 230 235 240

Ala Gin Asp lie Trp Gly Thr Ser Ala Ala Ala Tyr Phe Val Gly Tyr

245 250 255

Leu Lys Pro Thr Thr Phe Met Lev] Lys Tyr Asp Glu Asn Gly Thr lie 260 265 270

Thr Asp Ala Val Asp Cys Ser Gin Asn Pro Leu Ala Glu Leu Lys Cys 275 280 285

Ser Val Lys Ser Phe Glu lie Asp Lys Gly lie Tyr Gin Thr Ser Asn 290 295 300

Phe Arg Val Val Pro Ser Gly Asp Val Val Arg Phe Pro Asn lie Thr 305 310 315 320

Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Lys Phe Pro Ser 325 330 335

Val Tyr Ala Trp Glu Arg Lys Lys lie Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr 340 345 350

Ser Val Leu Tyr Asn Ser Thr Phe Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly 355 360 365

Val Ser Ala Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Ser Asn Val Tyr Ala 370 375 380

Asp Ser Phe Val Val Lys Gly Asp Asp Val Arg Gin 工le Ala Pro Gly 385 390 395 400

Gin Thr Gly Val lie Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe 405 410 415

Met Gly Cys Val Leu Ala Trp Asn Thr Arg Asn lie Asp Ala Thr Ser 420 425 430

Thr Gly Asn Tyr Asn Tyr Lys Tyr Arg Tyr Leu Arg His Gly Lys Leu 435 440 445

Arg Pro Phe Glu Arg Asp lie Ser Asn Val Pro Phe Ser Pro Asp Gly 450 455 460

Lys Pro Cys Thr Pro Pro Ala Leu Asn Cys Tyr Trp Pro Leu Asn Asp 200813223 465 470 475 480

Tyr Gly Phe Tyr Thr Thr Thr Gly lie Gly Tyr Gin Pro Tyr Arg Val 485 490 495

Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu Asn Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly 500 505 510

Pro Lys Leu Ser Thr Asp Leu lie Lys Asn Gin Cys Val Asn Phe Asn 515 520 525

Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Pro Ser Ser Lys Arg 530 535 540

Phe Gin Pro Phe Gin Gin Phe Gly Arg Asp Val Ser Asp Phe Thr Asp 545 550 555 560

Ser Val Arg Asp Pro Lys Thr Ser Glu lie Leu Asp lie Ser Pro Cys 565 570 575

Ser Phe Gly Gly Val Ser Val lie Thr Pro Gly Thr Asn Ala Ser Ser 580 585 590

Glu Val Ala Val Leu Tyr Gin Asp Val Asn Cys Thr Asp Val Ser Thr 595 600 605

Ala lie His Ala Asp Gin Leu Thr Pro Ala Trp Arg lie Tyr Ser Thr 610 615 620

Gly Asn Asn Val Phe Gin Thr Gin Ala Gly Cys Leu lie Gly Ala Glu 625 630 635 640

His Val Asp Thr Ser Tyr Glu Cys Asp lie Pro lie Gly Ala Gly lie 645 650 655

Cys Ala Ser Tyr His Thr Val Ser Leu Leu Arg Ser Thr Ser Gin Lys 660 665 670

Ser lie Val Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Asp Ser Ser lie Ala 675 680 685

Tyr Ser Asn Asn Thr lie Ala lie Pro Thr Asn Phe Ser lie Ser lie 690 695 700

Thr Thr Glu Val Met Pro Val Ser Met Ala Lys Thr Ser Val Asp Cys 705 710 715 720

Asn Met Tyr lie Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ala Asn Leu Leu Leu 725 730 735

Gin Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gin Leu Asn Arg Ala Leu Ser Gly lie 740 745 750

Ala Ala Glu Gin Asp Arg Asn Thr Arg Glu Val Phe Ala Gin Val Lys 755 760 765

Gin Met Tyr Lys Thr Pro Thr Leu Lys Tyr Phe Gly Gly Phe Asn Phe 770 775 780

Ser Gin lie Leu Pro Asp Pro Leu Lys Pro Thr Lys Arg Ser Phe lie 785 790 795 800 200813223

Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly Phe Met 805 810 815

Lys Gin Tyr Gly Glu Cys Leu Gly Asp lie Asn Ala Arg Asp Leu lie 820 825 830

Cys Ala Gin Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu Leu Thr 835 840 845

Asp Asp Met lie Ala Ala Tyr Thr Ala Ala Leu Val Ser Gly Thr Ala 850 855 860

Thr Ala Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gin lie Pro Phe 865 870 875 880

Ala Met Gin Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly lie Gly Val Thr Gin Asn 885 890 895

Val Leu Tyr Glu Asn Gin Lys Gin 工le Ala Asn Gin Phe Asn Lys Ala 900 905 910 lie Ser Gin Tie Gin Glu Ser Leu Thr Thr Thr Ser Thr Ala Leu Gly 915 920 925

Lys Leu Gin Asp Val Val Asn Gin Asn Ala Gin Ala Leu Asn Thr Leu 930 935 940

Val Lys Gin Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala lie Ser Ser Val Leu Asn 945 950 955 960

Asp lie Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gin lie Asp 965 970 975

Arg Leu lie Thr Gly Arg Leu Gin Ser Leu Gin Thr Tyr Val Thr Gin 980 985 990

Gin Leu lie Arg Ala Ala Glu lie Arg Ala Ser Ala Asn Leu Ala Ala 995 1000 1005

Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gin Ser Lys Arg Val Asp 1010 1015 1020

Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro Gin Ala Ala 1025 1030 1035

Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ser Gin 1040 1045 1050

Glu Arg Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala lie Cys His Glu Gly Lys 1055 1060 1065

Ala Tyr Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Phe Asn Gly Thr Ser 1070 1075 1080

Trp Phe lie Thr Gin Arg Asn Phe Phe Ser Pro Gin lie lie Thr 1085 1090 1095

Thr Asp Asn Thr Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val Val lie Gly 1100 1105 1110 lie lie Asn Asn Thr Val Tyr Asp Pro Leu Gin Pro Glu Leu Asp 1125 200813223 1115

Ser Phe Lys Glu Glu Leu 1130

Pro Asp Val Asp Leu Gly 1145

Val Asn lie Gin Lys Glu w 1160

Asn Leu Asn Glu Ser Leu • 1175

Glu Gin Tyr lie Lys Trp 1190

Ala Gly Leu lie Ala lie 1205 f \ Met Thr Ser Cys Cys Ser \ ./ 1220

Ser Cys Cys Lys Phe Asp 1235

Gly Val Lys Leu His Tyr 1250

Lys Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser 1140 lie Ser Gly lie Asn Ala Ser Val 1155

Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys 1170

Asp Leu Gin Glu Leu Gly Lys Tyr 1185

Trp Tyr Val Trp Leu Gly Phe lie 1200

Met Val Thr lie Leu Leu Cys Cys 1215

Leu Lys Gly Ala Cys Ser Cys Gly 1230

Asp Asp Ser Glu Pro Val Leu Lys 1245

Claims (1)

1. 200813223 十申睛專利範圍： 種產生哺乳動物病毒之類病毒微粒（VLp)之方法， 該方法包含： 、建構一質體，該質體包含一核苷酸序列，該序列編 碼至少兩種的病毒結構性蛋白質之組合； 以該質體轉染維羅（Ver0)細胞；及 ^ 於級轉染之細胞中表現該等病毒結構蛋白質以產生 違病毒之VLps。 2·根據申言青專利範圍帛1項之方法，其中該哺乳動物病毒 為越狀病毒。 3·根據申凊專利範圍第2項之方法，其中該冠狀病毒為急 性嚴重呼吸道症候群冠狀病毒（SARS-CoV)。 4.根據申請專利範圍第3項之方法，其中該等病毒結構性 蛋白質係選自由SARS-CoV之E、Μ、N及S蛋白所組 成之群。 5·根據申請專利範圍第4項之方法，其中該等病毒結構性 蛋白質為SARS_CoV之Ε、Μ及S蛋白。 6·根據申請專利範圍第1項之方法，其中供轉染之維羅細 胞為維羅Ε6細胞。 7·根據申請專利範圍第1項之方法，其中該病毒結構性蛋 白質於經轉染細胞中之表現係由一可誘發性表現系統調 控。 8·根據申請專利範圍第7項之方法，其中該可誘發性表現 系統為四環素·可誘發性表現系統。 ACA0005TW 200813223 9·根據申請專利範圍第8項之方法，其中該誘發之達成係 藉由於經轉染細胞之培養基中添加強力黴素 (doxycycline ) 〇 ίο· —種抗哺乳動物病毒之致免疫性組合物，包含免疫上有 效量之由根據申請專利範圍第1項之方法所產生之 VLPs。 11·根據申請專利範圍第10項之致免疫性組合物，其中該哺 乳動物病毒為冠狀病毒。 12· —種抗哺乳動物病毒之疫苗組合物，包含免疫上有效量 之根據申請專利範圍第10項之致免疫性組合物。 13·根據申睛專利範圍第丨2項之疫苗組合物，其中該哺乳動 物病毒為冠狀病毒。 14· 一種產生抗SARS-CoV抗體之方法，包含以由根據申請 專利範圍第3項之方法所產生之SARS-VLPs免疫哺乳動 物或鳥類’及由該哺乳動物或鳥類之血液中收取抗VLps 抗體。 15· —種偵測一個體是否受SARS_c〇v感染之方法，包含以 由根據申請專利範圍第3項之方法所產生之SARs_VLps 接觸該個體之血清樣本，及測定該樣本中是否有能結合 SARS-VLP抗原之專_性抗體，其中該抗體之存在表示 陽性結果。 16.根據申請專利範圍第15項之方法，其中該方法包含酵素 連結免疫吸附分析（ELIS A )。 π. —種偵測一個體是否是否受SARS_c〇v感染之方法，包 ACA0005TW 200813223 含以根據申請專利範圍第3項之方法所產生之 s所產生之專一性抗體接觸該個體 本，及測㈣樣本中圓稷抗原之存在，其中= 原之存在表示陽性結果。 18. 19. 20. 21. 根據申請專利_第17項之方法，其中該方法包含間接 性免疫螢光染色分析。 一種預防—個體感染SARS-CoV之方法，包含以由根據 申明專利範圍第3項之方法所產生之SARS_VLPs免疫該 個體。 種致免疫1±組合物，包含免疫上有效量之由根據申請 專利範㈣3奴枝所產生之SARS·VLPs。 種抗SARS疫苗，包含根據申請專利範圍第2〇項之致 免疫性組合物。 ACA0005TW 200813223 七、指定代表圖： (一) 本案指定代表圖為：第（1A )圖。 (二) 本代表圖之元件符號簡單說明： 八、本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化學式:

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