SU1576859A1 - Method of quantitative determination of 5-hydroxyisoflavones - Google Patents

Abstract

Изобретение касаетс  аналитической химии, в частности количественного определени  5-гидроксиизофлавонов, может быть использовано в анализе лекарственных и кормовых трав. Цель - повышение точности и чувствительности анализа при сокращении его длительности. Анализ пробы ведут экстракцией и очисткой фенольных соединений, их хроматографическим разделением на закрепленном слое силикагел  и про влением 5-гидроксиизофлавонов с помощью 40%-ного раствора эфирата BF 3. Затем провод т элюирование продукта концентрированной CH 3C(O)OH, содержащей 0,06 - 0,38 мл 40%-ного раствора BF 3 в диэтиловом эфире на 10 мл CH 3C(O)OH, и полученный элюат подвергают флуориметрированию. Эти услови  повышают точность анализа в 4 - 6 раз, чувствительность в 2 - 3,5 раза при меньшем в 2,3 - 3,4 раза времени определени , чем в известном случае. 10 табл.The invention relates to analytical chemistry, in particular the quantitative determination of 5-hydroxyisoflavones, can be used in the analysis of medicinal and fodder herbs. The goal is to increase the accuracy and sensitivity of the analysis while reducing its duration. Samples are analyzed by extraction and purification of phenolic compounds, their chromatographic separation on a fixed layer of silica gel, and the formation of 5-hydroxyisoflavones with 40% aqueous solution of BF 3 etherate. Then, the product is eluted with concentrated CH 3C (O) OH containing 0.06 - 0.38 ml of a 40% solution of BF 3 in diethyl ether per 10 ml of CH 3C (O) OH, and the resulting eluate is subjected to fluorimetry. These conditions increase the accuracy of the analysis by 4–6 times, the sensitivity by 2–3.5 times, with a 2.3–3.4 times lower determination time than in the known case. 10 tab.

Description

Изобретение относитс  к способу количественного определени  5-гидрок- сиизофлавонов, который может найти применение в анализе лекарственных и кормовых трав, галеновых препаратов.The invention relates to a method for the quantitative determination of 5-hydroxyisoflavones, which can be used in the analysis of medicinal and fodder herbs, herbal preparations.

Цель изобретени  - повышение точности и чувствительности определени  и его ускорение.The purpose of the invention is to improve the accuracy and sensitivity of the determination and its acceleration.

Пример 1. Определение содержани  биоханина А в клевере ладино.Example 1. Determination of Biochanin A content in clover Ladino.

Фиксированное растительное сырье высушивают, измельчают, отбирают навески 10 г. Экстрагируют растительный материал 40-50 мл 90%-ного этанола на глицериновой или вод ной бане (t 60-70°С) в колбе с обратным холодильником в течение 20-30 мин. Экстракт отдел ют, а растительный материал снова заливают этанолом. Извлечение повтор ют 4-5 раз, полученные экстракты объедин ют, отфильтровывают и упаривают до водного остатка . Последний очищают в делительной воронке 5-6 порци ми (по 50 мл) пет- ролейного эфира до тех пор, пока органическа  фаза не станет бесцветной или слабо-желтой. Очищенный водный остаток упаривают на роторном вакуумном испарителе почти досуха, затем гидролизуют его при нагревании (100 С) в течение 3 ч с 5-10 мл 10%-ной серной кислоты.Fixed plant materials are dried, crushed, and weighed 10 g. Are taken out. Plant material is extracted with 40-50 ml of 90% ethanol in a glycerol or water bath (t 60-70 ° C) in a flask with reflux condenser for 20-30 minutes. The extract is separated and the plant material is again filled with ethanol. The extraction is repeated 4-5 times, the obtained extracts are combined, filtered and evaporated to a water residue. The latter is purified in a separatory funnel in 5-6 portions (50 ml each) of petroleum ether until the organic phase becomes colorless or slightly yellow. The purified aqueous residue is evaporated on a rotary vacuum evaporator almost to dryness, then it is hydrolyzed by heating (100 ° C) for 3 hours with 5-10 ml of 10% sulfuric acid.

Агликоны фенольных соединений извлекают из гидролизата 5-6 порци ми этилацетата. Этилацетатные экстракты объедин ют, упаривают досуха, раствор ют сумму фенольных соединений в 5 мл метанола, Аликвоту 0,05 мл метанольного раствора нанос т в виде полосы на хроматографическую пластину Силуфол, предварительно очищенную метанолом и активированную при нагревании в течение 30 мин при 120 С. Справа и слева от полосы фенольных соединений нанос т п тна меток-свидетелей (биоханина А), Разделение провод т в камерах с насыщенной атмосферой в системе растворителей хлороформ + метанол ( 95-5-0,5).The aglycones of phenolic compounds are extracted from the hydrolyzate in 5-6 portions of ethyl acetate. The ethyl acetate extracts are combined, evaporated to dryness, the amount of phenolic compounds is dissolved in 5 ml of methanol, an aliquot of 0.05 ml of methanol solution is applied as a strip on a chromatographic plate Silufol pre-purified with methanol and activated by heating for 30 minutes at 120 C. To the right and to the left of the phenolic compound band, spots of witness marks (biochanin A) are deposited. Separation is carried out in chambers with a saturated atmosphere in the solvent system chloroform + methanol (95-5-0.5).

По окончании разделени  пластинку, сушат на воздухе 5-10 мин, затем опрыскивают 40%-ным раствором эфирата трифторида бора в диэтиловом эфире, Полоса, содержаща  биоханин А, приобретает -в УФ-свете желто-зеленую флуоресценцию , в видимом свете, если изо- флавона много, - светло-желтую окраску .After the separation is completed, the plate is dried in air for 5-10 minutes, then sprayed with a 40% solution of boron trifluoride etherate in diethyl ether. The band containing biohanin A acquires a yellow-green fluorescence in UV light, in visible light, if - there is a lot of flavon, - light yellow color.

Флуоресцирующую в УФ-свете полосу очерчивают, соскребают силикагель с анализируемым веществом с хроматогра- фической пластинки и заливают его 0,1 мм раствора эфирата BF и 8 мл концентрированной уксусной кислоты, Смесь периодически встр хивают в течение 25 мин, отфильтровывают от адсорбента и флуориметрируют ( 6огБ - 254 им, Ъ „реп 580 нм) .The UV-fluorescent band is outlined, the silica gel with the analyte is scraped off the chromatographic plate and its 0.1 mm solution of BF etherate and 8 ml of concentrated acetic acid are poured over. The mixture is shaken periodically for 25 minutes, filtered from the adsorbent and fluorinated ( 6 gb - 254 them, b "rep 580 nm).

Параллельно провод т аналогичные процедуры дл  получени  стандартного и фонового растворов. Содержание 5- гидроксиизофлавона определ ют по формулеIn parallel, similar procedures are carried out to obtain standard and background solutions. The content of 5-hydroxyisoflavone is determined by the formula

YtМхСо Ф х Фср х -ф 1-ф--. YtМхСо Ф х Фср х -ф 1-ф--.

gg

00

5five

00

5five

00

О где Y - объем метанола дл  растворени  суммы фенольных соединений , мм; М - молекул рна  масса изофлавонов , г/моль;About where Y is the volume of methanol to dissolve the sum of phenolic compounds, mm; M is the molecular weight of isoflavones, g / mol;

5 С0 концентраци  стандартного раствора , моль/л;5 С0 concentration of a standard solution, mol / l;

g - навеска растительного материала , г;g - weight of plant material, g;

Фу - флуоресценци  исследуемого 0 раствора;Fu - fluorescence of the studied 0 solution;

Фс - флуоресценци  стандартногоFS - standard fluorescence

раствора;solution;

Фф - флуоресценци  фонового раствора;Фф - fluorescence of the background solution;

5 X - содержание 5-гидрооксиизофл а- вона в растительном материале , мг/г.5 X - the content of 5-hydroxyisoflu-Won in plant material, mg / g.

Содержание биоханина А в клевере ладино составл ет, мг/г: по известному способу - в листь х 1,360, в стебл х 1,331; по предлагаемому способу - в листь х 0,310, в стебл х 0,970.The content of biochanin A in clover is Ladino, mg / g: according to a known method, in leaves of 1,360, in stems of 1,331; according to the proposed method - in leaves x 0,310, in stalks x 0,970.

Пример 2. Определение гени- стеина и софорикозида в сумме фенольных соединений из Софоры  понской. Сравнение точности предлагаемого способа и известного.Example 2. Determination of genisteine and sophoricoside in the amount of phenolic compounds from Sophora Ponska. Comparison of the accuracy of the proposed method and the known.

10 навесок, содержащих 0,7-0,9 г суммы фенольных соединений, и 10 таких же навесок с добавлением гени- стеина в количестве 0,5 кг/г и софорикозида 1 мг/г раствор ют в 10 мл метанола. 0,1 мл раствора нанос т на хроматографическую пластинку вместе с метчиками 5-гидроксиизофлавоног;. Разделение провод т в системе растворителей хлороформ + метанол 75-25, Rr генистеина 0,69iO,02, софорикозида 0,32j;0,03. По окончании разделени  опрыскивают пластинку раствором эфирата BF, под УФ-светом очерчивают флуоресцирующие зоны и соскребают их с подложки. Элюирование провод т как в примере 1. Флуориметрируют с использованием стандартного и фонового 5 растворов (табл. 1 и 3).Параллельно провод т определение по известному способу с использованием спектрофото- метрии (табл, 2 и 4).10 batches containing 0.7-0.9 g of the amount of phenolic compounds, and 10 of the same batches with the addition of genistein in the amount of 0.5 kg / g and sophoricoside 1 mg / g are dissolved in 10 ml of methanol. 0.1 ml of the solution is applied to the chromatographic plate along with taps of 5-hydroxyisoflavonog ;. Separation is carried out in the solvent system chloroform + methanol 75-25, Rr of genistein 0.69 iO, 02, sophoricoside 0.32 j; 0.03. At the end of the separation, the plate is sprayed with a solution of BF etherate, under UV light, fluorescent zones are delineated and scraped from the substrate. Elution was carried out as in Example 1. Fluorimetry was carried out using standard and background 5 solutions (Tables 1 and 3). In parallel, determination was carried out by a known method using spectrophotometry (Tables 2 and 4).

При определении генистеина на хроматографической пластинке в зоне Rr 0,60-0,75 мало мешающих феноль- ных соединений. Однако, вследствие невозможности полного удалени  5-гид- роксиизофлавона, выход его в известном способе на 15,9% ниже, чем в предлагаемом, точность предлагаемого способа в 4,3 раза выше.When determining genistein on a chromatographic plate in the Rr 0,60–0,75 zone, there is little interfering phenolic compounds. However, due to the impossibility of complete removal of 5-hydroxyisoflavone, its yield in the known method is 15.9% lower than in the proposed one, the accuracy of the proposed method is 4.3 times higher.

При анализе софорикозида наблюдаетс  большое количество мешающих фе- нольных соединений, что приводит в случае известного способа к завышению результатов (10,3%). Точность предлагаемого способа в 6,4 раза выше, чем известного. Низкий выход внутреннего стандарта в известном способе объ сн етс  одновременным вли нием двух факторов - большим количеством примесей и неполным удалением с пластинки анализируемого компонента.In the analysis of sophoricoside, a large amount of interfering phenolic compounds is observed, which in the case of the known method leads to an overestimation of the results (10.3%). The accuracy of the proposed method is 6.4 times higher than the known. The low yield of the internal standard in the known method is explained by the simultaneous influence of two factors — a large amount of impurities and incomplete removal from the plate of the analyzed component.

П р и -м е р 3. Приготовление стандартного и внутреннего растворов сравнени .Example 3. Preparation of the standard and internal solutions of comparison.

0,1-0,2 мл раствора известной концентрации нанос т на пластинку и подвергают хроматографическому разделет нию как в примерах 1 и 2. Элюирование и флуориметрию провод т так же, как дл  анализируемых растворов. Фоновый раствор приготавливают по указанной методике из чистого силикагел , удал емого с пластинки, с площади, примерно равной площади полос анализируемых на хроматограммах 5-гидрокси- изофлавонов. .Использование фоновых растворов необходимо на однолучевых флуориметрах. В двулучевых приборах фоновые растворы использовать не нужно: флуоресценци  фона учитываетс  автоматически.0.1-0.2 ml of a solution of known concentration is applied to the plate and subjected to chromatographic separation as in Examples 1 and 2. Elution and fluorimetry are carried out in the same way as for the analyzed solutions. The background solution is prepared according to this method from pure silica gel removed from the plate, from an area approximately equal to the area of the bands analyzed on the chromatograms of 5-hydroxy-isoflavones. Use of background solutions is necessary on single beam fluorimeters. No need to use background solutions in dual beam instruments: background fluorescence is automatically taken into account.

Пример 4. Выбор реактива дл  идентификации 5-гидроксиизофлаво- нов на хроматографических пластинках Силуфол.Example 4. Selection of a reagent for identifying 5-hydroxy isoflavones on Silufol chromatographic plates.

Дл  определени  предела обнаружени  про вл ющих реактивов растворы генистеина, наиболее часто встречающегос  представител  5-гидроксиизо- флавонов, нанос т на хроматографи- ческие пластинки в виде полос, содержащих -195, 100, 50, 40, 20, 10, 8, 5, 3 мкг.To determine the detection limit of the exhibiting reagents, solutions of genistein, the most commonly found representative of 5-hydroxyisoflavones, are plotted on the chromatographic plates in the form of bands containing -195, 100, 50, 40, 20, 10, 8, 5, 3 mcg.

Результаты определений представле.- ны в табл. 5.The results of the definitions are presented in Table. five.

Из табл. 5 видно, что эфират BF-j  вл етс  наиболее чувствительным реактивом дл  идентификации 5-оксиизо768596From tab. 5 that BF-j etherate is the most sensitive reagent for identifying 5-hydroxy768596

флаконов, в частности его открываемый минимум в 4 раза ниже, чем у pfc- актива, используемого в известном способе. В случае идентификации гли- козидов, например софорнкозида, наблюдаетс  дополнительное увеличение флуоресценции, веро тно, за счет реакции между эфиратом ВГ и гликоэидJQ ной частью молекул определ емых веществ .vials, in particular, its opening is at least 4 times lower than that of the pfc asset used in the known method. In the case of the identification of glycosides, for example, sophorncoside, an additional increase in fluorescence is observed, probably due to the reaction between the VG ester and the glycoeid JQ of the molecules of the detected substances.

Пример 5. Исгользование эфи- рата BFj дл  количественного анализа 5-гидроксиизофлавонов.Example 5. The use of BFj ester for the quantitative analysis of 5-hydroxyisoflavones.

15 .,5.1. Зависимость интенсивности15., 5.1. Intensity dependence

флуоресценции от количества добавленного 40%-ного раствора эфирата триfluorescence from the amount of added 40% aqueous solution of etherate three

фторида бора в диэтиловом эфире.boron fluoride in diethyl ether.

0,2 мл раствора генистеина (1 г/л) в метаноле приливают к 8 мл концентрированной уксусной кислоты (концентраци  генистеина в полученной пробе 24,4 мкг/мл). Затем к полученным таким образом пробам, добавл ют различные объемы раствора эфирата BF. Такие же количества реагента приливают к 8 мл уксусной кислоты, несодержащей изофлавона. Этот раствор используют в качестве фонового. На основе0.2 ml of a solution of genistein (1 g / l) in methanol is poured into 8 ml of concentrated acetic acid (the concentration of genistein in the obtained sample is 24.4 µg / ml). Then, to the samples thus obtained, different volumes of the BF etherate solution are added. The same amount of reagent is added to 8 ml of acetic acid containing isoflavone. This solution is used as a background. Based

проведенных исследований установлено, что оптимальное количество эфирата BF5 0,05 - 0,3 мл на 8 мл уксусной кислоты (0,06 - 0,38 мл на 10 мл кислоты ) .studies found that the optimal amount of etherate BF5 0.05 - 0.3 ml per 8 ml of acetic acid (0.06 - 0.38 ml per 10 ml of acid).

Данные приведены в табл. 6.The data are given in table. 6

5.2.Устойчивость флуоресцирукще- io комплекса во времени.5.2. The stability of the fluorescence of the complex in time.

Готов т флуоресцирующий раствор, состо щий из 8 мл концентрированнойPrepare a fluorescent solution consisting of 8 ml of concentrated

уксусной кислоты, 0,} мл раствора эфирата BF и 0,2 мл раствора генистеина в уксусной кислоте, несодержащий эфирата BF. Стрелку флуориметра устанавливают на значение 100% и измер ют зависимость флуоресценции о г времени.acetic acid, 0,} ml of a solution of BF etherate and 0.2 ml of a solution of genistein in acetic acid, containing no BF etherate. The fluorometer needle is set to 100% and the fluorescence is measured as a g time.

Из табл. 7 следует, что в течение 30-35 мин флуоресценци  раствора не измен етс . За это врем  в процессеFrom tab. 7 it follows that for 30-35 minutes the fluorescence of the solution does not change. During this time in the process

анализа 5-гидроксиизофлавоны элюиру- ют с адсорбента, фильтруют элюат и измер ют его флуоресценцию.The analysis of 5-hydroxyisoflavones is eluted from the adsorbent, the eluate is filtered and its fluorescence is measured.

5.3.Зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации генистеина .5.3. Dependence of fluorescence intensity on the concentration of genistein.

В раствор, содержащий 8 мл уксусной кислоты и 0,1 мл эфирата BFg, добавл ют 0,2; 0,1; 0,05; 0,02; 0,005мл раствора генистеина в метанолеTo a solution containing 8 ml of acetic acid and 0.1 ml of BFg etherate is added 0.2; 0.1; 0.05; 0.02; 0,005ml of a solution of genistein in methanol

( мг/л). Полученные данные (с учетом фона) показывают линейную зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации анализируемого вещества. (mg / l). The obtained data (taking into account the background) show a linear dependence of the fluorescence intensity on the concentration of the analyte.

Пример 6. Определение условий элюировани  флуоресцирующего комплекса 5-гидроксиизофлавона с адсорбента .Example 6. Determination of the elution conditions of the fluorescent complex of 5-hydroxyisoflavone with the adsorbent.

6.. Подбор элюента.6 .. Selection of eluent.

В качестве элюентов дл  извлечени  анализируемого компонента из адсорбента - сшшкагел  испробованы органические растворители - метанол, этанол , хлороформ, диэтиловый эфир, бен- зол, этилацетат, гексан, диметилсуль- фоксид, а также смеси метанола с концентрированными сол ной, фосфорной и уксусной кислотами. Установлено, что флуоресцирующее соединение 5-гидрок- сиизофлавонов с BF3 : не элюируетс  чистыми органическими растворител ми, разрушаетс  в смес х метанола с сол ной кислотой; в смес х фосфорна  кислота - метанол элюирование проте- кает медленно из-за большой в зкости t растворител  (система растворителей ЬЦР04 + СНЭОН 3+7 извлекает за 30 мин 15%, за 48 ч 49% анализируемо гцо вещества, система ЬЦРОФ + СН3ОН 5+5 - за 30 мин 41%, за 49 ч 78%), смесь метанола и уксусной кислоты (1:9), а также концентрированна  уксусна  кислота позвол ют полностью элюировать анализируемое вещество (табл. 8).Organic solvents such as methanol, ethanol, chloroform, diethyl ether, benzene, ethyl acetate, hexane, dimethyl sulfoxide, and also mixtures of methanol with concentrated hydrochloric, phosphoric, and acetic acids were tested as eluents for extracting the analyte from the adsorbent — cling-off. The fluorescent compound 5-hydroxyisoflavones with BF3 has been found to: not eluted by pure organic solvents, is destroyed in mixtures of methanol with hydrochloric acid; in mixtures of phosphoric acid – methanol, elution proceeds slowly due to the high viscosity t of the solvent (the LCR4 + SNEON 3 + 7 solvent system removes 15% 15%, 49% 49% analyzed substance, LCRF + CH3OH 5 +5 - in 30 minutes 41%, in 49 hours 78%), a mixture of methanol and acetic acid (1: 9), and also concentrated acetic acid, allow the eluted substance to be fully eluted (Table 8).

Измерение степени извлечени  флуоресцирующего комплекса 5-гидроксиизофлавона и BF3 производ т следующим образом. 0,02 мл раствора генистеина (1 г/л) нанос т на хроматографичес- кук) пластинку Силуфол, затем после высыхани  опрыскивают ее раствором эфирата BF-, соскребают силикагель, адсорбировавший изофлавон и заливают его 0,1 мл раствора эфирата BF3,8 мл элюента. Через 30 мин раствор отфильтровывают от адсорбента и флуори- метрируют. Фоновый раствор готов т аналогично, залива  элюирующей смесью такое же количество чистого силикаге- ла, В качестве стандарта используют смесь 0,02 мл раствора генистеина (1 г/л), 8 мл соответствующего элюента и 0,1 мл раствора эфирата BFj. Флуоресценцию стандартного раствора измер ют по отношению к смеси 8 мл элюента и О,1 мл раствора эфирата BFj .Measurement of the recovery rate of the fluorescent complex of 5-hydroxyisoflavone and BF3 is performed as follows. 0.02 ml of a solution of genistein (1 g / l) is applied onto a chromatographic plate of Silufol, then after drying it is sprayed with a solution of BF-etherate, the silica gel that adsorbs isoflavone is scraped off and 0.1 ml of a solution of BF etherate BF3.8 ml is scraped off. eluent. After 30 minutes, the solution is filtered off from the adsorbent and fluorinated. The background solution is prepared similarly, pouring the same amount of pure silica gel with an eluting mixture. As a standard, a mixture of 0.02 ml of genistein solution (1 g / l), 8 ml of the corresponding eluent and 0.1 ml of BFj etherate solution is used. The fluorescence of the standard solution was measured with respect to a mixture of 8 ml of eluent and O, 1 ml of a solution of BFj etherate.

Добавление раствора эфирата BF- в элюент необходимо дл  обеспечени  полного перехода 5-гидроксиизофлавона в флуоресцирующую форму (т.е.,дл  полного протекани  реакции между изо флавоном и BF9).Adding a solution of BF-β esterate to the eluent is necessary to ensure the complete transition of 5-hydroxyisoflavone to the fluorescent form (i.e., to allow the reaction between isoflavone and BF9 to fully proceed).

6.2. Определение длительности элюировани  5-гидроксиизофлавонов концентрированной уксусной кислотой.6.2. Determination of the elution duration of 5-hydroxyisoflavones with concentrated acetic acid.

На хроматографическую пластинку нанос т по 0,02 мл растворов генистеина и софорикозида. Про вление и удаление 5-гидроксиизофлавонов с адсорбента провод т как в примерах 1 и 2. Элюируют 8 мл концентрированной уксусной кислоты с добавлением 0,1 мл раствора эфирата ВГ3 . Врем  элюировани  варьирует от 5 до 30 мин. Измер ют флуоресценцию как в примере 6.10.02 ml of solutions of genistein and sophoricoside are applied to the chromatographic plate. The formation and removal of 5-hydroxyisoflavones from the adsorbent is carried out as in Examples 1 and 2. 8 ml of concentrated acetic acid are eluted with the addition of 0.1 ml of VG3 etherate. The elution time varies from 5 to 30 minutes. Measure fluorescence as in Example 6.1.

Зависимость полноты извлечени  анализируемых веществ от времени элюировани  приведена в табл. 9.The dependence of the completeness of extraction of the analyzed substances on the elution time is given in Table. 9.

Таким образом, полное извлечение комплексов 5-гидроксиизофлавонов (как гликозидов, так и агликонов) протекает, за 25-30 мин. Использовать большее врем  элюировани  нецелесообразно , так как после 35 мин флуоресценци  элюата начинает уменьшатьс . Элюирование известным способом позвол ет извлечь за 30 минут 82,3%, за 10 ч 98,1%, за 24 ч 101% (за счет примесей) 5-гидроксиизофлавона агли- кона.Thus, the complete extraction of 5-hydroxyisoflavone complexes (both glycosides and aglycones) proceeds in 25-30 minutes. It is impractical to use a longer elution time, since after 35 minutes the fluorescence of the eluate begins to decrease. Elution in a known manner allows to extract in 30 minutes 82.3%, in 10 hours 98.1%, in 24 hours 101% (due to impurities) of 5-hydroxyisoflavone aglycone.

Пример 7. Продолжительность определени  5-гидроксиизофлавонов.Example 7. Duration of determination of 5-hydroxyisoflavones.

Данные по продолжительности аналитического определени  5-гидроксиизофлавонов известным и предлагаемым способами приведены в табл. 10.Data on the duration of the analytical determination of 5-hydroxyisoflavones known and proposed methods are given in Table. ten.

При определении 5-гидроксиизофлавонов в фармацевтических препаратах, суммах фенольных соединений анализ предлагаемым способом провод т примерно в 9 раз быстрее, чем с использованием известного способа. Если изофлавоны анализируют непосредственно в растительном сырье, необходимо проводить процедуры экстракции и очистки . При этом обща  продолжительность анализа предлагаемым способом в 2,3-3,4 раза меньше, чем известнымWhen determining 5-hydroxyisoflavones in pharmaceutical preparations, the amounts of phenolic compounds, the analysis by the proposed method is carried out about 9 times faster than using a known method. If the isoflavones are analyzed directly in plant materials, it is necessary to carry out extraction and purification procedures. In this case, the total duration of the analysis by the proposed method is 2.3-3.4 times less than the known

Предлагаемый способ имеет точност в средне-м .в 4-6 раз выше, предел обнаружени  5-гидроксиизофлапонов в 2- 3,5 раза ниже, чем известный способ. Врем  выполнени  собственно анализа в предлагаемом способе в У раз (с использованием экстракции в 2,3-3,4 раза ) меньше, чем в известном.The proposed method has an accuracy in the medium. 4-6 times higher, the detection limit of 5-hydroxyisoflapones is 2-3,5 times lower than the known method. The time of the actual analysis in the proposed method is Y times (using an extraction of 2.3-3.4 times) less than in the known.

Claims (1)

Формула изобретени  Invention Formula Способ количественного определени  5-гидроксиизофлавонов, включающий экстракцию и очистку фенольных соединений , их хроматографическое разделе- ние на закрепленном слое силикагел , про вление 5-гидроксиизофлавонов, элюирование их.из силикагел  органическим растворителем, о -т л и ч а ю- IThe method of quantitative determination of 5-hydroxyisoflavones, including extraction and purification of phenolic compounds, their chromatographic separation on a fixed layer of silica gel, the development of 5-hydroxyisoflavones, elution of them from silica gel with an organic solvent, o-t h and h o- I щ и и с   тем, что, с целью повыше-., ни  точности и чувствительности определени  и его ускорени , про вление провод т 40%-ным раствором эфирата трифторида бора в диэтиловом эфире, в качестве элюента используют концентрированную уксусную кислоту, содержащую 0,06-0,38 мл 40%-ного раствора эфирата трифторида бора в диэтиловом эфире на 10 мл кислоты, и полученный элюат подвергают флуори- метрированию.y and, in order to increase the accuracy and sensitivity of the determination and its acceleration, the development is carried out with a 40% solution of boron trifluoride etherate in diethyl ether as concentrated acetic acid, containing 0, 06-0.38 ml of a 40% solution of boron trifluoride etherate in diethyl ether per 10 ml of acid, and the resulting eluate is subjected to fluorimetry. Примечание. Дисперси  0,069, коэффициент вариации А,40.Note. Dispersion 0.069, coefficient of variation A, 40. Примеч ание. Дисперси  0,758, коэффициент вариации 18,02.Note. Dispersion 0.758, coefficient of variation 18.02. Таблица 1Table 1 Таблица 2.Table 2. Примечание. Дисперси  74,21, коэффициент вариации 11,5%. Оптическую плот- ногть определ ют разбавлением фотометрируемого раствора в 10 раз.Note. Dispersion 74.21, the coefficient of variation 11.5%. The optical density is determined by diluting the photometric solution 10 times. сутствии фенольных соединений клевера ладино В видимом свете светло-ко- 50 ричнева  окраскаin the presence of phenolic compounds clover Ladino In visible light, light brown color В видимом свете светло-ко- 20 ричнева  окраскаIn visible light, light brownish brown color Таблица 3Table 3 Таблица 5Table 5 ,НH Опрыскивание 0,1%- ным ZrOCl2 в метанолеSpraying with 0.1% ZrOCl2 in methanol Опрыскивание 0,1%- ным ZrOCL2 в метанолеSpraying with 0.1% Nr ZrOCL2 in methanol Опрыскивание 0,5%-ным А1СЦ в метанолеSpraying with 0.5% AlSC in methanol Опрыскивание раствором диазосульфанило- вой кислоты в 15%- ном Spraying with a solution of diazosulfanolic acid in 15% Опрыскивание смесью хлорсульфонова  кислота + хлороформ 4+1Spraying a mixture of chlorosulfonic acid + chloroform 4 + 1 0,01 М йода в 0,025 М 1 растворе KJ в воде0.01 M iodine in 0.025 M 1 KJ solution in water Опрыскивание 1%-ным дифенилборным эфиром аминоэтанола и 5%-ным полиэтиленгликолем 400 в метанолеSpraying with 1% diphenylborne aminoethanol and 5% polyethylene glycol 400 in methanol Опрыскивание 40%-ным раствором эфирата BF,, в диэтиловомSpraying with 40% solution of BF etherate, in diethyl В УФ-свете желто-зелена  40-50 3,6-4,5 флуоресценци In the UV light, yellow-green 40-50 3.6-4.5 fluorescence В видимом свете светло-жел- 50 4,5 та  окраскаIn the visible light, light yellow - 50 4.5 that color В УФ-свете (253 им) желта  50-100 4,5-9,0 флуоресценци In UV light (253 im) yellow 50-100 4.5-9.0 fluorescence В видимом свете красно-ко- 20 1,8 рнчнева  окраска In the visible light of red-color 20 1.8 brown color В видимом свете желта  ок- 20 1,8 раскаIn the visible light yellow approx. 20 1.8 В видимом свете коричнева  20-40 1,8-3,6In visible light brown 20-40 1.8-3.6 или желтовато-коричнева or yellowish brown окраскаcoloring В УФ-свете (360 нм) желта  10-20 0,9-1,8 флуоресценци In UV light (360 nm) yellow 10-20 0.9-1.8 fluorescence В видимом свете светло-жел- 20-40 1,8-3,6 та  окраскаIn the visible light of the light yellow 20-40 1.8-3.6 and color Количество, мл, раствора эфирара ВГЭ на 8 мл уксусной кислотыAmount, ml, solution of ether HGE per 8 ml of acetic acid То же, на 10 мл уксусной кислотыSame as 10 ml of acetic acid Интенсивность флуоресценции:Fluorescence intensity: в абс. единицахin abs. units в %at % 0,000,030,050,200,300,400,501,000,000,030,050,200,300,400,501.00 0,000,040,060,250,380,500,631,250,000,040,060,250,380,500,631,25 315353535343429315353535343429 8,642,8100,0100,0100,097,197,182,48,642,8100,0100,0100,097,197,182,4 Таблица 6 Table 6 с with Фильтр - син   или желта  лентаFilter - blue or yellow ribbon В известном способе спектрофотометр СФ-16, в предлагаемом способе флуориметр ЭФ-ЗМАIn the known method spectrophotometer SF-16, in the proposed method, fluorometer EF-ZMA Собственно анализActually analysis Анализ + экстракци  и очистка фенольных соединений 1230Analysis + extraction and purification of phenolic compounds 1230 При определении глнкоэидов стади  тидролиэа отсутствует.At definition of glnkoeidov tidroliaa stage is absent. Таблица 8Table 8 Таблица 10Table 10 5 255 25 10 510 5 785785 9090 355-535355-535