RU2697849C1 - Способ диагностики цирковируса свиней - Google Patents
Способ диагностики цирковируса свиней Download PDFInfo
- Publication number
- RU2697849C1 RU2697849C1 RU2019112883A RU2019112883A RU2697849C1 RU 2697849 C1 RU2697849 C1 RU 2697849C1 RU 2019112883 A RU2019112883 A RU 2019112883A RU 2019112883 A RU2019112883 A RU 2019112883A RU 2697849 C1 RU2697849 C1 RU 2697849C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- minutes
- circovirus
- phosphate
- pig
- cell culture
- Prior art date
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии и ветеринарной вирусологии и представляет собой способ диагностики цирковируса свиней, включающий посев культуры клеток РК-15, инфицирование ее биологическим материалом, фиксацию клеток РК-15, инкубирование последовательно со специфическими сыворотками и антисвиными меченными пероксидазой хрена иммуноглобулинами и выявление антигена цирковируса свиней по наличию темно-красного окрашивания цитоплазмы клеток, отличающийся тем, что фиксацию клеток РК-15 проводят в течение 30-40 минут в 0,01-0,02 М фосфатно-солевом буфере с рН 7,2-7,4, содержащем 1-4% параформальдегида и 0,2-0,4% нонилфенилполиэтиленгликоля, при температуре 22-24°С, затем обрабатывают последовательно 10-15 минут 0,01-0,02 М фосфатно-солевым буфером с рН 7,2-7,4, содержащим 0,3-0,4 М глицина и 1-2% казеина, затем 10-15 минут 0,3-0,6%-ной перекисью водорода, после чего наносят специфические поликлональные антитела. Использование заявленного способа позволяет быстроту и точность диагностики цирковируса свиней. 1 з.п. ф-лы, 11 пр.
Description
Изобретение относится к области биотехнологии и ветеринарной вирусологии и касается способа выявления вируса цирковируса свиней, определения биологической активности вируса при производстве инактивированной вакцины и научных исследованиях.
Способ диагностики цирковируса свиней, включающий посев культуры клеток РК-15, инфицирование ее биологическим материалом, фиксацию клеток РК-15, инкубирование последовательно со специфическими сыворотками и антисвинными меченными пероксидазой хрена-иммуноглобулинами и выявления антигена цирковируса свиней по наличию темно-красного окрашивания цитоплазмы клеток (Патент Украины (UA 89399). Иммунопероксидазный тест для вирусологической диагностики цирковирусной инфекции свиней, МПК G01N 33/536, A61K 39/42 опубликовано 25.04.2014, Бюл. №8).
Цирковирусная инфекция свиней - заболевание поросят отъемышей, которое характеризуется истощением, одышкой, пневмонией, увеличением лимфатических узлов, желтухой, бледностью. Это заболевание известно так же как синдром мультисистемного послеотъемного истощения поросят (СПМИ) - наиболее распространенная форма проявления цирковируса свиней 2-го типа. Впервые заболевание наблюдалось в Саскачеване (Канада), затем оно быстро распространилось во все страны с развитым свиноводством, включая Европу, Америку и Азию. В 1998 г. из тканей поросят с СПМИ был изолирован вирус, обозначенный как цирковирус свиней 2-типа (PCV2), а исходному ЦВС - не патогенному контаминанту культуры клеток РК-15 дали обозначение PCV1 (Патент РФ №2283862 Цирковирус свиней 2 типа и его применение, МПК C12N 7/00, C12N 15/34, C12N 15/63, C07K 14/01, A61K 39/12, C12Q 1/68, G01N 33/569, опубликовано 20.09.2006, Бюл. №26).
Однако известный диагностики цирковируса свиней является недостаточно эффективным при диагностике цирковируса свиней 2 типа.
Задачей предполагаемого изобретения является повышение чувствительности способа при диагностике цирковируса свиней 2 типа.
Поставленная задача достигается в способе диагностики цирковируса свиней, включающий посев культуры клеток РК-15, инфицирование ее биологическим материалом, фиксацию клеток РК-15, инкубирование последовательно со специфическими сыворотками и антисвинными меченными пероксидазой хрена-иммуноглобулинами и выявления антигена цирковируса свиней по наличию темно-красного окрашивания цитоплазмы клеток тем, что фиксацию клеток РК-15 проводят в течение 30-40 минут в 0,01-0,02 М фосфатно-солевым буфере с рН 7,2-7,4, содержащем 1-4% параформальдегида и 0,2-0,4% нонилфенилполиэтиленгликоля при температуре 22-24°С, затем обрабатывают последовательно 10-15 минут 0,01-0,02 М фосфатно-солевым буфером с рН 7,2-7,4, содержащем 0,3-0,4 М глицина и 1-2% казеина, затем 10-15 минут 0,3-0,6%-ной перекисью водорода, после чего наносят специфические поликлональные антитела.
Также поставленная задача предполагаемого изобретения достигается в способе диагностики цирковируса свиней тем, что в качестве биологического материала используют сыворотку крови, или гомогенат лимфоузлов, или гомогенат легких.
Как показали наши исследования, для проведения иммунопероксидазной реакции возможно использование только забуференного параформальдегида, при этом необходимо строго придерживаться определенного времени фиксации. Так, меньшая продолжительность фиксации приводит к диффузии, вымыванию антигена, а длительная - обуславливает маскировку антигена, образование большого числа альдегидных связей, препятствующих реакции антиген-антител, что приводит к снижению возможности выявления цирковируса свиней 2 типа. Нами впервые предложено проводить пермеабилизацию антигена с помощью использования нонилфенилполиэтиленгликоля (нонидент, NP-40), что позволило проводить идентификацию цирковируса свиней более стабильно. Пермеабилизация нужна, когда антитело должно достигать внутриклеточной части клеток, так как эпитопы находятся в цитоплазматической области. Кроме этого, впервые предложено обрабатывать клетки РК-15 глицином при определенных режимах воздействия, что способствует повышению проницаемости клеточных мембран, устранению «сшивок» между белками, образуемых в результате фиксации. Предполагаем, что глицин связывает свободные альдегидные группы, которые в противном случае связывали бы первичные и вторичные антитела, что неизбежно привело бы к высокому фоновому окрашиванию. После воздействия антиген становиться более доступным для антител. В патентной и научно-технической литературе не известны технические решения, содержащие режимы способа диагностики цирковируса свиней аналогичное заявляемому, т.е. предложение соответствует критериям «новизна» и «изобретательский уровень».
Все режимы способа осуществимы в промышленных условиях, направлены на решение реальной технической задачи, т.е. предложение «промышленно применимо».
Изобретение иллюстрируется на следующих примерах:
Пример 1.
Инфицирование культуры клеток РК-15 проводят биологическим объектом - сывороткой крови свиней (проб сыворотки было в опыте 20 от поросят 3-4 недельного возраста, зараженных цирковирусом свиней 2 типа - штаммом «PCV2/SHBC»).
Фиксацию культуры клеток РК-15 проводят в течение 30 минут в 0,01 М фосфатно-солевым буфере с рН 7,2, содержащем 1% параформальдегид и 0,2% нонилфенилполиэтиленгликоля при температуре 22°С, затем обрабатывают последовательно 10 минут 0,01 М фосфатно-солевым буфером с рН 7,2, содержащем 0,3 М глицина и 1% казеина, затем 10 минут 0,3%-ной перекисью водорода, после чего наносят специфические поликлональные антитела. Далее в лунках полистироловых панелей производят окрашивание комплекса антиген-антитела добавлением хромоген-субстратного раствора по 50 мкл в каждую лунку полистироловых панелей как и в известном способе. После 30 минутного окрашивания хромоген-субстратным раствором, лунки промывают дистиллированной водой и вирус штамма «PCV2/SHBC» выявляют по темно-красному окрашиванию цитоплазмы инфицированных клеток со светлым неокрашенным ядром. У неинфицированных клеток отсутствует окрашивание цитоплазмы.
Те же тест-препараты обрабатывали известным способом-прототипом. Все тест-препараты, обработанные способом - прототипом дали отрицательный результат. Все тест-препараты, обработанные по заявляемому способу дали положительный результат, что подтверждено еще положительным результатом ПЦР в реальном времени.
Пример 2. Готовят гомогенаты легких из проб материала легких известным способом (Патент РФ №2283862 Цирковирус свиней 2 типа и его применение, МПК C12N 7/00, C12N 15/34, C12N 15/63, C07K 14/01, A61K 39/12, C12Q 1/68, G01N 33/569, опубликовано 20.09.2006, Бюл. №26).
Инфицирование культуры клеток РК-15 проводят биологическим объектом - гомогенатом легких свиней (проб материала легких было в опыте 20 от поросят 3-4 недельного возраста, зараженных цирковирусом свиней 2 типа - штаммом «PCV2/SHBC»).
Фиксацию культуры клеток РК-15 проводят в течение 30 минут в 0,01 М фосфатно-солевым буфере с рН 7,2, содержащем 1% параформальдегида и 0,2% нонилфенилполиэтиленгликоля при температуре 22°С, затем обрабатывают последовательно 10 минут 0,01 М фосфатно-солевым буфером с рН 7,2, содержащем 0,3 М глицина и 1% казеина, затем 10 минут 0,3%-ной перекисью водорода, после чего наносят специфические поликлональные антитела. Далее в лунках полистироловых панелей производят окрашивание комплекса антиген-антитела добавлением хромоген-субстратного раствора по 50 мкл в каждую лунку полистироловых панелей как и в известном способе. После 30 минутного окрашивания хромоген-субстратным раствором, лунки промывают дистиллированной водой и вирус штамма «PCV2/SHBC» выявляют по темно-красному окрашиванию цитоплазмы инфицированных клеток со светлым неокрашенным ядром. У неинфицированных клеток отсутствует окрашивание цитоплазмы.
Те же пробы обрабатывали способом-прототипом. Все тест-препараты, обработанные способом - прототипом дали отрицательный результат.Все тест-препараты, обработанные по заявляемому способу дали положительный результат, что подтверждено положительным результатом ПЦР в реальном времени.
Пример 3. Готовят гомогенаты лимфатических узлов из проб материала лимфатических узлов известным способом (Методические особенности изоляции вируса из лимфоидных органов свиньи и инфицирование культуры РК-15 описано в статье Морозова И. (JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY Detection of a Novel Strain of Porcine Circovirus in Pigs with Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome IGOR MOROZOV et all. 1998, p. 2535-2541 Vol. 36, No. 9).
Инфицирование культуры клеток РК-15 проводят биологическим объектом - гомогенатом их лимфатических узлов (проб материала лимфатических узлов было в опыте 20 от поросят 3-4 недельного возраста, зараженных цирковирусом свиней 2 типа - штаммом «PCV2/SHBC»).
Фиксацию культуры клеток РК-15 проводят в течение 30 минут в 0,01 М фосфатно-солевым буфере с рН 7,2, содержащем 1% параформальдегида и 0,2% нонилфенилполиэтиленгликоля при температуре 22°С, затем обрабатывают последовательно 10 минут 0,01 М фосфатно-солевым буфером с рН 7,2, содержащем 0,3 М глицина и 1% казеина, затем 10 минут 0,3%-ной перекисью водорода, после чего наносят специфические поликлональные антитела. Далее в лунках полистироловых панелей производят окрашивание комплекса антиген-антитела добавлением хромоген-субстратного раствора по 50 мкл в каждую лунку полистироловых панелей, как и в известном способе. После 30 минутного окрашивания хромоген-субстратным раствором, лунки промывают дистиллированной водой и вирус штамма «PCV2/SHBC» выявляют по темно-красному окрашиванию цитоплазмы инфицированных клеток со светлым неокрашенным ядром. У неинфицированных клеток отсутствует окрашивание цитоплазмы.
Те же пробы обрабатывали способом-прототипом. Все тест-препараты, обработанные способом - прототипом дали отрицательный результат.Все тест-препараты, обработанные по заявляемому способу дали положительный результат, что подтверждено положительным результатом ПЦР в реальном времени.
Пример 4.
Инфицирование культуры клеток РК-15 проводят биологическим объектом - сывороткой крови свиней (проб сыворотки было в опыте 20 от поросят 3-4 недельного возраста, зараженных цирковирусом свиней 2 типа - штаммом «PCV2/SHBC»).
Фиксацию культуры клеток РК-15 проводят в течение 30 минут в 0,01 М фосфатно-солевым буфере с рН 7,2, содержащем 1% параформальдегида и 0,2% нонилфенилполиэтиленгликоля при температуре 22°С, затем обрабатывают последовательно 10 минут 0,01 М фосфатно-солевым буфером с рН 7,2, содержащем 0,3 М глицина и 1% казеина, затем 10 минут 0,3%-ной перекисью водорода, после чего наносят специфические поликлональные антитела. Далее в лунках полистироловых панелей производят окрашивание комплекса антиген-антитела добавлением хромоген-субстратного раствора по 50 мкл в каждую лунку полистироловых панелей как и в известном способе. После 40 минутного окрашивания хромоген-субстратным раствором, лунки промывают дистиллированной водой и вирус штамма «PCV2/SHBC» выявляют по темно-красному окрашиванию цитоплазмы инфицированных клеток со светлым неокрашенным ядром. У неинфицированных клеток отсутствует окрашивание цитоплазмы.
Те же тест-препараты обрабатывали известным способом-прототипом. Все тест-препараты, обработанные способом - прототипом дали отрицательный результат. Все тест-препараты, обработанные по заявляемому способу дали положительный результат, что подтверждено еще положительным результатом ПЦР в реальном времени.
Пример 5. Готовят гомогенаты легких из проб материала легких известным способом (Патент РФ №2283862 Цирковирус свиней 2 типа и его применение, МПК C12N 7/00, C12N 15/34, C12N 15/63, C07K 14/01, A61K 39/12, C12Q 1/68, G01N 33/569, опубликовано 20.09.2006, Бюл. №26).
Инфицирование культуры клеток РК-15 проводят биологическим объектом - гомогенатом легких свиней (проб материала легких было в опыте 20 от поросят 3-4 недельного возраста, зараженных цирковирусом свиней 2 типа - штаммом «PCV2/SHBC»).
Фиксацию культуры клеток РК-15 проводят в течение 40 минут в 0,02 М фосфатно-солевым буфере с рН 7,4, содержащем 4% параформальдегида и 0,4% нонилфенилполиэтиленгликоля при температуре 24°С, затем обрабатывают последовательно 15 минут 0,02 М фосфатно-солевым буфером с рН 7,4, содержащем 0,4 М глицина и 2% казеина, затем 15 минут 0,6%-ной перекисью водорода, после чего наносят специфические поликлональные антитела. Далее в лунках полистироловых панелей производят окрашивание комплекса антиген-антитела добавлением хромоген-субстратного раствора по 50 мкл в каждую лунку полистироловых панелей, как и в известном способе. После 40 минутного окрашивания хромоген-субстратным раствором, лунки промывают дистиллированной водой и вирус штамма «PCV2/SHBC» выявляют по темно-красному окрашиванию цитоплазмы инфицированных клеток со светлым неокрашенным ядром. У неинфицированных клеток отсутствует окрашивание цитоплазмы.
Те же тест-препараты обрабатывали известным способом-прототипом. Все тест-препараты, обработанные способом - прототипом дали отрицательный результат. Все тест-препараты, обработанные по заявляемому способу дали положительный результат, что подтверждено еще положительным результатом ПЦР в реальном времени.
Пример 6. Готовят гомогенаты лимфатических узлов из проб материала лимфатических узлов известным способом (Методические особенности изоляции вируса из лимфоидных органов свиньи и инфицирование культуры РК -15 описано в статье Морозова И. (JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY Detection of a Novel Strain of Porcine Circovirus in Pigs with Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome IGOR MOROZOV et all. 1998, p. 2535-2541 Vol. 36, No. 9).
Инфицирование культуры клеток РК-15 проводят биологическим объектом - гомогенатом их лимфатических узлов (проб материала лимфатических узлов было в опыте 20 от поросят 3-4 недельного возраста, зараженных цирковирусом свиней 2 типа - штаммом «PCV2/SHBC»).
Фиксацию культуры клеток РК-15 проводят в течение 40 минут в 0,02 М фосфатно-солевым буфере с рН 7,4, содержащем 4% параформальдегида и 0,4% нонилфенилполиэтиленгликоля при температуре 24°С, затем обрабатывают последовательно 15 минут 0,02 М фосфатно-солевым буфером с рН 7,4, содержащем 0,4 М глицина и 2% казеина, затем 15 минут 0,6%-ной перекисью водорода, после чего наносят специфические поликлональные антитела. Далее в лунках полистироловых панелей производят окрашивание комплекса антиген-антитела добавлением хромоген-субстратного раствора по 50 мкл в каждую лунку полистироловых панелей, как и в известном способе. После 40 минутного окрашивания хромоген-субстратным раствором, лунки промывают дистиллированной водой и вирус штамма «PCV2/SHBC» выявляют по темно-красному окрашиванию цитоплазмы инфицированных клеток со светлым неокрашенным ядром. У неинфицированных клеток отсутствует окрашивание цитоплазмы.
Те же тест-препараты обрабатывали известным способом-прототипом. Все тест-препараты, обработанные способом - прототипом дали отрицательный результат. Все тест-препараты, обработанные по заявляемому способу дали положительный результат, что подтверждено еще положительным результатом ПЦР в реальном времени.
Пример 7.
Инфицирование культуры клеток РК-15 проводят биологическим объектом - сывороткой крови свиней (проб сыворотки было в опыте 20 от поросят 3-4 недельного возраста, зараженных цирковирусом свиней 2 типа - штаммом «Stoon 1010»).
Фиксацию культуры клеток РК-15 проводят в течение 30 минут в 0,01 М фосфатно-солевым буфере с рН 7,2, содержащем 1% параформальдегид и 0,2% нонилфенилполиэтиленгликоля при температуре 22°С, затем обрабатывают последовательно 10 минут 0,01 М фосфатно-солевым буфером с рН 7,2, содержащем 0,3 М глицина и 1% казеина, затем 10 минут 0,3%-ной перекисью водорода, после чего наносят специфические поликлональные антитела. Далее в лунках полистироловых панелей производят окрашивание комплекса антиген-антитела добавлением хромоген-субстратного раствора по 50 мкл в каждую лунку полистироловых панелей, как и в известном способе. После 30 минутного окрашивания хромоген-субстратным раствором, лунки промывают дистиллированной водой и вирус штамма «Stoon 1010» выявляют по темно-красному окрашиванию цитоплазмы инфицированных клеток со светлым неокрашенным ядром. У неинфицированных клеток отсутствует окрашивание цитоплазмы.
Те же тест-препараты обрабатывали известным способом-прототипом. Все тест-препараты, обработанные способом - прототипом дали отрицательный результат.Все тест-препараты, обработанные по заявляемому способу дали положительный результат, что подтверждено еще положительным результатом ПЦР в реальном времени.
Пример 8. Готовят гомогенаты легких из проб материала легких известным способом (Патент РФ №2283862 Цирковирус свиней 2 типа и его применение, МПК C12N 7/00, C12N 15/34, C12N 15/63, C07K 14/01, A61K 39/12, C12Q 1/68, G01N 33/569, опубликовано 20.09.2006, Бюл. №26).
Инфицирование культуры клеток РК-15 проводят биологическим объектом - гомогенатом легких свиней (проб материала легких было в опыте 20 от поросят 3-4 недельного возраста, зараженных цирковирусом свиней 2 типа - штаммом «Stoon 1010»).
Фиксацию культуры клеток РК-15 проводят в течение 30 минут в 0,01 М фосфатно-солевым буфере с рН 7,2, содержащем 1% параформальдегида и 0,2% нонилфенилполиэтиленгликоля при температуре 22°С, затем обрабатывают последовательно 10 минут 0,01 М фосфатно-солевым буфером с рН 7,2, содержащем 0,3 М глицина и 1% казеина, затем 10 минут 0,3%-ной перекисью водорода, после чего наносят специфические поликлональные антитела. Далее в лунках полистироловых панелей производят окрашивание комплекса антиген-антитела добавлением хромоген-субстратного раствора по 50 мкл в каждую лунку полистироловых панелей, как и в известном способе. После 30 минутного окрашивания хромоген-субстратным раствором, лунки промывают дистиллированной водой и вирус штамма «Stoon 1010» выявляют по темно-красному окрашиванию цитоплазмы инфицированных клеток со светлым неокрашенным ядром. У неинфицированных клеток отсутствует окрашивание цитоплазмы.
Те же пробы обрабатывали способом-прототипом. Все тест-препараты, обработанные способом - прототипом дали отрицательный результат. Все тест-препараты, обработанные по заявляемому способу дали положительный результат, что подтверждено положительным результатом ПЦР в реальном времени.
Пример 9. Готовят гомогенаты лимфатических узлов из проб материала лимфатических узлов известным способом (Методические особенности изоляции вируса из лимфоидных органов свиньи и инфицирование культуры РК-15 описано в статье Морозова И. (JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY Detection of a Novel Strain of Porcine Circovirus in Pigs with Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome IGOR MOROZOV et all. 1998, p. 2535-2541 Vol. 36, No. 9).
Инфицирование культуры клеток РК-15 проводят биологическим объектом - гомогенатом их лимфатических узлов (проб материала лимфатических узлов было в опыте 20 от поросят 3-4 недельного возраста, зараженных цирковирусом свиней 2 типа - штаммом «Stoon 1010»).
Фиксацию культуры клеток РК-15 проводят в течение 30 минут в 0,01 М фосфатно-солевым буфере с рН 7,2, содержащем 1% параформальдегида и 0,2% нонилфенилполиэтиленгликоля при температуре 22°С, затем обрабатывают последовательно 10 минут 0,01 М фосфатно-солевым буфером с рН 7,2, содержащем 0,3 М глицина и 1% казеина, затем 10 минут 0,3%-ной перекисью водорода, после чего наносят специфические поликлональные антитела. Далее в лунках полистироловых панелей производят окрашивание комплекса антиген-антитела добавлением хромоген-субстратного раствора по 50 мкл в каждую лунку полистироловых панелей, как и в известном способе. После 30 минутного окрашивания хромоген-субстратным раствором, лунки промывают дистиллированной водой и вирус штамма «Stoon 1010» выявляют по темно-красному окрашиванию цитоплазмы инфицированных клеток со светлым неокрашенным ядром. У неинфицированных клеток отсутствует окрашивание цитоплазмы.
Те же пробы обрабатывали способом-прототипом. Все тест-препараты, обработанные способом - прототипом дали отрицательный результат. Все тест-препараты, обработанные по заявляемому способу дали положительный результат, что подтверждено положительным результатом ПЦР в реальном времени.
Пример 10.
Инфицирование культуры клеток РК-15 проводят биологическим объектом - сывороткой крови свиней (проб сыворотки было в опыте 20 от поросят 3-4 недельного возраста, зараженных цирковирусом свиней 2 типа - штаммом «Stoon 1010»).
Фиксацию культуры клеток РК-15 проводят в течение 30 минут в 0,01 М фосфатно-солевым буфере с рН 7,2, содержащем 1% параформальдегида и 0,2% нонилфенилполиэтиленгликоля при температуре 22°С, затем обрабатывают последовательно 10 минут 0,01 М фосфатно-солевым буфером с рН 7,2, содержащем 0,3 М глицина и 1% казеина, затем 10 минут 0,3%-ной перекисью водорода, после чего наносят специфические поликлональные антитела. Далее в лунках полистироловых панелей производят окрашивание комплекса антиген-антитела добавлением хромоген-субстратного раствора по 50 мкл в каждую лунку полистироловых панелей, как и в известном способе. После 40 минутного окрашивания хромоген-субстратным раствором, лунки промывают дистиллированной водой и вирус штамма «Stoon 1010» выявляют по темно-красному окрашиванию цитоплазмы инфицированных клеток со светлым неокрашенным ядром. У неинфицированных клеток отсутствует окрашивание цитоплазмы.
Те же тест-препараты обрабатывали известным способом-прототипом. Все тест-препараты, обработанные способом - прототипом дали отрицательный результат.Все тест-препараты, обработанные по заявляемому способу дали положительный результат, что подтверждено еще положительным результатом ПЦР в реальном времени.
Пример 11. Готовят гомогенаты легких из проб материала легких известным способом (Патент РФ №2283862 Цирковирус свиней 2 типа и его применение, МПК C12N 7/00, C12N 15/34, C12N 15/63, C07K 14/01, A61K 39/12, C12Q 1/68, G01N 33/569, опубликовано 20.09.2006, Бюл. №26).
Инфицирование культуры клеток РК-15 проводят биологическим объектом - гомогенатом легких свиней (проб материала легких было в опыте 20 от поросят 3-4 недельного возраста, зараженных цирковирусом свиней 2 типа -штаммом «Stoon 1010»).
Фиксацию культуры клеток РК-15 проводят в течение 40 минут в 0,02 М фосфатно-солевым буфере с рН 7,4, содержащем 4% параформальдегида и 0,4% нонилфенилполиэтиленгликоля при температуре 24°С, затем обрабатывают последовательно 15 минут 0,02 М фосфатно-солевым буфером с рН 7,4, содержащем 0,4 М глицина и 2% казеина, затем 15 минут 0,6%-ной перекисью водорода, после чего наносят специфические поликлональные антитела. Далее в лунках полистироловых панелей производят окрашивание комплекса антиген-антитела добавлением хромоген-субстратного раствора по 50 мкл в каждую лунку полистироловых панелей, как и в известном способе. После 40 минутного окрашивания хромоген-субстратным раствором, лунки промывают дистиллированной водой и вирус штамма «Stoon 1010» выявляют по темно-красному окрашиванию цитоплазмы инфицированных клеток со светлым неокрашенным ядром. У неинфицированных клеток отсутствует окрашивание цитоплазмы.
Те же тест-препараты обрабатывали известным способом-прототипом. Все тест-препараты, обработанные способом - прототипом дали отрицательный результат.Все тест-препараты, обработанные по заявляемому способу дали положительный результат, что подтверждено еще положительным результатом ПЦР в реальном времени.
Пример 12. Готовят гомогенаты лимфатических узлов из проб материала лимфатических узлов известным способом (Методические особенности изоляции вируса из лимфоидных органов свиньи и инфицирование культуры РК-15 описано в статье Морозова И. (JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY Detection of a Novel Strain of Porcine Circovirus in Pigs with Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome IGOR MOROZOV et all. 1998, p. 2535-2541 Vol. 36, No. 9).
Инфицирование культуры клеток РК-15 проводят биологическим объектом - гомогенатом их лимфатических узлов (проб материала лимфатических узлов было в опыте 20 от поросят 3-4 недельного возраста, зараженных цирковирусом свиней 2 типа - штаммом «Stoon 1010»).
Фиксацию культуры клеток РК-15 проводят в течение 40 минут в 0,02 М фосфатно-солевым буфере с рН 7,4, содержащем 4% параформальдегида и 0,4% нонилфенилполиэтиленгликоля при температуре 24°С, затем обрабатывают последовательно 15 минут 0,02 М фосфатно-солевым буфером с рН 7,4, содержащем 0,4 М глицина и 2% казеина, затем 15 минут 0,6%-ной перекисью водорода, после чего наносят специфические поликлональные антитела. Далее в лунках полистироловых панелей производят окрашивание комплекса антиген-антитела добавлением хромоген-субстратного раствора по 50 мкл в каждую лунку полистироловых панелей, как и в известном способе. После 40 минутного окрашивания хромоген-субстратным раствором, лунки промывают дистиллированной водой и вирус штамма «Stoon 1010» выявляют по темно-красному окрашиванию цитоплазмы инфицированных клеток со светлым неокрашенным ядром. У неинфицированных клеток отсутствует окрашивание цитоплазмы.
Те же тест-препараты обрабатывали известным способом-прототипом. Все тест-препараты, обработанные способом - прототипом дали отрицательный результат. Все тест-препараты, обработанные по заявляемому способу дали положительный результат, что подтверждено еще положительным результатом ПЦР в реальном времени.
Таким образом, только использование предлагаемого технического решения при диагностике цирковируса свиней 2 типа позволило диагностировать это заболевание животных.
Claims (2)
1. Способ диагностики цирковируса свиней, включающий посев культуры клеток РК-15, инфицирование ее биологическим материалом, фиксацию клеток РК-15, инкубирование последовательно со специфическими сыворотками и антисвиными меченными пероксидазой хрена иммуноглобулинами и выявление антигена цирковируса свиней по наличию темно-красного окрашивания цитоплазмы клеток, отличающийся тем, что фиксацию клеток РК-15 проводят в течение 30-40 минут в 0,01-0,02 М фосфатно-солевом буфере с рН 7,2-7,4, содержащем 1-4% параформальдегида и 0,2-0,4% нонилфенилполиэтиленгликоля, при температуре 22-24°С, затем обрабатывают последовательно 10-15 минут 0,01-0,02 М фосфатно-солевым буфером с рН 7,2-7,4, содержащим 0,3-0,4 М глицина и 1-2% казеина, затем 10-15 минут 0,3-0,6%-ной перекисью водорода, после чего наносят специфические поликлональные антитела.
2. Способ диагностики цирковируса свиней по п.1, отличающийся тем, что в качестве биологического материала используют сыворотку крови, или гомогенат лимфоузлов, или гомогенат легких.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2019112883A RU2697849C1 (ru) | 2019-04-26 | 2019-04-26 | Способ диагностики цирковируса свиней |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2019112883A RU2697849C1 (ru) | 2019-04-26 | 2019-04-26 | Способ диагностики цирковируса свиней |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2697849C1 true RU2697849C1 (ru) | 2019-08-21 |
Family
ID=67733684
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2019112883A RU2697849C1 (ru) | 2019-04-26 | 2019-04-26 | Способ диагностики цирковируса свиней |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2697849C1 (ru) |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2283862C2 (ru) * | 1997-10-03 | 2006-09-20 | Мериаль | Цирковирус свиней типа ii и его применение |
EA028376B1 (ru) * | 2010-12-22 | 2017-11-30 | Сбк Вирбак Лимитед | Цирковирус свиней 2 типа (цвс2), содержащая его иммуногенная композиция, набор для анализа и их применение |
-
2019
- 2019-04-26 RU RU2019112883A patent/RU2697849C1/ru active
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2283862C2 (ru) * | 1997-10-03 | 2006-09-20 | Мериаль | Цирковирус свиней типа ii и его применение |
EA028376B1 (ru) * | 2010-12-22 | 2017-11-30 | Сбк Вирбак Лимитед | Цирковирус свиней 2 типа (цвс2), содержащая его иммуногенная композиция, набор для анализа и их применение |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
ПЕТРОВА О.Г. и др. Диагностика цикровирусной инфекции свиней// Аграрный Вестник Урала, 2014, N3 (121), с.27-30. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Dulac et al. | Porcine circovirus antigens in PK-15 cell line (ATCC CCL-33) and evidence of antibodies to circovirus in Canadian pigs. | |
McNeilly et al. | Production, characterisation and applications of monoclonal antibodies to porcine circovirus 2 | |
US7358075B2 (en) | Assay for porcine circovirus production | |
Wacheck et al. | Detection of IgM and IgG against hepatitis E virus in serum and meat juice samples from pigs at slaughter in Bavaria, Germany | |
CN103308688A (zh) | 猪圆环病毒2型IgM抗体ELISA检测试剂盒及制备方法 | |
Monaghan et al. | Expression of immunogenic structural proteins of cyprinid herpesvirus 3 in vitro assessed using immunofluorescence | |
Yoon et al. | Comparison of a commercial H1N1 enzyme-linked immunosorbent assay and hemagglutination inhibition test in detecting serum antibody against swine influenza viruses | |
CN110967480A (zh) | 一种猪流行性腹泻病毒IgA抗体ELISA试剂盒的制备及应用 | |
RU2697849C1 (ru) | Способ диагностики цирковируса свиней | |
Wang et al. | Development and evaluation of a competitive ELISA using a monoclonal antibody for antibody detection after goose parvovirus virus-like particles (VLPs) and vaccine immunization in goose sera | |
Collins et al. | A competition ELISA for the detection of antibodies to rabbit haemorrhagic disease virus | |
CN109799351A (zh) | 猪圆环病毒2型双抗体夹心elisa试剂盒及其应用 | |
Aiki-Raji et al. | A slaughterhouse survey for porcine circovirus type 2 in commercial pigs in Ibadan, Southwest Nigeria | |
Todd et al. | Development of a blocking enzyme-linked immunosorbent assay for the serological diagnosis of chicken anaemia virus | |
RU2425377C1 (ru) | Способ диагностики лейкоза крупного рогатого скота | |
Qing et al. | The recombinant nonstructural polyprotein NS1 of porcine parvovirus (PPV) as diagnostic antigen in ELISA to differentiate infected from vaccinated pigs | |
Han et al. | Establishment and application of a competitive enzyme-linked immunosorbent assay differentiating PCV2 antibodies from mixture of PCV1/PCV2 antibodies in pig sera | |
Seo et al. | Evaluation of commercial polyclonal-and monoclonal-antibody-based immunohistochemical tests for 2 genotypes of Porcine circovirus type 2 and comparison with in-situ hybridization assays | |
Zhang et al. | Development of a potential diagnostic monoclonal antibody against capsid spike protein VP27 of the novel goose astrovirus | |
Endalew et al. | Virological and serological responses of sheep and cattle to experimental Schmallenberg virus infection | |
Dekker et al. | Validation of a screening liquid phase blocking ELISA for swine vesicular disease | |
Gottschalk et al. | An Antigen Capture Test for the Detection of Cattle Viremic with Bovine Viral Diarrhoea Virus‐A Comparison with BVD Virus Isolation from Buffy Coat Cells in Bovine Kidney Cells | |
KR101099076B1 (ko) | Heparin 처리된 PRRSV 항원을 사용한 간접면역효소반응 키트 및 이의 제조 방법 | |
Gu et al. | Infectious bovine rhinotracheitis | |
Alvarado et al. | Comparison of the serum neutralization test and a competitive enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of antibodies to vesicular stomatitis virus New Jersey and vesicular stomatitis virus Indiana |