RU2697849C1 - Способ диагностики цирковируса свиней - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии и ветеринарной вирусологии и представляет собой способ диагностики цирковируса свиней, включающий посев культуры клеток РК-15, инфицирование ее биологическим материалом, фиксацию клеток РК-15, инкубирование последовательно со специфическими сыворотками и антисвиными меченными пероксидазой хрена иммуноглобулинами и выявление антигена цирковируса свиней по наличию темно-красного окрашивания цитоплазмы клеток, отличающийся тем, что фиксацию клеток РК-15 проводят в течение 30-40 минут в 0,01-0,02 М фосфатно-солевом буфере с рН 7,2-7,4, содержащем 1-4% параформальдегида и 0,2-0,4% нонилфенилполиэтиленгликоля, при температуре 22-24°С, затем обрабатывают последовательно 10-15 минут 0,01-0,02 М фосфатно-солевым буфером с рН 7,2-7,4, содержащим 0,3-0,4 М глицина и 1-2% казеина, затем 10-15 минут 0,3-0,6%-ной перекисью водорода, после чего наносят специфические поликлональные антитела. Использование заявленного способа позволяет быстроту и точность диагностики цирковируса свиней. 1 з.п. ф-лы, 11 пр.

Description

Изобретение относится к области биотехнологии и ветеринарной вирусологии и касается способа выявления вируса цирковируса свиней, определения биологической активности вируса при производстве инактивированной вакцины и научных исследованиях.

Способ диагностики цирковируса свиней, включающий посев культуры клеток РК-15, инфицирование ее биологическим материалом, фиксацию клеток РК-15, инкубирование последовательно со специфическими сыворотками и антисвинными меченными пероксидазой хрена-иммуноглобулинами и выявления антигена цирковируса свиней по наличию темно-красного окрашивания цитоплазмы клеток (Патент Украины (UA 89399). Иммунопероксидазный тест для вирусологической диагностики цирковирусной инфекции свиней, МПК G01N 33/536, A61K 39/42 опубликовано 25.04.2014, Бюл. №8).

Цирковирусная инфекция свиней - заболевание поросят отъемышей, которое характеризуется истощением, одышкой, пневмонией, увеличением лимфатических узлов, желтухой, бледностью. Это заболевание известно так же как синдром мультисистемного послеотъемного истощения поросят (СПМИ) - наиболее распространенная форма проявления цирковируса свиней 2-го типа. Впервые заболевание наблюдалось в Саскачеване (Канада), затем оно быстро распространилось во все страны с развитым свиноводством, включая Европу, Америку и Азию. В 1998 г. из тканей поросят с СПМИ был изолирован вирус, обозначенный как цирковирус свиней 2-типа (PCV2), а исходному ЦВС - не патогенному контаминанту культуры клеток РК-15 дали обозначение PCV1 (Патент РФ №2283862 Цирковирус свиней 2 типа и его применение, МПК C12N 7/00, C12N 15/34, C12N 15/63, C07K 14/01, A61K 39/12, C12Q 1/68, G01N 33/569, опубликовано 20.09.2006, Бюл. №26).

Однако известный диагностики цирковируса свиней является недостаточно эффективным при диагностике цирковируса свиней 2 типа.

Задачей предполагаемого изобретения является повышение чувствительности способа при диагностике цирковируса свиней 2 типа.

Поставленная задача достигается в способе диагностики цирковируса свиней, включающий посев культуры клеток РК-15, инфицирование ее биологическим материалом, фиксацию клеток РК-15, инкубирование последовательно со специфическими сыворотками и антисвинными меченными пероксидазой хрена-иммуноглобулинами и выявления антигена цирковируса свиней по наличию темно-красного окрашивания цитоплазмы клеток тем, что фиксацию клеток РК-15 проводят в течение 30-40 минут в 0,01-0,02 М фосфатно-солевым буфере с рН 7,2-7,4, содержащем 1-4% параформальдегида и 0,2-0,4% нонилфенилполиэтиленгликоля при температуре 22-24°С, затем обрабатывают последовательно 10-15 минут 0,01-0,02 М фосфатно-солевым буфером с рН 7,2-7,4, содержащем 0,3-0,4 М глицина и 1-2% казеина, затем 10-15 минут 0,3-0,6%-ной перекисью водорода, после чего наносят специфические поликлональные антитела.

Также поставленная задача предполагаемого изобретения достигается в способе диагностики цирковируса свиней тем, что в качестве биологического материала используют сыворотку крови, или гомогенат лимфоузлов, или гомогенат легких.

Как показали наши исследования, для проведения иммунопероксидазной реакции возможно использование только забуференного параформальдегида, при этом необходимо строго придерживаться определенного времени фиксации. Так, меньшая продолжительность фиксации приводит к диффузии, вымыванию антигена, а длительная - обуславливает маскировку антигена, образование большого числа альдегидных связей, препятствующих реакции антиген-антител, что приводит к снижению возможности выявления цирковируса свиней 2 типа. Нами впервые предложено проводить пермеабилизацию антигена с помощью использования нонилфенилполиэтиленгликоля (нонидент, NP-40), что позволило проводить идентификацию цирковируса свиней более стабильно. Пермеабилизация нужна, когда антитело должно достигать внутриклеточной части клеток, так как эпитопы находятся в цитоплазматической области. Кроме этого, впервые предложено обрабатывать клетки РК-15 глицином при определенных режимах воздействия, что способствует повышению проницаемости клеточных мембран, устранению «сшивок» между белками, образуемых в результате фиксации. Предполагаем, что глицин связывает свободные альдегидные группы, которые в противном случае связывали бы первичные и вторичные антитела, что неизбежно привело бы к высокому фоновому окрашиванию. После воздействия антиген становиться более доступным для антител. В патентной и научно-технической литературе не известны технические решения, содержащие режимы способа диагностики цирковируса свиней аналогичное заявляемому, т.е. предложение соответствует критериям «новизна» и «изобретательский уровень».

Все режимы способа осуществимы в промышленных условиях, направлены на решение реальной технической задачи, т.е. предложение «промышленно применимо».

Изобретение иллюстрируется на следующих примерах:

Пример 1.

Инфицирование культуры клеток РК-15 проводят биологическим объектом - сывороткой крови свиней (проб сыворотки было в опыте 20 от поросят 3-4 недельного возраста, зараженных цирковирусом свиней 2 типа - штаммом «PCV2/SHBC»).

Фиксацию культуры клеток РК-15 проводят в течение 30 минут в 0,01 М фосфатно-солевым буфере с рН 7,2, содержащем 1% параформальдегид и 0,2% нонилфенилполиэтиленгликоля при температуре 22°С, затем обрабатывают последовательно 10 минут 0,01 М фосфатно-солевым буфером с рН 7,2, содержащем 0,3 М глицина и 1% казеина, затем 10 минут 0,3%-ной перекисью водорода, после чего наносят специфические поликлональные антитела. Далее в лунках полистироловых панелей производят окрашивание комплекса антиген-антитела добавлением хромоген-субстратного раствора по 50 мкл в каждую лунку полистироловых панелей как и в известном способе. После 30 минутного окрашивания хромоген-субстратным раствором, лунки промывают дистиллированной водой и вирус штамма «PCV2/SHBC» выявляют по темно-красному окрашиванию цитоплазмы инфицированных клеток со светлым неокрашенным ядром. У неинфицированных клеток отсутствует окрашивание цитоплазмы.

Те же тест-препараты обрабатывали известным способом-прототипом. Все тест-препараты, обработанные способом - прототипом дали отрицательный результат. Все тест-препараты, обработанные по заявляемому способу дали положительный результат, что подтверждено еще положительным результатом ПЦР в реальном времени.

Пример 2. Готовят гомогенаты легких из проб материала легких известным способом (Патент РФ №2283862 Цирковирус свиней 2 типа и его применение, МПК C12N 7/00, C12N 15/34, C12N 15/63, C07K 14/01, A61K 39/12, C12Q 1/68, G01N 33/569, опубликовано 20.09.2006, Бюл. №26).

Инфицирование культуры клеток РК-15 проводят биологическим объектом - гомогенатом легких свиней (проб материала легких было в опыте 20 от поросят 3-4 недельного возраста, зараженных цирковирусом свиней 2 типа - штаммом «PCV2/SHBC»).

Фиксацию культуры клеток РК-15 проводят в течение 30 минут в 0,01 М фосфатно-солевым буфере с рН 7,2, содержащем 1% параформальдегида и 0,2% нонилфенилполиэтиленгликоля при температуре 22°С, затем обрабатывают последовательно 10 минут 0,01 М фосфатно-солевым буфером с рН 7,2, содержащем 0,3 М глицина и 1% казеина, затем 10 минут 0,3%-ной перекисью водорода, после чего наносят специфические поликлональные антитела. Далее в лунках полистироловых панелей производят окрашивание комплекса антиген-антитела добавлением хромоген-субстратного раствора по 50 мкл в каждую лунку полистироловых панелей как и в известном способе. После 30 минутного окрашивания хромоген-субстратным раствором, лунки промывают дистиллированной водой и вирус штамма «PCV2/SHBC» выявляют по темно-красному окрашиванию цитоплазмы инфицированных клеток со светлым неокрашенным ядром. У неинфицированных клеток отсутствует окрашивание цитоплазмы.

Те же пробы обрабатывали способом-прототипом. Все тест-препараты, обработанные способом - прототипом дали отрицательный результат.Все тест-препараты, обработанные по заявляемому способу дали положительный результат, что подтверждено положительным результатом ПЦР в реальном времени.

Пример 3. Готовят гомогенаты лимфатических узлов из проб материала лимфатических узлов известным способом (Методические особенности изоляции вируса из лимфоидных органов свиньи и инфицирование культуры РК-15 описано в статье Морозова И. (JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY Detection of a Novel Strain of Porcine Circovirus in Pigs with Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome IGOR MOROZOV et all. 1998, p. 2535-2541 Vol. 36, No. 9).

Инфицирование культуры клеток РК-15 проводят биологическим объектом - гомогенатом их лимфатических узлов (проб материала лимфатических узлов было в опыте 20 от поросят 3-4 недельного возраста, зараженных цирковирусом свиней 2 типа - штаммом «PCV2/SHBC»).

Фиксацию культуры клеток РК-15 проводят в течение 30 минут в 0,01 М фосфатно-солевым буфере с рН 7,2, содержащем 1% параформальдегида и 0,2% нонилфенилполиэтиленгликоля при температуре 22°С, затем обрабатывают последовательно 10 минут 0,01 М фосфатно-солевым буфером с рН 7,2, содержащем 0,3 М глицина и 1% казеина, затем 10 минут 0,3%-ной перекисью водорода, после чего наносят специфические поликлональные антитела. Далее в лунках полистироловых панелей производят окрашивание комплекса антиген-антитела добавлением хромоген-субстратного раствора по 50 мкл в каждую лунку полистироловых панелей, как и в известном способе. После 30 минутного окрашивания хромоген-субстратным раствором, лунки промывают дистиллированной водой и вирус штамма «PCV2/SHBC» выявляют по темно-красному окрашиванию цитоплазмы инфицированных клеток со светлым неокрашенным ядром. У неинфицированных клеток отсутствует окрашивание цитоплазмы.

Те же пробы обрабатывали способом-прототипом. Все тест-препараты, обработанные способом - прототипом дали отрицательный результат.Все тест-препараты, обработанные по заявляемому способу дали положительный результат, что подтверждено положительным результатом ПЦР в реальном времени.

Пример 4.

Инфицирование культуры клеток РК-15 проводят биологическим объектом - сывороткой крови свиней (проб сыворотки было в опыте 20 от поросят 3-4 недельного возраста, зараженных цирковирусом свиней 2 типа - штаммом «PCV2/SHBC»).

Фиксацию культуры клеток РК-15 проводят в течение 30 минут в 0,01 М фосфатно-солевым буфере с рН 7,2, содержащем 1% параформальдегида и 0,2% нонилфенилполиэтиленгликоля при температуре 22°С, затем обрабатывают последовательно 10 минут 0,01 М фосфатно-солевым буфером с рН 7,2, содержащем 0,3 М глицина и 1% казеина, затем 10 минут 0,3%-ной перекисью водорода, после чего наносят специфические поликлональные антитела. Далее в лунках полистироловых панелей производят окрашивание комплекса антиген-антитела добавлением хромоген-субстратного раствора по 50 мкл в каждую лунку полистироловых панелей как и в известном способе. После 40 минутного окрашивания хромоген-субстратным раствором, лунки промывают дистиллированной водой и вирус штамма «PCV2/SHBC» выявляют по темно-красному окрашиванию цитоплазмы инфицированных клеток со светлым неокрашенным ядром. У неинфицированных клеток отсутствует окрашивание цитоплазмы.

Те же тест-препараты обрабатывали известным способом-прототипом. Все тест-препараты, обработанные способом - прототипом дали отрицательный результат. Все тест-препараты, обработанные по заявляемому способу дали положительный результат, что подтверждено еще положительным результатом ПЦР в реальном времени.

Пример 5. Готовят гомогенаты легких из проб материала легких известным способом (Патент РФ №2283862 Цирковирус свиней 2 типа и его применение, МПК C12N 7/00, C12N 15/34, C12N 15/63, C07K 14/01, A61K 39/12, C12Q 1/68, G01N 33/569, опубликовано 20.09.2006, Бюл. №26).

Инфицирование культуры клеток РК-15 проводят биологическим объектом - гомогенатом легких свиней (проб материала легких было в опыте 20 от поросят 3-4 недельного возраста, зараженных цирковирусом свиней 2 типа - штаммом «PCV2/SHBC»).

Фиксацию культуры клеток РК-15 проводят в течение 40 минут в 0,02 М фосфатно-солевым буфере с рН 7,4, содержащем 4% параформальдегида и 0,4% нонилфенилполиэтиленгликоля при температуре 24°С, затем обрабатывают последовательно 15 минут 0,02 М фосфатно-солевым буфером с рН 7,4, содержащем 0,4 М глицина и 2% казеина, затем 15 минут 0,6%-ной перекисью водорода, после чего наносят специфические поликлональные антитела. Далее в лунках полистироловых панелей производят окрашивание комплекса антиген-антитела добавлением хромоген-субстратного раствора по 50 мкл в каждую лунку полистироловых панелей, как и в известном способе. После 40 минутного окрашивания хромоген-субстратным раствором, лунки промывают дистиллированной водой и вирус штамма «PCV2/SHBC» выявляют по темно-красному окрашиванию цитоплазмы инфицированных клеток со светлым неокрашенным ядром. У неинфицированных клеток отсутствует окрашивание цитоплазмы.

Те же тест-препараты обрабатывали известным способом-прототипом. Все тест-препараты, обработанные способом - прототипом дали отрицательный результат. Все тест-препараты, обработанные по заявляемому способу дали положительный результат, что подтверждено еще положительным результатом ПЦР в реальном времени.

Пример 6. Готовят гомогенаты лимфатических узлов из проб материала лимфатических узлов известным способом (Методические особенности изоляции вируса из лимфоидных органов свиньи и инфицирование культуры РК -15 описано в статье Морозова И. (JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY Detection of a Novel Strain of Porcine Circovirus in Pigs with Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome IGOR MOROZOV et all. 1998, p. 2535-2541 Vol. 36, No. 9).

Инфицирование культуры клеток РК-15 проводят биологическим объектом - гомогенатом их лимфатических узлов (проб материала лимфатических узлов было в опыте 20 от поросят 3-4 недельного возраста, зараженных цирковирусом свиней 2 типа - штаммом «PCV2/SHBC»).

Фиксацию культуры клеток РК-15 проводят в течение 40 минут в 0,02 М фосфатно-солевым буфере с рН 7,4, содержащем 4% параформальдегида и 0,4% нонилфенилполиэтиленгликоля при температуре 24°С, затем обрабатывают последовательно 15 минут 0,02 М фосфатно-солевым буфером с рН 7,4, содержащем 0,4 М глицина и 2% казеина, затем 15 минут 0,6%-ной перекисью водорода, после чего наносят специфические поликлональные антитела. Далее в лунках полистироловых панелей производят окрашивание комплекса антиген-антитела добавлением хромоген-субстратного раствора по 50 мкл в каждую лунку полистироловых панелей, как и в известном способе. После 40 минутного окрашивания хромоген-субстратным раствором, лунки промывают дистиллированной водой и вирус штамма «PCV2/SHBC» выявляют по темно-красному окрашиванию цитоплазмы инфицированных клеток со светлым неокрашенным ядром. У неинфицированных клеток отсутствует окрашивание цитоплазмы.

Те же тест-препараты обрабатывали известным способом-прототипом. Все тест-препараты, обработанные способом - прототипом дали отрицательный результат. Все тест-препараты, обработанные по заявляемому способу дали положительный результат, что подтверждено еще положительным результатом ПЦР в реальном времени.

Пример 7.

Инфицирование культуры клеток РК-15 проводят биологическим объектом - сывороткой крови свиней (проб сыворотки было в опыте 20 от поросят 3-4 недельного возраста, зараженных цирковирусом свиней 2 типа - штаммом «Stoon 1010»).

Фиксацию культуры клеток РК-15 проводят в течение 30 минут в 0,01 М фосфатно-солевым буфере с рН 7,2, содержащем 1% параформальдегид и 0,2% нонилфенилполиэтиленгликоля при температуре 22°С, затем обрабатывают последовательно 10 минут 0,01 М фосфатно-солевым буфером с рН 7,2, содержащем 0,3 М глицина и 1% казеина, затем 10 минут 0,3%-ной перекисью водорода, после чего наносят специфические поликлональные антитела. Далее в лунках полистироловых панелей производят окрашивание комплекса антиген-антитела добавлением хромоген-субстратного раствора по 50 мкл в каждую лунку полистироловых панелей, как и в известном способе. После 30 минутного окрашивания хромоген-субстратным раствором, лунки промывают дистиллированной водой и вирус штамма «Stoon 1010» выявляют по темно-красному окрашиванию цитоплазмы инфицированных клеток со светлым неокрашенным ядром. У неинфицированных клеток отсутствует окрашивание цитоплазмы.

Те же тест-препараты обрабатывали известным способом-прототипом. Все тест-препараты, обработанные способом - прототипом дали отрицательный результат.Все тест-препараты, обработанные по заявляемому способу дали положительный результат, что подтверждено еще положительным результатом ПЦР в реальном времени.

Пример 8. Готовят гомогенаты легких из проб материала легких известным способом (Патент РФ №2283862 Цирковирус свиней 2 типа и его применение, МПК C12N 7/00, C12N 15/34, C12N 15/63, C07K 14/01, A61K 39/12, C12Q 1/68, G01N 33/569, опубликовано 20.09.2006, Бюл. №26).

Инфицирование культуры клеток РК-15 проводят биологическим объектом - гомогенатом легких свиней (проб материала легких было в опыте 20 от поросят 3-4 недельного возраста, зараженных цирковирусом свиней 2 типа - штаммом «Stoon 1010»).

Фиксацию культуры клеток РК-15 проводят в течение 30 минут в 0,01 М фосфатно-солевым буфере с рН 7,2, содержащем 1% параформальдегида и 0,2% нонилфенилполиэтиленгликоля при температуре 22°С, затем обрабатывают последовательно 10 минут 0,01 М фосфатно-солевым буфером с рН 7,2, содержащем 0,3 М глицина и 1% казеина, затем 10 минут 0,3%-ной перекисью водорода, после чего наносят специфические поликлональные антитела. Далее в лунках полистироловых панелей производят окрашивание комплекса антиген-антитела добавлением хромоген-субстратного раствора по 50 мкл в каждую лунку полистироловых панелей, как и в известном способе. После 30 минутного окрашивания хромоген-субстратным раствором, лунки промывают дистиллированной водой и вирус штамма «Stoon 1010» выявляют по темно-красному окрашиванию цитоплазмы инфицированных клеток со светлым неокрашенным ядром. У неинфицированных клеток отсутствует окрашивание цитоплазмы.

Те же пробы обрабатывали способом-прототипом. Все тест-препараты, обработанные способом - прототипом дали отрицательный результат. Все тест-препараты, обработанные по заявляемому способу дали положительный результат, что подтверждено положительным результатом ПЦР в реальном времени.

Пример 9. Готовят гомогенаты лимфатических узлов из проб материала лимфатических узлов известным способом (Методические особенности изоляции вируса из лимфоидных органов свиньи и инфицирование культуры РК-15 описано в статье Морозова И. (JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY Detection of a Novel Strain of Porcine Circovirus in Pigs with Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome IGOR MOROZOV et all. 1998, p. 2535-2541 Vol. 36, No. 9).

Инфицирование культуры клеток РК-15 проводят биологическим объектом - гомогенатом их лимфатических узлов (проб материала лимфатических узлов было в опыте 20 от поросят 3-4 недельного возраста, зараженных цирковирусом свиней 2 типа - штаммом «Stoon 1010»).

Фиксацию культуры клеток РК-15 проводят в течение 30 минут в 0,01 М фосфатно-солевым буфере с рН 7,2, содержащем 1% параформальдегида и 0,2% нонилфенилполиэтиленгликоля при температуре 22°С, затем обрабатывают последовательно 10 минут 0,01 М фосфатно-солевым буфером с рН 7,2, содержащем 0,3 М глицина и 1% казеина, затем 10 минут 0,3%-ной перекисью водорода, после чего наносят специфические поликлональные антитела. Далее в лунках полистироловых панелей производят окрашивание комплекса антиген-антитела добавлением хромоген-субстратного раствора по 50 мкл в каждую лунку полистироловых панелей, как и в известном способе. После 30 минутного окрашивания хромоген-субстратным раствором, лунки промывают дистиллированной водой и вирус штамма «Stoon 1010» выявляют по темно-красному окрашиванию цитоплазмы инфицированных клеток со светлым неокрашенным ядром. У неинфицированных клеток отсутствует окрашивание цитоплазмы.

Те же пробы обрабатывали способом-прототипом. Все тест-препараты, обработанные способом - прототипом дали отрицательный результат. Все тест-препараты, обработанные по заявляемому способу дали положительный результат, что подтверждено положительным результатом ПЦР в реальном времени.

Пример 10.

Инфицирование культуры клеток РК-15 проводят биологическим объектом - сывороткой крови свиней (проб сыворотки было в опыте 20 от поросят 3-4 недельного возраста, зараженных цирковирусом свиней 2 типа - штаммом «Stoon 1010»).

Фиксацию культуры клеток РК-15 проводят в течение 30 минут в 0,01 М фосфатно-солевым буфере с рН 7,2, содержащем 1% параформальдегида и 0,2% нонилфенилполиэтиленгликоля при температуре 22°С, затем обрабатывают последовательно 10 минут 0,01 М фосфатно-солевым буфером с рН 7,2, содержащем 0,3 М глицина и 1% казеина, затем 10 минут 0,3%-ной перекисью водорода, после чего наносят специфические поликлональные антитела. Далее в лунках полистироловых панелей производят окрашивание комплекса антиген-антитела добавлением хромоген-субстратного раствора по 50 мкл в каждую лунку полистироловых панелей, как и в известном способе. После 40 минутного окрашивания хромоген-субстратным раствором, лунки промывают дистиллированной водой и вирус штамма «Stoon 1010» выявляют по темно-красному окрашиванию цитоплазмы инфицированных клеток со светлым неокрашенным ядром. У неинфицированных клеток отсутствует окрашивание цитоплазмы.

Те же тест-препараты обрабатывали известным способом-прототипом. Все тест-препараты, обработанные способом - прототипом дали отрицательный результат.Все тест-препараты, обработанные по заявляемому способу дали положительный результат, что подтверждено еще положительным результатом ПЦР в реальном времени.

Пример 11. Готовят гомогенаты легких из проб материала легких известным способом (Патент РФ №2283862 Цирковирус свиней 2 типа и его применение, МПК C12N 7/00, C12N 15/34, C12N 15/63, C07K 14/01, A61K 39/12, C12Q 1/68, G01N 33/569, опубликовано 20.09.2006, Бюл. №26).

Инфицирование культуры клеток РК-15 проводят биологическим объектом - гомогенатом легких свиней (проб материала легких было в опыте 20 от поросят 3-4 недельного возраста, зараженных цирковирусом свиней 2 типа -штаммом «Stoon 1010»).

Фиксацию культуры клеток РК-15 проводят в течение 40 минут в 0,02 М фосфатно-солевым буфере с рН 7,4, содержащем 4% параформальдегида и 0,4% нонилфенилполиэтиленгликоля при температуре 24°С, затем обрабатывают последовательно 15 минут 0,02 М фосфатно-солевым буфером с рН 7,4, содержащем 0,4 М глицина и 2% казеина, затем 15 минут 0,6%-ной перекисью водорода, после чего наносят специфические поликлональные антитела. Далее в лунках полистироловых панелей производят окрашивание комплекса антиген-антитела добавлением хромоген-субстратного раствора по 50 мкл в каждую лунку полистироловых панелей, как и в известном способе. После 40 минутного окрашивания хромоген-субстратным раствором, лунки промывают дистиллированной водой и вирус штамма «Stoon 1010» выявляют по темно-красному окрашиванию цитоплазмы инфицированных клеток со светлым неокрашенным ядром. У неинфицированных клеток отсутствует окрашивание цитоплазмы.

Те же тест-препараты обрабатывали известным способом-прототипом. Все тест-препараты, обработанные способом - прототипом дали отрицательный результат.Все тест-препараты, обработанные по заявляемому способу дали положительный результат, что подтверждено еще положительным результатом ПЦР в реальном времени.

Пример 12. Готовят гомогенаты лимфатических узлов из проб материала лимфатических узлов известным способом (Методические особенности изоляции вируса из лимфоидных органов свиньи и инфицирование культуры РК-15 описано в статье Морозова И. (JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY Detection of a Novel Strain of Porcine Circovirus in Pigs with Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome IGOR MOROZOV et all. 1998, p. 2535-2541 Vol. 36, No. 9).

Инфицирование культуры клеток РК-15 проводят биологическим объектом - гомогенатом их лимфатических узлов (проб материала лимфатических узлов было в опыте 20 от поросят 3-4 недельного возраста, зараженных цирковирусом свиней 2 типа - штаммом «Stoon 1010»).

Фиксацию культуры клеток РК-15 проводят в течение 40 минут в 0,02 М фосфатно-солевым буфере с рН 7,4, содержащем 4% параформальдегида и 0,4% нонилфенилполиэтиленгликоля при температуре 24°С, затем обрабатывают последовательно 15 минут 0,02 М фосфатно-солевым буфером с рН 7,4, содержащем 0,4 М глицина и 2% казеина, затем 15 минут 0,6%-ной перекисью водорода, после чего наносят специфические поликлональные антитела. Далее в лунках полистироловых панелей производят окрашивание комплекса антиген-антитела добавлением хромоген-субстратного раствора по 50 мкл в каждую лунку полистироловых панелей, как и в известном способе. После 40 минутного окрашивания хромоген-субстратным раствором, лунки промывают дистиллированной водой и вирус штамма «Stoon 1010» выявляют по темно-красному окрашиванию цитоплазмы инфицированных клеток со светлым неокрашенным ядром. У неинфицированных клеток отсутствует окрашивание цитоплазмы.

Те же тест-препараты обрабатывали известным способом-прототипом. Все тест-препараты, обработанные способом - прототипом дали отрицательный результат. Все тест-препараты, обработанные по заявляемому способу дали положительный результат, что подтверждено еще положительным результатом ПЦР в реальном времени.

Таким образом, только использование предлагаемого технического решения при диагностике цирковируса свиней 2 типа позволило диагностировать это заболевание животных.

Claims (2)

1. Способ диагностики цирковируса свиней, включающий посев культуры клеток РК-15, инфицирование ее биологическим материалом, фиксацию клеток РК-15, инкубирование последовательно со специфическими сыворотками и антисвиными меченными пероксидазой хрена иммуноглобулинами и выявление антигена цирковируса свиней по наличию темно-красного окрашивания цитоплазмы клеток, отличающийся тем, что фиксацию клеток РК-15 проводят в течение 30-40 минут в 0,01-0,02 М фосфатно-солевом буфере с рН 7,2-7,4, содержащем 1-4% параформальдегида и 0,2-0,4% нонилфенилполиэтиленгликоля, при температуре 22-24°С, затем обрабатывают последовательно 10-15 минут 0,01-0,02 М фосфатно-солевым буфером с рН 7,2-7,4, содержащим 0,3-0,4 М глицина и 1-2% казеина, затем 10-15 минут 0,3-0,6%-ной перекисью водорода, после чего наносят специфические поликлональные антитела.

2. Способ диагностики цирковируса свиней по п.1, отличающийся тем, что в качестве биологического материала используют сыворотку крови, или гомогенат лимфоузлов, или гомогенат легких.