RU2612147C1 - Способ оценки готовности раневой поверхности к пластическому закрытию - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к области клинической лабораторной диагностики. Предложен способ оценки готовности раневой поверхности к пластическому закрытию с использованием метода полимеразной цепной реакции (ПЦР). Способ включает количественное определение копий ДНК бактерий St. Aureus (MRSA), St. Epidermidis (MRCoNS), Ps. Aeruginosa, Kl. Pneumoniae, E. Coli, как наиболее значимых видов бактериального возбудителя инфекции, при этом в одном миллилитре раневого отделяемого определяют содержание бактериального возбудителя. При значении содержания каждого бактериального возбудителя менее 500 копий/мл делают вывод о готовности раны к пластическому закрытию. Предложенный способ позволяет надежно оценить готовность раны к пластическому закрытию и может быть использован в клинической практике для оценки эффективности комплексной терапии и готовности раны к пластическому закрытию. 2 пр.

Description

Изобретение относится к области клинической лабораторной диагностики и может быть использовано в клинической практике для оценки эффективности комплексной терапии и готовности раны к пластическому закрытию.

Проблема лечения открытых повреждений мягких тканей и костей остается актуальной и на сегодняшний день в связи с увеличением количества дорожно-транспортного травматизма и появлением новых экстремальных видов спорта.

Окончательным этапом хирургического лечения, после купирования воспалительных явлений и перехода раны во вторую фазу раневого заживления, является восстановление целостности покровных тканей. Значение пластических и реконструктивных операций очень велико, поскольку осложненное течение травмы приводит к утрате комплексов тканей и образованию обширных раневых дефектов.

В лечении ран, осложненных раневой инфекцией, главными факторами, определяющими исход заболевания, являются качество хирургической обработки раны, адекватная противомикробная терапия и правильная оценка готовности раны к окончательному закрытию. Уровень бактериальной обсемененности биоптатов ран в процессе лечения является информативным показателем течения раневого процесса, эффективности назначенной терапии и, как правило, коррелирует с клинической картиной и исходом заживления.

Известны способы объективизации готовности раневой поверхности к закрытию.

Локальная клиническая картина, наблюдаемая при клиническом осмотре. Показанием к пластике раны являются признаки перехода раневого процесса во вторую фазу: появление ярких мелкозернистых грануляций, отсутствие патологического отделяемого, перифокальной реакции и т.д. Недостатком является то, что визуальная оценка субъективна и не может применяться изолированно. Поэтому учитывают как клиническую картину, так и лабораторные данные.

Лабораторные анализы крови. Доказано, что рутинные методы лабораторной диагностики, применяемые в общей практике (например, количество лейкоцитов и их незрелых форм, а также исследование уровня С-реактивного белка, лактата), обладают низкой чувствительностью и специфичностью и не могут служить на современном этапе достоверными критериями для оценки эффективности лечения и готовности раны к закрытию. Так, например, прокальцитонин (РСТ), зарекомендовавший себя как один из наиболее объективных маркеров бактериальной инфекции, является неинформативным при инфекционных процессах, вызванных грибками, уровень РСТ может повышаться при состояниях, не связанных с инфекционным процессом, но сопровождающихся развитием синдрома полиорганной недостаточности, синдрома системной воспалительной реакции. Кроме того, РСТ тест не может выступать как независимый биомаркер для назначения антимикробного химиопрепарата, так как, ориентируясь на него, невозможно определить характер возбудителя и его биологические свойства. Белок астроглии S-100 может оказаться чувствительнее РСТ в диагностике инфекционных состояний, но в связи с его низкой специфичностью этот биомаркер в отдельности не может быть использован для оценки эффективности антимикробной терапии. Одним из лабораторных биомаркеров, который в ряде исследований использовали в качестве критерия генерализации инфекции, вызванной грамм-отрицательными бактериями, является высокий уровень липополи-сахарида (ЛПС) в сыворотке крови, а по его динамике пытались оценивать эффективность проводимой комплексной терапии. Данный тест используется в научно-экспериментальных исследованиях. Его диагностическая значимость в клинике подтверждена не была.

Цитологическое исследование мазков-отпечатков ран. Значительное преобладание молодых клеток грануляционной ткани (про- и фибробласты, макрофаги, эндотелий, полибласты) и снижение содержания нейтрофилов до 40-50% при цитологическом исследовании раневых отпечатков указывают на течение второй фазы раневого процесса. При данном исследовании отсутствует качественная и количественная микробиологическая визуализация, что позволяет отнести данное исследование к вспомогательным.

Лазерная допплеровская флоуметрия. Является аппаратным неинвазивным методом определения степени расстройства микроциркуляции при травмах с размозжением и раздавливанием тканей. Целесообразно использование метода для оперативной оценки состояния кровотока в первые сутки после травмы. К моменту выполнения операции по закрытию раневого дефекта, как правило, все нежизнеспособные участки отграничиваются зоной демаркации.

Микробиологическое исследование раневого экссудата, микробиологические посевы. В клинической практике широко распространен метод классической микробиологии, с помощью которого можно получить подробную информацию о характере возбудителя, его количественном содержании, биологических свойствах и чувствительности к антимикробным препаратам. Исследование включает в себя выделение, идентификацию микроорганизмов и количественное определение микробов в расчете на 1 см² поверхности и на 1 г биоптата раны. Если содержание бактерий в ране становится значительно ниже критического уровня, то заживление ран, как правило, протекает без осложнений, первичным натяжением. В тех случаях, когда развивается нагноение ран, количество бактерий в ране чаще всего составляет более 10⁵ на 1 г ткани (Кузин М.И., Костюченок Б.М. // Раны и раневая инфекция, Москва, «Медицина», 1990).

Недостатком этого способа является то, что предварительные результаты возможно получить не ранее чем на вторые сутки, а окончательный результат на 4-5 сутки после доставки материала в лабораторию.

Способ микробиологического исследования раневого экссудата выбран нами за прототип.

Задачей изобретения является разработка достоверного способа оценки готовности раневой поверхности к окончательному этапу хирургического лечения - пластическому закрытию.

Техническим результатом реализации поставленной задачи является разработка количественного показателя оценки готовности раневой поверхности к пластическому закрытию.

Сущность изобретения заключается в том, что предлагаемый способ оценки готовности раневой поверхности к пластическому закрытию основан на количественном определении ДНК бактерий в ране. Метод количественной ПЦР (полимеразная цепная реакция) диагностики использовали для идентификации бактериального возбудителя инфекции, определения его клинически значимых биологических свойств, для оценки эффективности антибактериальной химиотерапии в динамике и готовности раны к пластическому закрытию путем расчета копий ДНК возбудителя на мл образца.

Развитие молекулярной биологии позволило выделять ДНК и РНК микроорганизмов. И, если ранее использование ПЦР-диагностики в рутинной клинической практике ставилось под сомнение, то на сегодняшний день современные технологии и изменения в законодательстве существенно увеличило практику применения данного метода. Исследования подтверждают, что современные методы ПЦР в режиме реал-тайм по срокам и точности диагностики превосходят классические культуральные методы, более того позволяют более точно установить возбудителя инфекционного процесса. Малейшие количества ДНК возбудителя могут быть идентифицированы за счет многократного копирования специфических последовательностей генетического материала патогенного микроорганизма. Методом ПЦР можно обнаружить ДНК микроорганизмов намного быстрее и с более высокой чувствительностью. Не требуется предшествующая инкубация или получение культуры, и лаборатория может выдать результат в течение нескольких часов (1-6 часов) с момента взятия биоматериала на исследование. Возможно также определение «проблемной» резистентности для определенных штаммов микроорганизмов, например метициллинрезистентного стафилококка (MRSA). Дополнительным преимуществом диагностики является независимость от проводимой противомикробной терапии, а также большая вероятность получения результата в случае микст-ифекции по сравнению с исследованием культуральным методом. Кроме этого, в отличие от традиционного способа микробиологического исследования, которое выявляет только количество жизнеспособных клеток, с помощью ДНК диагностики возможно определение живых и разрушенных микробных клеток, что очень важно, так как воспалительные реакции вызывают и фрагменты клеток. Существует множество коммерческих тест-систем, основанных на ПЦР-диагностике для выявления возбудителей инфекционного процесса. Но до сих пор метод не применялся в лечении ран и раневой инфекции для мониторинга эффективности проводимой комплексной терапии (операция хирургическая обработка раны, местное лечение раны, противомикробная медикаментозная терапия и т.д.) и готовности раневой поверхности к окончательному этапу хирургического лечения - пластическому закрытию.

Способ осуществляют следующим образом. Стерильной одноразовой палочкой с ватным тампоном осуществляется забор раневого отделяемого. Материал погружают в разовую пробирку с плотно закрывающейся крышкой. Образцы могут находиться при комнатной температуре не более 2-х часов. При необходимости более длительного хранения пробы могут быть помещены в холодильник с температурой 2-8°С на срок не более суток. Более продолжительное хранение (до 2-х недель) допустимо в замороженном виде в морозильной камере при температуре минус 20°С. Не допускается повторное замораживание-оттаивание проб. Если ПЦР-диагностическая лаборатория и процедурный кабинет для забора проб территориально разобщены, то транспортировка проб должна осуществляться в термосах или термоконтейнерах с соблюдением правил хранения образцов и правил транспортировки инфекционных материалов. Для ПЦР-анализа тампон с образцом погружают в 0,5 мл транспортной среды «ТСМ» (ИнтерЛабСервис, Россия). Способ оценки эффективности противомикробной терапии и готовности раневого ложа к закрытию методом количественной ПЦР был отработан на примере количественной оценки ДНК MRSA, Pseudomonas aeruginosa и может быть с успехом воспроизведен на ДНК других бактериальных и грибковых возбудителей инфекционных процессов (MRCoNS (метициллин-резистентные коагулазонегативные стафилококки), Streptococcus pyogenes), при наличии соответствующих праймеров.

Выделение ДНК проводили с использованием набора «Рибо-преп» (Интер-ЛабСервис, Россия) согласно прилагаемой инструкции. Реакцию амплификации проводили на приборах с системой детекции флуоресцентного сигнала в режиме «реального времени» «Rotor-Gene» 6000 («CorbettResearch», Австралия) и «iQ5» («Вio-Rad», США). Например, по одному из каналов детектируется фрагмент ДНК Staphylococcus aureus для дифференцировки метициллинрезистентного Staphylococcusaureus (MRSA) отметициллинрезистентных коагулазонегативных стафилококков (MRCoNS). По второму каналу набор реагентов выявляет фрагмент ДНК гена mecA, обнаруживаемый только у метициллинрезистентных штаммов стафилококков (MRS). По третьему каналу происходит регистрация флуоресцентного сигнала внутреннего контрольного образца, который добавляется в каждую исследуемую пробу на этапе выделения ДНК, что позволяет контролировать процедуру анализа каждого образца и при количественных расчетах учитывать потери во время экстракции нуклеиновых кислот. В состав тест-системы входят положительный контрольный образец (ПКО) и калибраторы (стандартные образцы с заданной концентрацией). Калибраторы представляют собой смесь модифицированных плазмид pGEM-t, полученных путем клонирования в них участков специфической ДНК, концентрация которых измерена при подсчете копийности плазмидного гена β-лактамазы тест-системой «CQS-Bla-System». В динамике фиксируют количество содержания идентифицированного возбудителя и при значении менее 500 копий/мл делают вывод о готовности раны к пластическому закрытию.

Клинический пример 1. Больной С., 16 лет, через 80 мин от момента травмы (попал под поезд в метро) был доставлен бригадой СМП в стационар. Выставлен диагноз: Поездная травма. Тяжелая сочетанная травма. ЗЧМТ. Сотрясение головного мозга. Ушиб мягких тканей и подкожная гематома правой и левой теменно-височных областей. Закрытый оскольчатый перелом нижней трети левой плечевой кости со смещением. Ушиб мягких тканей и обширная ссадина грудной клетки справа. Ушибленно-рваная рана правой ягодичной области. Ушибленно-рваные раны в/3 правой бедренной области. Диагноз: обширная ушибленно-рваная скальпированная рана правой голени с размозжением мягких тканей. Открытый многооскольчатый перелом медиальной лодыжки со смещением. Состояние после травматического вывиха стопы в голеностопном суставе. Травматический шок 1 степени. После первичного обследования и стабилизации общего состояния пациент взят в экстренную операционную. При ревизии поврежденной конечности имелась обширная ушибленно-рваная скальпированная рана правой голени с отслойкой практически всей кожи голени циркулярно. По задней и боковым поверхностям н/3 голени имелось массивное размозжение мягких тканей с полным перерывом практически всех мышц передней группы и задней поверхностной группы голени. Кроме этого, обнаружено травматическое повреждение надкостницы и кортикального слоя латеральной поверхности н/3 малоберцовой (на протяжении 4 см) и большеберцовой костей (на протяжении 3 см). Также выявлен открытый перелом внутренней лодыжки со смещением и выявлена патологическая подвижность в голеностопном суставе. Выполнен тщательный туалет раны растворами 3% перекиси водорода и 1% йодопирона. Выполнены хирургическая обработка раны, все участки размозженной и загрязненной подкожно-жировой клетчатки, а также размозженной мышечной ткани удалены, металлоостеосинтез костей голени наружным спицевым аппаратом внешней фиксации (Илизарова), гемостаз и тампонирование раны повязками с мазью левомеколь. При поступлении проведено исследование раневого отделяемого двумя различными методами: методом классической микробиологии (4 суток) и методом ПЦР (4 часа). Роста не обнаружено. Но, учитывая характер травмы и общее состояние больного, назначена антибактериальная терапия широкого спектра действия. В течение 10 дней проводилось местное лечение раны мазями на полиэтиленгликолевой основе и йодофорами. В данные сроки классическое микробиологическое исследование показало наличие следующих микроорганизмов: St. Aureus, Ps. Aeruginosa, Proteusspp. Забор раневого отделяемого для ПЦР-диагностики осуществляется стерильной (одноразовой) палочкой с ватным тампоном. Материал был погружен в раствор транспортной среды и в течение 2-х часов был доставлен в лабораторию. Выполнено исследование материала на наличие копий ДНК основных видов болезнетворных микроорганизмов, выявлены метициллин-резистентные коагулазонегативные стафилококки в количестве 2100 копий/мл.

За данное время окончательно определились ткани сомнительной жизнеспособности, появились зоны демаркации, сохранялось умеренное серозно-геморрагическое отделяемое, отек тканей уменьшился. Выполнена повторная хирургическая обработка раны и определена чувствительность микроорганизмов к антибактериальным препаратам, выполнена коррекция медикаментозного лечения согласно чувствительности. Это дало положительный результат на контрольном исследовании (2-е сутки после повторной хирургической обработки) в виде уменьшения видового состава микроорганизмов по данным традиционной микробиологии (St. Aureus, St. Epiderrnidis) и снижения количества MRCoNS по ПЦР до 400 копий/мл. Местное лечение было продолжено в течение 2-х недель. К этому времени рана активно гранулировала, патологического отделяемого не было, перифокальная реакция купировалась, клинически была готова к закрытию. Результат посева методом классической микробиологии роста микроорганизмов не дал. В это же время динамика изменений количественного состава микрофлоры методом ПЦР-диагностики показала уменьшение числа микроорганизмов MRCoNS до полной эрадикации микроорганизмов. На основании полученных результатов сделан вывод о том, что рана перешла во вторую фазу раневого заживления и готова к закрытию. Методом выбора, учитывая площадь раневой поверхности, которая составляла 700 см², являлась дерматомная пластика перфорированными аутодермальными кожными трансплантатами. Приживление лоскутов произошло на 10 сутки без осложнений. Благодаря точной количественной оценки MRCoNS, выявленных при ПЦР-диагностике, удалось объективизировать сроки пластического закрытия раневого дефекта.

Клинический пример 2. Больная А., 13 лет, получила травму в результате ДТП. Переведена на 8-е сутки после получения травмы. Выставлен диагноз: Множественная и сочетанная травма. Обширные гнойно-некротические раны левого бедра и левой голени. Множественные ушибленные раны туловища. Состояние после ПХО ран. Закрытый перелом средней трети левой ключицы без смещения. При осмотре в области левого бедра по передне-латеральной поверхности имелась частично ушитая лоскутная рана длиной до 30,0 см, неправильной формы, в продольном направлении, в проксимальном отделе имелся раневой дефект 6,0×8,0 см, глубоко тампонированный салфетками. Последние удалены (пропитаны серозно-гнойным отделяемым), определяется глубокий "карман" на всю протяженность раны в дистальном направлении. По краю лоскута вдоль линии швов практически на всем протяжении отмечались ишемические изменения кожи (синюшно-багрового цвета), на расстоянии 2-3 см от края. В области левой голени по задне-латеральной поверхности имелась ушитая рана длиной до 10,0 см, неправильной формы в косо-поперечном направлении, края раны сопоставлены редкими узловыми швами, между швами отмечалось обильное серозное отделяемое. После предварительной подготовки ребенок взят в операционную. Выполнена хирургическая обработка раны. Швы в области раны бедра и голени были сняты. Проведено исследование раневого отделяемого двумя различными методами: методом классической микробиологии и методом ПЦР. При ревизии обнаружены и удалены инородные тела. Измененные мышечные ткани иссечены, удалены. Гнойно-некротические массы, размозженная подкожная клетчатка обработаны гидрохирургическим скальпелем. Выполнены туалет раны растворами антисептиков (3% перекись водорода и 1% йодопирон), гемостаз, начато лечение отрицательным давлением (установлена VAC-система с активной аспирацией). На 5-е сутки после перевода классическое микробиологическое исследование показало наличие следующих микроорганизмов: St. Aureus, St. Epidermidis, Ps. Aeruginosa, E. Coli, Proteusspp. Но уже к этому моменту времени ребенку была выполнена смена антибактериальной терапии широкого спектра действия (назначена в первые часы после травмы) на этиотропное лечение, согласно данным ПЦР-диагностики (получены в течение суток в день перевода). Что дало положительный результат в виде уменьшения количественного и качественного состава микроорганизмов. На 12 сутки после перевода при микробиологическом обследовании выявлены St. Aureus, Ps. Aeruginosa. Забор раневого отделяемого для ПЦР-диагностики осуществляется стерильной (одноразовой) палочкой с ватным тампоном. Материал был погружен в раствор транспортной среды, помещен в термоконтейнер и в течение 4-х часов был доставлен в лабораторию. Выполнено исследование материала на наличие копий ДНК основных видов болезнетворных микроорганизмов. При ПЦР-диагностике в динамике отмечается снижение количества выявленных микроорганизмов: в день перевода ДНК MRSA 800 копий/мл, ДНК Pseudomonas aeruginosa 1600 копий/мл, ДНК MRCoNS 10⁶ копий/мл, на 12 сутки ДНК MRSA 400 копий/мл, ДНК Pseudomonas aeruginosa 600 копий/мл, ДНК MRCoNS 10² копий/мл. Выполнена повторная хирургическая обработка раны, иссечены и удалены оставшиеся измененные ткани. На 21 сутки после перевода при микробиологическом обследовании роста нет. А при ПЦР-диагностике отмечается снижение количества выявленных микроорганизмов до минимальных значений или до полной эрадикации (ДНК MRSA - не обнаружено, ДНК Pseudomonas aeruginosa - не обнаружено, ДНК MRCoNS - 500 копий/мл). Таким образом, через 3 недели после перевода ребенка раны перешли во вторую фазу раневого заживления, раневые поверхности активно гранулировали и готовы к закрытию. Учитывая возможности пластической и реконструктивной хирургии в данных областях, раневые дефекты были закрыты местными полнослойными тканями.

Способ может быть реализован с использованием стандартного лабораторного оборудования с привлечением персонала, владеющего методикой выполнения ПЦР-диагностики.

Основным преимуществом ПЦР-диагностики по сравнению с традиционными методами количественного исследования микроорганизмов является возможность получения результатов в день забора материала. При удовлетворительных результатах исследования возможно выполнение операции, пластического закрытия раневого дефекта, в тот же день. По результатам лечения 30 больных определен уровень числа копий (500 копий) микроорганизмов, при котором отсутствовали осложнения после пластического закрытия.

Claims (1)

1. Способ оценки готовности раневой поверхности к пластическому закрытию, отличающийся тем, что методом полимеразной цепной реакции проводят количественное определение копий ДНК бактерий St. Aureus (MRSA), St. Epidermidis (MRCoNS), Ps. Aeruginosa, Kl. Pneumoniae, E. Coli, как наиболее значимых видов бактериального возбудителя инфекции, для чего в одном мл образца раневого отделяемого для идентификации бактериального возбудителя инфекции в динамике фиксируют содержание идентифицированного возбудителя и при значении менее 500 копий/мл делают вывод о готовности раны к пластическому закрытию.