RU2575084C2 - APPLICATION OF Vip3Ab IN COMBINATION WITH Cry1Ca TO CONTROL RESISTANT INSECTS - Google Patents
APPLICATION OF Vip3Ab IN COMBINATION WITH Cry1Ca TO CONTROL RESISTANT INSECTS Download PDFInfo
- Publication number
- RU2575084C2 RU2575084C2 RU2012129912/10A RU2012129912A RU2575084C2 RU 2575084 C2 RU2575084 C2 RU 2575084C2 RU 2012129912/10 A RU2012129912/10 A RU 2012129912/10A RU 2012129912 A RU2012129912 A RU 2012129912A RU 2575084 C2 RU2575084 C2 RU 2575084C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- plants
- protein
- plant
- cry1ca
- insecticidal
- Prior art date
Links
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 title claims abstract description 48
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 158
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 158
- 230000000749 insecticidal Effects 0.000 claims abstract description 45
- 229920003013 deoxyribonucleic acid Polymers 0.000 claims abstract description 28
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 100
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 45
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 claims description 33
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 claims description 23
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 claims description 20
- 235000005824 corn Nutrition 0.000 claims description 20
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 claims description 13
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 claims description 13
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 claims description 9
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 claims description 8
- 229940097012 Bacillus thuringiensis Drugs 0.000 claims description 5
- 241000193388 Bacillus thuringiensis Species 0.000 claims description 5
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 claims description 5
- ZHVOBYWXERUHMN-KVJKMEBSSA-N 3-[(3S,5R,8R,9S,10S,13S,14S,17S)-10,13-dimethyl-3-[(2R,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl]-2H-furan-5-one Chemical compound O([C@@H]1C[C@H]2CC[C@@H]3[C@@H]([C@]2(CC1)C)CC[C@]1([C@H]3CC[C@@H]1C=1COC(=O)C=1)C)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O ZHVOBYWXERUHMN-KVJKMEBSSA-N 0.000 claims description 3
- 230000001340 slower Effects 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 17
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 abstract description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 8
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 134
- 108020003112 toxins Proteins 0.000 description 120
- 231100000765 Toxin Toxicity 0.000 description 114
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 114
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 description 47
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 27
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 25
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 17
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 16
- 241000209149 Zea Species 0.000 description 15
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 13
- 229920005618 ethylene copolymer bitumen Polymers 0.000 description 12
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 12
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 12
- 229920001850 Nucleic acid sequence Polymers 0.000 description 11
- 206010034133 Pathogen resistance Diseases 0.000 description 11
- 230000000361 pesticidal Effects 0.000 description 11
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 11
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 230000002285 radioactive Effects 0.000 description 9
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 9
- 241000724266 Broad bean mottle virus Species 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 230000001131 transforming Effects 0.000 description 8
- AYDAHOIUHVUJHQ-UHFFFAOYSA-N 1-(3',6'-dihydroxy-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-5-yl)pyrrole-2,5-dione Chemical compound C=1C(O)=CC=C2C=1OC1=CC(O)=CC=C1C2(C1=CC=2)OC(=O)C1=CC=2N1C(=O)C=CC1=O AYDAHOIUHVUJHQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 description 7
- 230000000306 recurrent Effects 0.000 description 7
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 6
- 241001147398 Ostrinia nubilalis Species 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 241000255777 Lepidoptera Species 0.000 description 5
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 5
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 210000004215 spores Anatomy 0.000 description 5
- 229960001322 trypsin Drugs 0.000 description 5
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 5
- 239000008001 CAPS buffer Substances 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 210000004940 Nucleus Anatomy 0.000 description 4
- 206010042297 Subacute sclerosing panencephalitis Diseases 0.000 description 4
- 230000003115 biocidal Effects 0.000 description 4
- 239000002596 immunotoxin Substances 0.000 description 4
- 230000000968 intestinal Effects 0.000 description 4
- 238000006192 iodination reaction Methods 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 230000002633 protecting Effects 0.000 description 4
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 4
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 2-mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 3
- 101700021600 CRY1 Proteins 0.000 description 3
- 210000000936 Intestines Anatomy 0.000 description 3
- 240000001307 Myosotis scorpioides Species 0.000 description 3
- 231100000654 Protein toxin Toxicity 0.000 description 3
- 241000625014 Vir Species 0.000 description 3
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 230000002860 competitive Effects 0.000 description 3
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 3
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 3
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 3
- 239000000834 fixative Substances 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 230000002068 genetic Effects 0.000 description 3
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 3
- 239000002917 insecticide Substances 0.000 description 3
- 230000003834 intracellular Effects 0.000 description 3
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000002609 media Substances 0.000 description 3
- 239000003094 microcapsule Substances 0.000 description 3
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 3
- 230000002588 toxic Effects 0.000 description 3
- 241000589156 Agrobacterium rhizogenes Species 0.000 description 2
- 241000223651 Aureobasidium Species 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- -1 G418 Chemical compound 0.000 description 2
- 240000007842 Glycine max Species 0.000 description 2
- 241000235649 Kluyveromyces Species 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 102100003811 P3H3 Human genes 0.000 description 2
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 2
- 241000589540 Pseudomonas fluorescens Species 0.000 description 2
- 230000036462 Unbound Effects 0.000 description 2
- 241000589634 Xanthomonas Species 0.000 description 2
- 239000003139 biocide Substances 0.000 description 2
- 230000001488 breeding Effects 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M buffer Substances [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 108091006028 chimera Proteins 0.000 description 2
- 230000000875 corresponding Effects 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- PNDPGZBMCMUPRI-UHFFFAOYSA-N iodine Chemical compound II PNDPGZBMCMUPRI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N iso-propanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 230000000670 limiting Effects 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 108060005016 mobA Proteins 0.000 description 2
- 238000000329 molecular dynamics simulation Methods 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 2
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 229920000023 polynucleotide Polymers 0.000 description 2
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 210000001519 tissues Anatomy 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 241000589220 Acetobacter Species 0.000 description 1
- 244000235858 Acetobacter xylinum Species 0.000 description 1
- 235000002837 Acetobacter xylinum Nutrition 0.000 description 1
- 240000003348 Althaea officinalis Species 0.000 description 1
- 235000006576 Althaea officinalis Nutrition 0.000 description 1
- 229940064005 Antibiotic throat preparations Drugs 0.000 description 1
- 229940083879 Antibiotics FOR TREATMENT OF HEMORRHOIDS AND ANAL FISSURES FOR TOPICAL USE Drugs 0.000 description 1
- 229940042052 Antibiotics for systemic use Drugs 0.000 description 1
- 229940042786 Antitubercular Antibiotics Drugs 0.000 description 1
- 230000036912 Bioavailability Effects 0.000 description 1
- 108010006654 Bleomycin Proteins 0.000 description 1
- 229960001561 Bleomycin Drugs 0.000 description 1
- 229920002799 BoPET Polymers 0.000 description 1
- 108091003117 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 229940098773 Bovine Serum Albumin Drugs 0.000 description 1
- 101700040938 CRY2 Proteins 0.000 description 1
- 210000002421 Cell Wall Anatomy 0.000 description 1
- 229960001927 Cetylpyridinium Chloride Drugs 0.000 description 1
- YMKDRGPMQRFJGP-UHFFFAOYSA-M Cetylpyridinium chloride Chemical compound [Cl-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+]1=CC=CC=C1 YMKDRGPMQRFJGP-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M Coomassie Brilliant Blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241001337994 Cryptococcus <scale insect> Species 0.000 description 1
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 1
- YVGGHNCTFXOJCH-UHFFFAOYSA-N DDT Chemical compound C1=CC(Cl)=CC=C1C(C(Cl)(Cl)Cl)C1=CC=C(Cl)C=C1 YVGGHNCTFXOJCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 241000122106 Diatraea saccharalis Species 0.000 description 1
- 229940110715 ENZYMES FOR TREATMENT OF WOUNDS AND ULCERS Drugs 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000588698 Erwinia Species 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 102000013165 Exonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108060002716 Exonucleases Proteins 0.000 description 1
- 229940093922 Gynecological Antibiotics Drugs 0.000 description 1
- 241000255967 Helicoverpa zea Species 0.000 description 1
- 210000003000 Inclusion Bodies Anatomy 0.000 description 1
- 241000108025 Indosylvirana aurantiaca Species 0.000 description 1
- 231100000601 Intoxication Toxicity 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N Kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 241000588748 Klebsiella Species 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 125000000393 L-methionino group Chemical group [H]OC(=O)[C@@]([H])(N([H])[*])C([H])([H])C(SC([H])([H])[H])([H])[H] 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 125000000174 L-prolyl group Chemical group [H]N1C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[C@@]1([H])C(*)=O 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N L-serine Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- 125000000510 L-tryptophano group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C2N([H])C([H])=C(C([H])([H])[C@@]([H])(C(O[H])=O)N([H])[*])C2=C1[H] 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 239000005041 Mylar™ Substances 0.000 description 1
- 241001443590 Naganishia albida Species 0.000 description 1
- 241000033319 Naganishia diffluens Species 0.000 description 1
- 240000008962 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 241000222051 Papiliotrema laurentii Species 0.000 description 1
- 102000035443 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005771 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 206010062080 Pigmentation disease Diseases 0.000 description 1
- 231100000614 Poison Toxicity 0.000 description 1
- 208000005374 Poisoning Diseases 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 241000589615 Pseudomonas syringae Species 0.000 description 1
- 241000589180 Rhizobium Species 0.000 description 1
- 241000158450 Rhodobacter sp. KYW73 Species 0.000 description 1
- 241000191043 Rhodobacter sphaeroides Species 0.000 description 1
- 241000190932 Rhodopseudomonas Species 0.000 description 1
- 241000223252 Rhodotorula Species 0.000 description 1
- 241000223253 Rhodotorula glutinis Species 0.000 description 1
- 241000223254 Rhodotorula mucilaginosa Species 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241000555745 Sciuridae Species 0.000 description 1
- 241001479507 Senecio odorus Species 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 241000607720 Serratia Species 0.000 description 1
- 241000607715 Serratia marcescens Species 0.000 description 1
- 229940098362 Serratia marcescens Drugs 0.000 description 1
- 240000001016 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 241000222068 Sporobolomyces <Sporidiobolaceae> Species 0.000 description 1
- 241000123675 Sporobolomyces roseus Species 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 210000000538 Tail Anatomy 0.000 description 1
- 229940024982 Topical Antifungal Antibiotics Drugs 0.000 description 1
- 240000004702 Torulaspora delbrueckii Species 0.000 description 1
- 235000014681 Torulaspora delbrueckii Nutrition 0.000 description 1
- 241001495125 Torulaspora pretoriensis Species 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K [O-]P([O-])([O-])=O Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating Effects 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 230000000240 adjuvant Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 1
- 230000002152 alkylating Effects 0.000 description 1
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000002924 anti-infective Effects 0.000 description 1
- 239000005667 attractant Substances 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogens Species 0.000 description 1
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 230000035514 bioavailability Effects 0.000 description 1
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 1
- 230000000853 biopesticidal Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O bleomycin A2 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC=C(N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCC[S+](C)C)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O 0.000 description 1
- 239000001045 blue dye Substances 0.000 description 1
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 1
- 150000004649 carbonic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 238000003693 cell processing method Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000031902 chemoattractant activity Effects 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 235000008504 concentrate Nutrition 0.000 description 1
- 230000004059 degradation Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001809 detectable Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000004495 emulsifiable concentrate Substances 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 244000037666 field crops Species 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037240 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000267 glycino group Chemical group [H]N([*])C([H])([H])C(=O)O[H] 0.000 description 1
- 239000001963 growth media Substances 0.000 description 1
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002140 halogenating Effects 0.000 description 1
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 description 1
- 229940020899 hematological Enzymes Drugs 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 239000010903 husk Substances 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 229940079866 intestinal antibiotics Drugs 0.000 description 1
- 231100000566 intoxication Toxicity 0.000 description 1
- 230000035987 intoxication Effects 0.000 description 1
- 238000003973 irrigation Methods 0.000 description 1
- 230000002262 irrigation Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 230000001418 larval Effects 0.000 description 1
- 235000014666 liquid concentrate Nutrition 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 235000001035 marshmallow Nutrition 0.000 description 1
- 230000001404 mediated Effects 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 229940005935 ophthalmologic Antibiotics Drugs 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogens Species 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229910052615 phyllosilicate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000019612 pigmentation Effects 0.000 description 1
- 230000006308 pollination Effects 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective Effects 0.000 description 1
- 210000001938 protoplasts Anatomy 0.000 description 1
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 1
- 239000000941 radioactive substance Substances 0.000 description 1
- 108091007521 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000000717 retained Effects 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 150000003467 sulfuric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000004083 survival Effects 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic Effects 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000004563 wettable powder Substances 0.000 description 1
Images
Abstract
Description
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИBACKGROUND
Люди выращивают кукурузу для использования при производстве пищи и энергии. Люди также выращивают большое количество других видов зерновых, включая сою и хлопок. Насекомые поедают и повреждают растения и, тем самым, подрывают усилия людей. Миллиарды долларов ежегодно тратятся на контроль насекомых-вредителей и, помимо этого, миллиарды долларов теряются в виде ущерба, нанесенного насекомыми. Синтетические органические химические инсектициды являются основным инструментом контроля насекомых-вредителей, но биологические инсектициды, например, обладающие инсектицидным действием белки, полученные из Bacillus thuringiensis (Bt), играют важную роль в тех же областях применения. Возможность получения устойчивых к насекомым растений путем трансформации генами Bt белков, обладающих инсектицидным действием, совершила революцию в современном сельском хозяйстве и повысила важность и ценность белков, обладающих инсектицидным действием, и их генов.People grow corn for use in food and energy. People also grow a large number of other types of cereals, including soy and cotton. Insects eat and damage plants and thereby undermine people's efforts. Billions of dollars are spent annually on the control of insect pests and, in addition, billions of dollars are lost in the form of damage caused by insects. Synthetic organic chemical insecticides are the main control tool for insect pests, but biological insecticides, such as insecticidal proteins derived from Bacillus thuringiensis (Bt), play an important role in the same applications. The ability to obtain insect resistant plants by transforming Bt genes with an insecticidal effect has revolutionized modern agriculture and has increased the importance and value of insecticidal proteins and their genes.
Несколько Bt белков были использованы для создания устойчивых к насекомым трансгенных растений, которые к настоящему времени успешно зарегистрированы и выведены на рынок. Указанные белки включают Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1F и Cry3Bb у кукурузы, Cry1Ac и Cry2Ab у хлопка, и Cry3A у картофеля. Several Bt proteins have been used to create insect-resistant transgenic plants that have so far been successfully registered and marketed. These proteins include Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1F and Cry3Bb in corn, Cry1Ac and Cry2Ab in cotton, and Cry3A in potato.
Коммерческие продукты, экспрессирующие эти белки, экспрессируют один белок за исключением случаев, когда желателен комбинированный инсектицидный спектр действия двух белков (например, Cry1Ab и Cry3Bb у кукурузы комбинируют для обеспечения устойчивости, соответственно, к чешуекрылым насекомым-вредителям и корневым червям), или когда независимое действие белков позволяет использовать их в качестве средства, замедляющего развитие устойчивости в целевой популяции насекомых (например, Cry1Ac и Cry2Ab у хлопка комбинируют для обеспечения контроля развития устойчивости у табачной листовертки-почкоеда). См. также публикацию заявки на патент США № 2009/0313717, относящуюся к белку Cry2 плюс Vip3Aa, Cry1F или Cry1A для контроля Helicoverpa zea или armigerain. WO 2009/132850 относится к использованию Cry1F или Cry1A и Vip3Aa для контроля Spodoptera frugiperda. Публикация заявки на патент США №2008/0311096 частично относится к использованию Cry1Ab для контроля ECB, устойчивого к Cry1F.Commercial products expressing these proteins express one protein unless a combined insecticidal spectrum of two proteins is desired (e.g., Cry1Ab and Cry3Bb in corn are combined to provide resistance to lepidopteran pests and rootworms, respectively), or when independent the action of proteins allows them to be used as a means of slowing the development of resistance in the target insect population (for example, Cry1Ac and Cry2Ab in cotton are combined to provide control of Itijah resistance in tobacco budworm-pochkoeda). See also U.S. Patent Application Publication No. 2009/0313717 regarding the Cry2 Plus Vip3Aa, Cry1F, or Cry1A protein for controlling Helicoverpa zea or armigerain. WO 2009/132850 relates to the use of Cry1F or Cry1A and Vip3Aa to control Spodoptera frugiperda. US Patent Application Publication No. 2008/0311096 partially relates to the use of Cry1Ab to control Cry1F resistant ECB.
Таким образом, некоторые свойства трансгенных растений, устойчивых к насекомым, которые привели к быстрому и широкому внедрению этой технологии, но также вызвали опасения, что популяции насекомых-вредителей выработают устойчивость к обладающим инсектицидным действием белкам, продуцируемым этими растениями. Было предложено несколько стратегий для сохранения утилитарности связанных с устойчивостью к насекомым признаков, основанных на Bt, которые включали введение белков в высоких дозах в комбинации с организацией убежищ (рефугий) и поочередное или одновременное введение различных токсинов (McGaughey et al. (1998), “B.t. Resistance Management”, Nature Biotechnol. 16: 144-146).Thus, some properties of insect resistant transgenic plants that led to the rapid and widespread adoption of this technology, but also raised concerns that insect pest populations would develop resistance to insecticidal proteins produced by these plants. Several strategies have been proposed to preserve the utility of insect resistance-related features based on Bt, which include the introduction of high-dose proteins in combination with the organization of shelters (refugia) and the simultaneous or simultaneous administration of various toxins (McGaughey et al. (1998), “ Bt Resistance Management ”, Nature Biotechnol. 16: 144-146).
Белки, выбранные для использования в наборе для управления устойчивостью насекомых (IRM), должны проявлять свое инсектицидное действие независимо таким образом, чтобы устойчивость, развившаяся к одному белку, не вызывала появления устойчивости ко второму белку (т.е., чтобы отсутствовала перекрестная устойчивость к белкам). Например, если популяция насекомого-вредителя, которая проявляет устойчивость к “Белку А”, является чувствительной к “Белку В”, можно сделать вывод, что перекрестная устойчивость отсутствует и, что комбинация Белка А и Белка В будет эффективной для замедления развития устойчивости к Белку А, применяемому изолированно.Proteins selected for use in an insect resistance management kit (IRM) must exhibit their insecticidal effect independently so that resistance developed to one protein does not cause resistance to the second protein (i.e., there is no cross-resistance to squirrels). For example, if a population of the insect pest that is resistant to “Protein A” is sensitive to “Protein B”, it can be concluded that there is no cross-resistance and that the combination of Protein A and Protein B will be effective in slowing the development of resistance to Protein A, applied in isolation.
При отсутствии обладающих устойчивостью популяций насекомых может быть проведен анализ на основе других характеристик, которые, как предполагается, связаны с механизмом действия и потенциалом развития перекрестной устойчивости. Были выдвинуты предположения, согласно которым для идентификации обладающих инсектицидным действием белков, которые, вероятно, не обладают свойством перекрестной устойчивости, можно использовать рецептор-опосредованное связывание (van Mellaert et al. 1999). Ключевой прогнозирующий параметр отсутствия перекрестной устойчивости, естественно присущий такому подходу, заключается в том, что белки, обладающие инсектицидным действием, не конкурируют за рецепторы у чувствительных к ним видов насекомых.In the absence of resistant insect populations, analysis can be carried out on the basis of other characteristics, which are supposed to be associated with the mechanism of action and the potential for the development of cross-resistance. Assumptions have been advanced that receptor-mediated binding (van Mellaert et al. 1999) can be used to identify insecticidal proteins that are likely to lack cross-resistance. A key predictive parameter of the lack of cross-resistance, naturally inherent in this approach, is that proteins with an insecticidal effect do not compete for receptors in insect species sensitive to them.
Если два Bt токсина конкурируют за один и тот же рецептор, то в случае мутации этого рецептора у насекомого, при которой один из токсинов больше не связывается с этим рецептором и, следовательно, больше не обладает инсектицидным действием в отношении этого насекомого, это насекомое может стать устойчивым также и ко второму токсину (который конкурентно связывается с тем же рецептором). При этом насекомое рассматривается как обладающее перекрестной устойчивостью к обоим Bt токсинам. Однако если два токсина связываются с различными рецепторами, это может служить указанием на то, что насекомое может не быть одновременно устойчивым к этим двум токсинам.If two Bt toxins compete for the same receptor, then in the case of a mutation of this receptor in an insect, in which one of the toxins no longer binds to this receptor and, therefore, no longer has an insecticidal effect on this insect, this insect can become resistant also to the second toxin (which competitively binds to the same receptor). In this case, the insect is considered as having cross-resistance to both Bt toxins. However, if two toxins bind to different receptors, this may indicate that the insect may not be simultaneously resistant to these two toxins.
Например, белок Cry1Fa применим для контроля многих чешуекрылых насекомых-вредителей, включая мотылька кукурузного (ECB; Ostrinia nubilalis (Hűbner)) и кукурузную листовую совку (FAW; Spodoptera frugiperda), и проявляет активность в отношении огневки сахарного тростника (SCB; Diatraea saccharalis). Белок Cry1Fa, вырабатываемый в трансгенных растениях кукурузы, содержащих фактор TC1 507, является ответственным за развитие устойчивости к доминирующим в данной отрасли насекомым, т.е. за контроль FAW. Cry1Fa также используется в продуктах Herculex®, SmartStax™ и WideStrike™.For example, the Cry1Fa protein is useful in controlling many lepidopteran insect pests, including a corn moth (ECB; Ostrinia nubilalis (Hűbner)) and a corn leaf scoop (FAW; Spodoptera frugiperda), and is active against sugarcane moths (SCB; Diatraecha sac) . Protein Cry1Fa, produced in transgenic maize plants containing factor TC1 507, is responsible for the development of resistance to insects that dominate the industry, i.e. for controlling the FAW. Cry1Fa is also used in Herculex®, SmartStax ™ and WideStrike ™ products.
Дополнительные Cry токсины перечислены на веб-сайте официального комитета по номенклатуре B.t. (Crickmore et al.; lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/). В настоящее время существует примерно 60 основных групп “Cry” токсинов (Cry1-Cry59) с дополнительными Cyt токсинами, VIP токсинами и т.п. Многие группы с числовыми обозначениями имеют подгруппы, обозначенные заглавными буквами, а обозначенные заглавными буквами подгруппы имеют подгруппы, обозначенные прописными буквами. (Например, Cry1 имеет подгруппы A-L, а Cry1A имеет подгруппы a-i).Additional Cry toxins are listed on the B.t. (Crickmore et al .; lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/). Currently, there are approximately 60 major groups of “Cry” toxins (Cry1-Cry59) with additional Cyt toxins, VIP toxins, etc. Many groups with numerical designations have subgroups indicated in capital letters, and capitalized subgroups have subgroups indicated in capital letters. (For example, Cry1 has subgroups A-L, and Cry1A has subgroups a-i).
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯSUMMARY OF THE INVENTION
Таким образом, настоящее изобретение частично относится к применению белка Vip3Ab в комбинации с белком Cry1Ca. Растения (и площадь угодий, засеянных такими растениями), которые вырабатывают оба этих белка, включены в объем настоящего изобретения.Thus, the present invention partially relates to the use of a Vip3Ab protein in combination with a Cry1Ca protein. Plants (and the area sown with such plants) that produce both of these proteins are included in the scope of the present invention.
Настоящее изобретение частично относится к неожиданному открытию того, что Vip3Ab и Cry1Ca не конкурируют друг с другом за участки связывания в мембранных препаратах, полученных из клеток кишечника кукурузной листовой совки (FAW; Spodoptera frugiperda).The present invention relates in part to the unexpected discovery that Vip3Ab and Cry1Ca do not compete with each other for binding sites in membrane preparations obtained from intestinal maize leafworm intestinal cells (FAW; Spodoptera frugiperda).
Настоящее изобретение также относится к пакетам или “пирамидам” из трех (или более) токсинов, в которых Vip3Ab и Cry1Ca являются основной парой. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления пирамид комбинация выбранных токсинов обеспечивает активность по отношению к FAW без развития перекрестной устойчивости. Некоторые предпочтительные комбинации-пирамиды с “тремя местами действия” включают основную пару белков, плюс Cry1Fa, Cry1Da, Cry1Be или Cry1E в качестве третьего белка, воздействующего на FAW. Эти конкретные тройные пакеты, согласно настоящему изобретению, неожиданно обеспечивают три места действия у FAW. Это может способствовать смягчению или устранению требования к площадям убежищ.The present invention also relates to packets or “pyramids” of three (or more) toxins in which Vip3Ab and Cry1Ca are the main pair. In some preferred pyramid embodiments, the combination of selected toxins provides FAW activity without developing cross-resistance. Some preferred three-site pyramid combinations include a base pair of proteins, plus Cry1Fa, Cry1Da, Cry1Be or Cry1E as the third protein that acts on FAW. These particular triple packets of the present invention unexpectedly provide three sites of action for the FAW. This can help alleviate or eliminate shelter space requirements.
В соответствии с настоящим изобретением также могут быть добавлены дополнительные токсины/гены. Например, если Cry1Fa или Cry1Be вводят в пакет вместе с парой белков по изобретению (оба белка Cry1Fa и Cry1Be проявляют активность как по отношению к FAW так и по отношению к мотыльку кукурузному (ECB)), добавление двух дополнительных белков в этот тройной пакет, в котором два дополнительных белка нацелены на ECB, обеспечит три места действия у FAW и три места действия у ECB. Эти два добавленных белка (четвертый и пятый белок) могут быть выбраны из группы, состоящей из Cry2A, Cry1I, DIG-3 и Cry1Ab, что дает в результате пакет из пяти белков, имеющих по три места действия у двух насекомых (ECB и FAW).Additional toxins / genes may also be added in accordance with the present invention. For example, if Cry1Fa or Cry1Be is introduced into a bag along with a pair of proteins of the invention (both Cry1Fa and Cry1Be are active both in relation to FAW and in relation to corn moth (ECB)), the addition of two additional proteins to this triple packet, in which two additional proteins target the ECB, will provide three sites of action for the FAW and three sites of action for the ECB. These two added proteins (fourth and fifth protein) can be selected from the group consisting of Cry2A, Cry1I, DIG-3 and Cry1Ab, resulting in a packet of five proteins having three sites of action in two insects (ECB and FAW) .
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Настоящее изобретение частично относится к неожиданному открытию, заключающемуся в том, что Vip3Ab и Cry1Ca не конкурируют друг с другом за участки связывания в мембранных препаратах, полученных из клеток кишечника кукурузной листовой совки (FAW; Spodoptera frugiperda). Таким образом, белок Vip3Ab может быть использован в комбинации с белком Cry1Ca в трансгенной кукурузе (и других растениях, например, хлопке и сое) для замедления или предотвращения развития у FAW устойчивости к каждому из указанных белков по отдельности. Рассматриваемая пара белков может быть эффективной при защите растений (таких растений, как маис и соя) от повреждений, наносимых кукурузной листовой совкой, устойчивой к Cry. Другими словами, одна из областей применения настоящего изобретения относится к защите кукурузы и других экономически важных видов растений от повреждений и потери урожая, вызванных популяциями кукурузной листовой совки, у которых может развиться устойчивость к Vip3Ab или Cry1Ca.The present invention partially relates to the unexpected discovery that Vip3Ab and Cry1Ca do not compete with each other for binding sites in membrane preparations obtained from the cells of intestinal maize leafworm (FAW; Spodoptera frugiperda). Thus, the Vip3Ab protein can be used in combination with the Cry1Ca protein in transgenic maize (and other plants, such as cotton and soybeans) to slow or prevent FAW from developing resistance to each of these proteins individually. The protein pair in question can be effective in protecting plants (such as maize and soybeans) from damage caused by Cry resistant corn leaf scoop. In other words, one of the applications of the present invention relates to the protection of corn and other economically important plant species from damage and loss of crop caused by populations of corn leaf scoops, which may develop resistance to Vip3Ab or Cry1Ca.
В настоящем изобретении, таким образом, раскрывается пакет для управления устойчивостью насекомыми (IRM), содержащий Vip3Ab и Cry1Ca и предназначенный для предотвращения или ослабления развития у FAW устойчивости к каждому или обоим этим белкам.The present invention thus discloses an insect resistance management package (IRM) comprising Vip3Ab and Cry1Ca and is intended to prevent or reduce the development of FAW resistance to each or both of these proteins.
Настоящее изобретение обеспечивает композиции для контроля чешуекрылых насекомых-вредителей, содержащих клетки, продуцирующие обладающий инсектицидным действием белок Vip3Ab и обладающий инсектицидным действием белок Cry1Ca.The present invention provides compositions for controlling lepidopteran insect pests comprising cells producing the insecticidal Vip3Ab protein and the insecticidal Cry1Ca protein.
Изобретение также относится к хозяину, трансформированному для продуцирования как обладающего инсектицидным действием белка Vip3Ab, так и обладающего инсектицидным действием белка Cry1Ca, причем указанный хозяин представляет собой микроорганизм или клетку растения. Рассматриваемый полинуклеотид(ы) предпочтительно находится в генетической конструкции под управлением промотора(ов), не принадлежащего Bacillus thuringiensis. Рассматриваемые полинуклеотиды могут содержать кодоны, используемые для усиленной экспрессии в растениях.The invention also relates to a host transformed to produce both an insecticidal Vip3Ab protein and an insecticidal Cry1Ca protein, the host being a microorganism or plant cell. The subject polynucleotide (s) are preferably in a genetic construct under the control of a promoter (s) not belonging to Bacillus thuringiensis. Consider polynucleotides may contain codons used for enhanced expression in plants.
Дополнительно предполагается, что изобретение обеспечивает способ контроля чешуекрылых насекомых-вредителей, содержащий приведение в контакт указанных насекомых-вредителей с эффективным количеством композиции, которая содержит Vip3Ab белок, содержащий ядро токсина, и Cry1Ca белок, содержащий ядро токсина.It is further contemplated that the invention provides a method for controlling lepidopteran insect pests comprising contacting said pest insects with an effective amount of a composition that contains a Vip3Ab protein containing a toxin core and a Cry1Ca protein containing a toxin core.
Один из вариантов осуществления изобретения содержит растение маиса, содержащее экспрессируемый в растении ген, кодирующий обладающий инсектицидным действием белок Cry1Ca, и экспрессируемый в растении ген, кодирующий обладающий инсектицидным действием белок Vip3Ab.One embodiment of the invention comprises a maize plant comprising a gene expressed in a plant encoding an insecticidal Cry1Ca protein and an expressed in a plant gene encoding an insecticidal Vip3Ab protein.
Другой вариант осуществления изобретения содержит растение маиса, в котором экспрессируемый в растении ген, кодирующий обладающий инсектицидным действием белок Cry1Ca, и экспрессируемый в растении ген, кодирующий обладающий инсектицидным действием белок Vip3Ab, были введены в указанное растение маиса путем интрогрессии.Another embodiment of the invention comprises a maize plant in which a gene expressed in a plant encoding an insecticidal Cry1Ca protein and an expression in a plant gene encoding an insecticidal Vip3Ab protein are introduced into said maize plant by introgression.
Как описано в Примерах, исследования конкурентного связывания с рецептором с использованием меченного радиоактивным изотопом белка Cry1Ca показали, что белок Cry1Ca не конкурирует за связывание в тканях FAW, в которых происходит связывание Vip3Ab. Эти результаты также указывают на то, что комбинация белков Vip3Ab и Cry1Ca может представлять собой эффективное средство для ослабления развития устойчивости в популяциях FAW к каждому из этих белков. Таким образом, частично основываясь на данных, представленных в настоящем документе, можно предположить, что совместное продуцирование (пакетирование) белков Cry1Ca и Vip3Ab может быть использовано для получения IRM пакета с высокими дозами для FAW.As described in the Examples, studies of competitive binding to the receptor using the radioactive labeled Cry1Ca protein showed that the Cry1Ca protein does not compete for binding in FAW tissues in which Vip3Ab binding occurs. These results also indicate that the combination of Vip3Ab and Cry1Ca proteins can be an effective tool to reduce the development of resistance in FAW populations to each of these proteins. Thus, based in part on the data presented herein, it can be assumed that co-production (packaging) of the Cry1Ca and Vip3Ab proteins can be used to produce high dose IRM packages for FAW.
К этой паре могут быть добавлены другие белки. Например, рассматриваемое изобретение также частично относится к тройным пакетам или “пирамидам”, состоящим из трех (или более) токсинов, где Vip3Ab и Cry1Ca являются основной парой. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления пирамиды выбранные токсины имеют три отдельных места действия у FAW. Некоторые предпочтительные комбинации для пирамиды с “тремя местами действия” включают рассматриваемую основную пару белков плюс Cry1Fa, Cry1Da, Cry1Be или Cry1E в качестве третьего белка для воздействия на FAW. Под “отдельными местами действия” подразумевается то, что каждый из данных белков не вызывает развития перекрестной устойчивости с другими белками. Эти конкретные тройные пакеты, согласно настоящему изобретению, неожиданно обеспечивают три места действия у FAW. Это может способствовать смягчению или устранению требования к площадям убежищ.Other proteins may be added to this pair. For example, the invention also partially relates to triple packets or “pyramids” consisting of three (or more) toxins, where Vip3Ab and Cry1Ca are the main pair. In some preferred pyramid embodiments, the selected toxins have three distinct sites of action at the FAW. Some preferred combinations for the three-site pyramid include the main protein pair of interest, plus Cry1Fa, Cry1Da, Cry1Be or Cry1E as the third protein for influencing FAW. By “separate sites of action” is meant that each of these proteins does not cause the development of cross-resistance with other proteins. These particular triple packets of the present invention unexpectedly provide three sites of action for the FAW. This can help alleviate or eliminate shelter space requirements.
Что касается некоторых частных вариантов осуществления настоящего изобретения, авторы показали, что популяция FAW, устойчивая к инсектицидной активности белка Cry1Fa, не является устойчивой к инсектицидной активности белка Vip3Ab или инсектицидной активности белка Cry1Ca. Авторы продемонстрировали, что Cry1Ca не конкурирует за участки связывания с Cry1Fa, и что Vip3Ab не конкурирует за участки связывания с Cry1Fa в кишечнике FAW. См. US 61/284281 (поданную 16 декабря 2009) в отношении Cry1Fa и Cry1Ca, и параллельно поданную заявку PCT озаглавленную “COMBINED USE OF Vip3Ab AND Cry1Fa FOR MANAGEMENT OF RESISTANT INSECTS”.As for some particular embodiments of the present invention, the authors showed that the FAW population resistant to the insecticidal activity of the Cry1Fa protein is not resistant to the insecticidal activity of the Vip3Ab protein or the insecticidal activity of the Cry1Ca protein. The authors demonstrated that Cry1Ca does not compete for binding sites to Cry1Fa, and that Vip3Ab does not compete for binding sites to Cry1Fa in the intestines of FAW. See
Таким образом, пары токсинов Cry1Fa плюс Vip3Ab и Cry1Fa плюс Cry1Ca обеспечивают активность по отношению к FAW без развития перекрестной устойчивости. Неспособность Vip3Ab1 конкурировать с Cry1Ca за связывание в кишечнике FAW демонстрирует, что эти три белка-токсина (Cry1Fa, Vip3Ab, Cry1Ca) представляют тройной пакет - пирамиду токсинов Cry, которая обеспечивает три отдельных целевых участка взаимодействия в кишечнике FAW. Эти конкретные тройные пакеты, согласно настоящему изобретению, неожиданно обеспечивают воздействие на FAW без развития перекрестной устойчивости. Более того, демонстрация того, что эти три белка не конкурируют друг с другом, позволяет специалисту в данной области техники прийти к заключению, что это может способствовать смягчению или устранению требования к площадям убежищ. Настоящее раскрытие обеспечивает преимущество, заключающееся в том, что растения, экспрессирующие комбинацию Cry1Fa, Vip3Ab и Cry1Ca будут полезны для замедления или предотвращения развития у FAW устойчивости к каждому из этих белков и их комбинации.Thus, pairs of toxins Cry1Fa plus Vip3Ab and Cry1Fa plus Cry1Ca provide activity against FAW without the development of cross-resistance. The inability of Vip3Ab1 to compete with Cry1Ca for FAW intestinal binding demonstrates that these three toxin proteins (Cry1Fa, Vip3Ab, Cry1Ca) represent a triple packet - the Cry toxin pyramid, which provides three separate target sites for interaction in the FAW intestines. These particular triple packets of the present invention unexpectedly provide an effect on FAW without developing cross-resistance. Moreover, the demonstration that the three proteins do not compete with each other allows one skilled in the art to conclude that this can help alleviate or eliminate the requirement for shelter space. The present disclosure provides the advantage that the plants expressing a combination Cry1Fa, Vip3Ab Cry1Ca and will be useful in slowing or preventing the development of resistance in FAW for each of these proteins, and combinations thereof.
В соответствии с настоящим изобретением также могут быть добавлены дополнительные токсины/гены. Например, если Cry1Fa или Cry1Be вводят в пакет вместе с парой белков по изобретению (оба белка Cry1Fa и Cry1Be проявляют активность как по отношению к FAW, так и по отношению к мотыльку кукурузному (ECB)), добавление двух дополнительных белков в этот тройной пакет, в котором два дополнительных белка нацелены на ECB, обеспечит три места действия у FAW и три места действия у ECB. Эти два добавленных белка (четвертый и пятый белок) могут быть выбраны из группы, состоящей из Cry2A, Cry1I, DIG-3 (см. заявку на патент США № 61/284278 (подана 16 декабря 2009) и US 2010 00269223) и Cry1Ab, что дает в результате пакет из пяти белков, имеющих по три места действия у двух насекомых (ECB и FAW)Additional toxins / genes may also be added in accordance with the present invention. For example, if Cry1Fa or Cry1Be is introduced into a bag along with a pair of proteins of the invention (both the Cry1Fa and Cry1Be proteins are active both in relation to FAW and in relation to the corn moth (ECB)), adding two additional proteins to this triple bag, in which two additional proteins target ECB, will provide three sites of action for FAW and three sites of action for ECB. These two added proteins (fourth and fifth protein) can be selected from the group consisting of Cry2A, Cry1I, DIG-3 (see US patent application No. 61/284278 (filed December 16, 2009) and US 2010 00269223) and Cry1Ab, resulting in a packet of five proteins having three sites of action in two insects (ECB and FAW)
Таким образом, одна из возможных схем обработки представляет собой использование рассматриваемой пары белков в комбинации с третьим токсином/геном и использование этого тройного пакета для ослабления развития у FAW устойчивости к каждому из этих токсинов. Соответственно, рассматриваемое изобретение также относится к тройным пакетам или “пирамидам”, состоящим из трех (или более) токсинов. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления пирамиды выбранные токсины имеют три отдельных места действия в отношении FAW.Thus, one possible treatment regimen is to use the protein pair in question in combination with a third toxin / gene and use this triple packet to weaken the FAW's development of resistance to each of these toxins. Accordingly, the subject invention also relates to triple packets or “pyramids” consisting of three (or more) toxins. In some preferred pyramid embodiments, the selected toxins have three distinct locales for FAW.
Среди прочих схем обработки по настоящему изобретению могут быть использованы два, три или более белков из рассматриваемых белков в регионах произрастания кукурузы, в которых FAW может формировать популяции с развившейся устойчивостью.Among other treatment schemes of the present invention, two, three or more proteins of the considered proteins can be used in the regions where maize grows, in which FAW can form populations with developed resistance.
С учетом того, что Cry1Fa активен по отношению к FAW и ECB, Vip3Ab плюс Cry1Ca плюс Cry1Fa неожиданно обеспечивают, согласно настоящему изобретению, три места действия у FAW. Это может способствовать смягчению или устранению требования о площадях убежищ.Given that Cry1Fa is active against FAW and ECB, Vip3Ab plus Cry1Ca plus Cry1Fa unexpectedly provide, according to the present invention, three sites of action for FAW. This may help mitigate or eliminate the requirement for shelter space.
Cry1Fa содержится в продуктах Herculex®, SmartStax™ и WideStrike™. Рассматриваемая пара генов (Vip3Ab и Cry1Ca) может быть скомбинирована, например с содержащим Cry1Fa продуктом, таким как Herculex®, SmartStax™ и WideStrike™. Соответственно, рассматриваемая пара белков может играть значительную роль в уменьшении давления отбора на эти и другие белки. Рассматриваемая пара белков может быть использована в комбинациях из трех генов для кукурузы и других растений (например, хлопка и сои).Cry1Fa is available in Herculex®, SmartStax ™ and WideStrike ™ products. The pair of genes under consideration (Vip3Ab and Cry1Ca) can be combined, for example, with a Cry1Fa-containing product such as Herculex®, SmartStax ™ and WideStrike ™. Accordingly, the considered pair of proteins can play a significant role in reducing the selection pressure on these and other proteins. The considered pair of proteins can be used in combinations of three genes for corn and other plants (for example, cotton and soy).
Как уже указывалось выше, согласно настоящему изобретению также могут быть добавлены дополнительные токсины/гены. В отношении использования Cry1E (для контроля FAW), см. заявку на патент США № 61/284278 (подана 16 декабря 2009).As mentioned above, additional toxins / genes can also be added according to the present invention. Regarding the use of Cry1E (for FAW control), see US Patent Application No. 61/284278 (filed December 16, 2009).
Растения (и площади угодий, засеянных такими растениями), которые вырабатывают любую из рассматриваемых комбинаций белков, включены в объем настоящего изобретения. Также могут быть добавлены дополнительные токсины/гены, однако обсуждаемые выше конкретные пакеты неожиданно обеспечивают множество мест действия у FAW и ECB. Это может способствовать смягчению или устранению требования к площадям убежищ. Следовательно, засеянное таким образом поле, площадь которого превышает десять акров, входит в объем настоящего изобретения.Plants (and the area sown with such plants) that produce any of the considered protein combinations are included in the scope of the present invention. Additional toxins / genes may also be added, however the specific packages discussed above unexpectedly provide multiple locales for FAW and ECB. This can help alleviate or eliminate shelter space requirements. Therefore, a field sown in this way, an area of more than ten acres, is included in the scope of the present invention.
Для получения последовательностей любых генов и белков, раскрытых или упомянутых в настоящем документе, также может быть использован GENBANK. См. Приложение А ниже. Релевантные последовательности также доступны из патентов. Например, патент США № 5188960 и патент США № 5827514 описывают белки, содержащие ядро токсина Cry1Fa, которые являются подходящими для осуществления настоящего изобретения. Патент США № 6218188 описывает оптимизированные для растений последовательности ДНК, кодирующие белки, содержащие ядро токсина Cry1Fa, которые подходят для использования в настоящем изобретении. В US 61/284275 (подана 16 декабря 2009) раскрыты некоторые укороченные белки Cry1Ca, которые могут быть использованы в соответствии с настоящим изобретением.GENBANK can also be used to obtain sequences of any genes and proteins disclosed or mentioned herein. See Appendix A below. Relevant sequences are also available from patents. For example, US patent No. 5188960 and US patent No. 5827514 describe proteins containing the core of the Cry1Fa toxin, which are suitable for the implementation of the present invention. US Pat. No. 6,218,188 describes plant-optimized DNA sequences encoding proteins containing a Cry1Fa toxin core that are suitable for use in the present invention.
Комбинации белков, описанных в настоящем документе, могут быть использованы для контроля чешуекрылых насекомых-вредителей. Взрослые чешуекрылые, например бабочки и мотыльки, в основном питаются цветочным нектаром и являются важными опылителями. Практически все личинки чешуекрылых, т.е. гусеницы, питаются растениями, и многие из них являются важными насекомыми-вредителями. Гусеницы поедают внутреннюю часть листвы, корни или стебель растения, лишая растение возможности получать питательные вещества и часто разрушая физическую опорную структуру растения. Помимо этого, гусеницы поедают плоды, ткани и хранящиеся зерно и муку, придавая этим продуктам нетоварный вид или серьезно снижая их ценность. Как используется в настоящем документе, под чешуекрылыми насекомыми-вредителями подразумеваются различные стадии жизненного цикла насекомого-вредителя, включая стадии личинки.The protein combinations described herein can be used to control lepidopteran pests. Lepidoptera adults, such as butterflies and moths, feed mainly on flower nectar and are important pollinators. Almost all Lepidoptera larvae, i.e. caterpillars feed on plants, and many of them are important pests. Caterpillars eat the inside of the foliage, the roots or the stem of the plant, depriving the plant of the ability to receive nutrients and often destroying the physical supporting structure of the plant. In addition, caterpillars eat fruits, fabrics and stored grain and flour, giving these products a non-marketable appearance or seriously reducing their value. As used herein, lepidopteran pests are understood to mean various stages of the life cycle of the pest, including the stages of the larva.
Некоторые химерные токсины по настоящему изобретению содержат полную N-концевую часть ядра токсина Bt и, в некоторой точке от конца части, содержащей ядро токсина, белок переходит в гетерологичную последовательность протоксина. N-концевая часть токсина Bt, обладающая инсектицидной активностью, называется “ядром” токсина. Переход от сегмента ядра токсина к сегменту гетерологичного протоксина может находиться приблизительно в месте соединения токсин/протоксин или, в качестве альтернативы, может быть сохранена часть естественного протоксина (простирающаяся за пределы части ядра токсина) с переходом в гетерологичную часть, протоксин, расположенную далее.Some chimeric toxins of the present invention contain the complete N-terminal portion of the Bt toxin core and, at some point from the end of the portion containing the toxin core, the protein enters the heterologous protoxin sequence. The N-terminal portion of the Bt toxin, which has insecticidal activity, is called the “core” of the toxin. The transition from the toxin nucleus segment to the heterologous protoxin segment may be located at the toxin / protoxin junction, or, alternatively, a portion of the natural protoxin (extending beyond the portion of the toxin nucleus) may be retained with a transition to the heterologous portion, the protoxin, which is located next.
В качестве примера, один из химерных токсинов по настоящему изобретению представляет собой часть, относящуюся к ядру токсина Cry1Ca (приблизительно 600 аминокислот) и/или гетерологичный протоксин (остальные аминокислоты до С-конца). В одном из предпочтительных вариантов осуществления, часть химерного токсина, содержащую протоксин, получают из белка-токсина Cry1Ab. В предпочтительном варианте осуществления, часть химерного токсина, содержащую протоксин, получают из белка-токсина Cry1Ab.As an example, one of the chimeric toxins of the present invention is a portion related to the core of the Cry1Ca toxin (approximately 600 amino acids) and / or heterologous protoxin (the remaining amino acids to the C-terminus). In one preferred embodiment, the protoxin-containing portion of the chimeric toxin is derived from the Cry1Ab protein toxin. In a preferred embodiment, the protoxin-containing portion of the chimeric toxin is derived from the Cry1Ab toxin protein.
Специалист в данной области техники признает, что Bt токсины, даже в рамках определенного класса, такого как Cry1Ca, немного различаются по длине и точному положению перехода от ядра токсина к части, относящейся к протоксину. Обычно токсины Cry1Ca имеют длину от примерно 1150 до примерно 1200 аминокислот. Переход от части, относящейся к ядру токсина, к части, относящейся к протоксину, обычно находится в пределах от 50% до 60% полной длины токсина. Химерный токсин рассматриваемого изобретения полностью включает указанную N-концевую часть ядра токсина. Таким образом, химерный токсин содержит по меньшей мере 50% полной длины белка-токсина Cry1 Bt, что обычно составляет по меньшей мере 590 аминокислот. Что касается части, относящейся к протоксину, то полная длина части, относящейся к протоксину Cry1Ab, простирается от конца части, относящейся к ядру токсина, до С-конца молекулы.One of skill in the art will recognize that Bt toxins, even within a specific class, such as Cry1Ca, vary slightly in length and in the exact position of the transition from the toxin core to the protoxin portion. Typically, Cry1Ca toxins have a length of from about 1150 to about 1200 amino acids. The transition from the part related to the core of the toxin to the part related to the protoxin is usually in the range from 50% to 60% of the total length of the toxin. The chimeric toxin of the subject invention fully comprises the indicated N-terminal portion of the toxin core. Thus, a chimeric toxin contains at least 50% of the total length of the Cry1 Bt toxin protein, which typically is at least 590 amino acids. For the protoxin portion, the total length of the protryxin portion of Cry1Ab extends from the end of the portion of the toxin core to the C-terminus of the molecule.
Гены и токсины. Гены и токсины, используемые по настоящему изобретению, включают не только раскрытые последовательности полной длины, но также фрагменты этих последовательностей, варианты, мутанты и слитые белки, которые сохраняют характеристики пестицидной активности токсинов, примеры которых приведены в настоящем документе. В настоящем документе термин “варианты” или “вариации” генов относится к нуклеотидным последовательностям, которые кодируют одни и те же токсины или которые кодируют токсины-эквиваленты, обладающие пестицидной активностью. В настоящем документе термин “токсины-эквиваленты” относится к токсинам, имеющим такую же или по существу такую же биологическую активность по отношению к целевым насекомым-вредителям, что и заявленные токсины. Genes and toxins . The genes and toxins used in the present invention include not only the disclosed full-length sequences, but also fragments of these sequences, variants, mutants, and fusion proteins that retain the pesticidal activity characteristics of the toxins, examples of which are given herein. As used herein, the term “variants” or “variations” of genes refers to nucleotide sequences that encode the same toxins or that encode equivalent toxins having pesticidal activity. As used herein, the term “toxin equivalents” refers to toxins having the same or substantially the same biological activity with respect to the target insect pests as the claimed toxins.
В настоящем документе используются следующие ограничительные признаки: примерно 95% (для Vip3Ab и Cry1Ca), 78% (для Vip3Ab и Cry1C) и 45% (для Cry1) идентичность последовательностей согласно “Revision of the Nomenclature for the Bacillus thuringiensis Pesticidal Crystal Proteins”, N. Crickmore, D.R. Zeigler, J. Feitelson, E. Schnepf, J. Van Rie, D. Lereclus, J. Baum, and D.H. Dean. Microbiology and Molecular Biology Reviews (1998) Vol. 62: 807-813. Эти ограничения применимы только в отношении ядра токсинов.The following restrictive features are used in this document: approximately 95% (for Vip3Ab and Cry1Ca), 78% (for Vip3Ab and Cry1C) and 45% (for Cry1) sequence identity according to “Revision of the Nomenclature for the Bacillus thuringiensis Pesticidal Crystal Proteins”, N. Crickmore, DR Zeigler, J. Feitelson, E. Schnepf, J. Van Rie, D. Lereclus, J. Baum, and D.H. Dean. Microbiology and Molecular Biology Reviews (1998) Vol. 62: 807-813. These restrictions apply only to the toxin core.
Для специалиста в данной области техники очевидно, что гены, кодирующие активные токсины, могут быть идентифицированы и получены несколькими способами. Конкретные гены или части генов, проиллюстрированные в настоящем документе, могут быть получены из изолятов, депонированных в депозитарии культур. Эти гены или их части, или варианты также могут быть сконструированы синтетически, например, с использованием синтезатора генов. Вариации генов могут быть легко сконструированы стандартными методами для осуществления точечных мутаций. Фрагменты этих генов также могут быть получены с использованием коммерчески доступных экзонуклеаз или эндонуклеаз согласно стандартным процедурам. Например, для последовательного отщепления нуклеотидов от концов этих генов могут быть использованы такие ферменты, как Bal31, или сайт-направленный мутагенез. Гены, кодирующие активные фрагменты, также могут быть получены с использованием различных рестрикционных ферментов. Для непосредственного получения активных фрагментов указанных белков-токсинов могут быть использованы протеазы.For a person skilled in the art it is obvious that genes encoding active toxins can be identified and obtained in several ways. Specific genes or parts of genes illustrated herein can be obtained from isolates deposited in a culture depository. These genes or their parts or variants can also be synthetically engineered, for example, using a gene synthesizer. Variations in genes can be easily constructed using standard methods for performing point mutations. Fragments of these genes can also be obtained using commercially available exonucleases or endonucleases according to standard procedures. For example, enzymes such as Bal31 or site-directed mutagenesis can be used to sequentially cleave nucleotides from the ends of these genes. Genes encoding active fragments can also be obtained using various restriction enzymes. To directly obtain active fragments of these protein toxins, proteases can be used.
Фрагменты и эквиваленты, которые сохраняют пестицидную активность проиллюстрированных токсинов, также находятся в пределах объема настоящего изобретения. В силу избыточности генетического кода аминокислотные последовательности, раскрытые в настоящем документе, могут кодироваться множеством различных ДНК-последовательностей. Специалисту в данной области техники не составит труда создать такие альтернативные ДНК-последовательности, кодирующие такие же или по существу такие же токсины. Такие варианты ДНК-последовательностей находятся в пределах объема настоящего изобретения. В настоящем документе “по существу такие же” последовательности обозначают последовательности, имеющие замены, делеции, добавления или вставки, которые существенно не влияют на пестицидную активность. Это определение также охватывает фрагменты генов, кодирующие белки, которые сохраняют пестицидную активность.Fragments and equivalents that retain the pesticidal activity of the illustrated toxins are also within the scope of the present invention. Due to the redundancy of the genetic code, the amino acid sequences disclosed herein can be encoded by many different DNA sequences. It is not difficult for a person skilled in the art to create such alternative DNA sequences encoding the same or substantially the same toxins. Such variants of the DNA sequences are within the scope of the present invention. As used herein, “substantially the same” sequences refer to sequences having substitutions, deletions, additions or insertions that do not substantially affect pesticidal activity. This definition also encompasses fragments of genes encoding proteins that retain pesticidal activity.
Еще один способ идентификации генов, кодирующих токсины, и частей генов, пригодных согласно настоящему изобретению, состоит в использовании олигонуклеотидных зондов. Такие зонды представляют собой детектируемые нуклеотидные последовательности. Эти последовательности могут быть детектируемыми в силу наличия соответствующей метки или могут быть выполнены с возможностью их естественной флуоресценции, как описано в международной заявке WO93/16094. Как известно из уровня техники, если зонд и образец нуклеиновой кислоты гибридизуются, формируя сильную связь между двумя указанными молекулами, можно сделать достаточно обоснованное предположение, что зонд и образец являются по существу гомологичными. Предпочтительно, гибридизацию проводят в жестких условиях методом, хорошо известным из уровня техники, например, описанным в Keller, G. FL, M. M. Manak (1987) DNA Probes, Stockton Press, New York, N.Y., pp. 169-170. Некоторые примеры комбинаций концентрации соли и температуры являются следующими (в порядке возрастания жесткости): 2X SSPE или SSC при комнатной температуре; 1X SSPE или SSC при 42°C; 0,1X SSPE или SSC при 42°C; 0,1X SSPE или SSC при 65°C. Детектирование зонда обеспечивает средство для определения известным способом, произошла ли гибридизация. Такой зондовый анализ обеспечивает быстрый способ идентификации кодирующих токсин генов по настоящему изобретению. Нуклеотидные сегменты, используемые в качестве зондов, согласно изобретению, могут синтезироваться в ДНК-синтезаторе и с помощью стандартных процедур. Данные нуклеотидные последовательности также могут использоваться в качестве ПЦР-праймеров для амплификации генов по изобретению.Another way of identifying genes encoding toxins and parts of genes suitable according to the present invention is to use oligonucleotide probes. Such probes are detectable nucleotide sequences. These sequences can be detected due to the presence of an appropriate label or can be made with the possibility of their natural fluorescence, as described in international application WO93 / 16094. As is known in the art, if a probe and a nucleic acid sample hybridize to form a strong bond between these two molecules, a reasonably reasonable assumption can be made that the probe and sample are essentially homologous. Preferably, hybridization is carried out under stringent conditions by a method well known in the art, for example, as described in Keller, G. FL, M. M. Manak (1987) DNA Probes, Stockton Press, New York, N.Y., pp. 169-170. Some examples of combinations of salt concentration and temperature are as follows (in order of increasing hardness): 2X SSPE or SSC at room temperature; 1X SSPE or SSC at 42 ° C; 0.1X SSPE or SSC at 42 ° C; 0.1X SSPE or SSC at 65 ° C. Probe detection provides a means for determining in a known manner whether hybridization has occurred. Such probe analysis provides a quick way to identify toxin-encoding genes of the present invention. The nucleotide segments used as probes according to the invention can be synthesized in a DNA synthesizer and using standard procedures. These nucleotide sequences can also be used as PCR primers for amplification of the genes of the invention.
Варианты токсинов. В настоящем документе, в частности, приведены примеры некоторых токсинов по изобретению. Поскольку эти токсины являются всего лишь примерами токсинов по изобретению, очевидно, что настоящее изобретение содержит варианты или эквивалентные токсины (и нуклеотидные последовательности, кодирующие эквивалентные токсины), имеющие пестицидную активность, такую же или аналогичную пестицидной активности токсина, приведенного в качестве примера. Эквивалентные токсины обладают гомологией по аминокислотам с приведенным в качестве примера токсином. Такая гомология по аминокислотам обычно превышает 75%, предпочтительно превышает 90%, и наиболее предпочтительно превышает 95%. Гомология по аминокислотам является наибольшей в критических областях, которые ответственны за биологическую активность или участвуют в определении трехмерной конфигурации, которая, в конечном счете, и отвечает за биологическую активность. В этом отношении, определенные аминокислотные замены являются приемлемыми и допустимыми, если эти замены находятся в областях, которые не являются критичными для активности или представляют собой консервативные аминокислотные замены, которые не влияют на трехмерную конфигурацию молекулы. Например, аминокислоты могут быть отнесены к следующим классам: неполярные, незаряженные полярные, основные и кислые. Консервативные замены, в которых аминокислота одного класса заменяется аминокислотой из того же класса, находятся в пределах объема настоящего изобретения при условии, что замена не изменяет существенно биологическую активность соединения. Ниже приводится список примеров аминокислот, принадлежащих каждому классу. Options for toxins . In this document, in particular, examples of certain toxins of the invention are provided. Since these toxins are merely examples of the toxins of the invention, it is obvious that the present invention contains variants or equivalent toxins (and nucleotide sequences encoding equivalent toxins) having pesticidal activity that is the same or similar to the pesticidal activity of the toxin given as an example. Equivalent toxins have amino acid homology with an exemplary toxin. Such amino acid homology typically exceeds 75%, preferably exceeds 90%, and most preferably exceeds 95%. The amino acid homology is greatest in critical areas that are responsible for biological activity or are involved in determining the three-dimensional configuration, which, ultimately, is responsible for biological activity. In this regard, certain amino acid substitutions are acceptable and permissible if these substitutions are in areas that are not critical for activity or are conservative amino acid substitutions that do not affect the three-dimensional configuration of the molecule. For example, amino acids can be assigned to the following classes: non-polar, uncharged polar, basic and acidic. Conservative substitutions in which an amino acid of one class is replaced by an amino acid of the same class are within the scope of the present invention, provided that the substitution does not substantially alter the biological activity of the compound. The following is a list of examples of amino acids belonging to each class.
В некоторых примерах также могут быть использованы неконсервативные замены. При этом критическим фактором является то, что такие замены не должны существенно ухудшать биологическую активность токсина.Non-conservative substitutions may also be used in some examples. Moreover, a critical factor is that such substitutions should not significantly impair the biological activity of the toxin.
Рекомбинантные хозяева. Гены, кодирующие токсины по настоящему изобретению, могут быть введены во множество различных микроорганизмов-хозяев или растений-хозяев. Экспрессия гена токсина приводит в результате, прямо или опосредованно, к внутриклеточному продуцированию и поддержанию пестицида. Для создания штамма Bt, экспрессирующего оба токсина по изобретению, могут быть использованы конъюгационный перенос и рекомбинантный перенос. Один или оба гена токсинов могут быть перенесены также в другие организмы-хозяева, которые могут затем использоваться для получения синергического эффекта. При использовании подходящих микроорганизмов-хозяев, например Pseudomonas, такие микроорганизмы можно применять в местах нахождения насекомого-вредителя, где они будут размножаться и попадать в кишечник насекомого, что приведет в результате к контролю насекомого-вредителя. В качестве альтернативы, микроорганизмы, содержащие ген токсина, могут быть обработаны в условиях, продлевающих активность токсина и стабилизирующих клетку. Затем обработанные клетки, которые сохраняют токсическую активность, вносят в среду обитания целевого насекомого-вредителя. Recombinant hosts . Genes encoding the toxins of the present invention can be introduced into many different host microorganisms or host plants. Expression of the toxin gene results, directly or indirectly, in the intracellular production and maintenance of the pesticide. Conjugation transfer and recombinant transfer can be used to create a Bt strain expressing both toxins of the invention. One or both toxin genes can also be transferred to other host organisms, which can then be used to produce a synergistic effect. When using suitable host microorganisms, for example Pseudomonas, such microorganisms can be used at the location of the pest, where they will multiply and enter the intestine of the insect, resulting in control of the pest. Alternatively, microorganisms containing the toxin gene can be treated under conditions that prolong the activity of the toxin and stabilize the cell. Then, the treated cells that retain toxic activity are introduced into the habitat of the target insect pest.
Если ген Bt токсина вводят с помощью подходящего вектора в микроорганизм-хозяин, а указанный хозяин затем вводят в среду обитания в живом состоянии, то принципиальным моментом является использование определенных микроорганизмов-хозяев. Выбираются такие микроорганизмы-хозяева, в отношении которых известно, что они обитают в “фитосфере” (филлоплане, филлосфере, ризосфере и/или ризоплане) одной или более представляющих интерес зерновых культур. Такие микроорганизмы выбирают таким образом, чтобы они обладали способностью успешно конкурировать в конкретной среде обитания (зерновой культуре или других местах обитания насекомых) с дикими типами микроорганизмов, обеспечивали стабильное поддержание и экспрессию полипептида-пестицида и, желательно, обеспечивали улучшенную защиту пестицида от разложения и инактивации под действием окружающей среды.If the Bt toxin gene is introduced using a suitable vector into the host microorganism, and the specified host is then introduced into the living environment in a living state, then the principle point is the use of certain host microorganisms. Such host microorganisms are selected for which it is known that they live in the “phytosphere” (phylloplan, phyllosphere, rhizosphere and / or rhizoplan) of one or more crops of interest. Such microorganisms are selected so that they have the ability to successfully compete in a specific habitat (cereal or other insect habitats) with wild types of microorganisms, provide stable maintenance and expression of the pesticide polypeptide and, preferably, provide improved protection of the pesticide from degradation and inactivation under the influence of the environment.
В отношении огромного количества микроорганизмов известно, что они обитают в филлоплане (поверхности листьев растений) и/или в ризосфере (почве, окружающей корневую систему растения) множества важных зерновых культур. Эти микроорганизмы включают бактерии, водоросли и грибы. Особый интерес представляют такие микроорганизмы, как бактерии, например, относящиеся к родам Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylophilius, Agrobactenum, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc и Alcaligenes; грибы, в частности, дрожжи, например, относящиеся к видам Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula и Aureobasidium. Особый интерес представляют такие виды, обитающих в фитосфере бактерий, как Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens, Acetobacter xylinum, Agrobactenium tumefaciens, Rhodopseudomonas spheroides, Xanthomonas campestris, Rhizobium melioti, Alcaligenes entrophus и Azotobacter vinlandii, такие виды обитающих в фитосфере дрожжей, как Rhodotorula rubra, R. glutinis, R. marina, R. aurantiaca, Cryptococcus albidus, C. diffluens, C. laurentii, Saccharomyces rosei, S. pretoriensis, S. cerevisiae, Sporobolomyces roseus, S. odorus, Kluyveromyces veronae и Aureobasidium pollulans. Особый интерес представляют пигментированные микроорганизмы.With regard to the huge number of microorganisms, it is known that they live in the phylloplan (surface of plant leaves) and / or in the rhizosphere (soil surrounding the root system of the plant) of many important crops. These microorganisms include bacteria, algae and fungi. Of particular interest are microorganisms such as bacteria, for example, belonging to the genera Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylophilius, Agrobactenum, Acetobacter, Lactobaciller, Althrobacterus, Arthrobacterus, Arthrobacterus, Arthrobacterus, Arthrobacterus, Arthrobacterus, Arthrobacterus, Arthrobacterus, Arthrobacterus, Arthobacterus, Arthrobacterus, Arthrobacterus, Arthobacterus, Arthobacterus, Arthobacterus fungi, in particular yeast, for example, belonging to the species Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula and Aureobasidium. Of particular interest are species that live in the phytosphere of bacteria, such as Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens, Acetobacter xylinum, Agrobactenium tumefaciens, Rhodopseudomonas spheroides, Xanthomonas campyris, Rhioberifermelliformes, mellifera, Azheroben Rhodotorula rubra, R. glutinis, R. marina, R. aurantiaca, Cryptococcus albidus, C. diffluens, C. laurentii, Saccharomyces rosei, S. pretoriensis, S. cerevisiae, Sporobolomyces roseus, S. odorus, Kluyveromyces veronae and Aureobasidium pollans. Of particular interest are pigmented microorganisms.
Существует широкий спектр способов введения Bt генов, кодирующих токсин, в микроорганизм-хозяин в условиях обеспечивающих стабильную поддержку и экспрессию этого гена. Эти способы хорошо известны специалистам в данной области техники и описаны, например, в патенте США № 5135867, который включен в настоящий документ в виде ссылки.There is a wide range of methods for introducing Bt genes encoding a toxin into a host microorganism under conditions providing stable support and expression of this gene. These methods are well known to those skilled in the art and are described, for example, in US Pat. No. 5,135,867, which is incorporated herein by reference.
Обработка клеток. Клетки Bacillus thuringiensis или рекомбинантные клетки, экспрессирующие Bt токсины, могут быть обработаны с целью продления активности токсина и стабилизации клетки. Формируемая микрокапсула с пестицидом содержит Bt токсин или токсины внутри клеточной структуры, которая была стабилизирована и защищает токсин при внесении микрокапсулы в среду обитания целевого насекомого-вредителя. Подходящие клетки-хозяева могут включать либо клетки прокариот, либо эукариот, и обычно ограничены только теми клетками, которые не вырабатывают вещества, токсичные для высших организмов, таких как млекопитающие. Тем не менее, могут быть использованы организмы, вырабатывающие вещества, токсичные для высших организмов, если эти токсичные вещества являются нестабильными, или вносимое количество является настолько низким, что при этом отсутствует какая-либо вероятность интоксикации млекопитающего-хозяина. В качестве хозяев особый интерес представляют прокариоты и низшие эукариоты, такие как грибы. Cell processing . Bacillus thuringiensis cells or recombinant cells expressing Bt toxins can be treated to prolong the activity of the toxin and stabilize the cell. The pesticide-formed microcapsule contains a Bt toxin or toxins inside the cell structure, which has been stabilized and protects the toxin when the microcapsule is introduced into the habitat of the target pest. Suitable host cells may include either prokaryotic or eukaryotic cells, and are usually limited only to cells that do not produce substances toxic to higher organisms, such as mammals. However, organisms that produce substances toxic to higher organisms can be used if these toxic substances are unstable or the amount introduced is so low that there is no chance of intoxication of the mammalian host. Of particular interest as hosts are prokaryotes and lower eukaryotes, such as mushrooms.
При обработке клетки обычно являются интактными и по существу находятся в пролиферативной форме, а не в форме спор, хотя в некоторых случаях могут быть использованы споры.In processing, the cells are usually intact and are substantially in proliferative form rather than in the form of spores, although spores may be used in some cases.
Обработка клеток микроорганизмов, т.е. клеток, содержащих ген или гены Bt токсина, может выполняться с использованием химических или физических средств или с использованием комбинации химических и/или физических средств при условии, что эти методы не оказывают негативного влияния на свойства токсина, а также не ухудшают способность клетки защищать токсин. Примерами химических реагентов являются галогенирующие агенты, в частности галогены с атомными номерами 17-80. Более точно, можно использовать йод в мягких условиях в течение времени, достаточного для достижения желаемых результатов. Другие подходящие методы включают обработку альдегидами, такими как глутаральдегид; противоинфекционными средствами, такими как зефиран хлорид и цетилпиридинхлорид; спиртами, такими как изопропиловый спирт и этанол; различными гистологическими фиксаторами, такими как Люголь-йод, фиксатор Буэна, различные кислоты и фиксатор Helly (См. Humason, Gretchen L., Animal Tissue Techniques, W. H. Freeman and Company, 1967); или комбинацией физических (тепло) и химических агентов, которые защищают и способствуют пролонгированию активности токсина, продуцируемого в клетке при введении этой клетки животному-хозяину. Примерами физических средств являются коротковолновое излучение, такое как гамма-излучение и рентгеновское излучение, заморозка, УФ-облучение, лиофилизация и прочие. Способы обработки клеток микроорганизмов описаны в патентах США №№ 4695455 и 4695462, которые включены в настоящий документ в виде ссылки.Treatment of microorganism cells, i.e. cells containing the Bt toxin gene or genes can be performed using chemical or physical means or using a combination of chemical and / or physical means, provided that these methods do not adversely affect the properties of the toxin and do not impair the cell's ability to protect the toxin. Examples of chemical reagents are halogenating agents, in particular halogens with atomic numbers 17-80. More precisely, iodine can be used under mild conditions for a time sufficient to achieve the desired results. Other suitable methods include treatment with aldehydes, such as glutaraldehyde; anti-infectious agents such as marshmallow chloride and cetylpyridinium chloride; alcohols such as isopropyl alcohol and ethanol; various histological fixatives, such as Lugol-iodine, Buen's fixative, various acids and Helly's fixative (See Humason, Gretchen L., Animal Tissue Techniques, W. H. Freeman and Company, 1967); or a combination of physical (heat) and chemical agents that protect and help prolong the activity of the toxin produced in the cell upon administration of the cell to the host animal. Examples of physical means are short-wave radiation, such as gamma radiation and x-ray radiation, freezing, UV radiation, lyophilization and others. Methods for treating microorganism cells are described in US Pat. Nos. 4,695,455 and 4,695,462, which are incorporated herein by reference.
Клетки обычно имеют повышенную структурную стабильность, что увеличивает их устойчивость к условиям окружающей среды. Если пестицид находится в проформе, способ обработки клетки следует выбирать таким образом, чтобы патогеном целевого насекомого-вредителя не подавлялся процессинг от проформы к зрелой форме пестицида. Например, формальдегид будет сшивать белки и может подавлять процессинг проформы полипептида-пестицида. Способ обработки клетки должен способствовать сохранению по меньшей мере существенной доли биодоступности или биоактивности токсина.Cells usually have increased structural stability, which increases their resistance to environmental conditions. If the pesticide is in proforma, the method of processing the cell should be selected so that the pathogen of the target insect pest does not inhibit the processing from the pro forma to the mature form of the pesticide. For example, formaldehyde will crosslink proteins and can inhibit the processing of pro-forma polypeptide-pesticide. The cell processing method should help to maintain at least a substantial proportion of the toxin bioavailability or bioactivity.
Представляющие особый интерес характеристики при выборе клетки-хозяина с целью продуцирования, включают легкость введения Bt гена или генов в клетку хозяина, доступность экспрессирующей системы, эффективность экспрессии, стабильность пестицида в клетке-хозяине и наличие вспомогательных генетических возможностей. Представляющие особый интерес характеристики в случае использования в виде пестицидной микрокапсулы включают защитные свойства в отношении пестицида, такие как толстые клеточные стенки, пигментация и внутриклеточная упаковка или формирование включений; выживание в водной среде; отсутствие токсичности для млекопитающего; привлекательность для поглощения насекомыми-вредителями; легкость в уничтожении и фиксации без повреждения токсина и тому подобное. Также может рассматриваться легкость в создании и обращении, экономичность, стабильность при хранении и тому подобное.Characteristics of particular interest in selecting a host cell for production include ease of introducing the Bt gene or genes into the host cell, accessibility of the expression system, expression efficiency, pesticide stability in the host cell, and the presence of auxiliary genetic capabilities. Characteristics of particular interest when used as a pesticidal microcapsule include protective properties against the pesticide, such as thick cell walls, pigmentation and intracellular packaging or the formation of inclusions; survival in the aquatic environment; lack of toxicity to a mammal; attractiveness for absorption by insect pests; ease of destruction and fixation without damaging the toxin and the like. Ease of creation and handling, economy, storage stability and the like can also be considered.
Выращивание клеток. Клетку-хозяина, содержащую инсектицидный Bt ген или гены можно выращивать в любой подходящей питательной среде, в которой ДНК-конструкция обеспечивает селективное преимущество, обеспечивая такую селективную среду, что все или по существу все клетки сохраняют Bt ген. Затем эти клетки могут быть собраны известными методами. С другой стороны, клетки можно обрабатывать до их сбора. Cell growth . A host cell containing an insecticidal Bt gene or genes can be grown in any suitable nutrient medium in which the DNA construct provides a selective advantage, providing such a selective medium that all or substantially all cells retain the Bt gene. Then these cells can be harvested by known methods. On the other hand, cells can be processed before they are harvested.
Bt клетки, продуцирующие токсины по изобретению, могут быть культивированы с использованием стандартных сред и методов ферментации, известных в данной области техники. После завершения цикла ферментации бактерии могут быть собраны сначала путем выделения спор и кристаллов Bt из ферментационного бульона способами, хорошо известными в данной области. Восстановленные споры и кристаллы Bt могут быть представлены в составах в виде смачиваемого порошка, жидкого концентрата, гранул или в виде других составов с добавлением поверхностно-активных веществ, диспергирующих веществ, инертных наполнителей и других компонентов для облегчения обращения с ними и их применения по отношению к конкретным целевым насекомым-вредителям. Такие составы и процедуры нанесения хорошо известны в данной области.Bt cells producing the toxins of the invention can be cultured using standard fermentation media and methods known in the art. After the completion of the fermentation cycle, bacteria can be collected first by isolating spores and Bt crystals from the fermentation broth by methods well known in the art. Reconstituted spores and Bt crystals can be presented in compositions in the form of a wettable powder, liquid concentrate, granules or in the form of other compositions with the addition of surfactants, dispersing agents, inert fillers and other components to facilitate their handling and use with respect to specific target pests. Such formulations and application procedures are well known in the art.
Составы. Сформированные гранулы-приманки, содержащие аттрактант и споры, кристаллы и токсины Bt изолятов, или рекомбинантные микробы, содержащие гены, полученные из Bt изолятов, раскрытых в настоящем документе, могут быть внесены в почву. Сформированный продукт также может быть нанесен в виде покрытия на семена или в процессе обработки корней или обработки всего растения на поздних стадиях цикла развития кукурузы. Обработка растений и почвы Bt клетками может производиться с использованием смачиваемых порошков, гранул или пудры путем смешивания с различными инертными материалами, такими как неорганические минералы (филлосиликаты, карбонаты, сульфаты, фосфаты и т.п.) или растительными материалами (измельченной сердцевиной кукурузного початка, рисовой шелухой, ореховой скорлупой и т.п.). Составы могут включать адгезивные адъюванты, стабилизирующие агенты, другие пестицидные добавки или поверхностно-активные вещества. Жидкие составы могут быть водными или неводными и могут применяться в виде пен, гелей, суспензий, эмульгируемых концентратов и т.п. Ингредиенты могут включать реологические агенты, поверхностно-активные вещества, эмульгаторы или полимеры. Compositions . Formed bait granules containing attractant and spores, crystals and toxins of Bt isolates, or recombinant microbes containing genes derived from Bt isolates disclosed herein can be introduced into the soil. The formed product can also be applied as a coating on the seeds or in the process of treating the roots or treating the entire plant in the later stages of the maize development cycle. The treatment of plants and Bt soil with cells can be carried out using wettable powders, granules or powders by mixing with various inert materials such as inorganic minerals (phyllosilicates, carbonates, sulfates, phosphates, etc.) or plant materials (ground corn cobs, rice husks, nutshells, etc.). The compositions may include adhesive adjuvants, stabilizing agents, other pesticidal additives or surfactants. Liquid formulations may be aqueous or non-aqueous and may be used in the form of foams, gels, suspensions, emulsifiable concentrates, and the like. Ingredients may include rheological agents, surfactants, emulsifiers or polymers.
Как хорошо известно специалисту в данной области, пестицидная концентрация может варьировать в широких пределах в зависимости от природы конкретной композиции, в частности, от того, будет ли она представлять собой концентрат или будет использоваться непосредственно. Пестицид может присутствовать по меньшей мере в количестве 1 вес.% и может составлять 100% веса композиции. Сухие композиции могут содержать пестицид в количестве примерно от 1 до 95 вес.%, в то время как жидкие составы как правило, могут содержать примерно от 1 до 60 вес.% твердого вещества в жидкой фазе. Композиции, как правило, могут содержать примерно от 102 до 104 клеток/мг. Эти составы применяются в количестве от примерно 50 мг (в жидком или сухом виде) до 1 кг или более на гектар.As is well known to the person skilled in the art, the pesticidal concentration can vary widely depending on the nature of the particular composition, in particular on whether it will be a concentrate or will be used directly. The pesticide may be present in at least 1% by weight and may comprise 100% by weight of the composition. Dry compositions may contain a pesticide in an amount of from about 1 to 95% by weight, while liquid compositions may typically contain from about 1 to 60% by weight of solids in the liquid phase. Compositions, as a rule, may contain from about 10 2 to 10 4 cells / mg These formulations are used in an amount from about 50 mg (in liquid or dry form) to 1 kg or more per hectare.
Составы могут наноситься на среду обитания чешуекрылого насекомого-вредителя, например на листву или на почву, путем орошения, опыления, обрызгивания и т.п.The compositions can be applied to the habitat of the lepidopteran insect pest, for example, foliage or soil, by irrigation, pollination, spraying, etc.
Трансформация растений. Предпочтительным рекомбинантным хозяином для продуцирования обладающих инсектицидным действием белков по изобретению является трансформированное растение. Гены, кодирующие белки Bt токсина, как это раскрыто в настоящем документе, могут быть введены в клетки растения множеством различных методов, которые хорошо известны в данной области техники. Например, для подготовки к введению чужеродных генов в высшие растения доступно множество клонирующих векторов, содержащих репликационную систему Escherichia coli и маркер, который обеспечивает возможность отбора трансформированных клеток. В число таких векторов входят, помимо прочих, pBR322, pUC серия, M13mp серия и pACYC184. Соответственно, фрагмент ДНК, содержащий последовательность, кодирующую белок Bt токсина, может быть вставлен в вектор в подходящем сайте рестрикции. Полученная в результате плазмида используется для трансформации в E. coli. Клетки E. coli культивируют в подходящей питательной среде, затем собирают и лизируют. Плазмиды выделяют. В качестве способов анализа обычно используют секвенирование, рестрикционный анализ, электрофорез и другие биохимические и молекулярно-биологические способы. После каждой операции использованная ДНК-последовательность может быть отщеплена и присоединена к следующей ДНК-последовательности. Каждая плазмидная последовательность может быть клонирована в тех же или других плазмидах. В зависимости от способа введения в растение желаемых генов также могут быть необходимы другие ДНК-последовательности. Например, если для трансформации клетки растения используются плазмиды Ti или Ri, то по меньшей мере правый конец, а часто как правый, так и левый концы Ti или Ri плазмидной Т-ДНК, должны быть присоединены в качестве фланкирующих областей предназначенных для вставки генов. Использование Т-ДНК для трансформации клеток растений подробно исследовано и исчерпывающе раскрыто в EP 120516, Lee and Gelvin (2008), Hoekema (1985), Fraley et al, (1986) and An et al., (1985) и является хорошо известным в данной области техники. Transformation of plants . A preferred recombinant host for the production of the insecticidal proteins of the invention is a transformed plant. Genes encoding Bt toxin proteins, as disclosed herein, can be introduced into plant cells by a variety of different methods that are well known in the art. For example, to prepare for the introduction of foreign genes into higher plants, many cloning vectors are available that contain the Escherichia coli replication system and a marker that allows the selection of transformed cells. These vectors include, but are not limited to, the pBR322, pUC series, M13mp series, and pACYC184. Accordingly, a DNA fragment containing a sequence encoding a Bt toxin protein can be inserted into a vector at a suitable restriction site. The resulting plasmid is used for transformation into E. coli. E. coli cells are cultured in a suitable culture medium, then harvested and lysed. Plasmids secrete. As methods of analysis, sequencing, restriction analysis, electrophoresis, and other biochemical and molecular biological methods are usually used. After each operation, the used DNA sequence can be cleaved and attached to the next DNA sequence. Each plasmid sequence can be cloned in the same or different plasmids. Other DNA sequences may also be necessary, depending on how the desired genes are introduced into the plant. For example, if plasmids Ti or Ri are used to transform plant cells, then at least the right end, and often both the right and left ends of the Ti or Ri of plasmid T-DNA, should be attached as flanking regions for insertion of genes. The use of T-DNA for transforming plant cells has been extensively studied and exhaustively disclosed in EP 120516, Lee and Gelvin (2008), Hoekema (1985), Fraley et al, (1986) and An et al., (1985) and is well known in this technical field.
После того как введенная ДНК интегрируется в геном растения, она становится относительно стабильной. Трансформационный вектор обычно содержит обеспечивающий возможность отбора маркер, который обеспечивает устойчивость трансформированной клетки растения к биоциду или антибиотику, такому как, например, Биалафос, Канамицин, G418, Блеомицин или Гигромицин. Отдельно используемый маркер должен, соответственно, обеспечивать отбор трансформированных клеток, а не тех клеток, которые не содержат вводимую ДНК.After the introduced DNA is integrated into the genome of the plant, it becomes relatively stable. The transformation vector typically contains a selectable marker that provides resistance to the transformed plant cell to a biocide or antibiotic, such as, for example, Bialafos, Kanamycin, G418, Bleomycin or Hygromycin. A separately used marker should, accordingly, provide for the selection of transformed cells, and not of those cells that do not contain the introduced DNA.
Существует множество способов введения ДНК в растительную клетку-хозяина. Эти способы включают трансформацию с помощью Т-ДНК, используя Agrobacterium tumefaciens или Agrobacterium rhizogenes в качестве трансформирующего агента, слияние, инъекцию, биолистику (бомбардировку микрочастицами) или электорпорацию, а также другие возможные способы. Если для трансформации используются Agrobacteria, предназначенная для введения ДНК должна быть клонирована в специальные плазмиды, а именно, либо в промежуточный вектор, либо в бинарный вектор. Промежуточные вектора могут быть встроены в Ti или Ri плазмиду методом гомологичной рекомбинации благодаря последовательностям, которые гомологичны последовательностям в Т-ДНК. Ti или Ri плазмиды также сдержат vir-область, необходимую для переноса Т-ДНК. Промежуточные вектора не могут самореплицироваться в Agrobacteria. Промежуточный вектор может быть перенесен в Agrobacterium tumefaciens с помощью плазмиды-хелпера (конъюгация). Бинарные вектора могут самореплицироваться как в E. coli, так и в Agrobacteria. Они содержат ген маркера селекции и линкер или полилинкер, который ограничен областями правой и левой границ Т-ДНК. Они могут быть трансформированы непосредственно в Agrobacteria (Holsters et ah, 1978). Agrobacteria, используемые в качестве клеток-хозяев, должны содержать плазмиду, несущую vir-область. Vir-область необходима для переноса Т-ДНК в клетку растения. Также могут содержаться дополнительные Т-ДНК. Трансформированные таким образом бактерии используются для трансформации клеток растения. Для переноса ДНК в клетку растения растительные эксплантанты можно преимущественно культивировать с Agrobacterium tumefaciens или Agrobacterium rhizogenes. Затем из инфицированного растительного материала (например, частей листьев, сегментов стебля, корней, а также из протопластов или клеток, культивированных в суспензии) в подходящей среде, которая может содержать антибиотики или биоциды для селекции, может быть регенерировано целое растение. Полученные таким образом растения затем могут быть исследованы на наличие внедренной ДНК. В случае инъекции или электропорации к плазмидам не предъявляется никаких дополнительных требований. Возможно использование обычных плазмид, таких как, например, производные от pUC.There are many methods for introducing DNA into a plant host cell. These methods include T-DNA transformation using Agrobacterium tumefaciens or Agrobacterium rhizogenes as a transforming agent, fusion, injection, biolystics (microparticle bombardment) or electroporation, as well as other possible methods. If Agrobacteria is used for transformation, the DNA to be introduced must be cloned into special plasmids, namely, either an intermediate vector or a binary vector. Intermediate vectors can be inserted into a Ti or Ri plasmid by homologous recombination due to sequences that are homologous to sequences in T-DNA. Ti or Ri plasmids also contain the vir region necessary for T-DNA transfer. Intermediate vectors cannot self-replicate in Agrobacteria. The intermediate vector can be transferred to Agrobacterium tumefaciens using a helper plasmid (conjugation). Binary vectors can self-replicate in both E. coli and Agrobacteria. They contain a selection marker gene and a linker or polylinker, which is limited to the regions of the right and left borders of T-DNA. They can be transformed directly into Agrobacteria (Holsters et ah, 1978). Agrobacteria used as host cells must contain a plasmid carrying the vir region. The Vir region is necessary for the transfer of T-DNA into the plant cell. Additional T-DNAs may also be contained. The bacteria transformed in this way are used to transform plant cells. To transfer DNA into a plant cell, plant explants can be predominantly cultured with Agrobacterium tumefaciens or Agrobacterium rhizogenes. Then, from the infected plant material (for example, parts of leaves, segments of the stem, roots, and also from protoplasts or cells cultured in suspension) in a suitable medium, which may contain antibiotics or biocides for selection, the whole plant can be regenerated. The plants thus obtained can then be examined for the presence of embedded DNA. In case of injection or electroporation, no additional requirements are imposed on the plasmids. You can use conventional plasmids, such as, for example, derivatives of pUC.
Трансформированные клетки растут в растениях обычным образом. Они могут формировать зародышевые клетки и передавать трансформированный признак(и) растениям-потомкам. Такие растения можно выращивать обычным способом и скрещивать с растениями, которые имеют такие же трансформированные наследственные факторы или другие наследственные факторы. Полученные в результате гибридные особи обладают соответствующими фенотипическими свойствами.Transformed cells grow in plants in the usual way. They can form germ cells and transmit the transformed trait (s) to descendant plants. Such plants can be grown in the usual way and crossed with plants that have the same transformed hereditary factors or other hereditary factors. The resulting hybrid individuals have corresponding phenotypic properties.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, растения трансформируют генами, в которых использование кодона оптимизировано для растений. См., например, патент США № 5380831, включенный в настоящий документ в виде ссылки. Хотя в настоящем документе в качестве примеров приведены укороченные токсины, в области использования Bt хорошо известно, что 130 кДа (полноразмерные) токсины имеют N-концевую половину, которая является ядром токсина, и С-концевую половину, которая представляет собой “хвост” протоксина. Таким образом, с укороченными/ядерными токсинами по настоящему изобретения можно использовать подходящие “хвосты”. См., например, патент США № 6218188 и патент США № 6673990. Помимо этого, способы создания синтетических Bt генов для использования в растениях известны в данной области техники (Stewart and Burgin, 2007). Одним из неограничивающих примеров трансформированного растения является плодоносное растение маиса, содержащее экспрессируемый растением ген, кодирующий белок Vip3Ab, и дополнительно содержащее экспрессируемый растением ген, кодирующий белок Cry1Ca.In a preferred embodiment of the present invention, the plants are transformed with genes in which the use of the codon is optimized for plants. See, for example, US patent No. 5380831, incorporated herein by reference. Although truncated toxins are given as examples in the field of use of Bt, it is well known that 130 kDa (full-sized) toxins have an N-terminal half, which is the nucleus of the toxin, and a C-terminal half, which is the “tail” of the protoxin. Thus, with the shortened / nuclear toxins of the present invention, suitable “tails” can be used. See, for example, US patent No. 6218188 and US patent No. 6673990. In addition, methods for creating synthetic Bt genes for use in plants are known in the art (Stewart and Burgin, 2007). One non-limiting example of a transformed plant is a fruitful maize plant containing a plant expressed gene encoding a Vip3Ab protein and further comprising a plant expressed gene encoding a Cry1Ca protein.
Перенос (или интрогрессия) признака(ов) определяемого Vip3Ab и Cry1Ca в инбредные линии маиса может достигаться путем выведения растений на основе рекуррентного отбора, например, путем обратного скрещивания. В этом случае, желаемый рекуррентный родитель сначала скрещивается с донорной инбредной особью (нерекуррентным родителем), несущей подходящий ген(ы) для признаков, определяемых Vip3Ab и Cry1C. Затем потомство от этого обратного скрещивания спаривают с рекуррентным родителем с последующим отбором полученного потомства по желаемому признаку(ам), который должен быть перенесен от нерекуррентного родителя. После трех, предпочтительно, четырех, более предпочтительно, пяти или более поколений полученных методом обратного скрещивания с рекуррентным родителем в результате отбора по желаемому признаку(ам), потомство становится гетерозиготным по локусу, контролирующему переносимый признак(и), но остается подобным рекуррентному родителю по большинству или почти по всем остальным генам (см., например, Poehlman & Sleper (1995) Breeding Field Crops, 4th Ed., 172-175; Fehr (1987) Principles of Cultivar Development, Vol. 1: Theory and Technique, 360-376). Transfer (or introgression) of the trait (s) determined by Vip3Ab and Cry1Ca to maize inbred lines can be achieved by breeding plants based on recurrent selection, for example, by backcrossing. In this case, the desired recurrent parent first crosses with the donor inbred individual (non-recurrent parent) carrying the appropriate gene (s) for the traits identified by Vip3Ab and Cry1C. Then the offspring from this backcross is mated with a recurrent parent, followed by selection of the resulting offspring according to the desired trait (s), which must be transferred from the non-recurrent parent. After three, preferably four, more preferably five or more generations obtained by the method of backcrossing with a recurrent parent as a result of selection by the desired trait (s), the offspring becomes heterozygous at the locus that controls the transferred trait (s), but remains similar to the recurrent parent in most or almost all other genes (see, for example, Poehlman & Sleper (1995) Breeding Field Crops, 4th Ed., 172-175; Fehr (1987) Principles of Cultivar Development, Vol. 1: Theory and Technique, 360- 376).
Стратегии управления устойчивостью насекомых (IRM). Например, Roush et al. описывает стратегии с двумя токсинами, что также называется созданием “пирамид” или “пакетов”, для управления трансгенными растениями, обладающими инсектицидными свойствами. (The Royal Society. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. (1998) 353, 1777-1786). Insect Resilience Management Strategies (IRM) . For example, Roush et al. describes strategies with two toxins, which is also called the creation of “pyramids” or “packages” for the management of transgenic plants with insecticidal properties. (The Royal Society. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. (1998) 353, 1777-1786).
На другом веб-сайте Агентство США по защите окружающей среды (epa.gov/oppbppdl/biopesticides/pips/bt_corn_refuge_2006.htm) опубликовало следующие требования для обеспечения нетрансгенных (т.е. не содержащих Bt генов) убежищ (раздел зерновые культуры/кукуруза, не содержащие Bt генов) для использования с трансгенными зерновыми культурами, продуцирующими один Bt белок, активный по отношению к целевым насекомым-вредителям. “Конкретные структурированные требования к кукурузе, защищенной от кукурузного мотылька белками Bt (Cry1Ab или Cry1F) являются следующими:The U.S. Environmental Protection Agency (epa.gov/oppbppdl/biopesticides/pips/bt_corn_refuge_2006.htm) has published the following requirements for non-transgenic (i.e., Bt-free) shelters (cereal / corn section, on another website) not containing Bt genes) for use with transgenic crops producing one Bt protein that is active against target insect pests. “The specific structured requirements for corn protected from corn moths by Bt proteins (Cry1Ab or Cry1F) are as follows:
Структурированные убежища:Structured Refuges:
20% убежище из кукурузы, не имеющей Bt защиты от чешуекрылых в областях, где кукуруза является основной культурой;20% shelter from maize without Bt protection against Lepidoptera in areas where maize is the main crop;
50% убежище из растений, не имеющих Bt защиты от чешуекрылых, в областях, где хлопок является основной культурой.50% shelter from plants that do not have Bt protection against Lepidoptera, in areas where cotton is the main crop.
Блоки:Blocks:
Внутренние (т.е. внутри Bt поля).Internal (i.e. inside Bt fields).
Внешние (т.е. отдельные поля в пределах 1/2 мили (1/4 мили, если возможно) от Bt поля для обеспечения максимального объема случайного спаривания).External (i.e. separate fields within 1/2 mile (1/4 mile, if possible) of the Bt field to ensure maximum random pairing).
Расположенные на поле полосыStripes located on the field
Полосы должны иметь по меньшей мере 4 ряда в ширину (предпочтительно 6 рядов) для уменьшения эффекта «перемещения личинок».The strips should have at least 4 rows wide (preferably 6 rows) to reduce the effect of “larval movement”.
Помимо этого, Национальная Ассоциация Производителей Кукурузы на своем веб-сайте (ncga.com/insect-resistance-management-fact-sheet-bt-corn) также представила похожие рекомендации в отношении требований на убежища. Например:In addition, the National Corn Producers Association, on its website (ncga.com/insect-resistance-management-fact-sheet-bt-corn), also provided similar recommendations regarding asylum requirements. For example:
“Требования в отношении IRM для мотылька кукурузного:“IRM requirements for a corn moth:
- засевать по меньшей мере 20% от площади посева кукурузы под гибриды-убежища.- sow at least 20% of the corn sown area for refuge hybrids.
- В регионах, выращивающих хлопок, убежища должны составлять 50%.- In regions growing cotton, shelters should be 50%.
- Посевы необходимо высаживать в пределах 1/2 мили от гибридов-убежищ.- Crops must be planted within 1/2 mile of the hybrids of refuge.
- Убежища можно засевать в виде полос внутри Bt поля; полосы-убежища должны составлять по меньшей мере 4 ряда в ширину.- Shelters can be sown in the form of strips inside the Bt field; shelter strips should be at least 4 rows wide.
- Убежища могут обрабатываться обычными пестицидами только в случае достижения экономического порога, достигаемого для целевого насекомого.- Shelters can be treated with conventional pesticides only if the economic threshold reached for the target insect is reached.
- Основанные на Bt распыляемые инсектициды нельзя использовать в отношении кукурузы-убежища.- Bt-based sprayable insecticides cannot be used on shelter corn.
- Подходящие убежища необходимо высаживать на каждой ферме с Bt кукурузой”.“Suitable shelters must be planted on every Bt corn farm.”
Как указано у Roush et al. (например, на стр. 1780 и 1784, правая колонка), создание пакетов или пирамид из двух различных белков, каждый из которых является активным в отношении целевого насекомого-вредителя, и с малой или без перекрестной устойчивости может обеспечивать возможность использования меньших убежищ. Roush указывает, что для успешно разработанного пакета размер убежища менее чем 10% может обеспечить эффект по управлению устойчивостью, сопоставимый с 50% убежищем для одиночного (на организованного в виде пирамиды) признака. Для доступных в настоящее время Bt продуктов кукурузы Агентство Защиты Окружающей Среды США требует существенно меньшего объема (обычно 5%) высаженных структурированных убежищ кукурузы, не содержащей Bt гены, чем в случае продуктов с единственным признаком (обычно 20%).As indicated by Roush et al. (for example, on pages 1780 and 1784, right column), the creation of packages or pyramids of two different proteins, each of which is active against the target insect pest, and with little or no cross-resistance can provide the possibility of using smaller shelters. Roush points out that for a successfully developed package, a shelter size of less than 10% can provide a sustainability management effect comparable to a 50% shelter for a single (on a pyramid organized) trait. For currently available Bt corn products, the U.S. Environmental Protection Agency requires substantially less (usually 5%) planted structured shelters for Bt-free maize than with single-tag products (usually 20%).
Существуют различные способы обеспечения IRM эффектов убежищ, включая различные геометрические паттерны посадок на полях (как уже упоминалось выше) и смешивание семян перед посевом как обсуждалось у Roush et al. (см. выше) и в патенте США № 6551962.There are various ways to provide the IRM effects of shelters, including various geometric patterns of field planting (as mentioned above) and mixing the seeds before sowing as discussed by Roush et al. (see above) and in US patent No. 6551962.
Приведенные выше процентные соотношения или близкие к ним соотношения убежищ могут использоваться для рассматриваемых двойных и тройных пакетов или пирамид. Для тройных пакетов и тремя местами действия на одного целевого насекомого-вредителя целевым значением является нулевая площадь убежища (или убежище с площадью, например, менее 5%). Это в особенности верно для коммерческих посевных площадей, например, более чем 10 акров.The percentages given above or the ratios of shelters close to them can be used for the considered double and triple packages or pyramids. For triple packets and three places of action per target insect pest, the target value is zero shelter area (or shelter with an area of, for example, less than 5%). This is especially true for commercial sown areas, such as over 10 acres.
Все патенты, заявки на патент, предварительные заявки и публикации, на которые приведены ссылки или которые цитируются в настоящем документе, включены в виде ссылки во всей своей полноте в той части, в которой они не противоречат сведениям, в явном виде приводимым в настоящем описании.All patents, patent applications, provisional applications and publications referenced or cited herein are incorporated by reference in their entirety to the extent that they do not contradict the information explicitly provided in the present description.
За исключением случаев, когда это специально оговорено или следует из контекста, грамматические формы единственного числа следует понимать как означающие “по меньшей мере один”.Unless otherwise expressly stated or as the context requires, the singular grammatical forms should be understood as meaning “at least one”.
Ниже приведены примеры, которые иллюстрируют способы осуществления изобретения.The following are examples that illustrate the methods of carrying out the invention.
Эти примеры не следует рассматривать в качестве ограничивающих. Все процентные соотношения указаны по массе, а соотношения в растворах указаны по объему. Все температуры указаны в градусах Цельсия.These examples should not be construed as limiting. All percentages are by weight, and ratios in solutions are by volume. All temperatures are in degrees Celsius.
ПРИМЕРЫEXAMPLES
Пример 1 - Получение и обработка трипсином белков Vip3Ab и Cry1CaExample 1 - Preparation and trypsin treatment of Vip3Ab and Cry1Ca proteins
Гены, кодирующие протоксины Cry1Ca и Vip3Ab1 экспрессировали в экспрессирующих штаммах Pseudomonas fluorescens, и белки полной длины выделяли в виде нерастворимых внутриклеточных телец. Промытые внутриклеточные тельца солюбилизировали перемешиванием при 37°C в буфере, содержащем 20 мМ CAPS буфера, pH 11, дополненном 10 мМ DDT и, 0,1% 2-меркаптоэтанолом, в течение 2 часов. Раствор центрифугировали при 27000x g в течение 10 минут при 37°C, супернатант обрабатывали 0,5% (вес./об.) TCPK-обработанным трипсином (Sigma). Этот раствор инкубировали при одновременном перемешивании в течение 1 часа при комнатной температуре, фильтровали, затем загружали в колонку Pharmacia Mono Q 1010, уравновешенную 20 мМ CAPS, pH 10,5. После промывки заряженной колонки буфером в количестве 2-х объемов колонки укороченный токсин элюировали, используя линейный градиент 0-0,5 M NaCl в 20 мМ CAPS в количестве 15-ти объемов колонки со скоростью потока 1,0 мл/мин. Очищенные Cry белки, укороченные трипсином, элюировали, используя примерно 0,2-0,3 M NaCl. Чистоту белков оценивали ДСН-ПААГ электрофорезом и визуализировали с помощью красителя Кумасси бриллиантового синего. В некоторых случаях объединенные фракции очищенного токсина концентрировали и загружали в колонку с Сефарозой 6 (диаметром 1,6 см, длиной 60 см) и очищали гель-хроматографией. Фракции, содержащие один пик, соответствующий молекулярному весу мономера, объединяли и концентрировали, получая препарат, гомологичный более чем на 95% белку с молекулярным весом примерно 60000 кДа.Genes encoding Cry1Ca and Vip3Ab1 protoxin expressed in strains expressing Pseudomonas fluorescens, and the full-length protein isolated as insoluble inclusion bodies. The washed intracellular bodies were solubilized by stirring at 37 ° C in a buffer containing 20 mM CAPS buffer,
Обработку Vip3Ab1 проводили аналогичным образом, взяв в качестве исходного белка очищенный 85 кДа белок полной длины (DIG-307). Белок (12 мг) диализовали в 50 мМ натрий фосфатного буфера, pH 8,4, затем обрабатывали путем добавления 1 мг твердого трипсина и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. Раствор загружали в MonoQ анионно-обменную колонку (диаметром 1 см, длиной 10 см) и элюировали, используя линейный градиент 0-500 мМ NaCl в 20 мМ натрий фосфатном буфере, pH 8,4, в количестве, равном 7-ми объемам колонки. Элюирование белка контролировали ДСН-ПААГ электрофорезом. Основная обработанная полоса имела молекулярный вес 65 кДа, определенный методом ДСН-ПААГ электрофореза с использованием для сравнения стандартов молекулярного веса.The Vip3Ab1 treatment was carried out in a similar manner, taking the purified full-
Пример 2 - Йодирование Cry1Ca белка ядра токсинаExample 2 - Iodination of Cry1Ca Toxin Core Protein
Предыдущая работа показала, что Cry1Ca трудно поддается введению радиоактивной метки с использованием традиционных способов, хотя в некоторых особых случаях он может быть снабжен радиоактивной меткой и хорошо работать в анализе связывания с рецептором. Для введения радиоактивной метки в Cry1Ca было решено использовать метод с использованием 125I-меченного флуоресцеин-5-малеимида, который успешно работал при мечении Cry1Fa (Prov. 69919). Йодирование флуоресцеин-5-малеимида и последующая конъюгация этого радиоактивно меченного химического вещества с Cry1Ca обеспечили цистеин-специфическое мечение белка. Такая процедура введения радиоактивной метки является высоко специфичной по отношению к предназначенным для мечения остаткам. Сегмент Cry1Ca ядра токсина (остатки 29-619) содержит два аминокислотных цистеиновых остатка в положениях 210 и 438. Palmer et al. (1997) показал, что фенильное кольцо флуоресцеин-5-малеимида может быть йодировано с помощью радиоактивного йода. Затем йодированный флуоресцеин-5-малеимид может реагировать с белками, содержащими сульфгидрильные группы (что обеспечивается, например, свободными цистеиновыми остатками), путем алкилирования свободных цистеинов в белке, и таким образом образуя радиоактивно меченный белок. Укороченное трипсином ядро токсина Cry1Ca содержит два цистеиновых остатка и таким образом обеспечивает субстрат для алкилирования и введения радиоактивной метки в этих двух (специфических) участках белка.Previous work has shown that Cry1Ca is difficult to introduce a radioactive label using traditional methods, although in some special cases it can be labeled with a radioactive label and work well in the analysis of binding to the receptor. To introduce a radioactive label into Cry1Ca, it was decided to use the method using 125 I-labeled fluorescein-5-maleimide, which worked successfully with Cry1Fa labeling (Prov. 69919). The iodination of fluorescein-5-maleimide and the subsequent conjugation of this radiolabeled chemical with Cry1Ca provided cysteine-specific labeling of the protein. This procedure for introducing a radioactive label is highly specific with respect to the residues intended for labeling. The Cry1Ca segment of the toxin core (residues 29-619) contains two amino acid cysteine residues at
Флуоресцеин-5-малеимид (F5-M) растворяли в 10 мМ ДМСО (диметилсульфоксид), затем разводили до концентрации 1 мМ забуференным фосфатом рассолом (PBS; 20 мМ фосфат натрия, 0,15 М NaCl, pH 7,5), которую определяли по коэффициенту молярной экстинкции F 5-M (68000 М-1см-1). К 100 мкл раствора PBS, содержащего две гранулы Pierce для йодирования (Thermo Fisher Scientific), добавляли 1,0 мКи Na125I за свинцовым экраном. Реакцию между компонентами проводили в течение 5 минут при комнатной температуре, затем в этот раствор добавляли 10 мкл 1 мМ раствора F 5-M. После проведения реакции йодирования в течение 10 мин удаляли раствор с помощью пипетки, и к раствору добавляли 2 мкг укороченного трипсином Cry1Ca белка ядра токсина высокой чистоты в PBS. Белок инкубировали при 4°С с раствором йодированного F 5-M в течение 48 часов, затем реакцию останавливали добавлением β-меркаптоэтанола до получения конечной концентрации, равной 14 мМ. Реакционную смесь вводили в центрифужную колонку Zeba™ (Invitrogen), уравновешенную 20 мМ CAPS, 150 мМ KCl, pH 9, и центрифугировали при 1500x g в течение 2 мин для отделения непрореагировавшего йодированного красителя от белка. 125I-меченный флуоресцеин-Cry1Ca белок ядра токсина измеряли на гамма-счетчике для определения удельной радиоактивности, исходя из предположения, что было извлечено 80% полученного белка токсина.Fluorescein-5-maleimide (F5-M) was dissolved in 10 mM DMSO (dimethyl sulfoxide), then diluted to a concentration of 1 mM phosphate-buffered brine (PBS; 20 mM sodium phosphate, 0.15 M NaCl, pH 7.5), which was determined molar extinction coefficient for 5 F-M (68000 M -1 cm -1). To 100 μl of PBS solution containing two Pierce iodination pellets (Thermo Fisher Scientific), 1.0 mCi of Na 125 I was added behind a lead screen. The reaction between the components was carried out for 5 minutes at room temperature, then 10 μl of a 1 mM F 5-M solution was added to this solution. After the iodination reaction was carried out for 10 min, the solution was removed using a pipette, and 2 μg of trypsin-shortened Cry1Ca protein of high purity toxin core in PBS was added to the solution. The protein was incubated at 4 ° C with a solution of iodinated F 5-M for 48 hours, then the reaction was stopped by the addition of β-mercaptoethanol to obtain a final concentration of 14 mM. The reaction mixture was introduced into a Zeba ™ centrifuge column (Invitrogen), equilibrated with 20 mM CAPS, 150 mM KCl,
Удельная активность радиоактивно меченного Cry1Ca белка ядра токсина составила примерно 6,8 мкКи/мкг белка. Радиоактивно меченный белок также анализировали ДСН-ПААГ электрофорезом и визуализировали методом получения изображения с использованием люминесцентного состава для подтверждения того, что измеренная радиоактивность является ковалентно связанной с CrylCa белком ядра токсина. Окрашенные Кумасси ДСН-ПААГ гели SDS-PAGE визуализировали путем обертывания их пленкой Mylar™ (толщиной 12 мкм) и экспонирования под люминесцентным экраном Molecular Dynamics (Sunnyvale, CA) (35 см × 43 см) с длительным послесвечением в течение 1 часа. Пластины проявляли в люминесцентном устройстве визуализации Molecular Dynamics Storm 820, и изображения анализировали с помощью программного обеспечения ImageQuant™. Небольшая радиоактивность была зарегистрирована в области геля, расположенной сильно ниже полосы Cry1Ca белка ядра токсина (т.е., фрагментов, которые были по размеру меньше Cry1Ca белка ядра токсина на примерно 10 кДа и более). Эти радиоактивные вещества, видимо, представляли собой небольшие пептиды, возможно, ассоциированные с укороченным Cry1Ca белком вследствие воздействия трипсина, использованного для расщепления белка до его ядерной структуры.The specific activity of the radioactively labeled Cry1Ca toxin core protein was approximately 6.8 μCi / μg protein. Radioactively labeled protein was also analyzed by SDS-PAGE by electrophoresis and visualized by imaging using a luminescent composition to confirm that the measured radioactivity is covalently linked to the CrylCa toxin core protein. Coomassie-stained SDS-PAGE SDS-PAGE gels were visualized by wrapping them with Mylar ™ film (12 μm thick) and exposure under a Molecular Dynamics (Sunnyvale, CA) fluorescent screen (35 cm × 43 cm) with a long afterglow for 1 hour. Plates were developed in a Molecular Dynamics Storm 820 luminescent imaging device, and images were analyzed using ImageQuant ™ software. Little radioactivity was detected in the gel region, located well below the Cry1Ca band of the toxin core protein (i.e., fragments that were about 10 kDa or more smaller than the Cry1Ca toxin core protein). These radioactive substances were probably small peptides, possibly associated with a shortened Cry1Ca protein due to the trypsin used to break down the protein to its nuclear structure.
Пример 3 - Сравнительный анализ связывания BBMV, выделенного из S. frugiperda, с белками ядра токсина Cry1Ca и Vip3AbExample 3 - Comparative analysis of the binding of BBMV isolated from S. frugiperda, with the core proteins of the toxin Cry1Ca and Vip3Ab
Анализ конкурентного гомологичного и гетерологичного связывания выполняли, используя 150 мкг/мл BBMV белка и 2 нМ 125I-меченного Cry1Ca белка ядра токсина. Концентрации гомологичного конкурентного немеченного Cry1Ca белка ядра токсина, добавленного к реакционной смеси, составляли 0,1, 1, 10, 100 и 1000 нМ. Гетерологичный укороченный трипсином Vip3Ab белок исследовали при концентрациях 10 и 1000 нМ, и белки добавляли одновременно с радиоактивным Cry1Ca белком ядра токсина для гарантии наличия истинной конкуренции за связывание. Инкубацию проводили в течение 1 часа при 28°С, и 125I-меченный Cry1Ca белок ядра токсина, несвязанный с BBMV (т.е., не связанного с рецепторным белком насекомых), отделяли от связанного белка центрифугированием смеси BBMV при 16000x g в течение 8 мин и отделением супернатанта от полученного осадка. Осадок промывали три раза охлажденным льдом буфером для связывания (PBS; 11,9 мМ Na2HP04, 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, pH 7,4 плюс 0,1% бычий сывороточный альбумин; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) для полного удаления любого несвязанного 125I-меченного Cry1Ca. Дно центрифужной пробирки с находящимся в нем осадком отрезали и помещали в 13×100 мм стеклянную культуральную пробирку, и с помощью гамма-счетчиков подсчитывали события в течение 10 минут для получения количества связанной радиоактивности, содержащейся в осадочной фракции. Количество радиоактивности во фракции связанного белка является показателем количества белка Cry, связанного с рецептором насекомого (общее связывание). Неспецифическое связывание было представлено количеством событий, полученным в осадке в присутствии 1000 нМ немеченного Cry1Ca белка ядра токсина. Количество меченного Cry1Ca, специфически связанного с BBMV (специфическое связывание), получали вычитанием величины неспецифического связывания из величины общего связывания. Считалось, что сто процентов общего связывания представляет собой величину связывания при отсутствии любого конкурентного Cry1Fa белка ядра токсина. Данные выражены в процентах специфического связывания 125I Cry1Ca в зависимости от концентрации конкурирующего немеченного лиганда.Analysis of homologous and heterologous competition binding was performed using 150 ug / ml BBMV protein and 2 nM 125 I-labeled nucleus Cry1Ca protein toxin. The concentrations of the homologous competitive unlabeled Cry1Ca toxin core protein added to the reaction mixture were 0.1, 1, 10, 100 and 1000 nM. A heterologous trypsin-shortened Vip3Ab protein was tested at concentrations of 10 and 1000 nM, and proteins were added simultaneously with the radioactive Cry1Ca toxin core protein to ensure true competition for binding. Incubation was performed for 1 hour at 28 ° C, and the 125 I-labeled Cry1Ca toxin core protein unbound with BBMV (i.e., not bound to insect receptor protein) was separated from the bound protein by centrifuging the BBMV mixture at 16000x g for 8 min and separating the supernatant from the resulting precipitate. The precipitate was washed three times with ice-cold binding buffer (PBS; 11.9 mM Na 2 HP0 4 , 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, pH 7.4 plus 0.1% bovine serum albumin; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) to completely remove any unbound 125 I-labeled Cry1Ca. The bottom of the centrifuge tube with the sediment in it was cut off and placed in a 13 × 100 mm glass culture tube, and events were counted using gamma counters for 10 minutes to obtain the amount of bound radioactivity contained in the sediment fraction. The amount of radioactivity in the bound protein fraction is an indication of the amount of Cry protein bound to the insect receptor (total binding). Nonspecific binding was represented by the number of events obtained in the sediment in the presence of 1000 nM unlabeled Cry1Ca toxin core protein. The amount of labeled Cry1Ca specifically bound to BBMV (specific binding) was obtained by subtracting the nonspecific binding value from the total binding value. One hundred percent of total binding was believed to be the amount of binding in the absence of any competitive Cry1Fa toxin core protein. Data are expressed as percent specific binding of 125 I Cry1Ca depending on the concentration of a competing unlabeled ligand.
Пример 4 - Краткий обзор результатовExample 4 — Summary of Results
Результаты (Фиг. 1) демонстрируют, что гомологичный немеченный Cry1Ca белок эффективно замещает радиоактивно меченный Cry1Ca белок ядра токсина при специфическом связывании с BBMV белком, причем это замещение зависит от дозы. Vip3Ab не замещает связанный 125I-меченный CrylCa белок ядра токсина из рецепторного белка(ов) при обоих показанных концентрациях (10 или 1000 нМ). Самая высокая исследованная концентрация Vip3Ab (1000 нМ) в 500 раз превышает концентрацию радиоактивно меченного Cry1Ca, использованного в анализе, демонстрируя, что Vip3Ab не конкурирует эффективно с радиоактивно меченным Cry1Ca за связывание с BBMV S. frugiperda.The results (Fig. 1) demonstrate that a homologous unlabeled Cry1Ca protein effectively replaces the radioactively labeled Cry1Ca toxin core protein upon specific binding to the BBMV protein, this substitution being dose dependent. Vip3Ab does not replace the bound 125 I-labeled CrylCa toxin core protein from the receptor protein (s) at both concentrations indicated (10 or 1000 nM). The highest studied concentration of Vip3Ab (1000 nM) is 500 times higher than the concentration of radiolabeled Cry1Ca used in the assay, demonstrating that Vip3Ab does not compete effectively with radiolabeled Cry1Ca for binding to S. frugiperda BBMV.
Фиг.1 представляет собой кривую доза-ответ для замещения 125I-меченного флуоресцеин-5-малеимид укороченного трипсином Cry1Ca в BBMV, выделенном из личинки S. frugiperda (FAW). Эта фигура показывает, что немеченный Cry1Ca (●) способен замещать меченный Cry1Ca в зависимости от дозы в диапазоне от 0,1 до 1000 нМ. На графике показана процентная доля специфически связанного меченного Cry1Ca (общее связывание минус неспецифическое связывание) в зависимости от концентрации добавленных лигандов без радиоактивной метки. Показана неспособность Vip3Ab1 (▲) без радиоактивной метки замещать специфически связанный радиоактивно меченный Cry1Ca в концентрациях 10 и 1000 нМ.Figure 1 is a dose-response curve for the replacement of 125 I-labeled fluorescein-5-maleimide trypsin-shortened Cry1Ca in BBMV isolated from S. frugiperda larva (FAW). This figure shows that unlabeled Cry1Ca (●) is able to replace labeled Cry1Ca depending on the dose in the range from 0.1 to 1000 nM. The graph shows the percentage of specifically bound labeled Cry1Ca (total binding minus non-specific binding) depending on the concentration of added ligands without a radioactive label. The inability of Vip3Ab1 (▲) without a radioactive label to replace specifically bound radioactively labeled Cry1Ca at concentrations of 10 and 1000 nM was shown.
Список литературыBibliography
Claims (19)
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US28428109P | 2009-12-16 | 2009-12-16 | |
| US28427509P | 2009-12-16 | 2009-12-16 | |
| US61/284,281 | 2009-12-16 | ||
| US61/284,275 | 2009-12-16 | ||
| PCT/US2010/060835 WO2011084634A1 (en) | 2009-12-16 | 2010-12-16 | Use of vip3ab in combination with cry1ca for management of resistant insects |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2012129912A RU2012129912A (en) | 2014-01-27 |
| RU2575084C2 true RU2575084C2 (en) | 2016-02-10 |
Family
ID=
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2210593C2 (en) * | 1993-09-02 | 2003-08-20 | Новартис Аг | Fragment of hybrid toxin of bacillus thuringiensis eliciting insecticide activity, recombinant dna encoding its, method for insects control |
| WO2009132850A1 (en) * | 2008-05-01 | 2009-11-05 | Bayer Bioscience N.V. | Armyworm insect resistance management in transgenic plants |
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2210593C2 (en) * | 1993-09-02 | 2003-08-20 | Новартис Аг | Fragment of hybrid toxin of bacillus thuringiensis eliciting insecticide activity, recombinant dna encoding its, method for insects control |
| WO2009132850A1 (en) * | 2008-05-01 | 2009-11-05 | Bayer Bioscience N.V. | Armyworm insect resistance management in transgenic plants |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| PARDO-LOPEZ L. et al., Strategies to improve the insecticidal activity of Cry toxins from Bacillus thuringiensis, Peptides, 2009, Vol.30, N.3, pp. 589-595. HERNANDEZ-MARTINEZ, P. et.al, Broad-spectrum cross-resistance in Spodoptera exigua from selection with a marginally toxic Cry protein. Pesticide Management Science, 2009. 65, 645- 650. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2590592C2 (en) | USE OF Cry1Da COMBINED WITH Cry1Be FOR CONTROLLING INSECT RESISTANCE | |
| RU2603257C2 (en) | COMBINED APPLICATION OF PROTEINS Cry1Da AND Cry1Fa TO GENERATE INSECT RESISTANCE | |
| RU2596406C2 (en) | COMBINED USE OF CRY1Ca AND CRY1Ab PROTEINS TO CONTROL INSECT RESISTANCE | |
| KR101841297B1 (en) | Use of cry1ab in combination with cry1be for management of resistant insects | |
| RU2593961C2 (en) | COMBINED APPLICATION OF PROTEINS CRY1Ca AND CRY1Fa TO CONTROL RESISTANCE OF INSECTS | |
| RU2569108C2 (en) | APPLICATION OF Cry1Da IN COMBINATION WITH Cry1Ca FOR CONTROL OF RESISTANT INSECTS | |
| KR101841293B1 (en) | Use of vip3ab in combination with cry1ca for management of resistant insects | |
| RU2608500C2 (en) | COMBINED USE OF Vip3Ab AND Cry1Ab FOR MANAGEMENT OF RESISTANT INSECTS | |
| JP2016501511A (en) | Use of combined Cry1Ea for the management of resistant fall army worm insects | |
| RU2624031C2 (en) | Application of insecticidic crystalline protein dig3 in combination with cry1ab for regulation of stability to corn borer | |
| US20170298381A1 (en) | Combination of four vip and cry protein toxins for management of insect pests in plants | |
| US10119149B2 (en) | Use of DIG3 insecticidal crystal protein in combination with cry1Ab for management of resistance in european cornborer | |
| JP5913124B2 (en) | Combination of CRY1Fa and CRY1Ab proteins for control of Cry-resistant sugarcane borers and management of insect resistance in sugarcane | |
| RU2575084C2 (en) | APPLICATION OF Vip3Ab IN COMBINATION WITH Cry1Ca TO CONTROL RESISTANT INSECTS |