RU2391979C2 - 2-(3,4-DIHYDROXYPHENYL)-9-DIETHYLAMINOETHYLIMIDAZO[1,2-a]BENZIMIDAZOLE DIHYDROBROMIDE AND BASED ON IT PHARMACEUTICAL COMPOSITION - Google Patents

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: invention belongs to medicine, notably to pharmacology, and relates to applications of 2-(3,4-dihydroxyphenyl)-9-diethylaminoethylimidazo[1,2-a]benzimidazole dihydrobromide within manufacture of medication, possessing anti-ischemic, hemoreologic and anti-radical properties, and to pharmaceutical composition, possessing above mentioned properties.

EFFECT: agent possesses high activity and doesn't have intense side effects.

10 cl, 1 dwg, 18 tbl

Description

Предлагаемое изобретение относится к медицине, а именно к фармацевтической химии, фармакологии и технологии лекарственных форм, и направлено на создание лекарственного препарата с противоишемическими, гемореологическими и антирадикальными свойствами.The present invention relates to medicine, namely to pharmaceutical chemistry, pharmacology and technology of dosage forms, and is aimed at creating a drug with anti-ischemic, hemorheological and anti-radical properties.

Известно, что при ишемии ограничивается поступление кислорода и запускается каскад метаболических процессов, в которые вовлечена генерация свободных радикалов кислорода и азота (S.Love. Oxidative stress in brain ischemia. // Brain Pathology. - 1999. - Vol.9. - P.119-131), играющих ключевую роль при ишемических и, в особенности, реперфузионных поражениях (M.Fujimura, T.Tominaga, P.H.Chan. Neuroprotective effect of antioxidant in ischemic brain injury. // Neurocritical Care. - 2005. - Vol.2, №1. - P.59-66).It is known that with ischemia, oxygen supply is limited and a cascade of metabolic processes is triggered, in which the generation of free radicals of oxygen and nitrogen is involved (S. Love. Oxidative stress in brain ischemia. // Brain Pathology. - 1999. - Vol.9. - P. 119-131), which play a key role in ischemic and, in particular, reperfusion lesions (M. Fujimura, T. Tominaga, PHChan. Neuroprotective effect of antioxidant in ischemic brain injury. // Neurocritical Care. - 2005. - Vol.2 , No. 1. - P.59-66).

Одним из наиболее перспективных направлений фармакологической коррекции поражений мозга является применение нейропротекторов с разными механизмами действия, таких как «ловушки» свободных радикалов (СР), ингибиторы NO-синтазы и селенорганичекие соединения (Е.И.Гусев, В.И.Скворцова. Ишемия головного мозга. // - М.: Медицина, 2001). При этом, помимо использования для монотерапии, препараты, элиминирующие свободные радикалы, могут быть полезны в комбинации с другими терапевтическими подходами, в особенности, со средствами, восстанавливающими нарушенный кровоток, когда реперфузия вызывает массированное увеличение продукции СР (I.Margaill, M.Plotkine, D.Lerrouet. Antioxidant strategies in the treatment of stroke. // Free Rad. Biol. Med. - 2005. - Vol.39, №4. - 429-443).One of the most promising areas of pharmacological correction of brain lesions is the use of neuroprotectors with different mechanisms of action, such as “traps” of free radicals (SRs), NO synthase inhibitors, and organo-selenium compounds (E. I. Gusev, V. I. Skvortsova. Ischemia of the head brain. // - M .: Medicine, 2001). Moreover, in addition to the use for monotherapy, drugs that eliminate free radicals can be useful in combination with other therapeutic approaches, in particular, with drugs that restore impaired blood flow, when reperfusion causes a massive increase in the production of CP (I.Margaill, M.Plotkine, D. Lerrouet. Antioxidant strategies in the treatment of stroke. // Free Rad. Biol. Med. - 2005. - Vol. 39, No. 4. - 429-443).

Как правило, в лечении ишемических поражений используется сочетание нескольких препаратов, влияющих на основные патогенетические звенья ишемии. Поэтому в качестве препаратов сравнения при изучении противоишемических свойств был выбран кавинтон, нейропротективное действие которого опосредовано его сосудистыми и гемореологическими эффектами (Г.Н.Авакян, А.А.Никонов, Е.И.Чуканова. Кавинтон в эксперименте и клинической практике: Методические рекомендации. - М.: Медицина, 1998. - 55 с.), при исследовании антирадикальных и мембранопротекторных свойств - препарат мексидол (соль эмоксипина и янтарной кислоты), для которого характерно антирадикальное и противогипоксическое действие и который эффективен при острых и хронических нарушениях мозгового кровообращения (Т.А.Воронина. Отечественный препарат нового поколения мексидол, основные эффекты, механизм действия, применение. Изд-во НИИ Фармакологии PAMH. - M. - 2003. - 20 c.), а при исследовании гемореологических свойств - препарат пентоксифиллин, оказывающий влияние на вязкостные характеристики крови (H.Flint, M.A.Cotter, N.E.Cameron. Pentoxifylline effects on nerve conduction velocity and blood flow in diabetic rats. // Int. J. Exp. Diabetes. Res. - 2000. - Vol., №1. - P.49-58) и эталонный антиагрегант - ацетилсалициловая кислота, широко используемая в клинической практике (В.А.Алмазов, B.C.Гуревич, Л.В.Шатилина и др. Роль гиперпероксидации липидов в нарушении структурой организации тромбоцитарных мембран. // Бюллетень эксперим. биологии и медицины. - 1992. - №9. - С.265-267).As a rule, in the treatment of ischemic lesions, a combination of several drugs is used that affect the main pathogenetic links of ischemia. Therefore, cavinton was chosen as a comparison drug in the study of anti-ischemic properties, the neuroprotective effect of which is mediated by its vascular and hemorheological effects (G.N. Avakyan, A.A. Nikonov, E.I. Chukanova. Cavinton in experiment and clinical practice: Methodological recommendations . - M .: Medicine, 1998. - 55 p.), In the study of antiradical and membrane protective properties - Mexidol (a salt of emoxipin and succinic acid), which is characterized by an antiradical and antihypoxic effect and which effective in acute and chronic disorders of cerebral circulation (T.A. Voronina. Domestic drug of the new generation mexidol, main effects, mechanism of action, application. Publishing house of the Research Institute of Pharmacology PAMH. - M. - 2003. - 20 p.), and with study of hemorheological properties - the drug pentoxifylline, which affects the viscosity characteristics of the blood (H. Flint, MACotter, NECameron. Pentoxifylline effects on nerve conduction velocity and blood flow in diabetic rats. // Int. J. Exp. Diabetes. Res. - 2000. - Vol., No. 1. - P.49-58) and the reference antiplatelet agent - acetylsalicylic acid, widely used in clinical practice (V.A. Almazov, BC Gurevich, L.V. Shatilina and others. The role of lipid hyperperoxidation in violation of the structure of platelet membrane organization. // Bulletin experimental biology and medicine. - 1992. - No. 9. - S.265-267).

Техническим результатом изобретения является создание средства, обладающего более высокой противоишемической, гемореологической и антирадикальной активностью.The technical result of the invention is the creation of funds with higher anti-ischemic, hemorheological and anti-radical activity.

Технический результат достигается дигидробромидом 2-(3,4-диоксифенил)-9-диэтиламиноэтилимидазо[1,2-а]бензимидазола формулы IThe technical result is achieved by dihydrobromide 2- (3,4-dioxiphenyl) -9-diethylaminoethylimidazo [1,2-a] benzimidazole of the formula I

Известно, что дигидробромид 2-(3,4-диоксифенил)-9-диэтил-аминоэтилимидазо[1,2-а]бензимидазола оказывает церебропротекторное действие при радиационных поражениях (Патент РФ №2238938, C07D 235/04, 2004 г.).It is known that 2- (3,4-dioxiphenyl) -9-diethylaminoethylimidazo [1,2-a] benzimidazole dihydrobromide has a cerebroprotective effect in radiation injuries (RF Patent No. 2238938, C07D 235/04, 2004).

Способ получения дигидробромида 2-(3,4-дигидроксифенил)-9-диэтиламиноэтилимидазо[1,2-а]бензимидазола заключается в конденсации 1-диэтиламиноэтил-2-аминобензимидазола с 3,4-диметоксифенацилбромидом, последующей циклизации образующегося в результате конденсации бромида 1-диэтиламиноэтил-3-(3,4-диметоксифенацил)-2-аминобензимидазолия в 48%-ной бромистоводородной кислоте (т.кип. 127°С), сопровождающейся деметилированием метоксигрупп и образованием искомого дигидробромида 2-(3,4-дигидроксифенил)замещенного имидазо[1,2-а]бензимидазола (аналогию см. Хим.-фарм. журнал, 2006 г., т.40, №10, с.3-10).A method of producing 2- (3,4-dihydroxyphenyl) -9-diethylaminoethylimidazo [1,2-a] benzimidazole dihydrobromide is the condensation of 1-diethylaminoethyl-2-aminobenzimidazole with 3,4-dimethoxyphenacylbromide, followed by cyclization of the resulting 1-bromide diethylaminoethyl-3- (3,4-dimethoxyphenacyl) -2-aminobenzimidazolium in 48% hydrobromic acid (bp 127 ° C), accompanied by demethylation of methoxy groups and the formation of the desired dihydrobromide 2- (3,4-dihydroxyphenyl) substituted imidazo [1,2-a] benzimidazole (for an analogy see Chem. .-Pharm. Journal, 2006, v.40, No. 10, pp. 3-10).

Ниже приведен пример получения соединения I.The following is an example of obtaining compounds I.

Пример. Дигидробромид 2-(3,4-диоксифенил)-9-этиламиноэтилимидазо[1,2-а]бензимидазола (I).Example. Dihydrobromide 2- (3,4-dioxiphenyl) -9-ethylaminoethylimidazo [1,2-a] benzimidazole (I).

В раствор 2,32 г (10 ммоль) 2-амино-1-диэтиламиноэтилбензимидазола в 25 мл ацетона вносят 2,6 г (10 ммоль) 3,4-диметоксифенацилбромида. Выпавший осадок бромида 2-амино-1-(2-диэтиламиноэтил)-3-(3,4-диметоксифенацил)бензимидазолия отфильтровывают, промывают ацетоном. Выход 4,6 г (93,5%). Т.пл. 182°С (разложение, из спирта). Найдено, %: C 56,2; H 6,4; Br 16,4; N 11,3. C₂₃H₃₀N₄O₃·HBr. Вычислено, %: C 56,2; H 6,4; Br 16,3; N 11,4. ИК-спектр (вазелиновое масло): 1685 см^-1 (C=O).To a solution of 2.32 g (10 mmol) of 2-amino-1-diethylaminoethylbenzimidazole in 25 ml of acetone was added 2.6 g (10 mmol) of 3,4-dimethoxyphenacyl bromide. The precipitated precipitate of 2-amino-1- (2-diethylaminoethyl) -3- (3,4-dimethoxyphenacyl) benzimidazolium bromide is filtered off, washed with acetone. Yield 4.6 g (93.5%). Mp 182 ° C (decomposition, from alcohol). Found,%: C 56.2; H 6.4; Br 16.4; N, 11.3. C ₂₃ H ₃₀ N ₄ O ₃ · HBr. Calculated,%: C 56.2; H 6.4; Br 16.3; N, 11.4. IR (Vaseline oil): 1685 cm ^-1 (C = O).

Кипятят 4 г (~8 ммоль) полученного бромида в 160 мл конц. HBr (т.кип.127°С) до полного протекания реакции (контроль - ТСХ: исчезновение пятна исходного имина и промежуточно образующегося 2-(3,4-диметоксифенил)замещенного имидазо[1,2-а]бензимидазола). По охлаждении осадок искомого дигидробромида отфильтровывают, промывают ацетоном. Выход 4,1 г (96%). Кристаллизуется соль из 80%-ного водного спирта в виде белоснежных волокнистых кристаллов, которые после высушивания при 110-120°С имеют т.пл. 289-290°С (разложение). Кристаллогидрат с 1 молекулой воды плавится при 180°С. В ИК-спектре полученного дигидробромида отсутствует полоса поглощения карбонильной группы, присутствующая в ИК-спектре четвертичной соли. Найдено, %: C 47,6; H 5,3; Br 30,0; N 10,7. C₂₁H₂₄N₄O₂·2HBr. Вычислено, %: C 47,9; H 5,0; Br 30,4; N 10,7.Boil 4 g (~ 8 mmol) of the resulting bromide in 160 ml conc. HBr (boiling point 127 ° C) until the reaction proceeds (control - TLC: disappearance of the stain of the initial imine and the intermediate 2- (3,4-dimethoxyphenyl) substituted imidazo [1,2-a] benzimidazole). After cooling, the precipitate of the desired dihydrobromide is filtered off, washed with acetone. Yield 4.1 g (96%). Salt crystallizes from 80% aqueous alcohol in the form of snow-white fibrous crystals, which after drying at 110-120 ° C have so pl. 289-290 ° C (decomposition). Crystal hydrate with 1 water molecule melts at 180 ° C. In the IR spectrum of the obtained dihydrobromide there is no absorption band of the carbonyl group present in the IR spectrum of the Quaternary salt. Found,%: C 47.6; H 5.3; Br 30.0; N, 10.7. C ₂₁ H ₂₄ N ₄ O ₂ · 2HBr. Calculated,%: C 47.9; H 5.0; Br 30.4; N, 10.7.

Фармакологические свойства заявленного соединения I.Pharmacological properties of the claimed compound I.

Данное соединение (I) проявляет противоишемические и гемореологические свойства, обладает широким спектром антирадикальной активности.This compound (I) exhibits anti-ischemic and hemorheological properties, has a wide spectrum of antiradical activity.

Исследование противоишемической активности соединения I in vivo (модель 4-сосудистой перевязки артерий мозга с реперфузией у крыс)Study of the anti-ischemic activity of compound I in vivo (model of 4-vascular ligation of brain arteries with reperfusion in rats)

Материалы и методыMaterials and methods

Опыты выполнены на 40 неинбредных крысах обоего пола массой 180-230 г, которых содержали в условиях вивария с естественным световым режимом на стандартной диете лабораторных животных (ГОСТ Р50258-92) с соблюдением Международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых при экспериментальных исследованиях (1997), а также правил лабораторной практики при проведении доклинических исследований в РФ. Забой животных проводили согласно требованиям, изложенным в «Международных рекомендациях по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (1989).The experiments were performed on 40 non-inbred rats of both sexes weighing 180-230 g, which were kept under vivarium conditions with natural light conditions on a standard laboratory animal diet (GOST R50258-92) in compliance with the International Recommendations of the European Convention for the Protection of Vertebrate Animals used in experimental studies ( 1997), as well as the rules of laboratory practice in conducting preclinical studies in the Russian Federation. Slaughter of animals was carried out according to the requirements set out in the "International recommendations for biomedical research using animals" (1989).

Соединение I (5 мг/кг) и препарат сравнения кавинтон (5 мг/кг) вводили однократно внутрибрюшинно за 10 мин перед окклюзией каротидных артерий. Для исследования было сформировано 3 группы: 1) контроль - ложнооперированные крысы; 2) ишемия; 3) животные с ишемией, которым за 10 мин до окклюзии вводили исследуемое вещество.Compound I (5 mg / kg) and the comparison drug Cavinton (5 mg / kg) were administered once intraperitoneally 10 minutes before occlusion of the carotid arteries. For the study, 3 groups were formed: 1) control - false-operated rats; 2) ischemia; 3) animals with ischemia, which were administered the test substance 10 minutes before occlusion.

Тотальную ишемию головного мозга с последующей реперфузией моделировали по методу (C.Bromont, C.Marie, J.Bralet. Increased lipid peroxidation in vulnerable brain regions after transient forebrain ischaemia in rats. // Stroke. - 1989. - Vol.20, №7. - P.918-924). Первоначально производили термокоагуляцию вертебробазилярных артерий. Через 4 сут после восстановления животных на каротидные артерии накладывали окклюзоры без пережатия. Все этапы операции проводили под наркозом (калипсол 80-100 мг/кг, в/бр). На следующие сутки после второй операции моделировали тотальную ишемию головного мозга пережатием каротидных артерий окклюзорами в течение 30 мин. Реперфузия достигалась снятием окллюзоров, восстановление кровотока контролировали визуально.Total cerebral ischemia followed by reperfusion was modeled by the method of (C. Bromont, C. Marie, J. Bralet. Increased lipid peroxidation in vulnerable brain regions after transient forebrain ischaemia in rats. // Stroke. - 1989. - Vol.20, No. 7.- P.918-924). Vertebrobasilar arteries were thermocoagulated initially. 4 days after the restoration of the animals, occlusors without clamping were applied to the carotid arteries. All stages of the operation were performed under general anesthesia (calypsol 80-100 mg / kg, iv). The next day after the second operation, total cerebral ischemia was simulated by squeezing the carotid arteries by the occlusors for 30 minutes. Reperfusion was achieved by the removal of occlusors, the restoration of blood flow was monitored visually.

В восстановительном периоде оценивали показатели двигательной активности (актометр Ugo Basile, Италия) в 1-е и 2-е сут реперфузии. В течение первых 7 сут оценивали неврологический статус животных и динамометрию передних лап, которую определяли по усилию удержания кольца динамометра при рефлексе хватания передними лапами, как описано (В.В.Дрозд, В.А.Косолапов, О.В.Островский, А.А.Спасов. Динамика восстановительного периода у крыс, перенесших тотальную ишемию головного мозга. // Бюлл. эксперим. биол. мед. - 2000. - Т.130, №10. - С.475-477.). Неврологический статус оценивали по 3-х балльной шкале с учетом нормальных (2 балла), сниженных (1 балл) или отсутствующих (0 баллов) рефлексов (роговичного, отдергивания хвоста, задней лапы, переворачивания, хватания передними лапами и вздрагивания на звуковой раздражитель). На 7-е сут реперфузии исследовали запоминание аверсивного стимула в тесте условной реакции пассивного избегания (УРПИ), обучение проводили предварительно за 1 час до начала ишемии. При наблюдении за животными позже 7 сут динамики отмечено не было.In the recovery period, indicators of motor activity (actometer Ugo Basile, Italy) were evaluated on the 1st and 2nd day of reperfusion. During the first 7 days, the neurological status of the animals and the dynamometry of the forelegs were assessed, which was determined by the retention force of the dynamometer ring during the grasp of the forelegs as described (V.V.Drozd, V.A. Kosolapov, O.V. Ostrovsky, A. A. Spasov, Dynamics of the recovery period in rats undergoing total cerebral ischemia // Bull. Experimental biol. Honey. - 2000. - T.130, No. 10. - S.475-477.). Neurological status was assessed on a 3-point scale, taking into account normal (2 points), reduced (1 point) or absent (0 points) reflexes (corneal, tail jerking, hind legs, flipping, grasping with front paws and shuddering for a sound stimulus). On the 7th day of reperfusion, the memorization of an aversive stimulus was studied in the test of the conditioned reaction of passive avoidance (passive avoidance reaction), training was carried out preliminary 1 hour before the onset of ischemia. When observing animals after 7 days, no dynamics were noted.

Смертность в ходе эксперимента колебалась между 25 и 35%. Гибель после термокоагуляции вертебробазилярных артерий составляла не более 10%. После 2-го этапа - наложения окклюзора на каротидные артерии гибели животных не наблюдали.Mortality during the experiment ranged between 25 and 35%. The death after thermocoagulation of vertebrobasilar arteries was not more than 10%. After the 2nd stage, the occlusor was not superimposed on the carotid arteries.

Статистическую обработку данных проводили в пакете Statistica 6.0. па (StatSoft, США) с использованием дисперсионного анализа множественных сравнений и критерия Шеффе (p≤0,05 или p≤0,01).Statistical data processing was carried out in the Statistica 6.0 package. PA (StatSoft, USA) using the analysis of variance of multiple comparisons and the Sheffe criterion (p≤0.05 or p≤0.01).

Результаты.Results.

При изучении влияния соединения I на восстановление крыс в реперфузионном периоде после ишемии было установлено, что соединение I превосходило препарат сравнения кавинтон по активности, более выражено восстанавливая нарушенную двигательную активность в 1-е и 2-е сут реперфузии (Таблица 1). Соединение I достоверно улучшало неврологический статус и вызывало его полную нормализацию на 7-е сут наблюдений (Таблица 2), а также практически полное восстановление мышечной силы (Таблица 3). Кавинтон не приводил к полной нормализации неврологического статуса и динамометрии - на 7-е сут дефицит составлял 34% и 23,5% соответственно. Соединение I нормализовало запоминание обучающего задания в тесте УРПИ у животных, перенесших тотальную ишемию мозга, сокращая дефицит памяти до 15,3% (p<0,01) (Таблица 4). Препарат сравнения также оказывал некоторое корректирующее влияние на памятный след, однако дефицит памяти под влиянием кавинтона составлял 50,3%.When studying the effect of Compound I on the restoration of rats in the reperfusion period after ischemia, it was found that Compound I exceeded the comparison drug Cavinton in activity, more clearly restoring impaired motor activity on the 1st and 2nd day of reperfusion (Table 1). Compound I significantly improved neurological status and caused its full normalization on the 7th day of observation (Table 2), as well as an almost complete restoration of muscle strength (Table 3). Cavinton did not lead to a complete normalization of neurological status and dynamometry - on the 7th day the deficit was 34% and 23.5%, respectively. Compound I normalized the memorization of the training task in the passive avoidance reaction test in animals undergoing total brain ischemia, reducing memory deficit to 15.3% (p <0.01) (Table 4). The comparison drug also had some corrective effect on the memorial trail, however, the memory deficit under the influence of cavinton was 50.3%.

Таким образом, соединение I превосходит препараты сравнения дибунол и кавинтон по противоишемической активности.Thus, compound I is superior to the comparison drugs dibunol and cavinton in anti-ischemic activity.

Исследование антирадикальной активности соединения I in vitroIn vitro study of the antiradical activity of compound I

Материалы и методыMaterials and methods

В качестве препарата сравнения использовали мексидол (НИИ фармакологии РАМН, Россия). Исследование процессов хемилюминесценции проводили на хемилюминометре «Хемилюминомер-03» (Уфа, Россия), связанном интерфейсом с компьютером.Mexidol (Research Institute of Pharmacology RAMS, Russia) was used as a comparison drug. The study of chemiluminescence processes was carried out on a chemiluminometer “Chemiluminomer-03” (Ufa, Russia), connected by a computer interface.

Способность веществ взаимодействовать с липидными радикалами LOO^• исследовали на модели Fe²⁺-индуцированной хемилюминесценции липидов (P.P.Фархутдинов, В.А.Лиховских. Хемилюминесцентные методы исследования свободно-радикального окисления в биологии и медицине. // - Уфа, 1995. - 110 с.). Реакционная смесь объемом 20 мл содержала липиды куриного желтка, содержащего липопротеиновые комплексы. Содержание белка определяли с помощью кумасси синего и доводили до 1 мг на мл дальнейшим разведением. Инициирование ПОЛ осуществляли FeSO₄ (чда, Украина) в конечной концентрации 2,5 мМ при интенсивном перемешивании и t 37°C, после чего в течение 10 мин измеряли кинетику хемилюминесценции.The ability of agents to interact with lipid radicals LOO ^• investigated on a model Fe ²⁺ -induced lipid chemiluminescence (PPFarhutdinov, V.A.Lihovskih Chemiluminescent research methods of free radical oxidation // Biology and Medicine -.. Ufa, 1995. - 110 p. ) The 20 ml reaction mixture contained chicken yolk lipids containing lipoprotein complexes. Protein content was determined using Coomassie Blue and adjusted to 1 mg per ml with further dilution. LPO was initiated by FeSO ₄ (chda, Ukraine) at a final concentration of 2.5 mM with vigorous stirring and t 37 ° C, after which the chemiluminescence kinetics were measured for 10 min.

Для измерения ХЛ, сопровождающей аутоокисление люминола с генерацией активных форм кислорода (АФК) (С.Г.Семешко, P.P.Фархутдинов. Общая антиоксидантная активность слезной жидкости. // Клин. лаб. диаг. - 2002. - №24. - С.33-34), в кювету хемилюминометра добавляли фосфатный буфер pH 7,45, содержащий 1 мкМ люминола (Serva, Германия) и 5 мМ цитрата натрия (ЧД, Россия) в конечном объеме 20 мл. Инициирование ХЛ осуществляли FeSO₄ в конечной концентрации 2,5 мМ при интенсивном перемешивании и в течение 5 мин измеряли кинетику ХЛ.To measure CL accompanying the autooxidation of luminol with the generation of reactive oxygen species (ROS) (S.G. Semeshko, PPFarkhutdinov. Total antioxidant activity of the tear fluid. // Clinical laboratory. Diagn. 34), a 7.45 phosphate buffer containing 1 μM luminol (Serva, Germany) and 5 mm sodium citrate (BH, Russia) in a final volume of 20 ml was added to the chemiluminometer cell. CL was initiated by FeSO ₄ at a final concentration of 2.5 mM with vigorous stirring, and CL kinetics was measured over 5 minutes.

Для оценки способности веществ инактивировать супероксидный анион-радикал использовали непрямой метод (В.А.Костюк, А.И.Потапович, Ж.В.Ковалева. Простой и чувствительный метод определения активности супероксиддисмутазы, основанный на реакции окисления кверцитина. // Вопр. мед. химии. - 1990. - Т.36, №2. - С.88-91) с применением кверцетина (Sigma, США). Ингибиторную активность соединений регистрировал по торможению падения оптической плотности на спектрофотометре СФ-46 (Ломо, Россия) при λ 406 нм в кювете с длиной оптического пути 10 мм. Степень ингибирования реакции рассчитавали: % инг=100-(ΔDвещ/ΔDкверц×100), где ΔDвещ - изменение оптической плотности за 10 мин в опытной пробе, содержащей вещество; ΔDкверц - изменение оптической плотности за 10 мин в контрольной пробе, не содержащей вещества. Также применяли прямой хемилюминесцентный метод ксантин-ксантиноксидаза индуцированной люцигенин-зависимой ХЛ (B.Gunaydin, A.T.Demiryurek. Interaction of lidocaine with reactive oxygen and nitrogen species. // Eur. J. Anaesthesiol. - 2001. - Vol.18, №12 - P.816-822). Генерацию супероксидного радикала вызывали внесением 0,25 мл ксантиноксидазы (Sigma, США) (0,25 U/ml) в пробу, содержащую 10 мл фосфатного буфера pH 7,45, содержащего 5 мкМ люцигенина (Fluka, Швейцария) и 0,5 мл 1 мМ ксантина (Sigma, США). Кинетику хемилюминисценции оценивали в течение 5 мин при интенсивном перемешивании и t 37°C.To assess the ability of substances to inactivate the superoxide anion radical, an indirect method was used (V.A. Kostyuk, A.I. Potapovich, Zh.V. Kovaleva. A simple and sensitive method for determining the activity of superoxide dismutase based on the oxidation reaction of quercetin. // Vopr. Honey Chemistry. - 1990. - T.36, No. 2. - P.88-91) using quercetin (Sigma, USA). The inhibitory activity of the compounds was recorded by inhibiting the drop in optical density on an SF-46 spectrophotometer (Lomo, Russia) at λ 406 nm in a cuvette with an optical path length of 10 mm. The degree of inhibition of the reaction was calculated:% ing = 100- (ΔDtv / ΔD querz × 100), where ΔDtv is the change in optical density over 10 min in the experimental sample containing the substance; ΔD querz — change in optical density over 10 min in a control sample containing no substance. The direct chemiluminescent method xanthine-xanthine oxidase induced lucigenin-dependent CL (B. Gunaydin, AT Demiryurek. Interaction of lidocaine with reactive oxygen and nitrogen species. // Eur. J. Anaesthesiol. - 2001. - Vol. 18, No. 12 - was also used. P.816-822). Superoxide radical generation was induced by adding 0.25 ml of xanthine oxidase (Sigma, USA) (0.25 U / ml) to a sample containing 10 ml of 7.45 phosphate buffer containing 5 μM lucigenin (Fluka, Switzerland) and 0.5 ml 1 mM xanthine (Sigma, USA). The chemiluminescence kinetics was evaluated for 5 min with vigorous stirring and t 37 ° C.

Способность веществ к перехвату и инактивации пероксильного радикала (ROO^•) оценивали по методу (Г.И.Клебанов, О.Б.Любицкий, О.В.Васильева и др. // Антиоксидантные свойства производных 3-оксипиридина: мексидола, эмоксипина и проксипина. // Вопр. мед. химии. - 2001. - Т.47. - С.288-300). Инициирование реакции осуществляли водорастворимым 2,2'-азобис(2-метилпропионамидин)дигидрохлоридом (АБАП) (Fluka, Швейцария), который при t 37°C разлагается, образуя пероксильные радикалы. В пробу, содержащую 2,5 мкМ люминола (Serva, Германия) в фосфатном буфере pH 7,4 при постоянном перемешивании и t 37°C, вносили 50 мМ АБАП и измеряли кинетику ХЛ в течение 30 мин.The ability of substances to intercept and inactivate the peroxyl radical (ROO ^• ) was evaluated according to the method (G.I. Klebanov, O.B. Lyubitsky, O.V. Vasilieva and others // Antioxidant properties of 3-hydroxypyridine derivatives: mexidol, emoxipine and proxypine . // Issues of medical chemistry. - 2001. - T.47. - S.288-300). The reaction was initiated by water-soluble 2,2'-azobis (2-methylpropionamidine) dihydrochloride (ABAP) (Fluka, Switzerland), which decomposes at t 37 ° C to form peroxyl radicals. In a sample containing 2.5 μM luminol (Serva, Germany) in phosphate buffer pH 7.4 with constant stirring and t 37 ° C, 50 mM ABAP was added and CL kinetics was measured for 30 min.

Изучаемые вещества вводили в среду инкубации за 1 мин перед инициированием реакции в широком диапазоне концентраций.The studied substances were introduced into the incubation medium 1 min before the initiation of the reaction in a wide range of concentrations.

Результаты оценивали статистически в программе Statistica 6.0 с использованием t-критерия Стьюдента с поправкой Бонферони (t). Отличия от контроля во всех группах считали статистически значимыми при Р≤0,05. Для сравнительной оценки эффективности веществ рассчитывали величины ИК₅₀ (концентрация вещества, ингибирующая реакцию на 50%). Расчет ИК₅₀ проводили с помощью простого линейного регрессионного анализа, реализованного во встроенном пакете анализа программы Microsoft Excel 2000 с расчетом парного коэффициента корреляции R². Достоверность регрессии оценивали с помощью двухфакторного дисперсионного анализа в программе «Statistica 6.0» (Stat Soft, США).The results were evaluated statistically in the Statistica 6.0 program using the Student t-test with Bonferoni correction (t). Differences from control in all groups were considered statistically significant at P≤0.05. For a comparative evaluation of the effectiveness of substances, IC ₅₀ values were calculated (the concentration of the substance inhibiting the reaction by 50%). Calculation of IC ₅₀ was carried out using a simple linear regression analysis implemented in the built-in analysis package of Microsoft Excel 2000 with calculation of the pair correlation coefficient R ² . The reliability of the regression was evaluated using two-way analysis of variance using the Statistica 6.0 software (Stat Soft, USA).

Результатыresults

Исследуемое вещество I дозозависимо подавляло образование липопероксильных радикалов (Таблица 5) и по величине ИК₅₀ почти на два порядка превосходило мексидол по активности. Соединение I почти в 15 раз превосходило мексидол по способности инактивировать активные формы кислорода в реакции Fe²⁺-индуцированной хемилюминесценции в присутствии люминола (Таблица 6). У соединения I отмечалась выраженная ингибирующая активность в отношении супероксидного радикала как в реакции с кверцетином (Таблица 7), так и при исследовании хемилюминесценции в системе ксантин-ксантиноксидаза в присутствии люцигенина (Таблица 8). Мексидол по способности к перехвату супероксида уступал соединению I более чем на порядок. Исследуемое соединение I дозозависимо угнетало образование пероксильных радикалов (Таблица 9), регистрируемых с помощью хемилюминесценции, сопровождающей термическое разложение АБАП, почти в десять раз превосходя мексидол по величине ИК₅₀.The studied substance I dose-dependently suppressed the formation of lipoperoxyl radicals (Table 5) and in terms of IC _{50 was} almost two orders of magnitude higher than mexidol in activity. Compound I was almost 15 times superior to Mexidol in its ability to inactivate reactive oxygen species in the reaction of Fe ²⁺ -induced chemiluminescence in the presence of luminol (Table 6). Compound I showed marked inhibitory activity against the superoxide radical both in the reaction with quercetin (Table 7) and in the study of chemiluminescence in the xanthine-xanthine oxidase system in the presence of lucigenin (Table 8). Mexidol in the ability to intercept superoxide was inferior to compound I by more than an order of magnitude. Test compound I inhibited dose-dependent formation of peroxyl radicals (Table 9), recorded by chemiluminescence accompanying the thermal decomposition of ABAP, almost ten times higher than mexidol in terms of IC ₅₀ .

Таким образом, соединение I превосходило мексидол более чем в десять раз по способности перехватывать липопероксильный, супероксидный и другие активные формы кислорода и АБАП-радикалы.Thus, compound I exceeded Mexidol more than ten times in its ability to intercept lipoperoxyl, superoxide and other reactive oxygen species and ABAP radicals.

Исследование гемореологических свойств соединения I in vitro и in vivoThe study of hemorheological properties of compound I in vitro and in vivo

Материалы и методыMaterials and methods

Антиагрегантную активность веществ исследовали на двухканальном лазерном анализаторе агрегации тромбоцитов/счетчике (модель 220 LA) (НПФ "Биола", Москва) по методу (G.V.R.Born. Aggregation of blood platelets by adenosine diphosphate and its reversal. // Nature. - 1962. - Vol.194. - P.927-929) в модификации (З.А.Габбасов, Е.Г.Попов, И.Ю.Гаврилов и др. Новый высокочувствительный метод анализа агрегации тромбоцитов. // Лабораторное дело. - 1989. - №10. - С.15-18). Исследования "in vitro" проводили на богатой тромбоцитами плазме (В.А.Люсов, Ю.Б.Белоусов. Метод графической регистрации агрегации тромбоцитов и изменения ее при ишемической болезни сердца. // Кардиология. - 1971. - №8. - С.459-461). Количество тромбоцитов регистрировали с помощью счетчика тромбоцитов. В качестве индуктора использовали 5 мкМ динатриевую соль АДФ (Reanal, Венгрия). Антиагрегантную активность соединений изучали в диапазоне концентраций от 1×10^-4 до 1×10^-6 М. Уровень агрегации оценивали по величине максимальной амплитуды агрегатограммы. Расчет антиагрегационого действия изучаемых веществ проводили по формуле (А-В)×100/А, где А -уровень агрегации тромбоцитов нативной плазмы, В - уровень агрегации тромбоцитов плазмы после инкубации с исследуемым веществом. Препаратом сравнения служили мексидол и ацетилсалициловая кислота.The antiplatelet activity of substances was studied on a two-channel laser platelet aggregation analyzer / counter (model 220 LA) (NPF Biola, Moscow) according to the method (GVRBorn. Aggregation of blood platelets by adenosine diphosphate and its reversal. // Nature. - 1962. - Vol. - 1962. - Vol. 1962. - Vol. .194. - P.927-929) in the modification (Z.A. Gabbasov, EG Popov, I.Yu. Gavrilov and others. A new highly sensitive method for the analysis of platelet aggregation. // Laboratory. - 1989. - No. 10. - S.15-18). In vitro studies were carried out on a platelet-rich plasma (V.A. Lyusov, Yu.B. Belousov. A method for graphically recording platelet aggregation and its changes in coronary heart disease. // Cardiology. - 1971. - No. 8. - P. 459-461). Platelet counts were recorded using a platelet counter. A 5 μM ADP disodium salt (Reanal, Hungary) was used as an inductor. The antiplatelet activity of the compounds was studied in the concentration range from 1 × 10 ^-4 to 1 × 10 ^-6 M. The level of aggregation was estimated by the value of the maximum amplitude of the aggregatogram. The anti-aggregation action of the studied substances was calculated using the formula (AB) × 100 / A, where A is the level of platelet aggregation of native plasma, B is the level of aggregation of plasma platelets after incubation with the test substance. Mexidol and acetylsalicylic acid were used as a comparison drug.

Исследование влияния соединения I и препарата сравнения мексидола на агрегацию тромбоцитов "in vivo" проводили в опытах на 30 интактных нелинейных крысах массой 220-260 г.A study of the effect of compound I and the preparation of comparison of Mexidol on platelet aggregation "in vivo" was carried out in experiments on 30 intact nonlinear rats weighing 220-260 g

Соединение I вводили в дозах 30 мг/кг внутрижелудочно в течение 3-х дней, мексидол вводили в эквимолярной дозе. Контрольные животные получали растворитель (дистиллированная вода). Забор крови из брюшной аорты осуществляли под нембуталовым (40 мг/кг) наркозом через 2 часа после введения соединений. Агрегацию тромбоцитов изучали по описанной выше методике с расчетом степени максимальной агрегации и степени дезагрегации (как разность между максимальной агрегацией тромбоцитов и агрегацией на 5-й мин), и скорость агрегации тромбоцитов (по величине максимального наклона кривой), выраженные в процентах к контролю, при этом степень агрегации тромбоцитов в контроле принимали за 100%. Подсчет количества тромбоцитов проводили на счетчике модели 220LA (НПФ "Биола", Москва) (З.А.Габбасов и др., 1989).Compound I was administered at doses of 30 mg / kg intragastrically for 3 days, Mexidol was administered in an equimolar dose. Control animals received a solvent (distilled water). Blood sampling from the abdominal aorta was performed under nembutal (40 mg / kg) anesthesia 2 hours after the administration of the compounds. Platelet aggregation was studied according to the method described above with the calculation of the degree of maximum aggregation and the degree of disaggregation (as the difference between the maximum platelet aggregation and aggregation at the 5th minute), and the platelet aggregation rate (according to the maximum slope of the curve), expressed as a percentage of the control, at this, the degree of platelet aggregation in the control was taken as 100%. Platelet counts were performed on a model 220LA counter (NPF Biola, Moscow) (Z.A. Gabbasov et al., 1989).

Измерение вязкости крови проводили на реологическом анализаторе крови АКР-2 (Россия) (Н.А.Добровольский, Ю.М.Лопухин, А.С.Парфенов и др. Анализатор вязкости крови. // Реологические исследования в медицине: Сб. науч. тр. / М.: НЦХ РАМН, 1998. - С.45-51) при нескольких скоростях сдвига (от 200 до 5 с^-1), моделирующих различную интенсивность кровотока в сосудах. При этом вязкость в области малых скоростей сдвига служит характеристикой агрегации эритроцитов, а в области более высоких скоростей сдвига - показателем их деформируемости. Все исследуемые образцы приводились к единому гематокриту 45 у.е., измеряемому на микрогемоцентрифуге МГЦ-8 (8000 об/мин, 2 мин). Исследования изучаемых соединений in vitro проводили в концентрациях от 1×10^-4 до 1×10^-6 М. Соединение I и препарат сравнения пентоксифиллин растворяли в физиологическом растворе, непосредственно перед исследованием, и 20 мкл раствора добавляли к исследуемой пробе перед термостатированием. В контрольные образцы вносили эквивалентное количество физиологического раствора (37°С). Кровь забирали из локтевой вены здоровых доноров и стабилизировали 3,8% раствором цитрата натрия в соотношении 1:9.Blood viscosity was measured on a rheological blood analyzer AKP-2 (Russia) (N.A. Dobrovolsky, Yu.M. Lopukhin, A.S. Parfenov and others. Blood viscosity analyzer. // Rheological studies in medicine: Sat. Scientific. tr. / M.: NTSKh RAMS, 1998. - P. 45-51) at several shear rates (from 200 to 5 s ^-1 ), simulating different blood flow intensities in the vessels. Moreover, viscosity in the region of low shear rates is a characteristic of red blood cell aggregation, and in the region of higher shear rates is an indicator of their deformability. All test samples were reduced to a single hematocrit of 45 cu, measured on a MGC-8 microhemocentrifuge (8000 rpm, 2 min). In vitro studies of the studied compounds were carried out in concentrations from 1 × 10 ^-4 to 1 × 10 ^-6 M. Compound I and the reference preparation pentoxifylline were dissolved in physiological saline immediately before the study, and 20 μl of the solution was added to the test sample before incubation. An equivalent amount of physiological saline (37 ° C) was added to the control samples. Blood was taken from the elbow vein of healthy donors and stabilized with a 3.8% sodium citrate solution in a 1: 9 ratio.

Изучение влияния соединения I на реологические свойства крови при реперфузионном поражении головного мозга проводили на 40 нелинейных крысах-самцах массой 240-280 г, наркотизированных хлоралгидратом в дозе 400 мг/кг. Измерение вязкости крови проводили как описано выше. Глобальную ишемию головного мозга воспроизводили билатеральной окклюзией общих сонной артерий в сочетании с контролируемой гипотензией (Методические указания по экспериментальному изучению перпаратов для лечения нарушений мозгового кровообращения и мигрени: Метод, рекомендации. / Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ; Сост.: Р.С.Мирзоян, А.С.Саратиков, М.Б.Плотников и др. - М., 2000. - 398 с.). Предварительно артериальное давление снижалось под влиянием забора крови из яремных вен до 50 мм рт.ст. (полученные образцы использовались для оценки исходных реологических показателей). Соединение I в дозе 10 мг/кг и пентоксифиллин в дозе 8 мг/кг вводили перорально за 30 мин до ишемии. Контрольным группам (ишемия - контроль и ложнооперированные животные) вводили физиологический раствор в аналогичном объеме. В качестве нормального контроля использовалась группа ложнооперированных животных. Через 1 час ишемии производили снятие лигатур с сонных артерий, что обеспечивало реперфузию головного мозга. Спустя час после реперфузии кровь забирали из нижней полой вены. Кровь стабилизировали 3,8% раствором цитрата натрия в соотношении 1:9.A study of the effect of compound I on the rheological properties of blood during reperfusion injury to the brain was performed on 40 non-linear male rats weighing 240-280 g, anesthetized with chloral hydrate at a dose of 400 mg / kg. Blood viscosity was measured as described above. Global cerebral ischemia was reproduced by bilateral occlusion of the common carotid arteries in combination with controlled hypotension (Guidelines for the experimental study of drugs for the treatment of cerebrovascular accidents and migraines: Method, recommendations. / Manual on experimental (preclinical) study of new pharmacological substances; Comp .: P .S. Mirzoyan, A.S. Saratikov, M. B. Plotnikov et al. - M., 2000. - 398 p.). Previously, blood pressure decreased under the influence of blood sampling from the jugular veins to 50 mm Hg. (the obtained samples were used to evaluate the initial rheological indicators). Compound I at a dose of 10 mg / kg and pentoxifylline at a dose of 8 mg / kg were administered orally 30 minutes before ischemia. The control groups (ischemia - control and false-operated animals) were injected with physiological saline in a similar volume. A group of false-operated animals was used as normal control. After 1 hour of ischemia, ligatures were removed from the carotid arteries, which ensured reperfusion of the brain. An hour after reperfusion, blood was taken from the inferior vena cava. Blood was stabilized with a 3.8% solution of sodium citrate in a ratio of 1: 9.

Для изучения влияния веществ на оксидативный гемолиз эритроцитов забор крови производили из ушной вены кролика в пробирки с 3,8% раствором натрия цитрата в соотношении 1:9. Эритроциты трехкратно отмывали трис-NaCl-буфером pH 7,4, Суспензия эритроцитов в буфере приводилась к единому гематокриту 45 у.е. Соединение I и препарат сравнения мексидол вводили в эритроцитарную суспензию непосредственно перед термостатированием в дозах 10^-4, 10^-5 и 10^-6 М. За основу был выбран метод (M.Tsuchiya, A.Asada, E.Kasahara et al. Antioxidant protection of propofol and its recycling in erythrocyte membranes. // Am. J. Resp. Crit. Care Med. - 2002. - Vol.165. - P.54-60) в нашей модификации. Гемолиз эритроцитов индуцировали 50 мМ водорастворимым 2,2'-азобис(2-метилпропионамидин)дигидрохлоридом (АБАП) (Fluka, Швейцария), который при t 37°C разлагается, образуя пероксильные радикалы. После инкубирования с разными интервалами времени образы центрифугировали при 1000 об/мин на центрифуге ОПН-3 (Россия) 10 мин и в супернатанте измеряли поглощение при 540 нм на СФ-46 (Ломо, Россия). Уровень гемолиза оценивали в процентах по отношению к абсолютному гемолизу эритроцитов в дистиллированной воде.To study the effect of substances on the oxidative hemolysis of red blood cells, blood was taken from the rabbit’s ear vein into test tubes with 3.8% sodium citrate in a ratio of 1: 9. The red blood cells were washed three times with Tris-NaCl-buffer pH 7.4. A suspension of red blood cells in the buffer resulted in a single hematocrit of 45 cu Compound I and the comparison drug Mexidol were injected into the erythrocyte suspension immediately before incubation at doses of 10 ^-4 , 10 ^-5 and 10 ^-6 M. The method was chosen as the basis (M. Tsuchiya, A. Asada, E. Kasahara et al. Antioxidant protection of propofol and its recycling in erythrocyte membranes. // Am. J. Resp. Crit. Care Med. - 2002. - Vol.165. - P.54-60) in our modification. Red blood cell hemolysis was induced by 50 mM water-soluble 2,2'-azobis (2-methylpropionamidine) dihydrochloride (ABAP) (Fluka, Switzerland), which decomposes at t 37 ° C to form peroxyl radicals. After incubation at different time intervals, the images were centrifuged at 1000 rpm in an OPN-3 centrifuge (Russia) for 10 min, and the absorbance at 540 nm was measured in a supernatant on an SF-46 (Lomo, Russia). The level of hemolysis was estimated as a percentage in relation to the absolute hemolysis of red blood cells in distilled water.

Статистическую обработку результатов экспериментов производили в пакете прикладных программ «Statistika 6.0» с использованием парного критерия Стьюдента при предварительной проверке выборки на нормальность распределения или критерия Манна-Уитни.Statistical processing of the experimental results was carried out in the Statistika 6.0 application package using the paired Student criterion during preliminary check of the sample for normal distribution or Mann-Whitney criterion.

Результаты.Results.

При изучении влияния соединения I и препаратов сравнения мексидола и ацетилсалициловой кислоты на агрегацию тромбоцитов in vitro, индуцированную 5 мкМ АДФ, было установлено (Таблица 10), что соединение I, ЭК₅₀ которого составила 3,30×10^-4 М, превосходило препараты сравнения по активности.When studying the effect of compound I and comparison preparations of mexidol and acetylsalicylic acid on in vitro platelet aggregation induced by 5 μM ADP, it was found (Table 10) that compound I, whose EC ₅₀ was 3.30 × 10 ^-4 M, was superior to comparison preparations by activity.

Было установлено, что соединение I обладает способностью дозозависимо ингибировать АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов и в условиях целого организма (Таблица 11). Оно уменьшало как степень максимальной агрегации тромбоцитов, так и скорость образования агрегатов, а также проявляло дезагрегирующие свойства, практически не меняя количество тромбоцитов, что свидетельствует о том, что изменение способности тромбоцитов к агрегации связано не с изменением их числа, а с возникшей под действием соединения I гипореактивностью кровяных пластинок. Мексидол уступал соединению I как по влиянию на степень максимальной агрегации тромбоцитов и скорость образования агрегатов, так и по влиянию на дезагрегацию.It was found that compound I has the ability to dose-dependently inhibit ADP-induced platelet aggregation in a whole organism (table 11). It reduced both the degree of maximum platelet aggregation and the rate of aggregate formation, and also showed disaggregating properties, practically without changing the number of platelets, which indicates that the change in the ability of platelets to aggregate is associated not with a change in their number, but with the compound I hyporeactivity of blood platelets. Mexidol was inferior to compound I both in its effect on the degree of maximum platelet aggregation and the rate of aggregation, and in its effect on disaggregation.

Соединение I дозозависимо снижало вязкость крови доноров при всех скоростях сдвига (Таблица 12). Так при скорости сдвига 200 сПз соединение I снижало вязкость крови на 4,24%, а пентоксифиллин - на 3,15%, что свидетельствует о влиянии соединений на пластичность мембраны эритроцитов. При снижении концентрации веществ в пробе при указанной скорости сдвига эффективность соединения I снижается и составляет 1,32%, а пентоксифиллин практически не оказывает влияния на вязкость крови. Со снижением скорости сдвига влияние соединения I на данный параметр увеличивается, являясь достоверным в концентрациях вещества 1×10^-4 и Compound I dose-dependently reduced the blood viscosity of donors at all shear rates (Table 12). So, at a shear rate of 200 cPs, compound I decreased the blood viscosity by 4.24%, and pentoxifylline by 3.15%, which indicates the effect of the compounds on the plasticity of the erythrocyte membrane. With a decrease in the concentration of substances in the sample at the indicated shear rate, the effectiveness of compound I decreases and amounts to 1.32%, and pentoxifylline has practically no effect on blood viscosity. With a decrease in shear rate, the effect of compound I on this parameter increases, being reliable at concentrations of 1 × 10 ^-4 and

1×10^-5 М. Препарат сравнения, в указанных концентрациях, оказывается практически не эффективным.1 × 10 ^-5 M. The comparison drug, in the indicated concentrations, is practically not effective.

Таким образом, наибольший эффект соединения I на вязкость крови доноров проявляется при низких скоростях сдвига, что подтверждается статистически достоверными изменениями индекса агрегации.Thus, the greatest effect of compound I on the blood viscosity of donors appears at low shear rates, which is confirmed by statistically significant changes in the aggregation index.

Соединение I также достоверно снижало вязкость крови у крыс с экспериментальной ишемией головного мозга особенно при низких скоростях сдвига (Таблица 13) (на 30% по сравнению с ишемизированной группой животных), и его эффект был сравним с пентоксифиллином.Compound I also significantly reduced blood viscosity in rats with experimental cerebral ischemia, especially at low shear rates (Table 13) (30% compared with the ischemic group of animals), and its effect was comparable to pentoxifylline.

При инкубировании в течение 2 ч в присутствии гидрофильного радикального инициатора АБАП можно было наблюдать существенный гемолиз эритроцитов по сравнению с контролем, который составил 81% (Таблица 14) (p<0,05) по сравнению с 29% в контроле с буфером. Соединение I в максимальной дозе 100 мкМ в суспензию эритроцитов приводило к дозозависимому достоверному снижению гемолиза до 39,3%. Мексидол оказался менее эффективен, чем соединение I в соответствующих концентрациях.When incubated for 2 hours in the presence of a hydrophilic radical initiator of ABA, significant erythrocyte hemolysis was observed compared to the control, which was 81% (Table 14) (p <0.05) compared to 29% in the control with buffer. Compound I at a maximum dose of 100 μM in a suspension of red blood cells led to a dose-dependent significant decrease in hemolysis to 39.3%. Mexidol was less effective than compound I at appropriate concentrations.

Таблица 1Table 1 Влияние соединения I (5 мг/кг) и кавинтона (5 мг/кг) на спонтанную двигательную активность крыс в раннем восстановительном периоде после четырехсосудистой перевязки артерий мозга (M±m)The effect of compound I (5 mg / kg) and cavinton (5 mg / kg) on the spontaneous motor activity of rats in the early recovery period after four-vascular ligation of the brain arteries (M ± m) Группы животныхGroups of animals nn Первые сутки, у.е.The first day, cu % от контроля% of control Вторые сутки, у.е.The second day, cu % от контроля% of control Контроль (Ложнооперированные)Control (False Operated) 99 121,3±9,32121.3 ± 9.32 -- 107,2±8,54107.2 ± 8.54 -- ИшемияIschemia 99 16,1±3,01*16.1 ± 3.01 * -86,7-86.7 18,7±3,95*18.7 ± 3.95 * -82,6-82.6 Ишемия + соединение IIschemia + Compound I 99 75,8±7,72*⁺ 75.8 ± 7.72 * ⁺ -37,5-37.5 58,5±3,58*⁺ 58.5 ± 3.58 * ⁺ -45,4-45.4 Контроль (Ложнооперированные)Control (False Operated) 99 111,9±44,80111.9 ± 44.80 -- 75,7±25,9975.7 ± 25.99 -- ИшемияIschemia 99 44,0±27,0044.0 ± 27.00 -60.7-60.7 25,2±13,6325.2 ± 13.63 -66,7-66.7 Ишемия + КавинтонIschemia + Cavinton 99 45,6±13,0045.6 ± 13.00 -59,2-59.2 21,5±15,7221.5 ± 15.72 -71,6-71.6 n - число животных в экспериментеn is the number of animals in the experiment * - данные статистически значимы по отношению к Контролю (p<0,01)* - data are statistically significant in relation to the Control (p <0,01) ⁺ - данные статистически значимы по отношению к Ишемии (p<0,01) ⁺ - data are statistically significant in relation to Ischemia (p <0,01)

Таблица 2table 2 Влияние соединения I (5 мг/кг) и кавинтона (5 мг/кг) на неврологический статус (баллы) крыс в раннем восстановительном периоде после четырехсосудистой перевязки артерий мозга (М±m)The effect of compound I (5 mg / kg) and cavinton (5 mg / kg) on the neurological status (scores) of rats in the early recovery period after four-vessel ligation of the arteries of the brain (M ± m) ГруппыGroups Сутки после ишемииDay after ischemia 1one 22 33 55 77 Контроль (Ложнооперированные)Control (False Operated) 12,0±0,0012.0 ± 0.00 12,0±0,0012.0 ± 0.00 12,0±0,0012.0 ± 0.00 12,0±0,0012.0 ± 0.00 12,0±0,0012.0 ± 0.00 ИшемияIschemia 5,3±0,37*5.3 ± 0.37 * 5,0±0,24*5.0 ± 0.24 * 4,6±0,48*4.6 ± 0.48 * 6,5±0,22*6.5 ± 0.22 * 7,4±0,24*7.4 ± 0.24 * Ишемия + соединение IIschemia + Compound I 9,5±0,22*⁺ 9.5 ± 0.22 * ⁺ 10,0±0,37^*+# 10.0 ± 0.37 ^{* + #} 9,7±0,49*⁺ 9.7 ± 0.49 * ⁺ 11,4±0,24^+# 11.4 ± 0.24 ^{+ #} 11,6±0,24⁺ 11.6 ± 0.24 ⁺ Контроль (Ложнооперированные)Control (False Operated) 12,0±0,0012.0 ± 0.00 12,0±0,0012.0 ± 0.00 12,0±0,0012.0 ± 0.00 12,0±0,0012.0 ± 0.00 12,0±0,0012.0 ± 0.00 ИшемияIschemia 5,6±0,50*5.6 ± 0.50 * 5,8±0,40*5.8 ± 0.40 * 5,6±0,50*5.6 ± 0.50 * 5,8±1,33*5.8 ± 1.33 * 6,5±1,32*6.5 ± 1.32 * Ишемия + КавинтонIschemia + Cavinton 6,5±0,82*6.5 ± 0.82 * 6,5±0,52*6.5 ± 0.52 * 6,6±0,89*6.6 ± 0.89 * 6,8±0,83*6.8 ± 0.83 * 7,9±0,83*7.9 ± 0.83 * * - данные статистически значимы по отношению к контролю при p≤0,01* - data are statistically significant with respect to control at p≤0.01 ⁺ - данные статистически значимы по отношению к ишемии при p≤0,01 ⁺ - data are statistically significant with respect to ischemia at p≤0.01 # - данные статистически значимы по отношению к кавинтону при p≤0,05# - data are statistically significant with respect to the cavinton at p≤0,05

Таблица 3Table 3 Влияние соединения I (5 мг/кг) и кавинтона (5 мг/кг) на мышечную силу передних лап (граммсилы) крыс в раннем восстановительном периоде после четырехсосудистой перевязки артерий мозга (М±m)The effect of compound I (5 mg / kg) and cavinton (5 mg / kg) on the muscle strength of the forepaws (gram force) of rats in the early recovery period after four-vessel ligation of the arteries of the brain (M ± m) ГруппыGroups Сутки после ишемииDay after ischemia 1one 22 33 55 77 Контроль (Ложно-оперированные)Control (False-operated) 391,0±3,32391.0 ± 3.32 390,8±3,74390.8 ± 3.74 394,0±2,92394.0 ± 2.92 392,0±3,39392.0 ± 3.39 392,0±2,54392.0 ± 2.54 ИшемияIschemia 131,1±22,13*131.1 ± 22.13 * 117,7±16,81*117.7 ± 16.81 * 98,6±24,73*98.6 ± 24.73 * 193,3±8,03*193.3 ± 8.03 * 248,0±13,56*248.0 ± 13.56 * Ишемия + соединение IIschemia + Compound I 343,3±7,60*^+# 343.3 ± 7.60 * ^{+ #} 337,5±8,70*⁺ 337.5 ± 8.70 * ⁺ 344,1±9,86*^+# 344.1 ± 9.86 * ^{+ #} 386,0±4,00^+# 386.0 ± 4.00 ^{+ #} 386,0±5,10^+# 386.0 ± 5.10 ^{+ #} Контроль (Ложнооперированные)Control (False Operated) 392,5±4,23392.5 ± 4.23 393,5±8,34393.5 ± 8.34 391,2±6,42391.2 ± 6.42 390,4±14,2 3390.4 ± 14.2 3 392,5±9,52392.5 ± 9.52 ИшемияIschemia 218,2±20,88*218.2 ± 20.88 * 221,8±20,49*221.8 ± 20.49 * 170,1±33,32*170.1 ± 33.32 * 160,2±30,5*160.2 ± 30.5 * 211,7±44,23211.7 ± 44.23 Ишемия + КавинтонIschemia + Cavinton 275,5±8,9⁺ 275.5 ± 8.9 ⁺ 279,1±11,4279.1 ± 11.4 250,3±12,25⁺ 250.3 ± 12.25 ⁺ 244,0±14,35244.0 ± 14.35 272,1±43,29272.1 ± 43.29 * - данные статистически значимы по отношению к контролю при p≤0,05* - data are statistically significant with respect to control at p≤0.05 ⁺ данные статистически значимы по отношению к ишемии при p≤0,05 ⁺ data are statistically significant with respect to ischemia at p≤0.05 ^# - данные статистически значимы по отношению к кавинтону при p≤0,05 ^# - data are statistically significant with respect to the cavinton at p≤0,05

Таблица 4Table 4 Влияние соединения I (5 мг/кг) и кавинтона (5 мг/кг) на запоминание аверсивного стимула крысами в условной реакции пассивного избегания на седьмой день после четырехсосудистой перевязки артерий мозга (М±m)The effect of compound I (5 mg / kg) and cavinton (5 mg / kg) on the memorization of an aversive stimulus by rats in the conditioned passive avoidance reaction on the seventh day after four-vascular ligation of the arteries of the brain (M ± m) Группа животныхGroup of animals nn Латентное время, сLatent time, s % от контроля% of control Контроль (Ложнооперированные)Control (False Operated) 55 176,0±4,00176.0 ± 4.00 -- ИшемияIschemia 55 15,6±5,08*15.6 ± 5.08 * -91,1-91.1 Ишемия + соединение IIschemia + Compound I 55 149,0±13,27⁺ 149.0 ± 13.27 ⁺ -15,3-15.3 Контроль (Ложнооперированные)Control (False Operated) 99 180,0±0,00180.0 ± 0.00 -- ИшемияIschemia 99 19,1±5,48*19.1 ± 5.48 * -89,44-89.44 КавинтонCavinton 99 89,4±27,2*89.4 ± 27.2 * -50,33-50.33 n - число животных в экспериментеn is the number of animals in the experiment * - данные статистически значимы по отношению к контролю при p≤0,01* - data are statistically significant with respect to control at p≤0.01 ⁺ - данные статистически значимы по отношению к ишемии при p≤0,01 ⁺ - data are statistically significant with respect to ischemia at p≤0.01

Таблица 6Table 6 Влияние соединения I и мексидола на образование активных форм кислорода при люминолзависимой хемилюминесценции (М±m)The effect of compound I and Mexidol on the formation of reactive oxygen species in luminol-dependent chemiluminescence (M ± m) ВеществоSubstance С, мкМC, μM nn S, отн.ед.S rel. % ингибирования% inhibition ИК₅₀, МIR ₅₀ , M КонтрольThe control 0,00,0 4four 76,83±1,2176.83 ± 1.21 -- -- Соединение ICompound I 1,01,0 33 62,93±2,12*62.93 ± 2.12 * 18,118.1 4,44×10^-6 4.44 × 10 ^-6   5,05,0 33 37,03±0,77⁺ 37.03 ± 0.77 ⁺ 51,851.8 R²=0,99R ² = 0.99   10,010.0 33 24,59±1,47⁺ 24.59 ± 1.47 ⁺ 67,967.9 (F=1503,3; P=0,0164)(F = 1503.3; P = 0.0164) КонтрольThe control 0,00,0 33 77,06±4,2177.06 ± 4.21 -- --   10,010.0 33 76,70±0,0076.70 ± 0.00 0,50.5 1,70×10^-4 1.70 × 10 ^-4 МексидолMexidol 50,050,0 33 61,52±0,87*61.52 ± 0.87 * 20,220,2 R²=0,93R ² = 0.93   100,0100.0 33 43,82±1,08⁺ 43.82 ± 1.08 ⁺ 43,143.1 (F=13,05; Р=0,1719)(F = 13.05; P = 0.1719) Примечание: n - количество выполненных повторов на каждое исследование, С - концентрация веществ в мкМ, S - суммарная светимость; * - p≤0,05 по отношению к контролю, ⁺ - p≤0,001 по отношению к контролю.Note: n is the number of performed repeats for each study, C is the concentration of substances in μM, S is the total luminosity; * - p≤0.05 in relation to the control, ⁺ - p≤0.001 in relation to the control.

Таблица 7Table 7 Влияние соединения I и мексидола веществ на генерацию супероксидного радикала в реакции окисления кверцетинаThe effect of compound I and mexidol on the generation of superoxide radical in the oxidation of quercetin ВеществоSubstance С, мкМC, μM % ингибирования% inhibition ИК₅₀, МIR ₅₀ , M Соединение ICompound I 1,01,0 3,03.0 2,48×10^-5 2.48 × 10 ^-5   5,05,0 34,234.2 R²=0,96R ² = 0.96   10,010.0 72,172.1   МексидолMexidol 1,01,0 25,825.8 6,91×10^-4 6.91 × 10 ^-4   10,010.0 26,626.6 R²=0,96R ² = 0.96   100,0100.0 41,741.7  

Таблица 8Table 8 Влияние соединения I и мексидола на генерацию супероксидного радикала в системе ксантин-ксантиноксидаза при люцигенин-зависимой хемилюминесценции (М±m)The effect of compound I and mexidol on the generation of superoxide radical in the xanthine-xanthine oxidase system with lucigenin-dependent chemiluminescence (M ± m) ВеществоSubstance С, мкМC, μM S, отн.ед.S rel. % инг.% ing. ИК₅₀, МIR ₅₀ , M КонтрольThe control 0,00,0 61,62±3,8061.62 ± 3.80 -- -- Соединение ICompound I 0,50.5 42,15±9,2042.15 ± 9.20 31,631.6 9,60×10^-7 9.60 × 10 ^-7   1,01,0 26,79±2,98⁺ 26.79 ± 2.98 ⁺ 56,556.5 R²=0,97R ² = 0.97   5,05,0 8,44±0,40⁺ 8.44 ± 0.40 ⁺ 86,386.3 (F=32,13; P=0,1111)(F = 32.13; P = 0.1111) КонтрольThe control 0,00,0 80,81±7,3380.81 ± 7.33 -- --   10,010.0 93,32±0,0093.32 ± 0.00 -15,5-15.5 1,67×10^-4 1.67 × 10 ^-4 МексидолMexidol 50,050,0 57,72±1,9357.72 ± 1.93 28,628.6 R²=0,99R ² = 0.99   500,0500,0 22,99±1,56*22.99 ± 1.56 * 71,571.5 (F=88,37; P=0,0694)(F = 88.37; P = 0.0694) Примечание: С, мкМ - концентрация веществ, S - суммарная светимость, * - p<0,05 по отношениею к контролю, ⁺ - p<0,001 по отношению к контролюNote: C, μM - concentration of substances, S - total luminosity, * - p <0.05 in relation to the control, ⁺ - p <0.001 in relation to the control

Таблица 9Table 9 Влияние соединения I и мексидола на образование пероксильного радикала при АБАП-индуцированной хемилюминесценции (М±m)The effect of compound I and Mexidol on the formation of a peroxyl radical in ABAp-induced chemiluminescence (M ± m) ВеществоSubstance С, мкМC, μM nn S, отн.ед.S rel. % ингибирования% inhibition ИК₅₀, МIR ₅₀ , M КонтрольThe control 0,00,0 4four 612,09±23,96612.09 ± 23.96 -- --   0,10.1 33 457,37±4,45*457.37 ± 4.45 * 25,225,2 2,00×10^-7 2.00 × 10 ^-7 Соединение ICompound I 0,250.25 33 295,02±2,39*295.02 ± 2.39 * 51,851.8 R²=0,96R ² = 0.96   0,50.5 33 58,67±10,9258.67 ± 10.92 90,490,4 (F=28,04;
Р=0,1188)(F = 28.04;
P = 0.1188) КонтрольThe control 0,00,0 33 698,28±42,64698.28 ± 42.64 -- --   1,01,0 33 396,37±16,78*396.37 ± 16.78 * 43,243,2 1,38×10^-6 1.38 × 10 ^-6 МексидолMexidol 5,05,0 33 158,64±68,18*158.64 ± 68.18 * 77,377.3 R²=0,98R ² = 0.98   10,010.0 33 105,19±15,93*105.19 ± 15.93 * 84,984.9 (F=63,88; Р=0,0792)(F = 63.88; P = 0.0792) Примечание: n - количество выполненных повторов на каждое исследование, С - концентрация веществ в мкМ, S - суммарная светимость; * - p≤0,05 по отношению к контролю.Note: n is the number of repetitions performed for each study, C is the concentration of substances in μM, S is the total luminosity; * - p≤0.05 in relation to the control.

Таблица 10Table 10 Влияние соединения I, мексидола и ацетилсалициловой кислоты на агрегацию тромбоцитов in vitro, индуцированную 5 мкМ АДФThe effect of compound I, mexidol and acetylsalicylic acid on platelet aggregation in vitro induced by 5 μM ADP №No. ВеществаSubstances Антиагрегантная активность, ЭК₅₀ (М)Antiplatelet activity, EC ₅₀ (M) 1.one. Соединение ICompound I 3,30×10^-4 3.30 × 10 ^-4 2.2. МексидолMexidol 1,40×10^-3 1.40 × 10 ^-3 3.3. Ацетилсалициловая кислотаAcetylsalicylic acid 7,27×10^-4 7.27 × 10 ^-4

Таблица 11Table 11 Влияние соединения I и мексидола (3-дневное пероральное введение в дозе 60 мМ) на агрегацию тромбоцитов (индуцированную 5 мкМ АДФ) и количество тромбоцитов (М±m)The effect of compound I and Mexidol (3-day oral administration at a dose of 60 mM) on platelet aggregation (induced by 5 μM ADP) and platelet count (M ± m) №No. Изучаемые веществаStudied substances Степень агрегации, отн.едThe degree of aggregation, rel. Скорость агрегации, отн.ед.Aggregation rate, rel. Степень дезагрегации, %The degree of disaggregation,% Количество тромбоцитов, 10⁹/лPlatelet count, 10 ⁹ / L 1.one. КонтрольThe control 84,05±8,1484.05 ± 8.14 67,25±11,0067.25 ± 11.00 0,95±0,950.95 ± 0.95 359,0±26,70359.0 ± 26.70 2.2. Соединение ICompound I 10,44±2,11*^# 10.44 ± 2.11 * ^# 13,07±2,64*^# 13.07 ± 2.64 * ^# 15,59±6,56*15.59 ± 6.56 * 342,5±17,50342.5 ± 17.50 3.3. МексидолMexidol 56,10±4,05*56.10 ± 4.05 * 28,65±3,06*28.65 ± 3.06 * 14,85±12,0014.85 ± 12.00 330,0±36,00330.0 ± 36.00 Примечание: n - количество исследованийNote: n - number of studies * - данные статистически значимы по отношению к контролю (p<0,05)* - data are statistically significant in relation to control (p <0.05) ^# - данные статистически значимы по отношению к мексидолу (p<0,05) ^# - data are statistically significant with respect to mexidol (p <0.05)

Таблица 12Table 12 Влияние соединения I и пентоксифиллина (%) на вязкость крови доноров в экспериментах in vitro (M±m).The effect of compound I and pentoxifylline (%) on the blood viscosity of donors in in vitro experiments (M ± m). Соединение ICompound I С, МCM Скорость сдвигаShear rate Индекс агрегацииAggregation Index 200 с^-1 200 s ^-1 40 с^-1 40 s ^-1 10 с^-1 10 s ^-1 Соединение ICompound I 1×10^-4 1 × 10 ^-4 -4,24±1,53-4.24 ± 1.53 -9,72±1,74*-9.72 ± 1.74 * -10,93±1,33*-10.93 ± 1.33 * -6,69±1,65*-6.69 ± 1.65 * 1×10^-5 1 × 10 ^-5 -1,32±0,62-1.32 ± 0.62 -10,17±1,52*-10.17 ± 1.52 * -11,54±1,05*-11.54 ± 1.05 * -7,37±1,94*-7.37 ± 1.94 * 1×10^-6 1 × 10 ^-6 0,00±0,000.00 ± 0.00 -1,54±0,78-1.54 ± 0.78 -1,75±0,74-1.75 ± 0.74 -0,48±0,54-0.48 ± 0.54 ПентоксифиллинPentoxifylline 1×10^-4 1 × 10 ^-4 -3,15±0,92-3.15 ± 0.92 -10,30±0,93*-10.30 ± 0.93 * -10,47±1,07*-10.47 ± 1.07 * -7,56±0,63*-7.56 ± 0.63 * 1×10^-5 1 × 10 ^-5 0,00±0,000.00 ± 0.00 -0,01±1,17-0.01 ± 1.17 -0,52±0,52-0.52 ± 0.52 -0,46±1,32-0.46 ± 1.32 1×10^-6 1 × 10 ^-6 0,00±0,000.00 ± 0.00 -1,17±3,50-1.17 ± 3.50 0,24±0,570.24 ± 0.57 -0,24±0,57-0.24 ± 0.57 * - данные статистически значимы (t) по отношению к контролю (p<0,05)* - data are statistically significant (t) in relation to control (p <0.05)

Таблица 13Table 13 Влияние соединения I (10 мг/кг)и пентоксифиллина (8 мг/кг) (при пероральном введении) на вязкость крови (сПз) крыс с ишемией головного мозга при различных скоростях сдвига (М±m)The effect of compound I (10 mg / kg) and pentoxifylline (8 mg / kg) (when administered orally) on the blood viscosity (cP) of rats with cerebral ischemia at different shear rates (M ± m) Группы животныхGroups of animals Скорость сдвигаShear rate 200 с^-1 200 s ^-1 100 с^-1 100 s ^-1 20 с^-1 20 s ^-1 5 с^-1 5 s ^-1 Контроль (Ложнооперированные)Control (False Operated) 3,44±0,093.44 ± 0.09 3,62±0,093.62 ± 0.09 4,72±0,154.72 ± 0.15 6,62±0,46.62 ± 0.4 ИшемияIschemia 4,09±0,22*4.09 ± 0.22 * 4,54±0,24*4.54 ± 0.24 * 6,31±0,33*6.31 ± 0.33 * 10,27±0,63*10.27 ± 0.63 * Ишемия + соединение IIschemia + Compound I 4,08±0,284.08 ± 0.28 4,23±0,274.23 ± 0.27 5,13±0,39^♣ 5.13 ± 0.39 ^♣ 6,45±0,57^♣ 6.45 ± 0.57 ^♣ Ишемия + пентоксифиллинIschemia + Pentoxifylline 3,76±0,143.76 ± 0.14 3,96±0,173.96 ± 0.17 4,84±0,28^♣ 4.84 ± 0.28 ^♣ 6,28±0,62^♣ 6.28 ± 0.62 ^♣ * - данные статистически значимы (критерий Манна-Уитни) по отношению к контролю (p<0,05);* - data are statistically significant (Mann-Whitney test) with respect to control (p <0.05); ♣ - данные статистически значимы (критерий Манна-Уитни) по отношению к ишемии (p<0,05)♣ - data are statistically significant (Mann-Whitney test) in relation to ischemia (p <0.05)

Таблица 14Table 14 Влияние соединения I и мексидола на АБАП-индуцированный окислительный гемолиз эритроцитов кролика in vitro (M±m).The effect of compound I and Mexidol on ABAP-induced oxidative hemolysis of rabbit erythrocytes in vitro (M ± m). ВеществаSubstances С, МCM Гемолиз, %Hemolysis,% Статистическая значимость, РStatistical significance, P Контроль (физ. раствор)Control (saline solution) -- 29,78±0,6529.78 ± 0.65 -- АБАПABAP -- 81,87±5,7081.87 ± 5.70 0,010.01 АБАП + соединение IABAP + compound I 1·10^-4 1 · 10 ^-4 39,29±4,0339.29 ± 4.03 0,010.01 1·10^-5 1 · 10 ^-5 46,61±5,3846.61 ± 5.38 0,020.02 1·10^-6 1 · 10 ^-6 60,81±3,4460.81 ± 3.44 0,050.05 АБАП + МексидолABAP + Mexidol 1·10^-4 1 · 10 ^-4 55,28±0,6055.28 ± 0.60 0,040.04 1·10^-5 1 · 10 ^-5 54,08±2,9954.08 ± 2.99 0,030,03 1·10^-6 1 · 10 ^-6 74,55±13,6074.55 ± 13.60 0,680.68

Создание фармацевтической композиции для получения таблетокThe creation of a pharmaceutical composition for tablets

Разработана фармацевтическая композиция, содержащая в качестве действующего вещества - дигидробромид 2-(3,4-диоксифенил)-9-диэтиламиноэтилимидазо[1,2-а]бензимидазола и в качестве вспомогательных веществ коллидон, лактозу, поливинилпирролидон, тальк, кальция стеарат и натрия метабисульфит. Исследованы композиции при следующем соотношении ингредиентов, вес (г):A pharmaceutical composition has been developed containing 2- (3,4-dioxiphenyl) -9-diethylaminoethylimidazo [1,2-a] benzimidazole dihydrobromide as an active ingredient and collidone, lactose, polyvinylpyrrolidone, talc, calcium stearate and sodium metabisulfite as excipients . The compositions were studied in the following ratio of ingredients, weight (g):

1. Дигидробромид 2-(3,4-диоксифенил)-9-диэтиламиноэтилимидазо [1,2-а]бензимидазола1. Dihydrobromide 2- (3,4-dioxiphenyl) -9-diethylaminoethylimidazo [1,2-a] benzimidazole - или 0,05 г, или 0,20 г, или 1,0 г- or 0.05 g, or 0.20 g, or 1.0 g 2. Коллидона2. Collidona - 0,05 г- 0.05 g 3. Лактозы3. Lactose - 0,062 г- 0.062 g 4. Поливинилпирролидона4. Polyvinylpyrrolidone - 0,02 г- 0.02 g 5. Талька5. Talc - 0,01 г- 0.01 g 6. Кальция стеарата6. Calcium stearate - 0,004 г- 0.004 g 7. Натрия метабисульфита7. Sodium metabisulfite - 0,004 г- 0.004 g

Для получения фармацевтической композиции используют метод прямого прессования смеси лекарственного вещества и вспомогательных веществ. Для этого отвешивают все ингредиенты из расчета на 100 кг таблеточной массы и просеивают через сито с диаметром отверстий 0,25 мм, после чего смешивают в смесителе в следующей последовательности: лактоза, натрия метабисульфит, соединение I, поливинилпирролидон низкомолекулярный медицинский, коллидон, тальк и кальция стеарат. Полученную смесь проверяют на однородность смешения: действующего вещества в таблеточной массе должно быть не менее 58,5% и не более 59,0%. При получении положительного результата таблеточную массу прессуют на таблеточном прессе типа РТМ-24М при давлении прессования 120 МПа.To obtain the pharmaceutical composition using the direct compression method of a mixture of a medicinal substance and excipients. For this, all ingredients are weighed per 100 kg of tablet mass and sieved through a sieve with a hole diameter of 0.25 mm, then mixed in a mixer in the following sequence: lactose, sodium metabisulfite, compound I, low molecular weight polyvinylpyrrolidone, collidone, talc and calcium stearate. The resulting mixture is checked for uniformity of mixing: the active substance in the tablet mass should be at least 58.5% and not more than 59.0%. Upon receipt of a positive result, the tablet mass is pressed on a RTM-24M tablet press at a compression pressure of 120 MPa.

С целью стандартизации таблеток согласно ОСТ 91500.05.001-00 выбраны следующие критерии: описание, подлинность, средняя масса и однородность по массе, тальк, распадаемость, посторонние примеси, микробиологическая чистота и количественное определение соединения I (Таблица 15).In order to standardize tablets according to OST 91500.05.001-00, the following criteria were selected: description, authenticity, average weight and homogeneity by weight, talc, disintegration, impurities, microbiological purity and quantitative determination of compound I (Table 15).

Таблица 15Table 15 Результаты анализа таблеток на основе дигидробромида 2-(3,4-диоксифенил)-9-диэтиламиноэтилимидазо[1,2-а]бензимидазолаThe results of the analysis of tablets based on 2- (3,4-dioxiphenyl) -9-diethylaminoethylimidazo [1,2-a] benzimidazole dihydrobromide ОписаниеDescription ПодлинностьAuthenticity Средняя масса, гAverage weight, g Тальк, %Talc,% Распадаемость, минDisintegration, min Посторонние примесиForeign matter Количественное определение, гQuantitative determination, g Таблетки белого цвета диаметром 10±0,3 мм и высотой 4±0,3 ммWhite tablets with a diameter of 10 ± 0.3 mm and a height of 4 ± 0.3 mm УФ-спектр должен совпадать со спектром раствора РСО РУ-185, Х,=268 нмThe UV spectrum should coincide with the spectrum of the RSO RU-185 solution, X, = 268 nm 0,35±5%0.35 ± 5% не более3%no more than 3% не более 15 минno more than 15 min не более 1%no more than 1% отсутствуютare absent 0,19-0,21 0.19-0.21

Был разработан состав защитного пленочного покрытия, обеспечивающего стабильность при хранении и растворимость в желудке. Из пленкообразователей, обеспечивающих желудочно-растворимые покрытия, нами апробированы следующие: коллидон-30, плаздон S-630, метилцеллюлоза МЦ-16, а также их комбинации. В качестве фотозащитных добавок использованы: тартразин, метиловый оранжевый, двуокись титана и их комбинации. Нанесение покрытия проводили в дражировочном котле путем распыления растворов пленкообразователей с последующей сушкой при t не больше 60°С до увеличения средней массы таблеток в сухом виде на 5%. Состав покрытий приведен ниже (Таблица 16).A protective film coating composition has been developed to provide storage stability and solubility in the stomach. Of the film-forming agents providing gastric-soluble coatings, we have tested the following: collidone-30, plazdon S-630, methylcellulose MC-16, as well as their combinations. As photoprotective additives used: tartrazine, methyl orange, titanium dioxide and their combinations. The coating was carried out in a coating pan by spraying solutions of film formers with subsequent drying at t no more than 60 ° C until the average dry weight of the tablets increased by 5%. The composition of the coatings is given below (Table 16).

Таблица 16Table 16 Состав покрытия таблеток на основе дигидробромида 2-(3,4-диоксифенил)-9-диэтиламиноэтилимидазо [1,2-а] бензимидазола.The coating composition of tablets based on 2- (3,4-dioxiphenyl) -9-diethylaminoethylimidazo [1,2-a] benzimidazole dihydrobromide. №No. КомпонентыComponents Кол.Count 1.one. Коллидон-30Collidon-30 10,010.0 Титана диоксидTitanium dioxide 5,05,0 Краситель (тартразин)Dye (tartrazine) 0,10.1 Вода очищенная доPurified water to 100,0100.0 2.2. Плаздон S-630Plazdon S-630 10,010.0 Метилцеллюлоза МЦ-16Methylcellulose MTs-16 1,01,0 Краситель (метиловый оранжевый)Dye (methyl orange) 0,10.1 Вода очищенная доPurified water to 100,0100.0 3.3. Коллидон-30Collidon-30 5,05,0 Метилцеллюлоза МЦ-16Methylcellulose MTs-16 2,02.0 Титана диоксидTitanium dioxide 5,05,0 Краситель (метиловый оранжевый)Dye (methyl orange) 0,050.05 Вода очищенная доPurified water to 100,0100.0 4.four. Метилцеллюлоза МЦ-16Methylcellulose MTs-16 2,02.0 Титана диоксидTitanium dioxide 5,05,0 Краситель (метиловый оранжевый)Dye (methyl orange) 0,050.05 Вода очищенная доPurified water to 100,0100.0 5.5. Плаздон S-630Plazdon S-630 10,010.0 Титана диоксидTitanium dioxide 5,05,0 Краситель (тартразин)Dye (tartrazine) 0,10.1 Вода очищенная доPurified water to 100,0100.0

Качество нанесенных покрытий оценивали по следующим показателям:The quality of the applied coatings was evaluated by the following indicators:

1. Внешний вид (равномерность покрытия, качество).1. Appearance (uniformity of coating, quality).

2. Распадаемость (мин, вода 37°С).2. Disintegration (min, water 37 ° С).

3. Фотозащитные свойства (отсутствие изменения цвета после снятия покрытия у таблеток, хранившихся при облучении лампой дневного света 10 Вт в течение 10 суток).3. Photoprotective properties (no discoloration after removal of the coating on tablets stored under exposure to a 10 W fluorescent lamp for 10 days).

4. Отклонение от средней массы (не более 5%).4. Deviation from the average weight (not more than 5%).

Таблица 17 содержит результаты оценки качества покрытий.Table 17 contains the results of the assessment of the quality of coatings.

Таблица 17Table 17 Качество покрытий таблеток на основе дигидробромида 2-(3,4-диоксифенил)-9-диэтиламиноэтилимидазо[1,2-а]бензимидазола.The quality of the coatings of tablets based on 2- (3,4-dioxiphenyl) -9-diethylaminoethylimidazo [1,2-a] benzimidazole dihydrobromide. НаименованиеName Внешний видAppearance Распадаемость, минDisintegration, min Фотозашитные свойстваPhoto protection properties Отклонение от средней массыDeviation from the average mass Состав №1Composition No. 1 Не соотв.Not acc. 18eighteen +-+ - ±12%± 12% Состав №2Composition No. 2 Не соотв.Not acc. 15fifteen +-+ - ±9%± 9% Состав №3Composition No. 3 Соотв.Acc. 2222 ++++ ±5%± 5% Состав №4Composition No. 4 Соотв.Acc. 2525 ++++ ±3%± 3% Состав №5Composition No. 5 Не соотв.Not acc. 20twenty --- ±10%± 10%

Как следует из таблицы, оптимальными качествами обладает состав №4. Он экономически выгоден, прост в исполнении.As follows from the table, composition No. 4 has optimal qualities. It is cost effective, easy to implement.

Предлагаемое соотношение действующих, вспомогательных веществ и покрытия является оптимальным, обеспечивает получение качественных таблетированных лекарственных препаратов соединения I и достижение необходимого терапевтического эффекта.The proposed ratio of active, excipients and coatings is optimal, provides high-quality tablet medicines of compound I and the desired therapeutic effect.

Создание фармацевтической композиции для получения лиофилизированного порошка для инъекцийThe creation of a pharmaceutical composition for lyophilized powder for injection

Разработана фармацевтическая композиция, содержащая в качестве действующего вещества дигидробромида 2-(3,4-диоксифенил)-9-диэтиламиноэтилимидазо[1,2-а]бензимидазола и в качестве вспомогательных веществ поливинилпирролидон и лимонную кислоту. Исследованы композиции при следующем соотношении ингредиентов, вес (г):A pharmaceutical composition has been developed containing 2- (3,4-dioxiphenyl) -9-diethylaminoethylimidazo [1,2-a] benzimidazole dihydrobromide as an active ingredient and polyvinylpyrrolidone and citric acid as excipients. The compositions were studied in the following ratio of ingredients, weight (g):

1. Дигидробромида 2-(3,4-диоксифенил)-9-диэтиламиноэтилимидазо[1,2-а]бензимидазола1. Dihydrobromide 2- (3,4-dioxiphenyl) -9-diethylaminoethylimidazo [1,2-a] benzimidazole - или 0,01 г, или 0,1 г, или 2,0 г- or 0.01 g, or 0.1 g, or 2.0 g 2. Поливинилпирролидона2. Polyvinylpyrrolidone - 0,100 г- 0.100 g 3. Лимонной кислоты3. Citric acid - 0,005 г- 0.005 g

Изучение биодоступности фармацевтической композицииStudy of the bioavailability of a pharmaceutical composition

Исследование биодоступности фармацевтической композиции соединения I проводили для таблеток с фотозащитным пленочным покрытием в соответствии с «Методическими рекомендациями по доклиническому изучению фармакокинетики лекарственных средств» (А.А.Фирсов, В.П.Жердев и др. Методические указания по проведению доклинических исследований фармакокинетики фармакологических веществ и лекарственных средств. // Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ: под общ. ред. Р.У.Хабриева. - 2-изд., перераб. и доп.- М.: ОАО «Издательство «Медицина»», 2005. - С.217-229).The bioavailability study of the pharmaceutical composition of compound I was carried out for tablets with a photoprotective film coating in accordance with the “Guidelines for the preclinical study of the pharmacokinetics of drugs” (A.A. Firsov, V.P. Zherdev and others. Guidelines for the preclinical studies of the pharmacokinetics of pharmacological substances and medicines. // Guide to the experimental (preclinical) study of new pharmacological substances: under the general editorship of R.U. Khabriev. - 2-ed. . B and dop.- M .: JSC "" Medicine "Publisher", 2005. - S.217-229).

Эксперименты по изучению фармакокинетики субстанции соединения I и ее фармацевтической композиции проводилось на 10 кроликах-самцах породы шиншилла массой 2,7-3,7 кг, содержавшихся в условиях вивария на стандартной диете. Накануне эксперимента кролики голодали в течение 12 часов без ограничения доступа к воде. Таблетки и субстанцию вводили животным внутрижелудочно через резиновый зонд. Субстанцию вводили в аналогичной дозе, содержащейся в таблетированных лекарственных формах. Кровь забирали из ушной вены самотеком перед введением препарата и затем через определенные временные интервалы после введения. Между экспериментами делали двухнедельный перерыв. В качестве стандарта использовали субстанцию в дозе 54 мг/кг. Забор проб крови производили через 0,5; 1; 1,5; 3; 6; 9 и 12 часов после введения.Experiments on the pharmacokinetics of the substance of compound I and its pharmaceutical composition were carried out on 10 male chinchilla rabbits weighing 2.7-3.7 kg, kept in vivarium on a standard diet. On the eve of the experiment, rabbits starved for 12 hours without limiting access to water. Tablets and substance were administered to animals intragastrically through a rubber tube. The substance was administered in a similar dose contained in tablet dosage forms. Blood was taken from the ear vein by gravity before administration of the drug and then at certain time intervals after administration. A two-week break was taken between the experiments. A substance at a dose of 54 mg / kg was used as a standard. Blood samples were taken after 0.5; one; 1.5; 3; 6; 9 and 12 hours after administration.

Содержание соединения I определяли методом ВЭЖХ на жидкостном хроматографе «Gilson» серии 6000 (Франция) с флуоресцентным детектором на колонке С18 4,6×250 мм, 5 µм. Подвижная фаза составляет смесь ацетонитрила (60%) и ацетатного буфера с pH 5,0 (40%). Длина волны возбуждения 270 нм, длина волны эмиссии 330 и 410 нм. Чувствительность метода составляет для эноксифола 1 µг/мл и для продуктов его окисления 100 nг/мл. Идентификацию исследуемых веществ и расчет их концентрации проводили по методу абсолютных стандартов. Время удерживания для соединения I составило 4,4-4,8 мин, для продукта окисления - 5,8-6,0 мин.The content of compound I was determined by HPLC on a Gilson 6000-series liquid chromatograph (France) with a fluorescence detector on a C18 column of 4.6 × 250 mm, 5 μm. The mobile phase is a mixture of acetonitrile (60%) and acetate buffer with a pH of 5.0 (40%). The excitation wavelength of 270 nm, the emission wavelength of 330 and 410 nm. The sensitivity of the method is 1 µg / ml for enoxifol and 100 ng / ml for its oxidation products. Identification of the studied substances and calculation of their concentration was carried out according to the absolute standard method. The retention time for compound I was 4.4-4.8 minutes, for the oxidation product - 5.8-6.0 minutes.

Фармакокинетические параметры рассчитывали методом статистических моментов (В.К.Пиотровский. Метод статистических моментов и интегральное модельнонезависимые параметры фармакокинетики. // Фармакология и токсикология. - 1986. - №5. - т.49. - c.118-127).Pharmacokinetic parameters were calculated by the method of statistical moments (V.K. Piotrovsky. Method of statistical moments and integral model-independent parameters of pharmacokinetics. // Pharmacology and Toxicology. - 1986. - No. 5. - v. 49. - p. 118-127).

Содержание соединения I в крови кроликов при введении субстанции и таблетки с фотозащитным покрытием в дозе 50 мг приведены на чертеже, где по оси абсцисс приведено время (час), по оси ординат - концентрация мкг/мл. Как видно из чертежа, при введении таблетки с фотозащитным покрытием фармакокинетическая кривая практически не отличается от таковой при введении субстанции.The content of compound I in the blood of rabbits with the introduction of a substance and a tablet with a photoprotective coating at a dose of 50 mg is shown in the drawing, where the time (hour) is shown on the abscissa axis, and the concentration μg / ml on the ordinate axis. As can be seen from the drawing, when introducing a tablet with a photoprotective coating, the pharmacokinetic curve practically does not differ from that with the introduction of the substance.

Фармакокинетические параметры субстанции и таблетированной лекарственной формы эноксифола представлены в Таблица 18.The pharmacokinetic parameters of the substance and tablet dosage form of enoxifol are presented in Table 18.

Относительная биодоступность (f отн.) таблетки с фотозащитным покрытием составляет 95%.The relative bioavailability (f Rel.) Tablets with photoprotective coating is 95%.

Таблица 18Table 18 Фармакокинетические параметры субстанции Соединения I и таблеток с фотозащитным покрытием при пероральном введении кроликамPharmacokinetic parameters of the substance of Compound I and photoprotective coated tablets for oral administration to rabbits ПараметрParameter СубстанцияSubstance Таблетка с фотозащитным покрытиемSunscreen tablet AUC, µg/ml/часAUC, µg / ml / hour 62,7662.76 59,4359.43 Cmax, ng/mlCmax, ng / ml 14,514.5 13,913.9 Тmax, минTmax, min 180180 180180 f отн.f rel   0,950.95

Таким образом, при проведении биофармацевтического анализа установлено, что таблетированная лекарственная форма является биоэквивалентной по отношению к субстанции и не препятствует высвобождению и всасыванию лекарственных веществ в желудочно-кишечном тракте. Таблетки соединения I с фотозащитным пленочным покрытием обладают высокой биологической доступностью (выше 90%). Фармакокинетические параметры при введении лекарственной формы практически не отличаются от таковых при введении субстанции.Thus, when conducting biopharmaceutical analysis, it was found that the tablet dosage form is bioequivalent with respect to the substance and does not interfere with the release and absorption of drugs in the gastrointestinal tract. Compound I tablets with a photoprotective film coating have high bioavailability (above 90%). The pharmacokinetic parameters with the introduction of the dosage form practically do not differ from those with the introduction of the substance.

Claims (10)

1. Применение дигидробромида 2-(3,4-дигидроксифенил)-9-диэтиламино-этилимидазо[1,2-а]бензимидазола формулы

при производстве лекарственного средства, обладающего противоишемическими, гемореологическими и антирадикальными свойствами.1. The use of dihydrobromide 2- (3,4-dihydroxyphenyl) -9-diethylaminoethylimidazo [1,2-a] benzimidazole of the formula

in the manufacture of a medicinal product with anti-ischemic, hemorheological and antiradical properties. 2. Фармацевтическая композиция, обладающая противоишемическими, гемореологическими и антирадикальными свойствами, содержащая дигидробромид 2-(3,4-дигидроксифенил)-9-диэтиламиноэтилимидазо[1,2-а]бензимидазола в эффективном количестве и фармацевтически приемлемый носитель.2. A pharmaceutical composition having anti-ischemic, hemorheological and anti-radical properties, containing 2- (3,4-dihydroxyphenyl) -9-diethylaminoethylimidazo [1,2-a] benzimidazole dihydrobromide and a pharmaceutically acceptable carrier. 3. Фармацевтическая композиция по п.2, отличающаяся тем, что носитель представляет собой вещество, выбранное из группы коллидон, лактоза, поливинилпирролидон, тальк, кальция стеарат, натрия метабисульфит и их комбинации.3. The pharmaceutical composition according to claim 2, characterized in that the carrier is a substance selected from the group of collidone, lactose, polyvinylpyrrolidone, talc, calcium stearate, sodium metabisulfite and combinations thereof. 4. Фармацевтическая композиция по любому из пп.2 или 3, отличающаяся тем, что содержит дигидробромид 2-(3,4-дигидроксифенил)-9-диэтиламиноэтилимидазо[1,2-а]бензимидазола в количестве 0,05-1,0 г на единичную дозу.4. The pharmaceutical composition according to any one of claims 2 or 3, characterized in that it contains 2- (3,4-dihydroxyphenyl) -9-diethylaminoethylimidazo [1,2-a] benzimidazole dihydrobromide in an amount of 0.05-1.0 g per unit dose. 5. Фармацевтическая композиция по п.3, отличающаяся тем, что содержит следующее количественное соотношение компонентов, г:
Дигидробромид 2-(3,4-дигидроксифенил)-   9-диэтиламиноэтилимидазо[1,2-а]бензимидазола 0,20 Коллидон 0,05 Лактоза 0,062 Поливинилпирролидон 0,02 Тальк 0,01 Кальция стеарат 0,004 Натрия метабисульфит 0,004 5. The pharmaceutical composition according to claim 3, characterized in that it contains the following quantitative ratio of components, g:
2- (3,4-dihydroxyphenyl) dihydrobromide - 9-diethylaminoethylimidazo [1,2-a] benzimidazole 0.20 Collidon 0.05 Lactose 0,062 Polyvinylpyrrolidone 0.02 Talc 0.01 Calcium stearate 0.004 Sodium metabisulfite 0.004 6. Фармацевтическая композиция по п.2, отличающаяся тем, что она выполнена в виде лиофилизированного порошка для инъекций.6. The pharmaceutical composition according to claim 2, characterized in that it is made in the form of a lyophilized powder for injection. 7. Фармацевтическая композиция по п.6, отличающаяся тем, что в качестве носителя она содержит поливинилпирролидон и лимонную кислоту.7. The pharmaceutical composition according to claim 6, characterized in that it contains polyvinylpyrrolidone and citric acid as a carrier. 8. Фармацевтическая композиция по любому из пп.6 или 7, отличающаяся тем, что содержит дигидробромид 2-(3,4-дигидроксифенил)-9-диэтиламиноэтилимидазо[1,2-а]бензимидазола в количестве 0,01-2,0 г на единичную дозу.8. The pharmaceutical composition according to any one of claims 6 or 7, characterized in that it contains 2- (3,4-dihydroxyphenyl) -9-diethylaminoethylimidazo [1,2-a] benzimidazole dihydrobromide in an amount of 0.01-2.0 g per unit dose. 9. Фармацевтическая композиция по п.7, отличающаяся тем, что содержит следующее количественное соотношение компонентов, г:
Дигидробромид 2-(3,4-дигидроксифенил)-   9-диэтиламиноэтилимидазо[1,2-а]бензимидазола 0,100 Поливинилпирролидон 0,100 Лимонная кислота 0,005 9. The pharmaceutical composition according to claim 7, characterized in that it contains the following quantitative ratio of components, g:
2- (3,4-dihydroxyphenyl) dihydrobromide - 9-diethylaminoethylimidazo [1,2-a] benzimidazole 0,100 Polyvinylpyrrolidone 0,100 Lemon acid 0.005 10. Фармацевтическая композиция по п.5, отличающаяся тем, что она выполнена в виде твердой лекарственной формы и покрыта защитным пленочным покрытием, содержащим следующее количественное соотношение компонентов, г:
Метилцеллюлоза МЦ-16 2,0 Титана диоксид 5,0 Краситель (метиловый оранжевый) 0,05 Вода очищенная до 100 10. The pharmaceutical composition according to claim 5, characterized in that it is made in the form of a solid dosage form and is coated with a protective film coating containing the following quantitative ratio of components, g:
Methylcellulose MTs-16 2.0 Titanium dioxide 5,0 Dye (methyl orange) 0.05 Purified water up to 100

Images