PL184557B1 - Białko fragment antygenowy izolowany DNA rekombinowany DNA komórka gospodarza sposób wytwarzania białka i zastosowanie białka - Google Patents

Abstract

1. Bialko, bedace Trp2 6 6 -ludzka gruczolowa kalikreina-1 (Trp2 2 6 -hK2), posiadajaca se- kwencje identyczna z Arg226-hK2 oprócz zmiany Arg2 2 6 na Trp, lub które jest Trp226-hK2 po- siadajacym przedluzenie N- i/lub C-terminalne i które zachowuje zdolnosc do wiazania przeciwcial Trp2 6 6 -hK2 lub przeciwcial wobec antygenu specyficznego dla ludzkiej prostaty, pod warunkiem, ze jesli wymienione bialko jest bialkiem naturalnie wystepujacym, jest ono zasadniczo wolne od innych bialek, z którymi zwykle jest zwiazane. PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest białko, fragment antygenowy, izolowany DNA, rekombinowany DNA, komórka gospodarza, sposób wytwarzania białka i zastosowanie białka. W szczególności wynalazek dotyczy nowej postaci ludzkiej gruczołowej kalikreiny-1 (hK2), kodowanej przez ostatnio zidentyfikowany gen hK2, oraz zastosowania technik rekombinacji DNA do uzyskania białek kodowanych przez geny hK2, włączając dojrzałe białko kodowane przez wcześniej rozpoznany gen hK2, Arg226-hK2 jako białko aktywne.

Rodzina genu ludzkiej gruczołowej kalikreiny składa się z genów, kodujących trzy różne białka: antygen specyficzny dla prostaty (PSA), gruczołowąkalikreinę-1 (hK2) i kalikreinę trzustkową/nerkową (KLK1). Geny te sąpołożone na chromosomie 19, a geny PSA i hK2 są uszeregowane w odległości 12 kb (1). Podobieństwo regionu kodującego ludzkiego genu KLK1 do regionów kodujących ludzkich genów PSA i K2, wynosi odpowiednio 74% i 75%. Regiony kodujące genów hPSA i hK2 są w 85% homologiczne, a regiony promotora tego samego genu są homologiczne w 91 %. Gen KLK1 koduje prawdziwą kalikreinę. KLK1 posiada aktywność kininogenazy i podlega ekspresji w nerkach, trzustce i gruczołach ślinowych (2). Za pomocą hybrydyzacji in situ, pokazano, że geny hPSA i hK2 podlegają ekspresji tylko w komórkach nabłonka prostaty. Mimo podobieństwa genów hK2 i hPSA, poziom ekspresji genu hK2 na poziomie

184 557 mRNA wynosi tylko około 10-30% poziomu genu hPSA w postaci (3). Przy testowaniu za pomocą komórek LNCaP, obserwowano regulację przez oczyszczanie poziomu mRNA zarówno dla hK2 jak i hPSA, w obecności androgenów (4).

Obecnie, dalsze badania wskazały, że ekspresja hK2 i hPSA nie jest faktycznie specyficzna dla prostaty, jak uważano wcześniej. Za pomocą analizy Southern biot przy użyciu sond oligonukleotydowych specyficznych dla genu po RT-PCR, wykryto ekspresję wszystkich trzech, przedtem zidentyfikowanych, genów ludzkiej kalikreiny, w ludzkiej śluzówce macicy (5). Wykryto także hPSA w mleku karmiących kobiet, za pomocą oznaczenia immunologicznego (6). Odkryto dodatkowo, że 30-40% guzów piersi, jak również hormonalnie stymulowane próbki normalnej tkanki piersi, zawierają hPSA (7).

Gen hK2 wyizolowano i sekwencjonowano z biblioteki DNA ludzkiej, genomowej wątroby płodowej (8a). Odkryto, że sekwencja nukleotydowa pięciu eksonów kodujących tego genu hK2 koduje 261 preprobiałek aminokwasowych z peptydem sygnałowym o 17 aminokwasach oraz peptydem aktywacyjnym o 7 aminokwasach, podobnie jak PSA. Odkryto, że hK2 posiada typową triadę katalityczną (His41-Asp-96-Ser189) proteaz serynowych. Obecność reszty asparaginianu w pozycji aminokwasu 183 w hK2, zapewnia temu białku aktywność substratu podobną do trypsyny. Jeśli chodzi o PSA reszta serynyjest w takiej samej pozycji, jaka odpowiada PSA, wykazując dla kontrastu aktywność podobną do chymotrypsyny (8).

FunkcjąPSA jest rozkładanie skrzepów galarety nasiennej (9), lecz funkcja hK2 jest nieznana. Stężenie PSA w surowicy wzrasta przy raku i przeroście gruczołu krokowego i PSA szeroko stosuje się jako marker do wykrywania i monitoringu raka prostaty (10). Z powodu wysokiej homologii między genami hPSA i hK2, białko hK2 jednakże, pozostaje do oczyszczenia. Również, czystość PSA nie zawsze jest jednoznaczna. Powoduje to problemy z oznaczeniami hPSA, które opierają się na przeciwciałach monoklonalnych lub poliklonalnych, wzrastających przeciw hPSA.

Białko hK2 otrzymano teraz wolne od zanieczyszczającego hPSA, drogą kloningu cDNA hK2 z biblioteki cDNA tkanki raka prostaty, w wektorze ekspresji i wykazujące ekspresję cDNA w odpowiednich komórkach gospodarza. Konkretniej, białko hK2 wytworzono przez zapewnienie wektora ekspresji bakulowirusa, kodującego białko prepro-hK2 w komórkach owadów (patrz przykłady 4 i 5). Podczas gdy opisuje się tutaj tylko zastosowanie w wytwarzaniu białka hK2 układu wektora ekspresji bakulowirusa, w szczególności można użyć rekombinowanego wirusa Autographa California Nuclear Polyhedrosis (AcNPV), zawierającego sekwencję kodująca dla prepro-hK2 pod kontrolą promotora polihedryny, inne układy wektorów ekspresji powszechnie stosowane do wytwarzania ludzkich białek. Jeśli jednakże np. stosuje się wektor ekspresji, kodujący białko prepro-hK2 do transformowania komórek bakteryjnych np. komórek E. coli, będzie docenione, że w odróżnieniu od przypadku powyższego układu wektora ekspresji bakulowirusa, prepro-sekwencja nie zostanie usunięta przez obróbkę potranslacyjną, aby dać bezpośrednio odpowiadające dojrzałe białko np. aktywne dojrzałe Arg²2--hK2.

Przez klonowanie cDNA hK2 z biblioteki ludzkiej prostaty, zidentyfikowano obecnie cDNA hK2, który posiada jedną podstawową różnicę w stosunku do sekwencji kodującej dla hK2, o której poprzednio doniesiono. Różnica ta w pozycji 792 (C na T) równa się zmianie aminokwasów w pozycji aminokwasu 266 z Arg na Trp. To, że obserwowana podstawowa różnica nie była artefaktem w klonowania cDNA i procedurze sekwencjonowania lecz odzwierciedla istnienie przedtem zidentyfikowanego genu hK2, potwierdzono przez użycie PCR do powielenia genu hK2 z genomowego DNA licznych próbek ludzkiej prostaty i leukocytów (patrz przykład 2).

Przedmiotem wynalazku jest białko, będące Trp2---ludzką gruczołową kalikreiną-1 (Trp22--hK2), posiadającą sekwencję identycznąz Arg226-hK2 oprócz zmiany Arg22- na Trp, lub które jest Trp22--hK2, posiadającym przedłużenie N- i/lub C-terminalne i które zachowuje zdolność do wiązania przeciwciał Trp2---hK2 lub przeciwciał wobec antygenu specyficznego dla ludzkiej prostaty, pod warunkiem, że jeśli wymienione białko jest białkiem naturalnie występującym, jest ono zasadniczo wolne od innych białek, z którymi zwykle jest związane.

184 557

Korzystnie białko według wynalazku, wybrane spośród proTrp²²⁶-hK2 lub prepro-Trp²²⁶-hK2 charakteryzuje się tym, że Trp226-hK2 łączy się przy końcu N z sekwencjami pro- lub prepro-, prepro-Arg266-hK2.

Bardziej korzystnie białko Trp226-hK2, posiada N-terminalne przedłużenie dipeptydowe Ser-Arg.

Białko (Trp226-hK2) według wynalazku najkorzystniej występuje w czystej postaci.

Przedmiotem wynalazku jest również fragment antygenowy białka będącego Trp²26-ludzką gruczołową kalikreiną-1 (Trp226-hK2), posiadającą sekwencję identyczną z Arg²²⁶-hK2 oprócz zmiany Arg2²⁶ na Trp, lub które jest Trp266-hK2, posiadającym przedłużenie N- i/lub C-terminalne i które zachowuje zdolność do wiązania przeciwciał Trp26⁶-hK2 lub przeciwciał wobec antygenu specyficznego dla ludzkiej prostaty, pod warunkiem, że jeśli wymienione białko jest białkiem naturalnie występującym, jest ono zasadniczo wolne od innych białek, z którymi zwykle jest związane, który to fragment zachowuje resztę aminokwasową Trp226 Trp²²⁶-hK2 i zdolność do wiązania przeciwciał Trp226-hK2.

Wynalazek dotyczy także izolowanego DNA, zawierający sekwencję identyczną z DNA Arg22⁶-hK2 oprócz zmiany pojedynczego nukleotydu z C na T, przekładającą się na zmianę aminokwasu w pozycji 226 z Arg na Trp i kodujący białko będące Trp22⁶-ludzką gruczołową kalikreiną-1 (Trp226-hK2), posiadającą sekwencję identyczną z Arg226-hK2 oprócz zmiany Arg226 na Trp, lub które jest Trp226-hK2, posiadającym przedłużenie N- i/lub C-terminalne i które zachowuje zdolność do wiązania przeciwciał Trp226-hK2 lub przeciwciał wobec antygenu specyficznego dla ludzkiej prostaty, pod warunkiem, że jeśli wymienione białko jest białkiem naturalnie występującym, jest ono zasadniczo wolne od innych białek, z którymi zwykle jest związane lub antygenowy fragment tego białka, który to fragment zachowuje resztę aminokwasową Trp226 Trp226-hK2 i zdolność do wiązania przeciwciał Trp226-hK2.

Następnym przedmiotem wynalazku jest rekombinowany DNA, obejmujący sekwencję DNA identyczną do DNA Arg266-hK2 oprócz zmiany pojedynczego nukleotydu z C na T, przekładającą się na zmianę aminokwasu w pozycji 226 z Arg na Trp kodujący białko będące Trp226-ludzkągruczołowa kalikreiną-1 (Trp2⁶⁶-hK2), posiadającą sekwencję identycznąz Arg226-hK2 oprócz zmiany Arg22^& na Trp, lub które jest Trp226-hK2, posiadającym przedłużenie N- i/lub C-terminalne i które zachowuje zdolność do wiązania przeciwciał Trp226-hK2 lub przeciwciał wobec antygenu specyficznego dla ludzkiej prostaty, pod warunkiem, że jeśli wymienione białko jest białkiem naturalnie występującym, jest ono zasadniczo wolne od innych białek, z którymi zwykle jest związane lub antygenowy fragment tego białka, który to fragment zachowuje resztę aminokwasową Trp226 Trp226-hK2 i zdolność do wiązania przeciwciał Trp226-hK2.

Korzystnie rekombinowany DNA według wynalazku, charakteryzuje się tym, że występuje w postaci wektora.

W następnej korzystnej postaci wynalazku rekombinowany DNA stanowi wektor ekspresji, w którym sekwencja kodująca ludzką gruczołową kalikreiną-1 (Trp26⁶-hK2) lub jej fragment antygenowy jest operacyjnie związana z sekwencją promotora, zdolnego do ukierunkowywania ekspresji wspomnianej sekwencji kodującej w komórkach owadzich, przy czym ludzka gruczołowa kalikreina-1 (Trp266-hK2) posiada sekwencję identycznąz Arg22^fi-hK2 oprócz zmiany Arg²2⁶ na Trp, lub która jest Trp2²⁶-hK2, posiadającą przedłużenie N- i/lub C-terminalne i która zachowuje zdolność do wiązania przeciwciał Trp22⁶-hK2 lub przeciwciał wobec antygenu specyficznego dla ludzkiej prostaty, pod warunkiem, że jeśli wymienione białko jest białkiem naturalnie występującym, jest ono zasadniczo wolne od innych białek, z którymi zwykle jest związane, lub antygenowy fragment tego białka, który to fragment zachowuje resztę aminokwasową Trp²²6 Trp²26-hK2 i zdolność do wiązania przeciwciał Trp²26-hK2.

Wektorem ekspresji może być wektorem ekspresji bakulowirusa, w którym sekwencja kodująca ludzką gruczołową kalikreiną-1 (Trp266-hK2) lub jej fragment antygenowy jest operacyjnie związana z sekwencjąpromotora, zdolnego do ukierunkowywania ekspresji wspomnianej sekwencji kodującej w komórkach owadzich, przy czym ludzka gruczołowa kalikreina-1 (Trp266-hK2) posiada sekwencję identycznąz Arg2²6-hK2 oprócz zmiany Arg²'^<! na Trp, lub która jest Trp226-hK2, posiadającą

184 557 przedłużenie N- i/lub C-terminalne i która zachowuje zdolność do wiązania przeciwciał Trp²²⁶-hK2 lub przeciwciał wobec antygenu specyficznego dla ludzkiej prostaty, pod warunkiem, że jeśli wymienione białko jest białkiem naturalnie występującym, jest ono zasadniczo wolne od innych białek, z którymi zwykle jest związane, lub antygenowy fragment tego białka, który to fragment zachowuje resztę aminokwasowaTrp226 Trp226-hK2 i zdolność do wiązania przeciwciał Trp226-hK2.

Rekombinantowy DNA według wynalazku korzystnie może stanowić wektor ekspresji bakulowirusa zawierającego sekwencję kodującą dla prepro-Trp226-hK2 pod kontrolą promotora, umożliwiającego kierowanie ekspresjąprepro-Trp²66-hK2 w komórkach owadów.

Korzystnie rekombinowany DNA może być rekombinowanym wektorem ekspresji bakulowirusa AcNPV, w którym sekwencja kodująca dla prepro-Trp266-hK2 jest pod kontrolą promotora polihedryny.

Przedmiotem wynalazku jest także komórka gospodarza, zawierająca wektor obejmujący rekombinowany DNA, który zawiera sekwencję identyczną z Arg226-hK2 oprócz zmiany pojedynczego nukleotydu z C na T przekładający się na zmianę aminokwasu w pozycji 226 z Arg na Trp kodujący białko będące Trp226-ludzkągruczołowąkalikreiną-1 (Trp266-hK2), posiadającą sekwencję identycznąz Arg226-hK2 oprócz zmiany Arg²26 na Trp, lub które jest Trp2^?6-hK2, posiadającym przedłużenie N- i/lub C-terminalne i które zachowuje zdolność do wiązania przeciwciał Trp²26-hK2 lub przeciwciał wobec antygenu specyficznego dla ludzkiej prostaty, pod warunkiem, żejeśli wymienione białko jest białkiem naturalnie występującym, jest ono zasadniczo wolne od innych białek, z którymi zwykle jest związane lub antygenowy fragment tego białka, który to fragment zachowuje resztę aminokwasowąTrp226 Trp226-hK2 i zdolność do wiązania przeciwciał Trp2²6-hK2.

Następnym przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania białka, które jest ludzką gruczołową kalikreiną-1 (Trp226-hK2), posiadającą sekwencję identyczną/ Arg²²6-hK2 oprócz zmiany Arg²²6 na Trp, lub które jest Trp²²ⁱ’-hK2, posiadającym przedłużenie N- i/lub C-terminalne i które zachowuje zdolność do wiązania przeciwciał Trp266-hK2 lub przeciwciał wobec antygenu specyficznego dla ludzkiej prostaty, lub jego fragmentu antygenowy, polegający na tym, że hoduje się komórkę gospodarza zawierającą wektor ekspresji w którym sekwencjąkodująca, wspomnianą ludzką gruczołową kalikreinę-1 (Trp²66-hK2) lub jej fragment antygenowy jest operacyjnie związana z sekwencjąpromotora, zdolnego do ukierunkowywania ekspresji wspomnianej sekwencji kodującej w komórkach owadzich, pod warunkiem, że wspomniane białko jest wytwarzane w komórkach gospodarza lub w pożywce hodowlanej i izoluje się wspomniane białko z komórek lub z pożywki, przy czym wspomniany antygenowy fragment zachowuje resztę aminokwasową Trp226 Trp²26-hK2 i zdolność do wiązania przeciwciał Trp226-hK2.

Korzystnie w sposobie według wynalazku stosuje się komórki owadów, zawierające wektor ekspresji bakulowirusa zawierającego sekwencję kodującąprepro-Trp266-hK2, pod kontrolą promotora zdolnego do ukierunkowania ekspresji prepro-Trp²66-hK2 w komórkach owadzich i izoluje się z pożywki hodowlanej Trp266-hK2 z N-terminalnym przedłużeniem dwupeptydowym Ser-Arg.

W sposobie tym izolacja obejmuje chromatografię jonowymienną i chromatografię żelowo-filtracyjną.

Korzystnie w sposobie według wynalazku Trp226-hK2 z N-terminalnym przedłużeniem dwupeptydowym Ser-Arg, podlega przekształceniu w Trp226-hK2.

Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie białka które jest ludzką gruczołową kalikreiną-1 (Trp226-hK2), posiadającą sekwencję identyczną z Arg226-hK2 oprócz zmiany Arg226 na Trp, lub, która jest Trp226-hK2, posiadającą przedłużenie N- i/lub C-terminalne i która zachowuje zdolność do wiązania przeciwciał Trp²66-hK2 lub przeciwciał wobec antygenu specyficznego dla ludzkiej prostaty, lub antygenowy fragment tego białka, który to fragment zachowuje resztę aminokwasową Trp226 Trp²²6-hK2 i zdolność do wiązania przeciwciał Trp²26-hK2 jako immunogen do otrzymania przeciwciał zdolnych do wiązania wspomnianego białka.

Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie białka które jest ludzką gruczołową kalikreiną-1 (Trp²26-h K2ł), posiadającą sekwencj ę identycznąz Arrg²26-hK2 oprócz zmiany Ai'g226 _na

184 557

Trp, lub, która jest Trp226-hK2, posiadającąprzedłużenie N- i/lub C-terminalne i która zachowuje zdolność do wiązania przeciwciał Trp266-hK2 lub przeciwciał wobec antygenu specyficznego dla ludzkiej prostaty, lub antygenowy fragment tego białka, który to fragment zachowuje resztę aminokwasową Trp226 Trp226-hK2 i zdolność do wiązania przeciwciał Trp226-hK2 jako immunogen do otrzymania przeciwciał monoklonalnych, umożliwiających wiązanie wymienionego białka.

Korzystnie zastosowanie białka dodatkowo obejmuje znakowanie wymienionych przeciwciał lub przeciwciała.

Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie białka które jest ludzką gruczołową kalikreiną-1 (Trp226-hK2), posiadającą sekwencję identyczną z Arg226-hK2 oprócz zmiany Arg226 na Trp, lub, którajest Trp²²6-hK2, posiadąjącąprzedłużenie N- i/lub C-terminalne i która zachowuje zdolność do wiązania przeciwciał Trp22⁶-hK2 lub przeciwciał wobec antygenu specyficznego dla ludzkiej prostaty, lub antygenowy fragment tego białka, który to fragment zachowuje resztę aminokwasowa Trp226 Trp226-hK2 i zdolność do wiązania przeciwciał Trp226-hK2 jako immunogen jako standardowego odniesienia lub do testowania pod względem reaktywności przeciwciała wobec wymienionego białka w oznaczeniu immunologicznym lub oznaczeniu immunohistochemicznym.

Białka według wynalazku obejmują, poza Trp226-hK2 w zasadniczo czystej postaci, np. pro-Trp²26-hK2 lub prepro-Trp226-hK2 w zasadniczo czystej postaci, w której Trp226-hK2 jest połączony na końcu na N- z sekwencjami pro- lub preprozidentyfikowanymi wcześniej dla Arg226-hK2. Białko według niniejszego wynalazku, jest Trp226-hK2, posiadający dieptydowe przedłużenie N-terminalne Ser-Arg. Odkryto, że raczej tą pochodną Trp226-hK2 niż Trp226-hK2 jako takie, otrzymuje się przez ekspresję cDNA, kodującego prepro-Trp226-hK2 w komórkach owadów. Można to wykryć za pomocą konwencjonalnego oznaczenia immunologicznego hPSA jakie są dostępne do użytku w badaniach klinicznych, przedstawiając w ten sposób reaktywność krzyżową ze znanymi przeciwciałami anty-hPSA, lecz jest nieaktywna (patrz przykład 3).

Fragmenty białek Trp226-hK2 jakie powyżej opisano zachowują antygeniczność i resztę aminokwasową Trp226. Wszystkie takie fragmenty i każde białko, posiadające sekwencje Trp226-hK2, zawarte są w terminie białka Trp226-hK2 użytym później.

Izolowany DNA lub rekombinowany DNA, kodujący białko Trp226-hK2 może obejmować naturalną sekwencję kodującą dla Trp226-hK2, korzystniej pełną naturalną sekwencję kodującą dla prepro-Trp226-hK2. Taki rekombinowany DNA może występować w postaci wektora, np. plazmidu lub wektora wirusowego. Pożądane jest, aby taki wektor mógł być wektorem ekspresji, który gdy jest obecny w komórkach gospodarza, zdolny jest do kierowania wytwarzaniem białka Trp226-hK2 według wynalazku w wymienionych komórkach lub pożywce hodowlanej. Jak tu przedtem wskazano, szczególnie zalecany jest np. wektor ekspresji bakulowirusa, który gdy jest obecny w komórkach owadów, jest zdolny do kierowania wytwarzaniem białka Trp^-hKZ według wynalazku w pożywce hodowlanej lub wymienionych komórkach.

Wynalazek dostarcza komórek gospodarza, zawierających wektor według wynalazku jaki tutaj opisano, oraz sposobu wytworzenia białka Trp226-hK2 według wynalazku, który obejmuje hodowane komórki gospodarza według wynalazku, zawierające wektor ekspresji w warunkach, w których wymienione białko jest wytwarzane w komórkach gospodarza lub pożywce hodowlanej, oraz izolowania wymienionego białka z wymienionych komórek lub pożywki. Przykładowo, wymienionymi komórkami są komórki owadów, zawierające wektor ekspresji bakulowirusa do ekspresji w komórkach prepro-Trp226-hK2, jak opisane tu wcześniej Trp226-hK2 z N-terminalnym przedłużeniem dipeptydowym Ser-Arg, którą można oczyścić z pożywki hodowlanej. Do tego celu protokół oczyszczania może np. obejmować połączenie etapów chromatografii jonowymiennej i chromatografii żelowo-filtracyjnej (patrz przykład 5). Otrzymanąw ten sposób pochodną Trp226-hK2 można następnie łatwo przekształcić w Trp226-hK2, przy użyciu technik dobrze znanych fachowcom z dziedziny inżynierii białek.

Jeśli w układzie ekspresji bakulowirusa jaki opisano powyżej sekwencję prepro-Trp226-hK2 podstawia się sekwencją, kodąjąjąprepro-Arg226-hK2 lub Arg226-hK2 połączonym z alternatywną sekwencją N-terminalną, umożliwiającą obróbkę w komórkach owadów, aby dać wydzielone

184 557 dojrzałe Arg22⁶-hK2, aktywne Arg²²6-hK2 można alternatywnie izolować z pożywki hodowlanej owadzich komórek gospodarza np. przez protokół oczyszczania, obejmujący połączenie etapów chromatografii .jonowymiennej i chromatografii żelowo-filtracyjnej (patrz przykład 5). W ten sposób, istnieje teraz dodatkowo dostarczone aktywne Arg226-hK2 zasadniczo wolne od innych białek, z którymi zwykle jest związane, a szczególniej aktywne Arg22⁶-hK2 w zasadniczo czystej postaci.

Przez aktywne Arg²²6-hK2 rozumie się białko, posiadające dojrzałą sekwencję Arg22⁶-hK2 i umożliwiające hydrolizę substratu syntetycznego polipeptydu chromogenicznego H-D-Pro-Arg-pNAH · 2HCl, gdzie pNA jest p-nitroaniliną, w procedurze oznaczenia jaką opisano w przykładzie 5. Aktywne Arg226-hK2 początkowo tak otrzymane, może być następnie trawione do fragmentów antygenicznych. Izolacja Arg22^&-hK2 lub jego antygenicznego fragmentu może nastąpić po znakowaniu białka.

Do użytku np. w oznaczeniach immunologicznych, białko według niniejszego wynalazku można znakować za pomocą każdego znacznika konwencjonalnie stosowanego do znakowania białek. W ten sposób np., białko według niniejszego wynalazku można znakować za pomocąradioznacznika, znacznika enzymatycznego (np. fosfatazy zasadowej), znacznika fluorescencyjnego (np. fluoresceiny lub rodaminy), lantanidu (lanthanide) lub biotyny (która można wykryć za pomocą awidyny lub streptoawidyny sprzężonej z peroksydazą).

Białko według niniejszego wynalazku może znaleźć zastosowanie jako standardowy odnośnik lub do testowania pod względem reaktywności przeciwciał wobec białka w odpowiednim oznaczeniu immunologicznym lub oznaczeniu immunohistochemicznym. Takie testy mogą obejmować np. testowanie pod względem reaktywności krzyżowej wobec przeciwciała tworzącego się przeciw hPSA, Arg2²⁶-hK2 lub Trp226-hK2.

Białko według niniejszego wynalazku w postaci nieznakoDanej można stosować jako immunogen do produkcji przeciwciał poliklonalnych lub monoklonalnych. Protokół stosowany przy produkcji przeciwciał poliklonalnych lub monoklonalnych można dostosować do każdej z konwencjonalnych procedur znanych dla wytwarzania przeciwciał. Do tego celu, białko będzie korzystnie połączone z adjuwantem, np. kompletnym adjuwantem Freunda, w kompozycji imma^zującej. Odpowiedniąprocedurę dla wytwarzania przeciwciał poliklonalnych i monoklonalnych wobec Trp²26-hK2 lub Arg²2⁶-hK2 można dostosować np. do procedury opisanej w Clinical Chemistry (1987) 33, 103-107 pod względem otrzymywania przeciwciał monoklonalnych wobec ludzkiej kwaśnej fosfatazy prostaty, lub procedury opisanej w Clinical Chemistry (1990) 26, 92-95 pod względem otrzymywania przeciwciał monoklonalnych wobec antygenu specyficznego dla prostaty człowieka. Tak otrzymane przeciwciało można także znakować w sposób konwencjonalny, np. za pomocą znacznika radioaktywnego, znacznika enzymatycznego, znacznika fluorescencyjnego, lantanidu lub biotyny·'.

Stosując Trp²2⁶-hK2 jako immunogen do wytwarzania przeciwciała monoklonalnego i następnie skriningu hybrydom przy użyciu oczyszczonego Trp^?26-hK2 i komercyjnie dostępnych oczyszczonych hPSA, przeciwciała monoklonalne można poddać selekcji, która umożliwia wiązanie Trp226-hK2 lecz nie hPSA w próbkach z ludzkiego organizmu i które w ten sposób są szczególnie wartościowe do celów diagnostycznych. Doceni się, że Arg²2⁶-hK2 lub połączenie Arg226-hK2 i Trp226-hK2 można alternatywnie stosować w takiej procedurze, jako immunogen. Można użyć także Arg226-hK2 oprócz, lub zamiast Trp²26-hK2 w protokole skriningu. Taki protokół skriningu przeciwciała, w którym stosuje się zarówno Arg226-hK2 jak i Trp22⁶-hK2, można zaplanować do selekcji przeciwciał nie wiążących hPSA, umożliwiających rozróżnienie między Arg²26-hK2 i Trp226-hK2.

Przy pomocy technik immunologicznych w oparciu o Trp²26-hK2 jako immunogenu można wytworzyć przeciwciała, albo w postaci znakowanej albo nieznakoDanep, umożliwiającego wiązanie Trp²26-hK2 i/lub Arg²2⁶-hK2, lecz nie hPSA. W technikach tych stosuje się odpowiednie hybrydomy, umożliwiające wytwarzanie takiego przeciwciała. Stosując przeciwciało w postaci znakowanej Trp226-hK2 i/lub Arg226-hK2 można konkretnie wykryć w próbce, np. próbce

184 557 ciała. Takie przeciwciało dostarcza nowego ważnego narzędzia do użytku w diagnozowaniu chorób prostaty.

Termin „przeciwciało” jaki się tu stosuje, będzie rozumiany jako obejmujący zarówno kompletne cząsteczki przeciwciałajak i ich fragmenty, wiążące antygen, takie jak fragmenty Fab i F(ab')2. Termin „przeciwciało” obejmuje także przeciwciała humanizowane i ich fragmenty.

U pacjentów homozygotycznych łub heterozygotycznych pod względem nowo zidentyfikowanego genu Trp226-hK2, sekwencja białka Trp22⁶-hK2 może służyć jako marker dla chorób prostaty, np. do diagnozowania raka lub przerostu gruczołu krokowego. Zatem, niniejszy wynalazek dostarcza metody diagnozowania choroby prostaty u pacjentów homozygotycznych lub heterozygotycznych pod względem genu Trp226-hK2, która obejmuje określenie czy występuje zmienione czy niezmienione stężenie białka kodowanego przez wymieniony gen w tkance prostaty lub płynach ustrojowych człowieka.

Następujące przykłady ilustrują wynalazek, z odniesieniem do fig. 1 i 2 jakie opisano poniżej.

Figury 1a do 1d. Elektroforeza na żelu poliakrylamidowym z barwieniem srebrem oraz analiza odcisku immunologicznego rekombinowanego białka hK2. Czyste rekombinowane białko Trp226-hK2 (przebieg 1) i komercyjne hPSA (przebieg 2) barwiono srebrem w natywnej (1a) i zredukowanej SDS-PAGE (1b). Królicze przeciwciało poliklonalne, wytworzone przeciw hPSA, oczyszczone z płynów nasiennych, użyto do wykrycia rekombinowanego Arg226-hK2 (przebieg 1), rekombinowanego Trp226-hK2 (przebieg 2) oraz komercjalnego hPSA (przebieg 3) na odciskowej natywnej PAGE (1c) i zredukowanej SDS-PAGE (1d).

Figury 2A i 2B. Ilościowe odzyski rekombinowanego Trp226-hK2 oraz komercjalnego hPSA za pomocą oznaczenia fluoroimmunologicznego z rozkładem w czasie (1A) i IRMA (1B). Czyste Trp226-hK2 i komercyjne hPSA rozcieńczono z albuminą surowicy bydlęcej, zawierającą bufory zerowe z zestawu, do stężeń, wynoszących 1,10,25,50,100 i 500 pl. Te stężenia oznaczono za pomocą zastawów do oznaczeń fluoroimmunologicznego z rozkładem w czasie i IRMA. Dane są średnimi ±SD z trzech do pięciu oddzielnych określeń.

Przykład 1: Klonowanie cDNA hK2 z biblioteki cDNA tkanki raka prostaty człowieka cDNA hK2 powielono z biblioteki tkanki raka prostaty człowieka, za pomocą PCR. Do tego powielenia PCR, oligomerem N-terminalnym był (5'- TCCCCCGGGAGATCTCACCATGTGGGACCTGGTTCTC-3') i zawierał miejsca restrykcyjne Smal i BglII. Oligomerem C-terminalnym był (5-CGCTCTAGATCAGGGGTTGGCTGCGATGGT-3') i zawierał miejsce restrykcyjne XbaI oprócz częściowej sekwencji hK2. Po potwierdzeniu sekwencji hK2 w wektorze PCRII (Invitrogen) metodą dideoksy (Sanger i in. Proc. Natl. Acad. Sci.USA (1977), 74, 5463), cDNA prepro-hK2 wtrącono do miejsca BglII/XbaI wektora transferowego pVL1392 (Invitrogen).

Sekwencja kodująca tego cDNA różniła się od ludzkiej sekwencji DNA dla hK2, o której doniósł wcześniej Schedlich i in., (8a) i ta pozycja kodująca 792 była raczej T niż C.

Przykład 2: Analiza sekwencji genów hK2 w próbkach tkanki prostaty człowieka i leukocytów - wykrywanie polimorfizmu Arg266Trp

Izolowano genomowy DNA z tkanki prostaty człowieka uzyskanej przez prostatektomię, biopsję lub wycięcie przezcewkowe, oraz z leukocytów krwi ludzkiej. DNA leukocytów żeńskich i młodych mężczyzn użyto jako materiału kontrolnego. Specyficznych oligonukleotydów użyto do powielenia i sekwencjonowania w PCR genu hK2. Do celów powielenia oligomerem N-terminalnym był 5'-TTCTCACTGTGTCTCTCCTCC-3' a znakowanym biotyną oligomerem C-terminalnym był 5-GTGGGACAGGGGCACTCA-3'. Do bezpośredniego sekwencjonowania PCR oligomerem znakowanym amidynem był 5'-ATCATGGGGCCCTGAGCC-3'.

Odmianę znaleziono w pozycji zasady 792 (C lub T). Próbki sekwencjonowanego DNA zarówno z próbek tkanki jak i leukocytów 36 pacjentów z chorobąprostaty, ujawniła, że występuje polimorfizm w tej pozycji zasady (tabela 1a). W tym ograniczonym materiale badawczym, 13 -24 pacj entów z rakiem prostaty było heterozygotami CT, 10 homozygotami CC i j eden homozygotą TT. Osiem z 12 kolejnych prób łagodnych przerostów prostaty było heterozygotami

184 557

CT i cztery homozygotami CC. Te same zmiany wykryto w próbkach tkanki i leukocytów·. W materiale kontrolnym pięciu prób DNA leukocytów z krwi żeńskiej, ponad 10 było homozygotami TT i dodatkowo cztery próbki DNA leukocytów krwi młodych mężczyzn, ponad 6 było heterozygotami CT i dwie homozygotami CC. Częstotliwość allelu Arg226 wśród pacjentów z rakiem prostaty (N=24) wynosiła 69%, 67% wśród pacjentów z łagodnym przerostem prostaty (N=12) i 66% wśród materiału kontrolnego (N=16), a częstotliwość allelu Trp266 wynosiła odpowiednio 31%, 33% i 34% (tabela 1b).

Tabela 1a

Genotypy w pozycji nukleotydu 792 w hK2

Próba	CCa	CTb	TTc
Rak prostaty (n=24)	10	13	1
Łagodny przerost prostaty (n=12)	4	8	0
Leukocyty z krwi żeńskiej (n=10)	4	5	1
Leukocyty z krwi młodych mężczyzn (n=6)	2	4	0

aCC, homozygotyczne Arg266-hK2; bCT, heterozygotyczne; cTT, homozygotyczne Trp266-hK2

Tabela 1b

Częstotliwość alleli Arg266 i Trp266 wśród raków prostaty, łagodnych przerostów i kontrolnych prób leukocytów z krwi

Allel	Próby raka prostaty (N=24) % alleli	Próby łagodnego przerostu prostaty (N=24)	Kontrolne próby leukocytów z krwi (N=16)
Arg266	33(69)	16(67)	21(66)
Trp266	15(31)	8(33)	11(34)

Przykład 3: Ilościowe odzyskiwanie rekombinowanego Trp266-hK2

Stężenie białka oczyszczonego rekombinowanego Trp26⁶-hK2 oszacowano metodą Lowr/ego i in. (J. Biol. Chem. 1951; 193:265) z albuminą surowicy bydlęcej (Bio-Rad, Richmond, CA) jako standardem. Odzyskane ilości rekombinowanego Trp2^fi6-hK2 mierzono dalej za pomocąoznaczenia fluoroimmunologicznego z rozkładem w czasie (zestaw DELFIA PSA, Wallac, Finlandia) i IRMA (zestaw Tandem®-R PSA, Hybritech Europe, Belgia). Dla celów oznaczenia rekombinowany Trp²66-hK2 i komercyjny PSA rozcieńczono ze standardem „zero” zestawu do oznaczania immunologicznego, zawierającego albuminę surowicy bydlęcej.

Odzyskane ilości Trp²⁶⁶-hK2 i komercyjnego hPSA testowano w oznaczeniu fluoroimmunologicznym, wykrywając, że ilość hPSA wynosiła odpowiednio 128 ± 20% (średnia±SD, n=13) oraz 98 ± 6% (średnia ±SD, n=15), w porównaniu z wzorcem zestawu IRMA (fig. 2).

W oznaczeniach zamierzano zmierzyć stężenia hPSA w surowicy, które nie były specyficzne dla hPSA, lecz wykryto 100% nieaktywnego dodanego hPSA. Aktywne rekombinowane hK2 były równie wykrywalne w komercyjnym oznaczeniu fluoroimmunologicznym i IRMA pod względem hPSA.

184 557

Przykład 4: Klonowanie cDNA prepro-hK2 w wektorze ekspresji bakulowirusa i ekspresja w komórkach owadów

Użyto takiej samej procedury kloningu jaką opisano u Vikho i in. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90 799-803. rozpoczynając za pomocą równoległej transfekcji DNA AcNPV (Invitrogen) oraz wektorem transferowym PVL1392, zawierającym cDNA prepro-hK2, uzyskane jak w przykładzie 1, do komórek Spodopterafrugiperda (Sf9) (Invitrogen). Pożywkę hodowlanąkomórek owadów, zawierającą rekombinowany DNA AcNPV, oznaczono pod względem wydzielonego białka, umożliwiającego wiązanie z przeciwciałem monoklonalnym hPSA, przy użyciu zestawu do oznaczania fluoroimmunologicznego hPSA (DELFLA, Wallac).

Odkryto, że komórki owadów, zawierające albo sekwencję kodującą dla prepro-Trp2—-hK2 albo prepro-Arg2—-hK2, wydzielają do pożywki hodowlanej białko, umożliwiające wykrycie hPSA za pomocą oznaczenia, mimo, że wyższą ekspresję obserwowano z sekwencją kodującą prepro-Trp26--hK2.

Przykład 5: Oczyszczanie rekombinowanego białka Trp2-⁰-hK2 i aktywnego Arg26--hK2

Pożywkę odebraną z infekcji rekombinowanym wirusem, zatężono za pomocą układu kasetowego Pellicon (odcinanie, 10 kDa Millipore) i dializowano do 50 mM buforu octanu sodu (pH 5,5). Zatężony roztwór załadowano na kolumnę jonowymienną (S-Sepharose HP 35/100, Pharmacia). Po przemyciu, białko hK2 wymyto z kolumny przy użyciu liniowego gradientu soli, od 0,1 M do 0,25 M NaCl. Te frakcje, które były immunoreakcyjne z przeciwciałem poliklonalnym hPSA (slot biot) zatężono do celów chromatografii żelowo-filtracyjnej (Sephacryl S-75, Pharmacia) i wymyto za pomocą 10 mM Tris-HCl przy pH 7,0, zawierającym 150 mM NaCl. Frakcje zawierające hK2 zlano i dializowano w 20 mM fosforanu sodu (pH 7,0) do chromatografii jonowymiennej (Mono-S, Pharmacia). Białko hK2 wymyto z kolumny za pomocą liniowego gradientu NaCl (0-60 mM). Kolumny S-Sepharose i Sephacryl S-75 dołączono do kolumny BioPilot i Mono-S, do układu automatycznej chromatografii FPLC (Pharmacia).

Czystość tak otrzymanego rekombinowanego białka Trp2—-hK2, oceniono przez SDS-PAGE, natywną PAGE oraz skupianie izoelektryczne albo przez barwienie srebrem albo barwienie immunologiczne (12). Drogą SDS-PAGE (fig. Ib, ld) odkryto, że ciężar cząsteczkowy białka Trp2—-hK2 wynosi około 33 kDa (12), podczas gdy Mr komercyjnego hPSA wynosił 34 kDa. Podczas analizy rekombinowanego białka Trp266-hK2 przez spektrometrię masową z rozpylaniem jonów (ISMS), wykryty przeciętny Mr wynosił 27,4 kDa. W przypadku natywnego PAGE z barwieniem srebrem (fig. 1a, 1c), rekombinowane białko Trp2—-hK2 wykazało jedną wstęgę o 370 kDa, podczas gdy komercyjny hPSA wykazał cztery wstęgi między 70 i 140 kDa. Heterogeniczność widoczna przy PSA była prawdopodobnie spowodowana rozszczepieniem endoproteolitycznym białka na 2 lub cztery łańcuchy polipeptydowe utrzymywane razem przez mostki disiarczkowe (13).

Analiza aminokwasu N-terminalnego wykazała, że obróbka posttranslacyjna nie całkowicie usunęła sekwencję prepro- prepro-Trp266-hK2 w komórkach owadów.

Rozszczepienie zachodzi raczej między Gln-3 i Ser-2 niż między Arg-1 i Ile-1. Okazało się, że ta postać rekombinowanego hK2 była nieaktywna gdy oznaczano jąza pomocą syntetycznych polipeptydów przy użyciu procedury oznaczenia:

Oznaczenie hydrolizy hK2

Hydrolizę H-D-Pro-Phe-Arg-pNA -2HCl oraz MeO-Suc-Arg-Pro-Tyr-pNA · 2HCl (Chromogenix AB) przy końcowym stężeniu 1 mM, zmierzono przy 405 nm. Reakcje przeprowadzono w temperaturze 370°C i zapoczątkowano, dodaj ąc substrat chromogeniczny (5 0 ml) do 200 ml 50 mM buforu Tris (pH 7,8) ze 100 mM NaCl, zawierającego białko hK2. Po jednej godzinie reakcję zatrzymano przez dodanie 800 ml 0,6 M kwasu octowego, a tempo reakcji (nmol utworzonego pNA na ml) obliczono ze standardowej krzywej pNA.

W surowicy, PSA istnieje przede wszystkim jako kompleks z a1-antychymotrypsyna(15). Inhibitory proteazy seryny, takie jak αΐ-antychymotrypsyna i αΐ-antytrypsyna, zwykle reagują

184 557 z aktywnym miejscem proteinazy (16). Odkryto jednakże, że rekombinowane białko Trp²6⁶-hK2 otrzymane jak opisano powyżej, nie tworzy kompleksu z obiema serpinami.

Procedurę oczyszczania podaną powyżej, można także stosować do odzyskiwania Arg266-hK2 z pożywki hodowlanej. W ten sposób komórki owadów, zawierające sekwencję, koduj ącąprepro-Arg266-hK2 w wektorze AcNPC związanym operacyjnie z promotorem polihedryny, wykazały, że wytwarzają aktywne białko hK2 z aktywnościąpodobnądo trypsyny. Natywna PAGE z barwieniem immunologicznym odzyskanego białka Arg²⁶⁽’-hK2 ukazała inny wzór w porównaniu z rekombinowanym białkiem Trp²66-hK2 (fig. lb i lc).

Jak tu wcześniej zaznaczono, oczyszczone rekombinowane białko hK2 uzyskane przez powyższą procedurę, i oczyszczone Trp266-hK2, otrzymane np. przez dodatkową obróbkę pochodnej Trp266-hK2 typu omawianego wyżej, można stosować jako antygeny do wytwarzania przeciwciał monoklonalnych. Stosując np. dojrzałe Trp266-hK2 lub dojrzałe Arg²66-hK2 do wytwarzania przeciwciał monoklonalnych zgodnie z procedurą opisaną przez H oyhtya i in., w Clin. Chem, (1987) 33, 103-107, i poddając skriningowi hybrydomy z jednym lub oboma Arg2⁶⁶-hK2 i Trp26⁶-hK2, oprócz komercjalnie dostępnego oczyszczonego hPSA można otrzymać przeciwciało monoklonalne, umożliwiające odróżnianie hK2 od hPSA w próbkach, obejmujących próbki ciała ludzkiego, np. próbki, pochodzące z tkanki prostaty człowieka. Takie przeciwciało można znakować jeśli trzeba, za pomocą atomów Eu, jak opisano u Vihko i in., Clinical Chemistry (1990) 26, 92-95.

Literatura

1. B.A. Evans i in., Biochem. 27, 3124 (1988). P.H.J. Riegman i in., FEBS Lett 247, 123 (1989). P.H.J. Riegman i in., Genomics 14, 6 (1992).

2. A.R. Baker i J.Shine DNA 4,445 (1985). D.Fukushima i in., Biochemistry 24,8037 (1985).

3. P. Chapdelaine i in., FEBS Lett 236,205 (1988). S.-D. Qiu i m.,JUrol. 144,1550 (1990). C.Y.-F. Young i in., Biochem. 31, 818 (1992). L. Hakach i in., Int. J. Cancer 55, 1 (1993).

4. P. Henttu i in., Endocrinology 130, 766-772 (1992).

5. J. Clements i A. Mukhtar, Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 78, 1536 (1994).

6. H. Yu i E.P. Diamandis, Clin. Chem. 41, 54 (1995).

7. H. Yu Clin. Chem. 27, 75 (1994).

8. (a) L. Schendlich i in., DNA 6, 429 (1987). (b) H. Neurath i in., Science 158, 1638 (1967) (c) J. Schalleri in,Eur. J. Biochem. 170,111 (1987) (d)K.W.KWatti in.,Proc. Nall. Acad. Sci. USA 83,3166 (1986).

9. H. Lilja, J. Clin. Invest. 76, 1899 (1985).

10. T.A. Stamey i in., New Engl. J. Med. 317, 909 (1987).

11. P. Vihko i in., Proc. Natl. Acad Sci. USA 90, 799, (199R).

12. T.M. Jovin, Biochem. 12, 871 (1973). M. Wyckof i in., Anal. Biochem, 78,459, (1977). B.J. Davis, Ann. N.Y.Acad. Sci. 121,404(1964). A.T. Andrews, w Electrophoresis. Theory. Techniques and Biochemical andClimcal Applicatiors (A.R. Peacoce and W.F. Harrington wyd.)

184 557

Clarendon Press, Oksford, strony 63-80 (1981). J. Heukeshoven i R. Dernick, Electrophoresis 6, 103 (1985). B. Prier i F. Russo-Marie, Anal. Biochem. 172, 338 (1988).

13. K.W.K. Watt i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 3166 (1986).

14. H. Liliann., J. Biol. Chem. 24,1894(1989). A. Christensson i vn.,Eur. J. Biochem. 194, 755 (1990).

15. A. Christensson i in., Eur. J. Biochem.. 104, 755 (1990). H. Lilja i in., Clin. Chem. 37, 1618(1991).

16. D.R. Boswell i R. Carrel, w Recent advances in clinical immunology, R. A. Thompson, wyd. (Churchill Livingston, Londyn, 1987) tom 4 strony 1-13.

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz.

Cena 4,00 zł.

Claims (24)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Białko będące Trp²⁶⁶-ludzką gruczołową kalikreiną-1 (Trp²²⁶-hK2), posiadającą sekwencję identyczną z Arg226-hK2 oprócz zmiany Arg226 na Trp, lub które jest Trp226-hK2 posiadającym przedłużenie N- i/lub C-terminalne i które zachowuje zdolność do wiązania przeciwciał Trp266-hK2 lub przeciwciał wobec antygenu specyficznego dla ludzkiej prostaty, pod warunkiem, że jeśli wymienione białko jest białkiem naturalnie występującym, jest ono zasadniczo wolne od innych białek, z którymi zwykle jest związane.
2. 2. Białko według zastrz. 1, wybrane spośród proTrp226-hK2 lub prepro-Trp²26-hK2, znamienne tym, że Trp226-hK2 łączy się przy końcu N z sekwencjami pro- lub prepro-, prepro-Arg266-hK2.
3. 3. Białko według zastrz. 1, będące Trp²²6-hK2, posiadające N-terminalne przedłużenie dipeptydowe Ser-Arg.
4. 4. Białko (Trp22⁶-hK2) według zastrz. 1, w czystej postaci.
5. 5. Białko według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, znamienne tym, że jest znakowane.
6. 6. Fragment antygenowy białka będącego TąfNludzką gruczołową kalikreiną-1 (Trp²26-hK2), posiadającą sekwencję identyczną z Arg²26-hK2 oprócz zmiany Arg²²⁶ na Trp, lub które jest Trp266-hK2, posiadającym przedłużenie N- i/lub C-terminalne i które zachowuje zdolność do wiązania przeciwciał Trp266-hK2 lub przeciwciał wobec antygenu specyficznego dla ludzkiej prostaty, pod warunkiem, że jeśli wymienione białko jest białkiem naturalnie występującym, jest ono zasadniczo wolne od innych białek, z którymi zwykle jest związane, który to fragment zachowuje resztę aminokwasową Trp226 Trp²²6-hK2 i zdolność do wiązania przeciwciał Trp²26-hK2.
7. 7. Fragment antygenowy białka według zastrz. 6, znamienny tym, że białko to jest znakowane.
8. 8. Izolowany DNA, zawierający sekwencję identyczną z DNA Arg226-hK2 oprócz zmiany pojedynczego nukleotydu z C na T, przekładający się na zmianę aminokwasu w pozycji 226 z Arg na Trp i kodujący białko będące Trp²26-ludzką gruczołową kalikreiną-1 (Trp22⁶-hK2), posiadającą sekwencję identyczną z Arg226-hK2 oprócz zmiany Arg226 na Trp, lub które jest Trp22⁶-hK2, posiadającym przedłużenie N- i/lub C-terminalne i które zachowuje zdolność do wiązania przeciwciał Trp226-hK2 lub przeciwciał wobec antygenu specyficznego dla ludzkiej prostaty, pod warunkiem, że jeśli wymienione białko jest białkiem naturalnie występującym, jest ono zasadniczo wolne od innych białek, z którymi zwykle jest związane lub antygenowy fragment tego białka, który to fragment zachowuje resztę aminokwasową Trp226 Trp226-hK2 i zdolność do wiązania przeciwciał Trp²26-hK2.
9. 9. Rekombinowany DNA, obejmujący sekwencję DNA identyczną do DNA Arg26⁶-hK2 oprócz zmiany pojedynczego nukleotydu z C na T, przekładającą się na zmianę aminokwasu w pozycji 226 z Arg na Trp kodujący białko będące Trp226-ludzką gruczołową kalikreiną-1 (Trp^2&6-hK2), posiadającą sekwencję identyczną z Arg22⁶-hK2 oprócz zmiany Arg2²ⁱ’ na Trp, lub które jest Trp²26-hK2, posiadającym przedłużenie N- i/lub C-terminalne i które zachowuje zdolność do wiązania przeciwciał Trp226-hK2 lub przeciwciał wobec antygenu specyficznego dla ludzkiej prostaty, pod warunkiem, że jeśli wymienione białko jest białkiem naturalnie występującym, jest ono zasadniczo wolne od innych białek, z którymi zwykłejest związane lub antygenowy fragment tego białka, który to fragment zachowuje resztę aminokwasową Trp²²6 Trp²26-hK2 i zdolność do wiązania przeciwciał Trp226-hK2.
10. 10. Rekombinowano DNA Dedług zastrz. 9, zn amienny tym, że wyst ępuje w po staci wektora.

    184 557
11. 11. Rekombinowany DNA według zastrz. 10, znamienny tym, że wektor ten stanowi wektor ekspresji, w którym sekwencja kodująca ludzką gruczołową kalikreiną-1 (Trp²⁶⁶-hK2) lub jej fragment antygenowy jest operacyjnie związana z sekwencją promotora, zdolnego do ukierunkowywania ekspresji wspomnianej sekwencji kodującej w komórkach owadzich, przy czym ludzka gruczołowa kalikreina-1 (Trp266-hK2) posiada sekwencję identyczną z Arg226-hK2 oprócz zmiany Arg²²6 na Trp, lub którajest Trp²²6-hK2, posiadąjącąprzedłużenie N- i/lub C-terminalne i która zachowuje zdolność do wiązania przeciwciał Trp226-hK2 lub przeciwciał wobec antygenu specyficznego dla i ludzkiej prostaty, pod warunkiem, że jeśli wymienione białko jest białkiem naturalnie występującym, jest ono zasadniczo wolne od innych białek, z którymi zwykle jest związane, lub antygenowy fragment tego białka, który to fragment zachowuje resztę aminokwasową Trp226 Trp226-hK2 i zdolność do wiązania przeciwciał Trp226-hK2.
12. 12. Rekombinowany DNA według zastrz 11, znamienny tym, że wektorem ekspresji jest wektorem ekspresji bakulowirusa, w którym sekwencja kodująca ludzką gruczołową kalikreiną-1 (Trp266-hK2) lub jej fragment antygenowyjest operacyjnie związana z sekwencjąpromotora, zdolnego do ukierunkowywania ekspresji wspomnianej sekwencji kodującej w komórkach owadzich, przy czym ludzka gruczołowa kalikreina-1 (Trp266-hK2) posiada sekwencję identyczną z Arg226-hK2 oprócz zmiany Arg226 na Trp, lub która jest Trp²26-hK2, posiadającą przedłużenie N- i/lub C-terminalne i która zachowuje zdolność do wiązania przeciwciał Trp226-hK2 lub przeciwciał wobec antygenu specyficznego dla ludzkiej prostaty, pod warunkiem, że jeśli wymienione białko jest białkiem naturalnie występującym, jest ono zasadniczo wolne od innych białek, z którymi zwykle jest związane, lub antygenowy fragment tego białka, który to fragment zachowuje resztę aminokwasowąTrp²^ Trp^-hK i zdolność do wiązania przeciwciał Trp226-hK2.
13. 13. Rekombinowany DNA według zastrz. 12, znamienny tym, wektor ekspresji bakulowirusa zawiera sekwencję kodującą dla prepro-Trp226-hK2 pod kontrolą promotora, umożliwiającego kierowanie ekspresją prepro-Trp266-hK2 w komórkach owadów.
14. 14. Rekombinowany DNA według zastrz. 13, znamienny tym, że jest rekombinowanym wektorem ekspresji bakulowirusa AcNPV, w którym sekwencja kodująca dla prepro-Trp²66-hK2 jest pod kontrolą promotora polihedryny.
15. 15. Komórka gospodarza, zawierająca wektor obejmujący rekombinowany DNA, który zawiera sekwencję identyczną z Arg²26-hK2 oprócz zmiany pojedynczego nukleotydu z C na T przekładający się na zmianę aminokwasu w pozycji 226 z Arg na Trp kodujący białko będące Trp2²6-ludzką gruczołową kalikreiną-1 (Trp²66-hK2), posiadającą sekwencję identyczną z Arg²²6-hK2 oprócz zmiany Arg226 na Trp, lub które jest Trp226-hK2, posiadającym przedłużenie N- i/lub C-terminalne i które zachowuje zdolność do wiązania przeciwciał Trp226-hK2 lub przeciwciał wobec antygenu specyficznego dla ludzkiej prostaty, pod warunkiem, że jeśli wymienione białko jest białkiem naturalnie występującym, jest ono zasadniczo wolne od innych białek, z którymi zwykle jest związane lub antygenowy fragment tego białka, który to fragment zachowuje resztę aminokwasową Trp226 Trp226-hK2 i zdolność do wiązania przeciwciał Trp226-hK2.
16. 16. Sposób wytwarzania białka, które jest ludzką gruczołową kalikreiną-1 (Trp²26-hK2), posiadającą sekwencję identyczną z Arg226-hK2 oprócz zmiany Arg226 na Trp, lub które jest Trp²26-hK2, posiadającym przedłużenie N- i/lub C-terminalne i które zachowuje zdolność do wiązania przeciwciał Trp266-hK2 lub przeciwciał wobec antygenu specyficznego dla ludzkiej prostaty, lub jego fragmentu antygenowy, znamienny tym, że hoduje się komórkę gospodarza zawierającą wektor ekspresji w którym sekwencją kodującą, wspomnianą ludzką gruczołową kalikreinę-1 (Trp266-hK2) lub jej fragment antygenowy jest operacyjnie związana z sekwencją promotora, zdolnego do ukierunkowywania ekspresji wspomnianej sekwencji kodującej w komórkach owadzich, pod warunkiem, że wspomniane białko jest wytwarzane w komórkach gospodarza lub w pożywce hodowlanej i izoluje się wspomniane białko z komórek lub z pożywki, przy czym wspomniany antygenowy fragment zachowuje resztę aminokwasową Trp226 Trp226-hK2 i zdolność do wiązania przeciwciał Trp226-hK2.
17. 17. Sposób według zastrz. 16, znamienny tym, że stosuje się komórki owadów, zawierające wektor ekspresji bakulowirusa zawierającego sekwencję kodującą prepro-Trp266-hK2,

    184 557 pod kontrolą promotora zdolnego do ukierunkowania ekspresji prepro-Trp²⁶⁶-hK2 w komórkach owadzich i izoluje się z pożywki hodowlanej Trp266-hK2 z N-terminalnym przedłużeniem dwupeptydowym Ser-Arg.
18. 18. Sposób według zastrz. 17, znamienny tym, że izolacja obejmuje chromatografię jonowymienną i chromatografię żelowo-filtracyjną.
19. 19. Sposób według zastrz. 17 albo 18, znamienny tym, że Trp²²6-hK2 z N-terminalnym przedłużeniem dwupeptydowym Ser-Arg, podlega przekształceniu w Trp226’hK2.
20. 20. Zastosowanie białka które jest ludzką gruczołową kalikreiną-1 (Trp226-hK2), posiadającą sekwencję identyczną z Arg226-hK2 oprócz zmiany Arg226 na Trp, lub, która jest Trp226-hK2, posiadającą przedłużenie N- i/lub C-terminalne i która zachowuje zdolność do wiązania przeciwciał Trp266-hK2 lub przeciwciał wobec antygenu specyficznego dla ludzkiej prostaty, lub antygenowy fragment tego białka, który to fragment zachowuje resztę aminokwasową Trp22⁶ Trp226-hK2 i zdolność do wiązania przeciwciał Trp226-hK2 jako immunogen do otrzymania przeciwciał zdolnych do wiązania wspomnianego białka.
21. 21. Zastosowanie białka według zastrz. 20, które dodatkowo obejmuje znakowanie wspomnianych przeciwciał lub przeciwciała.
22. 22. Zastosowanie białka które jest ludzką gruczołową kalikreiną-1 (Trp2^?6-hK2), posiadającą sekwencję identyczną z Arg2²⁶-hK2 oprócz zmiany Arg22⁶ na Trp, lub, która jest Trp226-hK2, posiadającą przedłużenie N- i/lub C-terminalne i która zachowuje zdolność do wiązania przeciwciał Trp2⁶⁶-hK2 lub przeciwciał wobec antygenu specyficznego dla ludzkiej prostaty, lub antygenowy fragment tego białka, który to fragment zachowuje resztę aminokwasową Trp²26 Trp226-hK2 i zdolność do wiązania przeciwciał Trp226-hK2 jako immunogen do otrzymania przeciwciał monoklonalnych, umożliwiających wiązanie wymienionego białka.
23. 23. Zastosowanie białka według zastrz. 22, które dodatkowo obejmuje znakowanie wymienionych przeciwciał lub przeciwciała.
24. 24. Zastosowanie białka które jest ludzką gruczołową kalikreiną-1 (Trp226-hK2), posiadającąsekwencję identyczną z Arg²26-hK2 oprócz zmiany Arg²26 na Trp lub, która jest Trp226-hK2, posiadającąprzedłużenie N- i/lub C-terminalne i która zachowuje zdolność do wiązania przeciwciał Trp²⁶6-hK2 lub przeciwciał wobec antygenu specyficznego dla ludzkiej prostaty, lub antygenowy fragment tego białka, który to fragment zachowuje resztę aminokwasową Trp²2^fi Trp226-hK2 i zdolność do wiązania przeciwciał Trp226-hK2 jako immunogen jako standardowego odniesienia lub do testowania pod względem reaktywności przeciwciała wobec wymienionego białka w oznaczeniu immunologicznym lub oznaczeniu immunohistochemicznym.