NO751734L - - Google Patents

Description

Fremgangsmåte til fermentativ

fremstilling av protein.

Det er kjent biosyntetiske fremgangsmåter, hvori mikroorganismer, f.eks. bestemte bakteriestammer, formeres fer-ment at i vt i et syntetisk næringsmedium, som som eneste karbonkilde inneholder metanol. Slike fremgangsmåter kan gjennom-føres såvel diskontinuerlig som også kontinuerlig. De således fremstilte bakterieceller inneholder i det såkalte "råprotein"

(beregnet ved multiplisering av elementæranalytisk funden verdi for nitrogen med den empiriske faktor 6,25) vanligvis 40 - 75 vekt$ aminosyrer og 8 - 16 vekt% nukleinsyrer. En så høy mengde nukleinsyre er imidlertid uønsket, da det av dem, spesielt i den ønskelige organisme, oppstår urinsyre som forårsaker gikt. Dessuten påvirkes mave-tarm-kanalens flora ugunstig.

Det er nå funnet en fremgangsmåte til fremstilling av bakterier med metanol som karbonkilde og en nitrogenkilde under aerobe betingelser ved en pH-verdi mellom 4,0 og 950,

idet fremgangsmåten erkarakterisert vedat man fermenterer bakteriestammer av slekten Bacillus, Pseudonomas og Flavobacterium, dens mutanter og varianter således at konsentrasjonen av metanol i fasen av logaritmisk vekst av bakteriecellene ligger mellom 5 og 200 ppm, referert til kultursuspensjonen.

Fortrinnsvis foretrekkes en konsentrasjon av metanol, som ligger mellom 10 og 150 ppm.

Fremgangsmåten gjennomføres hensiktsmessig i fermenteringsreaktorer som inneholder et næringsmedium som ved siden av nevnte metanol som nitrogenkilde inneholder salter som kaliumnitrat, ammoniumsulfat, ammoniumfosfat eller ammoniakk, urinstoff eller soyamel. Dessuten inneholder det fosfater som kaliumdihydrogenfosfat eller dinatriumhydrogenfosfat som mag-nesium- og kaliumsalter og sporeelementer, slik de f.eks. også er inneholdt i springvann. Således er f.eks. jern-, kobber-, molybdensalter tilstede i spor.

Det kan være hensiktsmessig, spesielt til for-kulturene å sette næringsstoffer som gjærekstrakt, kjøttek-strakt, leverekstrakt, glukose eller andre.

Fremgangsmåten gjennomføres hensiktsmessig ved temperaturer mellom 20 og 45°C, fortrinnsvis mellom 30 og 37°C.

Som bakteriestamme anvendes Bacillustyper, spesielt slike kjente Bacillusstammer som f.eks. Bacillus subtilis eller Bacillus polymyxa, videre Pseudomonastyper, som Pseudomonas aeruginosa. Også flavobakterier kan anvendes.

Kultursuspensjonene i reaktoren luftes med 0,1

til 1,5 liter luft pr. liter kulturoppløsninger og minutt (vvm), fortrinnsvis med 0,3 til 0,6 vvm. For å sikre et godt opptak av oksygenet ved cellene kan det omrøres godt, det kan også tilsettes emulgatorer. I andre reaktorsystemer enn rørekar må det tilsvarende sørges for en tilstrekkelig luftmengde, idet ved flyktighet av metanol er en tilbakeføring av luft gunstig.

I vanlige systemer har det vist seg fordelaktig å anvende en eller bedre dessuten to eller flere rørere i et fermenteringskar. Videre er det fordelaktig å anordne to rørere, spesielt hullskiverørere, således i fermenteringskaret, at røreravstanden utgjør omtrent en rørerdiameter. Forholdet mellom rørerdiameter og kjelediameter ligger hensiktsmessig mellom 0,35 og 0,65, fortrinnsvis mellom 0,45 og 0,55. Kultursuspensjonens omløpshastig-het utgjør hensiktsmessig mer enn 7 meter pr. sekund.

Hvis det inntrer skumdannelse lønner det seg en kjemisk eller mekanisk skumbekjempelse, f.eks. ved tilsetning av 0,01 til 0,1 vekt% av en skumdemper som oktanol, estere av oljesyre og laurinsyre med glykol, glycerol eller sorbit, al-koholisk kolesteroloppløsning eller silikoner som polydimetyl-siloksan.

Metanolkonsentrasjonen mellom 5 og 200 ppm, fortrinnsvis mellom 10 og 150 ppm kan styres kontinuerlig ved forskjellige forholdsregler, f.eks. ved måling av nitrogenfor-bruket, cellemassedelen eller fortrinnsvis ved måling av karbon-dioksydutstøpning. Herved er det mulig med en findosering av metanoltilsetningen med hurtig reaksjon til den ved karbonmangel synkende karbondioksydutstøpning. Fortrinnsvis kan denne styr-ing foregå over måling av gassformet metanol ved hjelp av flamme-ionisasj onsdetektor.

Når kultursuspensjonens pH-verdi synker under

den foreskrevne verdi bringes ved tilsetning av alkali, f.eks. natronlut eller kalilut igjen til den foreskrevne verdi. Likeledes regulerer en for høy pH-verdi ved tilsetning av syre, f.eks. saltsyre eller svovelsyre.

Por kontroll.av fremgangsmåten uttas fra kultur-suspens j onen prøver for å bestemme tørrvekt og nitrogeninnhold i bakteriecellemassen. Deretter kan vekstgraden og fordoblings-tiden av cellemassen bestemmes. Når cellenes"tørrvekt ved på hverandre følgende prøveuttak ikke mere øker logaritmisk avsluttes fermenteringen ved chargefremgangsmåter. Ved kontinuerlig drift kontrolleres over fortynningsgraden biomasse-produksjonen i reaktoren.

Adskillelsen av bakteriemassen foregår på vanlig måte ved sentrifugering under flere gangers vasking med vann. Det har også vist seg egnet fremgangsmåter, idet det ved flokula-sjon med syrer ved en pH-verdi mellom 2 og 6 cellemassen kan konsentreres. Det kan også være hensiktsmessig i første rekke å gjøre kultursuspensjonen alkalisk, hensiktsmessig på en pH-verdi mellom 8 og 11, fortrinnsvis mellom 8 og 9}deretter å oppvarme i kort tid ved 60 til 95°C etter avkjøling og surgjøre som angitt ovenfor. Videre kan utfnokningen understøttes ved tilsetning av salter av jern eller aluminium eller av fnoknings-hjelpemidler av naturlig opprinnelse, som f.eks. stivelse eller lim eller syntetisk opprinnelse, som f.eks. polyakryl-amider, polyakrylater, polyetyleniminer eller polyetylenoksyder. Man får således en pastalignende bakteriecellemasse som dessuten inneholder 75 til 90 vekt% vann. Tørkningen kan foregå

på forskjellig måte, f.eks. ved valsetørkning, hvirvelsjikt-tørkning eller forstøvningstørkning. Det således tørkede produkt inneholder bare 2-5 vekt% vann og 60 - 80 vekt% råprotein. I dette råprotein utgjør mengden aminosyrer 90 - 95 vekt%. Derved er det bemerkelsesverdig at ikke bare denne del av aminosyrer generelt, men spesielt innholdet av essentielle og semi-essentielle aminosyrer ligger høyere enn ved sammenlignbare produkter i henhold til teknikkens stand. Dessuten ligger rå-askeinnholdet av den ifølge oppfinnelsen dannede tørkede cellemasse tydelig lavere enn for kjente produkter. Det ifølge oppfinnelsen oppnådde råprotein inneholder videre bare 5 til 10 vekt% nukleinsyrer, mens kjente produkter inneholder 8 til 16

eller mere vekt% nukleinsyre.

De ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen oppnådde tørre bakteriemasser er derfor i spesiell grad egnet til å tjene som eggehvitekilde i næringsmidler og dyrefdr. Eksempel 1.

Stammen Pseudomonas sp. ATCC 31061 (FH-B-5163) som holdes på skråagarrør av sammensetning

avsvømmes med 4 ml destillert vann eller fysiologisk koksalt-oppløsning og overpodes sterilt i en 2 liters Erlenmeyerkolbe som inneholder 250 ml forkulturnæringsoppløsning av følgende sammensetning: 0,53$ (NH4)2S04

0,4 % KH2POii

0,2 %Na2HPOi|. 12 H20

0,02$ MgSO^. 7 H20

0,02$ KC1

1,5 % metanol og

0,1 % sporelementer

(pH 6,8).

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen gjennomføres i et 14 liters fermentasjonskar som er beskikket med 10 liter av følgende næringsoppløsning: 1 , 0056 (NHi|)2S04

0,4 % KH2P0I(

0,2 % Na^HPO^. 12 H20

''0,.02.JK MgSO^ . 7 H20

0,02$ KC1

Næringsoppløsningens pH-verdi utgjør 6,8. Den steriliseres 45 minutter ved 121°C. Dessuten settes 50 g (0,5 vekt%) metanol før podningen til hovedkulturen av nær-ingsoppløsningen.

Til podning av næringsoppløsningen anvendes

under sterile betingelser 2 x 250 ml av forkulturen, som ble rystet 24 - 48 timer ved 30°C. Den således podede nærings-oppløsning omrører ved porsjonsfremstilling 24 - 36 timer ved 30°C under luftning med 0,6 vvm luft med en turbinrører.

En pH-verdi-korrektur foregår hvis nødvendig ved tilsetning av 2 N steril HC1. Under porsjonsfermenteringens logaritmiske fase samt ved kontinuerlig drift overholdes en konsentrasjon av metanol mellom 5 til 150 ppm vekt%. Hertil tildoseres ved en nedsettelse av CC^-utstøtningen av cellene ytterligere mengder metanol automatisk inntil CC^-utstøtningen igjen øker. Dette kan likeledes foregå ved måling av gassformet metanoldel i avluften ved en flammeionisasjonsdetektor.

Fremgangsmåtens fremadskridning kontrolleres ved prøveuttak ved bestemmelse av tørrvekt og nitrogen av bakteriecellemassen.

Etter avslutning av den logaritmiske vekstfase foretas opparbeidelsen på vanlig måte ved sentrifugering eller flokulering, vasking av cellene med vann og etterfølgende for-støvningstørkning. Det således dannede produkt har et råproteininnhold på 71,87 vekt%, et aminosyreinnhold på 66,55 vekti og en nukleinsyredel på 9,8 vekt%. De essentielle og semiessenti-elle aminosyrer utgjør alene 46,47 vekt% (med glycin).

Utførlige angivelser finnes i følgende tabell 1.

Eksempel-, 2.

Stammen Pseudomonas aeruginosa ATCC 21996 (FH-N-845) virker som i eksempel 1. Videre haes i et 14 liters fermenteringskar 9 liter næringsoppløsning av den i eksempel 1 angitte sammensetning og 0,5 vekt% metanol tilsettes. Nær-ingsoppløsningen podes som angitt i eksempel 1 og omrøres ved 3°C under luftning med 0,6 vvm luft med en turbinrører med 210 omdreininger pr. minutt. pH-verdien holdes eventuelt ved tilsetning av steril HC1 ved pH 8,0. Under fermenteringens logaritmiske fase overholdes en metanolkonsentrasjon mellom 50 og 100 ppm. Reguleringen av denne konsentrasjonen, kontroll av fremgangsmåten.samt adskillelse og opparbeidelse av den dannede cellemasse foregår som angitt i eksempel 1. Etter for-støvningst.ørkning får man et produkt med et råproteininnhold på 75,8 vekt%, et aminosyreinnhold på 67,0 vekt% og et nukleinsyre innhold på 8,5 vekt%

Eksempe l 5.

Stammen Flavobacterium sp. ATCC 31062 (FH-B-5108) dyrkes som i eksempel 1 først i et 10 liters fermenteringskar. Den således dannede kultursuspensjon overføres deretter i et

200 liters fermenteringskar, som er beskikket med 150 liter av følgende næringsoppløsning: 1 , 0035 (NHl4)2S0lj

0,4 % KH2POi|

0,2 % K2HP0lj

0,2 .% Na2HP0^. 12 H20

0, 02% NaCl .

0,02$ MgSO^. 7 H20

0,5 % metanol.

Næringsoppløsningens pH-verdi innstilles med halvkonsentrert fosforsyre til 6,5. Deretter steriliserer man ved 120°C og 1,4 ato i 20 minutter. Etter steriliseringen utgjør pH 6,7. Metanol tilsettes adskilt.

Deretter fermenteres kulturen 24 til 36 timer

ved 35°C under luftning av 1,1 vvm ved et trykk på 0,3 ato under omrøring med 2 rørere med 250 omdreininger pr. minutt. Under fermenteringens logaritmiske fase overholdes en konsentrasjon av metanol mellom 50 og 120 ppm, idet det ved nedsettelse av karbondioksydutstøtningen tilsettes ytterligere mengder metanol, inntil karbondioksydutstøtningen igjen øker. pH-verdien holdes ved tilsetning av steril HC1 mellom 7,9 og 8,4. Fremgangsmåtens fremadskridning og tidspunktet for avslutningen bestemmes som angitt i eksempel 1.

Den således dannede kultursuspensjon anvendes som podningsmaterial for et 2000 liters fermenteringskar. Nærings-oppløsningen har samme sammensetning og samme pH-verdi som ovenfor for den sist omtalte fermentering. Fermenteringsreak- toren steriliseres 20 minutter ved 120°C og 1,4 ato under omrøring med 210 omdreininger pr. minutt. Etter steriliser-ing utgjør pH-verdien 6,8.

Den etterfølgende fermentering gjennomføres

ved 35°C, luftning med 0,6 vvm, et trykk på 0,3 ato og 2 om-rørere med 210 omdreininger pr. minutt.. pH-verdien holdes under fermenteringen med sterilt HC1 mellom 7,9 og 8,4.

Fremgangsmåtens fremadskridning overvåkes ved prøveuttak til undersøkelse av sterilitet, til pH-måling til bestemmelse av tørrvekt og bakteriecellemassens nitrogen.

Konsentrasjonen av metanol holdes under den logaritmiske vekstfase mellom 10 og 150 ppm som angitt ovenfor applisert etter graden av karbondioksydutstøtning.

Etter avslutning av den logaritmiske vekstfase oppvarmes kultursuspensjonen kort tid ved 55°C og avkjøles deretter til l8°C. pH-verdien ligger mellom 8,0 og 8,5.

2000 liter av den således dannede kultursuspensjon med et innhold av 20 g pr. liter tørrmasse sentrifugeres i en rørsentrifuge ved 15000 g med en ytelse på 400 liter pr. time. De således adskilte fuktige bakterieceller oppslemmes i saltet vann til en suspensjon med et innhold på 10 til 15 vekt/? tørrmasse og omrøres kraftig i en egnet beholder ved 15 til 18°C. Derved utvaskes i løpet av ca. en time følgestoffer og bestanddeler av næringsoppløsningen. Etter gjentatt sentrifugering fremstilles med avsaltet vann en 20 til 25 vekt%-ig bakteriesuspensjon, denne omrøres under samme betingelser og sentrifugeres igjen. De således vaskede bakterieceller opp-svømmes til en 40 til 50 vekt%-ig suspensjon og underkastes forstøvningstørkning.

Man får således 37 kg av et lyst, luktløst celle-produkt, som inneholder 7 3 3 7 vekt/? råprotein, 6l,0 vekt/» aminosyrer - herav 49,0 vekt/? essentielle aminosyrer - videre 10,5 vekt/J nukleinsyrer.

Claims (10)

1. Fremgangsmåte til fremstilling av protein fra bakterier med metanol som karbonkilde og en nitrogenkilde under aerobe betingelser ved en pH-verdi mellom 4,0 og 93 0, karakterisert ved at man fermenterer bakteriestammer av slekten Bacillus, Pseudomonas og Flavobacterium, deres mutanter og varianter således at konsentrasjonen av metanol i fasen- for logaritmisk vekst av bakteriecellene ligger mellom 10 og 150 ppm, fortrinnsvis mellom 50 Og 100 ppm, referert til kultursuspensj onen.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at konsentrasjonen av metanol ligger mellom 10 og 150 ppm.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 og 2, karakterisert ved at kultursuspensjonen luftes med 0,3 til 0,6 volum luft pr. volumsuspensjon og minutt.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1 til 3, karakterisert ved at kultursuspensjonen omrøres med 50 til 210 omdreininger pr. minutt.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1 til 4, karakterisert ved at fermenteringen gjennomføres i et kar som minst inneholder 2 hullskiverørere, idet forholdet mellom rørerdiameter og kjelediameter ligger mellom 0,35 og 0,65 og idet avstanden mellom to rørere utgjør en rørerdiameter.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 1 til 5, karakterisert ved at fermenteringen gjennomføres i reaktorer som kan omvalses såvel mekanisk, hydrodynamisk og pneumatisk.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 1 til 6, karakterisert ved at det anvendes Pseudomonas species, deres mutanter eller varianter.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 1 til 6, karakterisert ved at det anvendes Bacillus species, deres mutanter og varianter.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 1 til 6, karakterisert ved at det anvendes Flavobacterium species, deres mutanter og varianter.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 1 og 2, karakterisert ved at metanolkonsentrasjonen styres ved måling av karbondioksydutstøtningen.