NO147054B - PROCEDURE FOR STABILIZING BACTERIOLOGICAL TESTS - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for stabilisering av prøver som skal underkastes bakteriologiske laboratorieundersøkelser, spesielt urinprøver, for preservering The present invention relates to a method for stabilizing samples to be subjected to bacteriological laboratory examinations, in particular urine samples, for preservation

av dem under transport. of them during transport.

Anvendelse av borsyre for preservering av bakteriologiske prøver var kjent allerede ved begynnelsen av dette århundre, bl.a. fra veterinærmedisinske arbeider angående en bakteriologisk og produksjonshygienisk test av pasteurisert melk, hvor muligheten av og fordelen ved å anvende 1%-ig borsyreoppløsning som transportmedium til bakteriologiske laboratorier påvises. I forsøkene anvendes B. tuberculosis, og det viste seg at tuberkelbakteriene ikke ble ødelagt i melkeprøver, som ble konservert med 1%-ig borsyre, samtidig som denne konservering gjorde det mulig å trans-portere prøvene i lang tid uten at disse undergikk noen uønskede forandringer som grep forstyrrende inn i undersøkelsen i laboratoriet . The use of boric acid for the preservation of bacteriological samples was already known at the beginning of this century, i.a. from veterinary medical works regarding a bacteriological and production hygiene test of pasteurized milk, where the possibility of and the advantage of using a 1% boric acid solution as a transport medium to bacteriological laboratories is demonstrated. B. tuberculosis is used in the experiments, and it turned out that the tubercle bacteria were not destroyed in milk samples, which were preserved with 1% boric acid, while this preservation made it possible to transport the samples for a long time without them undergoing any unwanted changes that interfered with the examination in the laboratory.

Muligheten for å lette det bakteriologiske laboratoriearbeide ved bakterieanalyser av urinprøver ved hjelp av borsyre-konservering var ennu ikke akseptert ved slutten av 1920-tallet. Viktigheten av umiddelbart å undersøke urinprøver bakteriologisk ved suspekte urinveisinfeksjoner for i størst mulig grad å unngå overvekst av bakteriestammer, har vært understreket overordentlig sterkt til tross for at borsyre kan anvendes preanalytisk uten å forstyrre målinger av andre parametre. Muligheten for å anvende borsyre som 1%-ig transportmedium for å unngå overvekst ved under-søkelser av Brusella abortus er påvist. The possibility of facilitating bacteriological laboratory work by bacterial analysis of urine samples using boric acid preservation was not yet accepted at the end of the 1920s. The importance of immediately examining urine samples bacteriologically in case of suspected urinary tract infections in order to avoid overgrowth of bacterial strains to the greatest extent possible has been emphasized extremely strongly despite the fact that boric acid can be used pre-analytically without interfering with measurements of other parameters. The possibility of using boric acid as a 1% transport medium to avoid overgrowth during investigations of Brucella abortus has been demonstrated.

Borsyre har vært anvendt ved flere forskjellige undersøk-elser, både humane og dyriske, av bakterievekst og hemning derav i forskjellige medier. Til tross for dette påpekes det i flere videnskapelige arbeider, at bakteriologiske undersøkelser av urin må utføres umiddelbart, hvis ikke oppbevaring under avkjøling (+4°C) er mulig, og da bare i 48 timer. Problemet med overvekst ved langsom transport av urinprøver til bakteriologiske laboratorier gjenstår altså. I et arbeide fra slutten av 1960-tallet påpekes det noe overraskende at undersøkelse av borsyre som kon-serveringsmiddel ved urintransporter ikke er blitt overveiet og enda mindre undersøkt. I dette arbeide anføres at den optimale borsyrekonsentrasjon i en ferdig urintransportprøve skal være 1,8%, og at den preanalytiske tiden ikke bør overstige 4 dager. Boric acid has been used in several different investigations, both human and animal, of bacterial growth and its inhibition in different media. Despite this, it is pointed out in several scientific works that bacteriological examinations of urine must be carried out immediately, if storage under cooling (+4°C) is not possible, and then only for 48 hours. The problem of overgrowth during slow transport of urine samples to bacteriological laboratories therefore remains. In a work from the late 1960s, it is pointed out, somewhat surprisingly, that investigation of boric acid as a preservative in urine transport has not been considered and even less investigated. In this work it is stated that the optimal boric acid concentration in a finished urine transport sample should be 1.8%, and that the pre-analytical time should not exceed 4 days.

Til tross for disse vitenskapelige medisinske arbeider og til tross for at borsyre tidlig var kjent som et funksjonelt kon-serveringsmiddel med hensikt på bakterievekst, har denne metode fått liten utbredelse, det være seg nasjonalt eller internasjonalt ved det bakteriologiske laboratoriearbeide. Despite these scientific medical works and despite the fact that boric acid was early known as a functional preservative with the intention of bacterial growth, this method has gained little spread, be it nationally or internationally in bacteriological laboratory work.

Flere grunner kan imidlertid påvises for denne treghet til However, several reasons can be demonstrated for this sluggishness

å anta en tilsynelatende sikker og relativt sett klart mere økonomisk transportmetode enn kjøletransport„ Metoden innebærer store praktiske vanskeligheter eftersom man må måle opp meget små mengder av et pulver, og eftersom dette skal transporteres i meget små transportrør, samt at borsyren har en relativt lav oppløselig-hetsgrad i urin. Hvis pulveret dessuten oppløses i vann for lettere å kunne måles i eksakte volumer, fåes altfor store volum av borsyreoppløsning og urin, for å bli praktisk anvendbare ved transporter. For på laboratoriet å kunne skille mellom urinprøver med borsyre og urinprøver uten borsyre, kreves et ekstra arbeidsmoment, som er praktisk forstyrrende, idet den sentraliserte laboratorie-diagnostikk krever så få arbeidsmomenter som mulig på grunn av det store antall urinprøver som daglig innkommer (ca. 500 pr. dag ved et større laboratorium). to assume an apparently safe and relatively clearly more economical transport method than refrigerated transport" The method involves great practical difficulties since one has to measure out very small amounts of a powder, and since this must be transported in very small transport pipes, as well as the fact that boric acid has a relatively low solubility - degree of heat in urine. If the powder is also dissolved in water to make it easier to measure in exact volumes, much too large volumes of boric acid solution and urine are obtained to be practically usable for transport. In order to be able to distinguish between urine samples with boric acid and urine samples without boric acid in the laboratory, an additional amount of work is required, which is practically disruptive, as the centralized laboratory diagnostics requires as few work items as possible due to the large number of urine samples that are received daily (approx. 500 per day at a larger laboratory).

Borsyrens oppløselighet i vann: The solubility of boric acid in water:

hvilket innebærer at man praktisk ikke kan arbeide med høyere konsentrasjoner enn 3%-ige oppløsninger for å unngå utkryst allisasjon ved temperatursvingninger. Av bl.a. omkostningsgrunner efter-strebes så små transportenheter som mulig, og i alminnelighet anvendes standardiserte transportbeholdere med et volum på 10 ml. which means that you cannot practically work with higher concentrations than 3% solutions in order to avoid cross-linking due to temperature fluctuations. Of i.a. cost reasons strive for as small transport units as possible, and standardized transport containers with a volume of 10 ml are generally used.

Ved anvendelse av 3%-ig borsyreoppløsning må 13 ml tilsettes til 9 ml urin for at konsentrasjonen skal bli 1,8% borsyre, hvilket er nødvendig for å oppnå konservering. Dette medfører at meget vann tilføres til prøvene og at volumet økes til over det dobbelte. When using a 3% boric acid solution, 13 ml must be added to 9 ml of urine in order for the concentration to become 1.8% boric acid, which is necessary to achieve preservation. This means that a lot of water is added to the samples and that the volume is increased to more than double.

Det har vist seg at man kan oppnå mere effektiv preservering gjennom tilsetning av bare 0,5 - 0,8% borsyre hvis denne foreligger som et organisk kompleks. It has been shown that more effective preservation can be achieved through the addition of only 0.5 - 0.8% boric acid if this is present as an organic complex.

Eftersom konsentrasjonen av borsyre i disse komplekser er Since the concentration of boric acid in these complexes is

■><>>■><>>

høy, blir en ti<*>lsetning på 0,4 - 1,4 ml eller g til 9 ml urin fullt tilstrekkelig. Man øker på denne måte volumet i så begrenset ut-strekning at de standardiserte transportrør kan anvendes. ;Foreliggende fremgangsmåte karakteriseres ved at prøven tilsettes et borsyrekompleks med formelen: ;hvor R kan være ethylenglycol, propandiol-1,2, glycerol, fructose, mannit, sorbit eller andre vannoppløselige dioxy- eller polyoxy-forbindelser, og som er fremstilt ved oppvarmning av borsyren og oxyforbindelsen, idet 1-2 mol av det ved fremstillingen dannede reaksjonsvann fjernes, i en slik mengde at innholdet av borsyre i prøven blir 0,2 - 1,4 vekt%, fortrinnsvis 0,4 - 0,8.vekt%. ;De øvrige kjennetegn ved oppfinnelsen fremgår av under-kravene. ;For at man lettere skal kunne fastslå om preserveringsmidlet ;er tilsatt, kan disse farves med methylenblått eller annet passende farvestoff, som ikke forstyrrer den bakteriologiske under-søkelse»;Eksempel 1 ;100 vektdeler ethylenglycol ;17 vektdeler borsyre BP ;oppvarmes til 98°C, hvorved vann avspaltes, hvorefter temperaturen økes til 112°C i 4 minutter. Derved gikk der av 2 mol vann. Borsyreinnhold = 17,7% ;pH i det konsentrerte reaksjonsprodukt =2,5 ;pH i 10%-ig vannoppløsning =4,4 ;Eksempel 2 ;124 vektdeler glycerol DAB 6 d = 1,23 ;17 vektdeler borsyre BP ;ble oppvarmet til 110°C, hvorved reaksjonen begynte, og 2 mol vann ble avspaltet. Vanninnholdet steg i reaksjonsblandingen fra 11,3% til 22,3%. Temperaturen ble forhøyet i tre minutter til 129°C, hvorefter oppvarmningen ble avbrutt og reaksjonsproduktet fikk avkjøle. ;Vanninnhold =15,5% ;Borsyreinnhold = 12,4% ;pH i konsentrert reaksjonsprodukt = 1,3 ;pH i 10%-ig vannoppløsning = 3,9 ;Methylenblått tilsatt i en konsentrasjon på 5 - 50 ppm. ;Eksempel 3 ;lOO vektdeler d-mannit ;70 vektdeler vann ;32 vektdeler borsyre ;ble oppvarmet til 80°C, hvorved reaksjonen begynte. Temperaturen ble forhøyet i 7 minutter til 112°C, hvorved 2 mol vann gikk av. ;Borsyreinnhold = IO,8% ;pH i konsentrert reaksjonsprodukt =0,85 ;pH i 10%-ig vannoppløsning = 3»5 ;Produktet fikk størkne og ble presset til tabletter. ;Eksempel 4 ;100 vektdeler fructose ;50 vektdeler vann ;36 vektdeler borsyre ;ble oppvarmet til 80°C, hvorefter temperaturen ble forhøyet i ;6 minutter til 109°C, hvorved 2 mol vann gikk av. ;Borsyreinnhold = 12,1% ;pH i konsentrert reaksjonsprodukt =1,1 ;pH i 10%-ig vannoppløsning =4,2 ;Reaksjonsproduktet ble presset til tabletter. ;Eksempel 5 ;100 vektdeler propandiol-1,2 ;25 vektdeler borsyre ;ble oppvarmet til 98°C, hvorefter temperaturen ble forhøyet til l6o°C i IO minutter. ;Borsyreinnhold = 20% ;pH i konsentrert reaksjonsprodukt =1,7 ;pH i 10%-ig vannoppløsning = 4,6 ;Innfarvet med methylenblått. ;Borsyre-glycerol-komplekset som ble fremstilt ifølge eksempel 2, ble undersøkt på om individuell følsomhet foreligger mellom forskjellige bakteriearter, ved forskjellige bakterietall og i prøver, som samtidig inneholder flere forskjellige bakteriestammer ved å undersøke prøver dels før og dels efter normalt forekommende transporttype (mindre enn ett døgn), dels i prøve som ble oppbevart i lengre tid før dyrkning. Hensikten var også individuelt å undersøke de forskjellige komponenter som inngitt i produktene med hensyn til antibakteriell virkning samt å forsøke ;å bedømme hvor store avvikelser fra instruksjonene som kan toler-eres med hensyn til tilsatt mengde av det borsyreholdige konser-veringsprodukt, resp. mengden av urin. ;To typer forsøk ble utført: ;1) Prøver ble tatt fra pasienter med bacteriuria. Dels ble prøver tatt av laboratoriets personale, dels ble prøver tatt av avdelingspersonalet og transportert med normale transporter til ;laboratoriet. I de tilfelle hvor prøver og transporter ble utført av laboratoriets personale, har man hatt full kontroll over prøve-tagningsteknikken og transporttiden. Prøver ble tatt efter vasking og tørring som såkalt "mid-stream-prøve" og dyrkning igangsatt ;innen en time. Dyrkningen ble utført på blodagarplater, Drigalski-agar og acidsorbitolagar. Kvantitering ble gjort efter dyrkninger fra seriefortynninger av urinprøve i koksalt. Artsbestemmelse ;ble gjort ved vanlig rutinemetode efter primær inkubering i 18 timer ved 37°C. ;2) Laboratorieforsøk med eksperimentelt fremstilt, bakterie-holdig urin ble utført for å muliggjøre testing av spesielle stammer. Til forsøket ble anvendt åtte bakteriestammer som er van- ;lige ved urinveisinfeksjon, nemlig: ;Escherichia coli ;Klebsiella ;Pseudomonas aeruginosa ;Pseudomonas mirabilis ;Ent erokocker ;Staphyloccus aureus ;Staphylococcus epidermidis ;Staphylococcus saprophyticus ;I forsøk som krever spesielt følsom teststamme, ble gonococcer anvendt. ;Undersøkelsene ble i hovedsak utført som sammenligninger mellom oppbevaring av prøver i kjøleskap, hhv. ved værelsetemperatur med bor-glyceroltilsetning. ;Som referanseverdi ble anvendt det dyrkningsresultat som man fikk ved dyrkning i løpet av en time efter prøvetagningen. ;Til forsøkene ble anvendt dels ren borsyre i pulverform, dels forskjellige konsentrasjoner av borsyrekomplekser ifølge eksempel 2. ;Eksperimentel bacteriuria-urin: ;Fra bakteriekolonier på agarplater ble gjort oppslemninger ;i fysiologisk koksaltoppløsning. Kvantitering ble gjort med mål-setningen å få en bakteriemengde mellom ca. 100.000 og 10 milli-oner pr. ml urin efter tilsetning av oppslemningen til uinfisert urin. ;Result at ;Forsøk ble utført med borsyre i pulverform. Til 9 ml urin ble tilsatt 0,1 g borsyre. Anvendte teststammer fremgår av tabell 1. ;Den ifølge metodebeskrivelsen fremstilte, bakterieholdige urin ble kvantitert og delt i to porsjoner. Den ene ble anbrakt ved +4°C, til den annen ble tilsatt borsyre, og den ble oppbevart i værelsetemperatur. Kvant itering ble utført efter 24 timer og efter 48 timer. Av tabellen fremgår det at ingen anmerkningsverdige avvikelser skjer enten urinen oppbevares koldt eller ved værelsetemperatur med borsyretilsetning. ;Pasientprøver: Prøver ble tatt av seks geriatriske pasienter i pleieavdelinger. Dyrkningen av prøvene ble satt i gang i løpet av 1 time, hvorefter prøvene ble behandlet analogt med ovenstående. Av tabell 2 fremgår det at avvikelsene for såvel avkjølte som i borsyre oppbevarte prøver er mindre enn en 10-potens. ;For å finne ut om glycerol i seg selv skulle ha hemmende virkning på bakterier, ble følgende forsøk utført: 15 friske bakterieisolater fra pasienter med bacteriuria ble tilsatt urin som ble kvantitert og oppdelt i tre porsjoner for oppbevaring ved +4°C, for oppbevaring ved værelsetemperatur med tilsetning av borsyre og for oppbevaring ved +22°C med tilsetning av glycerol. Av tabell 3 fremgår undersøkte bakteriestammer og målte forandringer i 10-log. I ingen av tilfellene har man fått hemning ved tilsetning av glycerol. Forandringer i kjøleoppbevart, hhv. ved væreIsetemperatur oppbevart prøve med borsyretilsetning var i alle tilfelle mindre enn en 10-potens. ;For å bestemme om negativ virkning kunne oppnåes ved kombinasjonen av borsyrekompleks ifølge eksempel 2 og kjøleoppbevaring, ble følgende forsøk utført: Til urin ble tilsatt fem forskjellige bakteriearter. Prøven ble kvantitert og oppdelt. Ubehandlet urin ble oppbevart ved -20°C. En annen porsjon av prøven ble tilsatt borsyrekompleks ifølge eksempel 2 og oppbevart dels ved +4°C og dels ved værelsetemperatur. ;Av tabellene fremgår det at kombinasjonen av kjøleoppbevar-ing og borsyre-glycerol-kompleks ifølge eksempel 2 ikke gir av-vikende resultater efter oppbevaring i 18 timer. Frysning av urin medfører helt upålitelige kvantitative resultater. Avvikelsene er større for gramnegative staver enn for grampositive coccer. ;For å undersøke glycerolens effekt på bakterier, ble der utført forsøk med en spesielt følsom stamme: ;Urin med og uten glyceroltilsetning ble sammenlignet. Til ;9 ml urin ble tilsatt 0,65 ml glycerol. Gonococcer ble tilsatt såvel til denne urin som urin uten glyceroltilsetning. Kvantitering ble gjort efter 1, 2, 4 og 6 timer. Av tabell 5 fremgår den prosentuelle andel av opprinnelig tilførte gonococcer, som kan ;igjenisoleres efter angitt tid. Av tabellen fremgår dét at gonococcer hurtig avlives i urin og ikke kan gjenfinnes 4 timer efter tilsetningen, mens tilsetning av glycerol gjør at gonococcer for-satt isoleres efter 6 timer. ;;Forsøket ble utført med tilsetning av forskjellige farve-stoffer. Lofflers methylenblått (0,5 g/1.000 ml) ble utspedt og tilsatt til urin. Farven i en konsentrasjon på 0,01 ml/9 ml urin var tydelig iakttagbar for det blotte øye. For å bestemme methylenblåtts virkning på bakterier, ble der utført forsøk med en 10 ganger sterkere oppløsning. Borsyre-glycerol-kompleks med og uten methylenblått ble satt til prøver. Av tabell 6 fremgår det at tilsetningen av methylenblått ikke forstyrrer kvantiter-ingen av de undersøkte bakteriestammer. ;Feilmarginaler: ;For å bestemme i hvor høy grad man kan gjøre avvikelser fra metodebeskrivelsen med hensyn til mengden av urin, hhv. mengden av borsyrekomplekstilsetning, ble der gjort forsøk med forskjellige konsentrasjoner. ;For forsøket ble anvendt urin med tilsetning av E. coli. ;Med utgangspunkt fra tidligere rapporter om passende konsentrasjon av borsyre og efter justeringer bygget på erfaringer, ble det fremstilt et borsyre-glycerolkompleks med 12,4% borsyre. Til vanlig urinprøvemengde, 9 ml, ble tilsatt ni forskjellige mengder fra 0,4 til 0,8 ml (0,65 ml tilsvarer 0,82% borsyre). Prøvene ble oppbevart ved +22°C i 24 timer. Kvantitering ble gjort dels fra drøyt 5 måneder gammel oppløsning, dels fra nytilberedt oppløsning. Forandringene innen fortynningsområdet var mindre enn en 10-potens. Borsyrekomplekset ble pakket i en porsjonspose. Ved valg av ;0,65 ml pr. porsjonspose ble resultatet sannsynligvis ikke påvirket, hvis man ved slurv unnlater å tømme en tredjedel av innholdet i ;urinprøven og derved får en lavere konsentrasjon av borsyre enn det som er tilsiktet. Metoden synes dessuten å tåle en viss kon-sentrasjonsøkning ved at for lite urin fåes i røret. Ifølge beregningen tillater metoden at man unnlater å tilsette 3 - 4 ml av de anbefalte 9 ml. ;Sluttforsøk ;Sluttforsøk ble utført på prøvene tatt fra pasienter med bacteriuria. All prøvetagning ble gjort med tilsetning fra porsjonspose, og transport av prøven ble utført med ordinære rutiner.<* >En del av prøven ble forsynt med bor-glycerol-kompleks og oppbevart ved værelsetemperatur, og den annen del ble avkjølt og kjøle-transportert. Begge prøvetyper ble oppbevart i 24 timer, hvorefter kvantitering ble utført. Resultatene fremgår av tabell 7. high, a titration of 0.4 - 1.4 ml or g to 9 ml of urine is fully sufficient. In this way, the volume is increased to such a limited extent that the standardized transport pipes can be used. The present method is characterized by adding a boric acid complex with the formula to the sample: where R can be ethylene glycol, propanediol-1,2, glycerol, fructose, mannitol, sorbitol or other water-soluble dioxy or polyoxy compounds, and which is produced by heating the boric acid and the oxy compound, with 1-2 mol of the water of reaction formed during the preparation being removed, in such an amount that the content of boric acid in the sample is 0.2 - 1.4% by weight, preferably 0.4 - 0.8% by weight. The other characteristics of the invention appear from the sub-claims. "In order to make it easier to determine whether the preservative has been added, these can be stained with methylene blue or another suitable dye, which does not interfere with the bacteriological examination"; Example 1 ; 100 parts by weight ethylene glycol ; 17 parts by weight boric acid BP ; heated to 98° C, whereby water is split off, after which the temperature is increased to 112°C for 4 minutes. Thereby 2 moles of water were lost. Boric acid content = 17.7%; pH in the concentrated reaction product = 2.5; pH in 10% water solution = 4.4; Example 2; 124 parts by weight glycerol DAB 6 d = 1.23; 17 parts by weight boric acid BP; was heated to 110°C, whereupon the reaction began, and 2 moles of water were split off. The water content rose in the reaction mixture from 11.3% to 22.3%. The temperature was raised for three minutes to 129°C, after which the heating was interrupted and the reaction product was allowed to cool. ;Water content = 15.5% ;Boric acid content = 12.4% ;pH in concentrated reaction product = 1.3 ;pH in 10% water solution = 3.9 ;Methylene blue added in a concentration of 5 - 50 ppm. Example 3 100 parts by weight d-mannitol 70 parts by weight water 32 parts by weight boric acid were heated to 80°C, whereupon the reaction began. The temperature was raised for 7 minutes to 112°C, whereupon 2 moles of water were removed. ;Boric acid content = 10.8% ;pH in concentrated reaction product =0.85 ;pH in 10% aqueous solution = 3»5 ;The product was allowed to solidify and was pressed into tablets. ;Example 4 ;100 parts by weight fructose ;50 parts by weight water ;36 parts by weight boric acid ;was heated to 80°C, after which the temperature was raised for ;6 minutes to 109°C, whereupon 2 moles of water went off. ;Boric acid content = 12.1% ;pH in concentrated reaction product =1.1 ;pH in 10% water solution =4.2 ;The reaction product was pressed into tablets. Example 5: 100 parts by weight of propanediol-1,2, 25 parts by weight of boric acid were heated to 98°C, after which the temperature was raised to 160°C for 10 minutes. ;Boric acid content = 20% ;pH in concentrated reaction product =1.7 ;pH in 10% water solution = 4.6 ;Colored with methylene blue. The boric acid-glycerol complex, which was prepared according to example 2, was examined to see if individual sensitivity exists between different bacterial species, at different bacterial numbers and in samples, which simultaneously contain several different bacterial strains, by examining samples partly before and partly after the normally occurring type of transport ( less than one day), partly in samples that were stored for a longer time before cultivation. The purpose was also to individually examine the various components included in the products with regard to antibacterial action and to try to judge how large deviations from the instructions can be tolerated with regard to the added amount of the boric acid-containing preservative product, resp. the amount of urine. ;Two types of experiments were performed: ;1) Samples were taken from patients with bacteriuria. Samples were partly taken by the laboratory's staff, partly samples were taken by the department's staff and transported by normal transport to the laboratory. In those cases where samples and transport were carried out by the laboratory's staff, they had full control over the sampling technique and the transport time. Samples were taken after washing and drying as a so-called "mid-stream sample" and cultivation started within an hour. Cultivation was carried out on blood agar plates, Drigalski agar and acid sorbitol agar. Quantitation was done after cultures from serial dilutions of urine samples in saline. Species determination was done by the usual routine method after primary incubation for 18 hours at 37°C. ;2) Laboratory tests with experimentally produced bacteria-containing urine were carried out to enable testing of particular strains. Eight bacterial strains that are common in urinary tract infections were used for the experiment, namely: Escherichia coli, Klebsiella, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas mirabilis, Ent erococcus, Staphyloccus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus; In experiments that require a particularly sensitive test strain, gonococci used. The investigations were mainly carried out as comparisons between storing samples in a refrigerator, respectively. at room temperature with boron-glycerol addition. As a reference value, the cultivation result obtained by cultivation within one hour after sampling was used. ;For the experiments, partly pure boric acid in powder form was used, partly different concentrations of boric acid complexes according to example 2. ;Experimental bacteriuria urine: ;From bacterial colonies on agar plates, slurries were made ;in physiological saline solution. Quantification was done with the aim of obtaining a bacterial quantity between approx. 100,000 and 10 million per ml of urine after adding the slurry to uninfected urine. ;Result that ;Experiments were carried out with boric acid in powder form. 0.1 g of boric acid was added to 9 ml of urine. The test strains used appear in table 1. The bacteria-containing urine produced according to the method description was quantified and divided into two portions. One was placed at +4°C until boric acid was added to the other, and it was stored at room temperature. Quantification was performed after 24 hours and after 48 hours. The table shows that no notable deviations occur whether the urine is stored cold or at room temperature with the addition of boric acid. ;Patient samples: Samples were taken from six geriatric patients in nursing wards. Cultivation of the samples was initiated within 1 hour, after which the samples were treated analogously to the above. Table 2 shows that the deviations for samples both cooled and stored in boric acid are less than a power of 10. ;In order to find out whether glycerol in itself should have an inhibitory effect on bacteria, the following experiment was carried out: 15 healthy bacterial isolates from patients with bacteriuria were added to urine which was quantified and divided into three portions for storage at +4°C, for storage at room temperature with the addition of boric acid and for storage at +22°C with the addition of glycerol. Table 3 shows examined bacterial strains and measured changes in 10-log. In none of the cases has inhibition been achieved by the addition of glycerol. Changes in cold storage, respectively at ice temperature stored sample with boric acid addition was in all cases less than a power of 10. In order to determine whether a negative effect could be achieved by the combination of boric acid complex according to example 2 and cold storage, the following experiment was carried out: Five different bacterial species were added to urine. The sample was quantified and divided. Untreated urine was stored at -20°C. Another portion of the sample was added with boric acid complex according to example 2 and stored partly at +4°C and partly at room temperature. From the tables it appears that the combination of cold storage and boric acid-glycerol complex according to example 2 does not give deviant results after storage for 18 hours. Freezing urine results in completely unreliable quantitative results. The deviations are greater for Gram-negative rods than for Gram-positive cocci. ;To investigate the glycerol's effect on bacteria, experiments were carried out with a particularly sensitive strain: ;Urine with and without glycerol addition was compared. 0.65 ml of glycerol was added to 9 ml of urine. Gonococci were added to this urine as well as to urine without the addition of glycerol. Quantitation was done after 1, 2, 4 and 6 hours. Table 5 shows the percentage of originally supplied gonococci, which can be re-isolated after the specified time. The table shows that gonococci are quickly killed in urine and cannot be found 4 hours after the addition, while the addition of glycerol means that gonococci are still isolated after 6 hours. ;;The experiment was carried out with the addition of different dyes. Loffler's methylene blue (0.5 g/1,000 ml) was diluted and added to urine. The color in a concentration of 0.01 ml/9 ml of urine was clearly visible to the naked eye. In order to determine the effect of methylene blue on bacteria, experiments were carried out with a 10 times stronger solution. Boric acid-glycerol complex with and without methylene blue was added to samples. Table 6 shows that the addition of methylene blue does not interfere with the quantification of the investigated bacterial strains. ;Margins of error: ;To determine the extent to which deviations from the method description can be made with regard to the amount of urine, or the amount of boric acid complex addition, experiments were carried out with different concentrations. For the experiment, urine with the addition of E. coli was used. Based on previous reports on the appropriate concentration of boric acid and after adjustments based on experience, a boric acid-glycerol complex with 12.4% boric acid was prepared. Nine different amounts from 0.4 to 0.8 ml (0.65 ml corresponds to 0.82% boric acid) were added to the usual amount of urine sample, 9 ml. The samples were stored at +22°C for 24 hours. Quantitation was done partly from just over 5 months old solution, partly from freshly prepared solution. The changes within the dilution range were less than a power of 10. The boric acid complex was packaged in a portion bag. When choosing ;0.65 ml per portion bag, the result was probably not affected, if one carelessly fails to empty a third of the contents of the urine sample and thereby obtains a lower concentration of boric acid than intended. The method also seems to tolerate a certain increase in concentration if too little urine is obtained in the tube. According to the calculation, the method allows one to omit adding 3 - 4 ml of the recommended 9 ml. ;Final test ;Final test was performed on the samples taken from patients with bacteriuria. All sampling was done with addition from a portion bag, and transport of the sample was carried out using ordinary routines. Both sample types were kept for 24 hours, after which quantification was carried out. The results appear in table 7.

Store problemer foreligger ved transport av prøver før bakteriologisk dyrkning» Uønskede forandringer inntreffer, hvis ikke dyrkningen skjer i løpet av meget kort tid efter prøvetag-ningen. Forandringene kan forhindres ved kjøletransport. Kjøl-ing av prøven kan iblant medføre frysing av prøven, hvilket er skadelig for mange bakteriearter. Kjølemetoden er klosset og uøkonomisk. Anvendelsen av borsyre som preserverende tilsetning til urinprøver har tidligere vært påvist og verifisert ved nye forsøk. Ulempene med borsyre i pulverform har bevirket forsøk med å få borsyre i oppløsning. Borsyre-glycerol-komplekser er blitt fremstilt ifølge eksempel 2, og methylenblått er tilsatt for å gjøre tilsetningen til prøven synlig. Såvel laboratoriemessig som kliniske prøveundersøkelser har vist at sammensetningen ifølge oppfinnelsen har den tilsiktede virkning. Forandringer er ikke oppstått i prøvene i løpet av to døgn. Et stort antall forskjellige bakteriearter, aktuelle som ethiologi til urinveisinfeksjon, er blitt prøvet. Ingen antibakteriell virkning er påvist for noen av de inngående bestanddeler ved den anvendte konsentrasjon. Ut-titrering av sikkerhetsmarginalene for feilanvendelse av produktene har vist at man sannsynligvis kan tolerere en 30%-ig feildosering, såvel oppad som nedad, fra den anbefalte konsentrasjon. Major problems exist when transporting samples before bacteriological culture." Undesirable changes occur if the culture does not take place within a very short time after the sample is taken. The changes can be prevented by refrigerated transport. Refrigeration of the sample can sometimes lead to freezing of the sample, which is harmful to many species of bacteria. The cooling method is clumsy and uneconomical. The use of boric acid as a preservative addition to urine samples has previously been demonstrated and verified in new experiments. The disadvantages of boric acid in powder form have led to attempts to get boric acid in solution. Boric acid-glycerol complexes have been prepared according to Example 2, and methylene blue has been added to make the addition to the sample visible. Both laboratory and clinical test examinations have shown that the composition according to the invention has the intended effect. Changes have not occurred in the samples within two days. A large number of different bacterial species, relevant as the etiology of urinary tract infection, have been tested. No antibacterial effect has been demonstrated for any of the constituents at the concentration used. Titration of the safety margins for incorrect use of the products has shown that one can probably tolerate a 30% wrong dosage, both upwards and downwards, from the recommended concentration.

Ved produktenes konsentrasjon er man ikke låst til noen spesiell rørtype, men kan fleksibelt tilpasse seg til de prøve-volumer og rørtyper som anvendes ved forskjellige laboratorier. When it comes to the concentration of the products, you are not locked into any particular tube type, but can flexibly adapt to the sample volumes and tube types used in different laboratories.

Det er åpenbart at dette system er betydelig smidigere enn kjøletransport og at det eliminerer risikoen for fryseskader på prøven. Fra transportsynspunkt byr metoden på større smidighet og betydelig lavere omkostninger. Riktig gjennomført kjøletransport har i praksis vist seg å være meget vanskelig å utføre. It is obvious that this system is significantly more flexible than refrigerated transport and that it eliminates the risk of freezing damage to the sample. From a transport point of view, the method offers greater flexibility and significantly lower costs. Properly carried out refrigerated transport has in practice proven to be very difficult to carry out.

Claims (4)

1. Fremgangsmåte ved stabilisering av prøver som skal underkastes bakteriologiske laboratorieundersøkelser, spesielt urin-prøver, for å preservere dem under transport, karakterisert ved at der til prøven tilsettes et borsyrekompleks med formelen: hvor R betegner ethylenglycol, propandiol-1,2, glycerol, fructose, mannit, sorbit eller andre vannoppløselige dioxy- eller poly-oxyforbindelser, som er fremstilt ved oppvarmning av borsyre og oxyforbindelse idet 1-2 mol av det ved fremstillingen dannede reaksjonsvann fjernes, i en slik mengde at innholdet av borsyre i prøven blir 0,2 - 1,4 vekt%, fortrinnsvis 0,4 - 0,8 vekt%.1. Procedure for stabilizing samples to be subjected to bacteriological laboratory tests, especially urine samples, in order to preserve them during transport, characterized by adding a boric acid complex with the formula to the sample: where R denotes ethylene glycol, propanediol-1,2, glycerol, fructose, mannitol, sorbitol or other water-soluble dioxy- or poly-oxy compounds, which are produced by heating boric acid and oxy compound, with 1-2 mol of the reaction water formed during the preparation being removed, in such an amount that the content of boric acid in the sample is 0.2 - 1.4% by weight, preferably 0.4 - 0.8% by weight. 2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at der tilsettes en blanding av borsyrekomplekser,2. Method according to claim 1, characterized in that a mixture of boric acid complexes is added, 3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at der anvendes et borsyrekompleks som er tilsatt et farvestoff.3. Method according to claim 1 or 2, characterized in that a boric acid complex to which a dye has been added is used. 4. Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved at der som farvestoff anvendes methylenblått i en mengde på 5 - 50 ppm.4. Method according to claim 3, characterized in that methylene blue is used as a dye in an amount of 5 - 50 ppm.