NL9002157A - Dna fragmenten en daarop gebaseerde dna-probes en primers. - Google Patents
Dna fragmenten en daarop gebaseerde dna-probes en primers. Download PDFInfo
- Publication number
- NL9002157A NL9002157A NL9002157A NL9002157A NL9002157A NL 9002157 A NL9002157 A NL 9002157A NL 9002157 A NL9002157 A NL 9002157A NL 9002157 A NL9002157 A NL 9002157A NL 9002157 A NL9002157 A NL 9002157A
- Authority
- NL
- Netherlands
- Prior art keywords
- dna
- methicillin
- probe
- staphylococcus
- resistant
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/305—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F)
- C07K14/31—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F) from Staphylococcus (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Titel: DNA fragmenten en daarop gebaseerde DNA-probes en primers.
De uitvinding heeft betrekking op een DNA fragment dat afgeleid is van een methicilline-resistente Staphylococcus stam, alsmede op een op zo'n DNA fragment gebaseerde DNA-probe voor de detectie van Staphylococcus bacteriën die resistent zijn tegen methicilline en verwante voor β-lactamase ongevoelige penicillines en DNA-primer voor DNA-amplificatie door middel van een polymerase kettingreactie.
Van de Staphylococcus bacteriën is Staphylococcus aureus de belangrijkste voor mensen pathogene bacterie. Het verschijnen van methicilline-resistente stammen van deze bacterie is een ernstig probleem bij de antibacteriële chemotherapie (1,2). Dergelijke stammen zijn resistent tegen methicilline en ook tegen nauw verwante voor β-lactamase ongevoelige penicillines zoals cloxacilline, flucloxacilline, enz. In de hierna volgende beschrijving zullen deze stammen kortheidshalve als methicilline-resistente stammen worden aangeduid.
Methicilline-resistentie is gebleken samen te gaan met de aanwezigheid van een uniek penicilline-bindend proteïne (PBP2a of PBP2') dat klaarblijkelijk niet aanwezig is in gevoelige Staphylococcus stammen. De genetische determinant voor methicilline-resistentie (mee) bevindt zich op het chromosomale DNA (3). Diverse publikaties zijn gewijd aan de betrokkenheid van mee en mogelijk nog een tweede factor bij de methicilline-resistentie van Staphylococcus stammen (4-10). Door experimenten, waarbij het mee-een van een methicilline-resistent S. aureus isolaat door insertie van een transposon werd geïnactiveerd, is aangetoond dat het mec-aen noodzakelijk is voor resistentie (7). In methicilline-resistente stammen van Staphylococcus epidermidis, £.hhemolytious, S.hsminis., S.simulans en S.saprophvticus komt een penicilline bindend eiwit voor dat vergelijkbaar is met het produkt van het mec-gen (8,9) en verantwoordelijk is voor resistentie tegen methicilline. Bij de regulatie van de expressie van methicilline resistentie is nog een tweede element betrokken, aangeduid met mecR (10), dat echter niet in alle resistente stammen voorkomt.
De in de praktijk gebruikelijke methode voor het aantonen van methicilline-resistente Staphylococcus stammen bestaat uit het kweken van de stam op agar-platen in aanwezigheid van methicilline gedurende ongeveer 48 uur.
Naast deze conventionele methode is in de klinische laboratoria het gebruik van zogenaamde DNA-probes sterk in opkomst. DNA-probes zijn kleine segmenten enkelstrengig nucleïnezuur, gelabeld met bijvoorbeeld een enzym of een radioisotoop, die zeer specifiek binden aan complementaire nucleïnezuursequenties (hybridisatie). De detectie van gebonden label duidt op de aanwezigheid van het aan te tonen pathogeen in een klinisch monster. Zo zijn probes ontwikkeld voor de detectie van bijvoorbeeld bacteriën, virussen, protozoa en zelfs schimmels. Er zijn al een aantal probe-kits commercieel verkrijgbaar. Een probleem bij het ontwikkelen van een probe is dat deze gevoelig en zeer specifiek moet zijn. Gestreefd wordt naar een zo klein mogelijke probe die voldoende specifiek is.
Een probe voor de detectie van resistentie tegen een bepaald antibioticum is bijvoorbeeld bekend uit de Franse octrooiaanvrage 2.602.794. Deze aanvrage heeft betrekking op een DNA fragment dat tenminste een deel van het tetM-aen bevat, dat codeert voor een tetracycline-resistentie proteïne en waarvan de nucleotidesequentie is gegeven. Een dergelijk fragment kan worden gebruikt voor de bereiding van een DNA-probe voor de detectie van tetracycline-resistentie in een celkweek. De enige probe die bruikbaar blijkt is een tamelijk groot DNA fragment van 850 bp.
Ook voor het onderscheiden van methicilline-resistente en methicilline-gevoelige Staphylococcus stammen is hybridisatie analyse met behulp van DNA-probes voorgesteld (11). Hierbij is als DNA-probe een 3.9 kb HindlII restrictiefragment van chromosomaal DNA van een tegen methicilline resistente Staphylococcus aureus stam gebruikt, welk fragment hybridiseerde met het eerder door Beek et al. (5) beschreven 3.5 kb BcrlII restrictiefragment. De 3.9 kb DNA-probe hybridiseerde met chromosomaal DNA van alle geselecteerde methicilline-resistente Staphylococcus haemolvticus en Staphylococcus epidermidis stammen, terwijl geen hybridisatie optrad met de negatieve hybridisatie controles, te weten een methicilline-gevoelig Staphylococcus heamolyticus isolaat en een methicilline-gevoelig Staphylococcus epidermidis isolaat.
De grootte (3.9 kb) en onbekende basenvolgorde van deze probe staan echter de ontwikkeling van gevoelige en specifieke tests in de weg. Hetzelfde geldt voor de onlangs voorgestelde (12) probe, die op een 1.1 kb BcrlII-Xbal fragment van het voor PBP2a coderende mee gen is gebaseerd.
Er is in de klinische praktijk een grote behoefte aan een gevoelige en specifieke DNA-probe voor de detectie van methicilline-resistente Staphylococcus bacteriën , in het bijzonder Staphylococcus aureus, maar ook Staphylococcus epidermidis. Staphylococcus saproohyticus. Staphylococcus haemolvticus. Staphylococcus warneri. Staphylococcus hominis. Staphylococcus simulans r enz. Evenzo is er grote behoefte aan DNA fragmenten die als DNA-primers in een PCR-techniek (Polymerase Chain Reaction) voor een specifieke amplificatie van DNA van methicilline-resistente Staphylococcus bacteriën kunnen worden toegepast.
De uitvinding voorziet in deze behoeftes door middel van een DNA fragment, afgeleid van een tegen methicilline resistente Staphylococcus stam en in essentie bestaande uit de in de sequentielijst onder seq. id. nr. 1 getoonde nucleotidensequentie of uit een verwante nucleotidensequentie, zoals een van de in de sequentielijst onder seq. id. nrs. 2-8 getoonde nucleotidensequenties, dan wel uit een deel van een dergelijke nucleotidensequentie met een lengte van ten minste 14 nucleotiden.
Het DNA fragment volgens de uitvinding is afgeleid van een tegen methicilline-resistente Staphylococcus stam. In beginsel is de uitvinding niet beperkt tot DNA fragmenten die van een bepaalde soort van Staphylococcus bacteriën zijn afgeleid. Zo kunnen de DNA fragmenten afgeleid zijn van een tegen methicilline-resistente stam van Staphylococcus aureus. Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophvticus. Staphylococcus haemolvticus, Staphylococcus warneri. Staphylococcus hominis. Staphylococcus simulans. enz. De DNA fragmenten met de nucleotidensequenties volgens de Seq. ld. Nrs. 1-8 zijn alle afgeleid van methicilline-resistente Staphylococcus aureus stammen. Desondanks kunnen ze ook worden gebruikt voor het detecteren van methicilline-resistente stammen van andere soorten van Staphylococcus bacteriën, dankzij de grote homologie tussen de betrokken sequenties van de verschillende Staphylococcus soorten.
De in de sequentielijst onder seq.id. nr. 1 getoonde nucleotidensequentie is afgeleid van de methicilline-resistente S.aureus stam 05723. Met een daarmee verwante nucleotidensequentie wordt bedoeld de overeenkomstige sequentie in andere methicilline-resistente Staphylococcus stammen, zowel methicilline-resistente stammen van de soort S.aureus als methicilline-resistente stammen van andere Staphylococcus soorten (zoals de hierboven genoemde soorten). Voorbeelden van dergelijke verwante sequenties worden gegeven in de sequentielijst onder de seq.id. nrs. 2-8, welke resp. zijn afgeleid van de methicilline-resistente S.aureus stammen 00646, A216, 02599, 214, 215C, 06231 en 1335. Zoals deze voorbeelden laten zien, bestaat er een grote mate van homologie tussen deze sequenties, maar kunnen ook significante verschillen in lengte optreden: de DNA sequenties, afgeleid van de S.aureus stammen 02599, 214, 215C, 06231 en 1335, blijken ca. 70 nucleotiden korter te zijn dan die van de andere getoonde voorbeelden.
De uitvinding verschaft DNA probes en primers, die op DNA fragmenten als hierboven gedefinieerd zijn gebaseerd. DNA
probes zijn gelabelde DNA fragmenten waarmee complementaire sequenties kunnen worden gedetecteerd. Bruikbare labeling methoden zijn aan de deskundige bekend. Bij wijze van voorbeeld worden genoemd labeling met radioisotopen, enzymen, fluorescerende stoffen, pigmenten, het biotine-avidine systeem, enz. DNA probes volgens de uitvinding kunnen worden gebruikt voor de detectie van Staphylococcus bacteriën die resistent zijn tegen methicilline en verwante voor β-lactamase ongevoelige penicillines.
De uitvinding voorziet dan ook tevens in een diagnostische testkit voor de detectie in een monster van Staphylococcus bacteriën die resistent zijn tegen methicilline en verwante voor β-lactamase ongevoelige penicillines, omvattende a) een DNA probe volgens de uitvinding, b) een reagens dat hybridisatie van de probe met het DNA van de te detecteren bacteriën in het monster mogelijk maakt, c) een hybridisatievaatje waarin de hybridisatie tussen de probe en het DNA van de bacteriën kan optreden, d) een geschikte wasvloeistof voor het verwijderen van niet gehybridiseerde probe, en e) middelen voor het analyseren van de eventuele hybridisatie.
Ook voorziet de uitvinding in een werkwijze voor het detecteren in een monster van Staphylococcus bacteriën die resistent zijn tegen methicilline en verwante voor β-lactamase ongevoelige penicillines, waarbij men a) het DNA van de bacteriën in het monster isoleert, b) het geïsoleerde DNA in aanraking brengt met een DNA probe volgens de uitvinding in aanwezigheid van een reagens dat hybridisatie van de probe met het geïsoleerde DNA mogelijk maakt, c) niet gehybridiseerde probe uitwast, en e) de eventuele hybridisatie analyseert.
DNA primers zijn DNA fragmenten die complementair zijn aan een gedeelte van een "target" DNA en na hybridisatie daaraan dienst kunnen doen als startpunt voor DNA polymerase, dat in aanwezigheid van de noodzakelijke bouwstoffen de aan het target DNA complementaire keten synthetiseert. Door twee schikte primers in een DNA fragment volgens de uitvinding te kiezen kan op een zeer gevoelige en specifieke wijze met behulp van de PCR methode de aanwezigheid in een monster van DNA van methicilline-resistente Staphyloccocus stammen worden vastgesteld.
Primers zullen in het algemeen relatief kort zijn, mits ze nog voldoende specifiek zijn voor het beoogde target DNA. DNA fragmenten met een lengte van 14 nucleotiden zijn veelal voldoende, maar iets langere fragmenten, zeg van 15 tot 40, liefst van 18 tot 32 nucleotiden, hebben de voorkeur. Dergelijke relatief korte DNA fragmenten kunnen ook voor DNA probes worden gebruikt, maar langere fragmenten, in het bijzonder de volledige sequenties zoals weergegeven in de sequentielijst, hebben in dat geval de voorkeur.
De uitvinding voorziet verder in een plasmide, in essentie bestaande uit een bacteriële kloneringsvector met daarin een uit een DNA fragment volgens de uitvinding bestaande insertie, en in bacteriën die ten minste één zo'n plasmide bevatten.
Een DNA fragment met de nucleotidensequentie volgens Seq. Id. Nr. 1, bevindt zich in het plasmide pAA29-l in E.coli DH5aF', welke stam op 15 november 1989 gedeponeerd is onder toegangsnr. CBS 588.89 bij het Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) te Baarn, Nederland. Een op dit DNA fragment gebaseerde probe is zeer specifiek. Bij alle onderzochte Staphylococcus stammen gaf deze probe een perfecte correlatie met methicilline-resistentie.
Een DNA fragment volgens de uitvinding kan met de volgende werkwijze worden verkregen: a) partiële digestie van gezuiverd DNA van een methicilline-resistente Staphylococcus stam met bijv. Sau 3AI, b) hybridisatie van de verkregen fragmenten met gelabelde DNA-fragmenten van een methicilline-gevoelige Staphylococcus stam, c) verzamelen van de vrije DNA-fragmenten, d) herhaling van de stappen b) en c), e) ligatie van de verkregen fragmenten in een piasmide en transformatie van een geschikte bacteriestam met dit plasmide, f) kweken van de transformanten en isolatie van het DNA uit de transformanten, g) hybridisatie van het geïsoleerde DNA met gelabeld DNA van een klein aantal methicilline-resistente en methicilline-gevoelige Staohvlococcus stammen, h) selectie van de transformanten die alleen hybridisatie vertonen met DNA van de methicilline-resistente stam of stammen, i) digestie met bijv. PstI en EcoRl van het DNA van de geselecteerde transformanten, j) labeling op een gebruikelijke wijze van de gedigereerde DNA-fragmenten, k) hybridisatie van de gelabelde DNA-fragmenten met DNA van een groot aantal methicilline-resistente en methicilline-gevoelige Staphylococcus stammen, l) selectie van gelabelde DNA-fragmenten die alleen hybridisatie vertonen met DNA van methicilline-resistente stammen.
Alle stappen van deze werkwijze bestaan uit op zichzelf bekende methoden, en zullen -voor zover nodig in het gedeelte "Materialen en Methoden" of in het Voorbeeld verder worden toegelicht.
De Staphyloccus stammen die in de stappen a, b, d, g en k worden gebruikt, kunnen elke Staohvloccus stam of isolaat zijn, mits zij voldoen aan het desbetreffende kriterium van methicilline-resistentie of methicilline-gevoeligheid dat in de verschillende stappen vereist wordt.
Stap b) bestaat bij voorkeur uit hybridisatie in oplossing bij verhoogde temperatuur van de verkregen fragmenten met "sheared" gebiotinyleerde DNA-fragmenten van een methicilline-gevoelige Staphylococcus stam.
Stap e) bestaat bij voorkeur uit ligatie van de verkregen fragmenten in de unieke BamHI restrictieplaats van pUC18, en transformatie van E.coli DH5aF' met dit plasmide.
Stap f) bestaat bij voorkeur uit kweken van de transformanten, lyse en DNA-fixatie op filters.
Stap g) bestaat bij voorkeur uit Southern-hybridisatie van het geïsoleerde DNA met gelabeld DNA van ten hoogste drie methicilline-resistente Staphylococcus stammen en ten hoogste drie methicilline-gevoelige Staphylococcus stammen.
In het hierna volgende voorbeeld wordt uitvoeriger beschreven op welke wijze de probe volgens de uitvinding kan worden verkregen. In combinatie met deze werkwijze wordt een andere werkwijze beschreven, welke begint met digestie met HinduI, maar niet tot een gewenste probe leidde. De specificiteit van de probe volgens de uitvinding blijkt uit de daarmee uitgevoerde hybridisatieproeven, die een perfecte correlatie tonen met methicilline-resistentie.
Materialen en methoden a) De isolaten van methicilline-resistente Staphylococcus aureus die bij de bereiding van de probe en bij de hybridisatieproeven werden gebruikt, worden beschreven in onderstaande tabel A. De isolaten van methicilline-gevoelige Staphylococcus aureus die bij de bereiding van de probe en bij de hybridisatieproeven werden gebruikt, worden beschreven in tabel B.
De MIC's voor methicilline en gentamicine werden bepaald onder toepassing van de agar-verdunningsmethode. De MIC's voor methicilline werden bepaald door inoculatie van 100 μΐ van een 108 cfu/ml bacterie-suspensie op Mueller-Hinton-agar gevolgd door incubatie bij 30°C. Isolaten met een MIC > 4 werden als resistent beschouwd. De MIC's voor gentamycine werden bepaald door inoculatie van 100 μΐ van een suspensie van 106 cfu/ml op Isosensitest gevolgd door incubatie bij 37°C. Isolaten met een MIC > 4 werden als resistent beschouwd.
Tabel A
Toegepaste methicilline-resistente Staphylococcus aureus» isolaten
1 Geïmporteerd met een patient uit Italië 2 Geïmporteerd met een patient uit Frankrijk 3 Geïmporteerd met een patient uit Portugal 4 Geïmporteerd met een patient uit Joegoslavië.
b) Staphylococcus aureus DNA werd gezuiverd met de methode zoals beschreven door Lindberg c.s. (13), behalve dat na lyse van de bacteriën de suspensie werd geextraheerd met fenol/chloroform zoals beschreven door Maniatis c.s. (14). Na de eerste extractie werd het mengsel behandeld met RNase en nog een keer geextraheerd met fenol/chloroform. Plasmide DNA werd gezuiverd zoals beschreven door Maniatis c.s., gevolgd door centrifugering met CsCl dichtheidsgradiënt (14).
c) Digesties met restrictie-endonucleases werden uitgevoerd volgens de voorschriften van de fabrikant (GIBCO Laboratories, Paisley, Renfrewshire, Groot-Brittannië).
d) De kweek, lyse en fixatie van transformanten op Zeta-probe-fliters is eerder beschreven (15).
Het als probe gebruikte Staphylococcus aureus DNA werd gelabeld met a-32P-dCTP (specifieke activiteit 800 Ci/mmol; Amersham, Groot-Brittannië) -onder toepassing van een "nick-translatie"-kit van GIBCO. Nick-translaties werden uitgevoerd zoals aangegeven door de fabrikant. Het DNA van de plasmide-inserts werd gelabeld met digoxigenine van Boehringer (Mannheim, West-Duitsland) onder toepassing van incubatie-omstandigheden zoals aangegeven door de fabrikant. Southern-hybridisaties werden uitgevoerd zoals beschreven door Maniatis c.s. (14) .
Voorbeeld
Een methode beschreven door Welcher c.s. (15) werd gebruikt om DNA-fragmenten die specifiek zijn voor methicilline-resistentie te verrijken. Hierbij werd gezuiverd DNA uit het methicilline-resistente isolaat 05723 partieel gedigereerd met Sau 3AI, waardoor fragmenten kleiner dan 4 kb werden verkregen. Teneinde D'NA-fragment en te vinden die specifiek zijn voor methicilline-resistente stammen werd hybridisatie in oplossing uitgevoerd onder toepassing van de Sau 3AI restrictiefragmenten en "sheared" gebiotinyleerde DNA-fragmenten van de methicilline-gevoelige stam Ps-47-8325.
5 μg Sau 3AI fragmenten en 6 μg gebiotinyleerd DNA werden door verhitting gedenatureerd, waarna men ze bij 62°C in oplossing liet hybridiseren. Na 4 uur bij 62°C werd een suspensie van avidine-agarosekorrels toegevoegd. De gebiotinyleerde probe en de hybriden werden na 5 min bij kamertemperatuur tot een pellet gecentrifugeerd. De vrije DNA-fragmenten in oplossing werden verzameld en de boven beschreven handelwijze werd herhaald. De verkregen fragmenten werden geligeerd in de unieke BamHI restrictieplaats van pUC18.
Daarnaast werd, als alternatieve procedure, gezuiverd DNA van het methicilline-resistente isolaat 05723 en de methicilline-gevoelige stam Ps-47-8325 gedigereerd met het restrictie-endonuclease HindlII en geanalyseerd op agarose-gel. Het methicilline-resistente isolaat vertoonde extra banden bij ongeveer 9 kb en 3.5 kb. Deze fragmenten werden geïsoleerd en gekloneerd in de unieke HindlII restrictieplaats van pUC18.
Transformatie van Escherichia coli DH5aF' met de hierboven beschreven plasmiden leidde tot 770 klonen die een insert in ofwel de BamHI ofwel de HindlII restrictieplaats bevatten. De transformanten werden gekweekt op Zeta-Probe-filters en na lyse en DNA-fixatie geselecteerd met Southern-hybridisaties onder toepassing van 32P-gelabeld chromosomaal DNA uit één methicilline-resistent isolaat (A216) en 3 methicilline-gevoelige isolaten (isolaten 8075, 9838 en 9848) als probes. Negen transformanten werden geselecteerd die hybridisatie vertoonden met probe-DNA van de methicilline-resistente isolaten maar niet met probe-DNA van de gevoelige isolaten. De transformanten werden gekarakteriseerd door digesties met restrictie-endonucleases. De transformanten met een insert in de HindlII-plaats bevatten Staphylococcus aureus DNA-sequenties van ongeveer 3.5 kb. De inserts in de BamHI-plaats varieerden van ongeveer 0.1 tot 1.5 kb.
De inserts van deze transformanten werden geïsoleerd door digestie met PstI en EcoRI en daarna gelabeld met digoxigenine en gebruikt bij Southern-hybridisaties gedurende ongeveer 24 uur met DNA dat geïsoleerd was uit 25 methicilline-resistente stammen en 41 methicilline-gevoelige isolaten. De gebruikte isolaten waren klinische isolaten uit verschillende plaatsen (zie Materialen en Methoden). De resultaten van de hybridisatieproeven vertoonden een consistente hybridisatie van DNA uit één specifieke kloon met DNA uit methicilline-resistente isolaten. Deze kloon was verkregen uit de werkwijze waarbij in de eerste stap met Sau 3AI was gedigereerd. Het betreffende DNA-insert was ongeveer 300 bp lang. Er trad echter geen hybridisatie op van het DNA uit deze kloon met DNA dat verkregen was uit de 41 methicilline-gevoelige isolaten.
De hybridisaties met de inserts van de andere klonen vertoonden geen enkele correlatie met de afwezigheid of aanwezigheid van methicilline-resistentie. Van geen enkel DNA-insert kon een correlatie worden aangetoond met gentamycine-resistentie.
Uit de hierboven beschreven resultaten blijkt dat de gevonden sequentie van circa 300 bp een uitstekende correlatie vertoont met het voorkomen van methicilline-resistentie in Staphylococcus stammen. Deze sequentie kan derhalve worden toegepast als probe voor de detectie van methicilline-resistente Staphylococcus stammen.
De basenvolgorde van deze uit S.aureus stam 05723 afgeleide probe wordt in de separate sequentielijst getoond onder sequentie identificatienummer 1.
Voor verschillende andere methicilline-resistente S. aureus stammen is de DNA sequentie van het overeenkomstige gebied bepaald. In de sequentielijst worden de DNA sequenties van het probe gebied van de S.aureus stammen 00646, A216, 02599, 214, 215C, 06231 en 1335 getoond onder resp. de sequentie identificatienummers 2, 3, 4, 5, 6, 7 en 8.
L ITF.RATTIURl· IJST
1. Locksley, R.M., Cohen, M.L., Quinn. T.C., Tompkins, L.S., Coyle. M.B., Kirihara, J.M., Counts, G.W.: Multiply antibiotic-resistant Staphylococcus aureus: introduction, transmission and evolution of nosocomial infection.
Annals of Internal Medicine 1982: 97, 317-324.
2. Bradley, J.M., Noone, P., Townsend, D.E., Grubb. W.B.: Methicillin-resistant Staphylococcus aureus in a London hospital. Lancet 1985: 1, 1493-1495.
3. S-iöström, J.-E., Löfdahl, S., Philipson, L.: Transformation reveals a chromosomal locus of gene(s) for methicillin resistance in Staphylococcus aureus. Journal of Bacteriology 1975: 123, 905-915.
4. Kornblum. J., Hartman. B.J., Novick, R.P., Tomasz. A.: Conversion of a homogeneously methicillin-resistant strain of Staphylococcus aureus to heterogeneous resistance by Tn551-mediated insertional inactivation. European Journal of Clinical Microbiology 1986: 5, 714-718.
5. Beck, W.D.. Beraer-Bachi. B.. Kavser, F.H.: Additional DNA in methicillin-resistant Staphylococcus aureus and molecular cloning of mec-specific DNA. Journal of Bacteriology 1986: 165, 373-378.
6. Matthews, P.R., Reed, K.C.. Stewart, P.R.: The cloning of chromosomal DNA associated with methicillin and other resistances in Staphylococcus aureus. Journal of General Microbiology 1987: 133, 1919-1929.
7. Matthews. P.. Tomasz. A.: Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Sept. 1990, 34: 1777-1779.
8. Pierre, J,. Williamson. R., Bornet, M,, Gutmann, L.: Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Sept. 1990, 34: 1691-1694.
9. Stratton. C.W.. Gelfand. M.S., Gerberding, J.L.,
Chambers, H.F.: Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Sept. 1990, 34: 1780-1782.
10. Tesch, W., Rvffel, C., Strassle. A.. Kavser, F.H., Beraer-Bachi, B.: Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Sept. 1990, 34: 1703-1706.
11. Frocraatt, J.W., Johnston, J.L., Galetto, D.w,, Archer, G.L.: Antimicrobial resistance in nosocomial isolates of Staphylococcus haemolvticus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, April 1989: 33, 460-466.
12. Archer. G.l·., Pennell. E.: Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Sept. 1990, 34: 1720-1724.
13. Lindberc, M.. Siöström. J.-E.. Johansson. T.: Transformation of chromosomal and plasmid characters in Staphylococcus aureus. Journal of Bacteriology 1972, 109: 844-847.
14. Maniatis. T.. Fritsch, E.F.. Sambrook, J.: Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982, p. 387.
15. Fluit, A,C., Baas, P.D., Van Boom, J.H., Veeneman, G.H., Jansz, H.S.: Gene A protein cleavage of recombinant plasmids containing the 0X174 replication origin. Nucleic Acids Research 1984, 12: 6443-6454.
16. Welcher, A.A., Torres, A.R., Ward. D.C.: Selective enrichment of specific DNA, cDNA, and mRNA sequences using biotinylated probes, avidin and copper-chelat agarose. Nucleic Acids Research 1986: 10020-10036.
SEQUENTIELIJST Sea. Id. No. 1
Nucleotide sequentie van de probe uit Staphylococcus aureus stam 05723.
GATCCTTATA TACTATCGTG CGTTTCCATG GCCCGCTATT GTACCAAATT AATCGACTCA TTGTTGCTTC CTGGGGATAT CCATACTTAC TAATTATGGT TTTTGCCCCT TCCAACGGTG GTCCCTGCCA ATAGGACAAA ATGTGATTTA AATGACTATC CATTGCCATA CCTCCTAAAC ATTTGCCTAA AAGCATTGTA TGCCCAATAA ATGAATTTTA GGGGTTCTGT TGCAAAGTAA AAAAATATAG CTAACCACTA ATTTATCATG TCAGTGTTCG CTTAACTTGC TAGCATGATG CTAATTTCGT GGCATGGCGA AAATCCGTAG ATC
Seq. Id. No. 2 DNA sequentie voor het probe gebied van Staphylococcus aureus stam 00646.
GATCCTTATA TACTATCGTG CGTTTCCATG GCCCGCTATT GTACCAAATT AATCGACTCA TTGTTGCTTC CTGGGGATAT CCATACTTAC TAATTATGGT TTTTGCCCCT TCCAACGGTG GTCCCTGCCA ATAGGACAAA ATGTGATTTA AATGACTATC CATTGCCATA CCTCCTAAAC ATTTGCCTAA AAGCATTGTA TGCCCAATAA ATGAATTTTA GGGGTTTTGT TGCAAAGTAA AAAAATATAG CTAACCACTA ATTTATCATG TCAGTGTTCG CTTAACTTGC TAGCATGATG CTAATTTCGT GGCATGGCGA AAATCCGTAG ATC
Seq. Id. No. 3 DNA sequentie voor het probe gebied van Staphylococcus aureus stam A216.
GATCCTTATA TACTATCGTG CGTTTCCATG GCCCGCTATT GTACCAAATT AATCGACTCA TTGTTGCTTC CTGGGGATAT CCATACTTAC TAATTATGGT TTTTGCCCCT TCCAACGGTG GTCCCTGCCA ATAGGACAAA ATGTGATTTA AATGACTATC CATTGCCATA CCTCTTAAAC ATTTGCCTAA AAGCATTGTA TGCCCAATAA ATGAATTTTA GGGGTTCTGT TGCAAAGTAA AAAATATAGC TAACCACTAA TTTATCATGT CAGTGTTCGC TTAACTTGCT AGCATGATGC TAATTTCGTG GCATGGCGAA AATCCGTAGA TC
Seq. Id. No. 4 DNA sequentie voor het probe gebied van Staphylococcus aureus stam 02599.
GATCTTATAT ACTATCGTGC GTTTCCATGG CCCGCTATTG TACCAAATTA ATCGTCTCAT TGTTGCTTCC TGGGGATATC CATACTTACT AATTATGGTT TTTGCCCCTT CCAACGGTGG TCCCTGCCAA TAGGACAAAA TGTGATTTAA ATGGGTTCTG TTGCAAAGTA AAAAAATATA GCTAACCACT AATTTATCAT GTCAGTGTTC GCTTAACTTG CTAGCATGAT GCTAATTTCG TGGCATGGCG AAAATCCGTA GATC
Sea. Id. No. 5 DNA sequentie voor het probe gebied van Staphylococcus aureus stam 214.
GATCCTTATA TACTATCGTG CGTTTCCATG GCCCGCTATT GTACCAAATT AATCGTCTCA TTGTTGCTTC CTGGGGATAT CCATACTTAC TAATTATGGT TTTTGCCCCT TCCAACGGTG GTCCCTGCCA ATAGGACAAA ATGTGATTTA AATGGGTTCT GTTGCAAAGT AAAAAAATAT AGCTAACCAC TAATTTATCA TGTCAGTGTT CGCTTAACTT GCTAGCATGA TGCTAATTTC GTGGCATGGC GAAAATCCGG ATC
DNA sequentie voor het probe gebied van Staphylococcus aureus stam 215C.
GATCCTTATA TACTATCGTG CGTTTCCATG GCCCGCTATT GTACCAAATT AATCGTCTCA TTGTTGCTTC CTGGGGATAT CCATACTTAC TAATTATGGT TTTTGCCCCT TCCAACGGTG GTCCCTGCCA ATAGGACAAA ATGTGATTTA AATGGGTTCT GTTGCAAAGT AAAAAAATAT AGCTAACCAC TAATTTATCA TGTCAGTGTT CGCTTAACTT GCTAGCATGA GCTAATTTCG TGGCATGGCG AAAATCCGTA GATC
Seq. Id. No. 7 DNA sequentie voor het probe gebied van Staphylococcus aureus stam 06231.
GATCCTTATA TACTATCGTG CGTTTCCATG GCCCGCTATT GTACCAAATT AATCGTCTCA TTGTTGCTTC CTGGGGATAT CCATACTTAC TAATTATGGT TTTTGCCCCT TCCAACGGTG GTCCCTGCCA ATAGGACAAA ATGTGATTTA AATGGGTTCT GTTGCAAAGT AAAAAAATAT AGCTAACCAC TAATTTATCA TGTCAGTGTT CGCTTAACTT GCTAGCATGA TGCTAATTTC GTGGCATGGC GAAAATCCGT AGATC
Seq. Id. No. 8 DNA sequentie voor het probe gebied van Staphylococcus aureus stam 1335.
GATCCTTATA TACTATCGTG CGTTTCCATG GCCCGCTATT GTACCAAATT AATCGTCTCA TTGTTGCTTC CTGGGGATAT CCATACTTAC TAATTATGGT TTTTGCCCCT TCCAACGGTG GTCCCTGCCA ATAGGACAAA ATGTGATTTA AATGGGTTCT GTTGCAAAGT AAAAAAATAT AGCTAACCAC TAATTTATCA TGTCAGTGTT CGCTTAACTT GCTAGCATGA TGCTAATTTC GTGGCATGGC GAAAATCCGT AGATC
Claims (7)
1. DNA fragment, afgeleid van een tegen methicilline resistente Staphylococcus stam en in essentie bestaande uit de in de sequentielijst onder seq. id. nr. 1 getoonde nucleotidensequentie of uit 'een verwante nucleotidensequentie, zoals een van de in de sequentielijst onder seq. id. nrs. 2-8 getoonde nucleotidensequenties, dan wel uit een deel van een dergelijke nucleotidensequentie met een lengte van ten minste 14 nucleotiden.
2. DNA probe voor de detectie van Staphylococcus bacteriën die resistent zijn tegen methicilline en verwante voor β-lactamase ongevoelige penicillines, omvattende een DNA fragment volgens conclusie 1.
3. DNA primer voor DNA amplificatie door middel van een polymerase kettingreactie, omvattende een DNA fragment volgens conclusie 1.
4. Plasmide, in essentie bestaande uit een bacteriële kloneringsvector met daarin een uit een DNA fragment volgens conclusie 1 bestaande insertie.
5. Bacteriën die ten minste één plasmide volgens conclusie 4 bevatten.
6. Diagnostische testkit voor de detectie in een monster van Staphylococcus bacteriën die resistent zijn tegen methicilline en verwante voor β-lactamase ongevoelige penicillines, omvattende a) een DNA probe volgens conclusie 2, b) een reagens dat hybridisatie van de probe met het DNA van de te detecteren bacteriën in het monster mogelijk maakt, c) een hybridisatievaatje waarin de hybridisatie tussen de probe en het DNA van de bacteriën kan optreden, d) een geschikte wasvloeistof voor het verwijderen van niet gehybridiseerde probe, en e) middelen voor het analyseren van de eventuele hybridisatie.
7. Werkwijze voor het detecteren in een monster van Staphylococcus bacteriën die resistent zijn tegen methicilline en verwante voor β-lactamase ongevoelige penicillines, waarbij men a) het DNA van de bacteriën in het monster isoleert, b) het geïsoleerde DNA in aanraking brengt met een DNA probe volgens conclusie 2 in aanwezigheid van een reagens dat hybridisatie van de probe met het geïsoleerde DNA mogelijk maakt, c) niet gehybridiseerde probe uitwast, en e) de eventuele hybridisatie analyseert.
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| NL9002157A NL9002157A (nl) | 1989-11-27 | 1990-10-04 | Dna fragmenten en daarop gebaseerde dna-probes en primers. |
| AU69507/91A AU6950791A (en) | 1989-11-27 | 1990-11-27 | Dna fragments and dna probes and primers based thereon |
| PCT/NL1990/000178 WO1991008305A1 (en) | 1989-11-27 | 1990-11-27 | Dna fragments and dna probes and primers based thereon |
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| NL8902926A NL8902926A (nl) | 1989-11-27 | 1989-11-27 | Werkwijze voor de bereiding van een dna-probe voor de detectie van methicilline-resistente staphylococcus-bacterien, daarmee verkrijgbare dna-probe en diagnostische test-kit die de dna-probe bevat. |
| NL8902926 | 1989-11-27 | ||
| NL9002157 | 1990-10-04 | ||
| NL9002157A NL9002157A (nl) | 1989-11-27 | 1990-10-04 | Dna fragmenten en daarop gebaseerde dna-probes en primers. |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NL9002157A true NL9002157A (nl) | 1991-06-17 |
Family
ID=26646613
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NL9002157A NL9002157A (nl) | 1989-11-27 | 1990-10-04 | Dna fragmenten en daarop gebaseerde dna-probes en primers. |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| AU (1) | AU6950791A (nl) |
| NL (1) | NL9002157A (nl) |
| WO (1) | WO1991008305A1 (nl) |
Families Citing this family (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5620847A (en) * | 1990-10-05 | 1997-04-15 | Hoffman-La Roche Inc. | Methods and reagents for detection of bacteria in cerebrospinal fluid |
| CA2075423A1 (en) * | 1991-08-13 | 1993-02-14 | Paul Luther Skatrud | Rapid method for detection of methicillin resistant staphylococci |
| US5656432A (en) * | 1992-02-10 | 1997-08-12 | Bio Merieux | Genomic DNA fragment of Streptococcus pneumoniae, hybridization probe, amplification primer, reagent and method for the detection of Streptococcus pneumoniae |
| FR2687168B1 (fr) * | 1992-02-10 | 1994-03-25 | Bio Merieux | Fragment de l'adn genomique de streptococcus pneumoniae, sonde d'hybridation, amorce d'amplification, reactif et procede de detection de streptococcus pneumoniae. |
| DE69333872T2 (de) * | 1992-07-07 | 2006-06-14 | Fuso Pharmaceutical Ind | Sonde zur Diagnose einer ansteckenden Krankheit verursacht durch Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae oder Enterobacter cloacae |
| EP0625575A3 (en) * | 1993-04-30 | 1995-02-22 | Lilly Co Eli | Fem A gene from Staphylococcus epidermis, Fem A protein and vectors and microorganisms that contain the Fem A gene. |
| EP0624650A3 (en) * | 1993-04-30 | 1995-02-22 | Lilly Co Eli | FemB gene from Staphylococcus epidermis, FemB protein, and vectors and microorganisms that contain the FemB gene. |
| US6001564A (en) * | 1994-09-12 | 1999-12-14 | Infectio Diagnostic, Inc. | Species specific and universal DNA probes and amplification primers to rapidly detect and identify common bacterial pathogens and associated antibiotic resistance genes from clinical specimens for routine diagnosis in microbiology laboratories |
| US20020055101A1 (en) | 1995-09-11 | 2002-05-09 | Michel G. Bergeron | Specific and universal probes and amplification primers to rapidly detect and identify common bacterial pathogens and antibiotic resistance genes from clinical specimens for routine diagnosis in microbiology laboratories |
| US5994066A (en) * | 1995-09-11 | 1999-11-30 | Infectio Diagnostic, Inc. | Species-specific and universal DNA probes and amplification primers to rapidly detect and identify common bacterial pathogens and associated antibiotic resistance genes from clinical specimens for routine diagnosis in microbiology laboratories |
| US20030049636A1 (en) | 1999-05-03 | 2003-03-13 | Bergeron Michel G. | Species-specific, genus-specific and universal DNA probes and amplification primers to rapidly detect and identify common bacterial and fungal pathogens and associated antibiotic resistance genes from clinical specimens for diagnosis in microbiology laboratories |
| US20100267012A1 (en) | 1997-11-04 | 2010-10-21 | Bergeron Michel G | Highly conserved genes and their use to generate probes and primers for detection of microorganisms |
| DE19731292A1 (de) * | 1997-07-21 | 1999-01-28 | Biotecon Ges Fuer Biotechnologische Entwicklung & Consulting Mbh | Nucleinsäuremolekül, Kit und Verwendung |
| DE19822108A1 (de) * | 1998-05-12 | 2000-02-03 | Schering Ag | Verfahren zur Detektion von Mikroorganismen in Produkten, insbesondere in Arzneimitteln und Kosmetika |
| US6242223B1 (en) * | 1998-09-28 | 2001-06-05 | Creighton University | Primers for use in detecting beta-lactamases |
| JP2003511015A (ja) | 1999-09-28 | 2003-03-25 | インフェクティオ ダイアグノスティク（アイ．ディー．アイ．）インコーポレイティド | 高度に保存された遺伝子、および種特異的、属特異的、科特異的、群特異的および普遍的核酸プローブおよび増幅プライマーを発生させて、診断の臨床検体からの藻類、古細菌、細菌、真菌および寄生生物の微生物を急速に検出しかつ同定するためのそれらの使用 |
| US7045291B2 (en) | 2002-05-17 | 2006-05-16 | Creighton University | Multiplex PCR for the detection of AmpC beta-lactamase genes |
| EP1771583A2 (en) * | 2004-07-26 | 2007-04-11 | Nanosphere, Inc. | Method for distinguishing methicillin resistant s. aureus from methicillin sensitive s. aureus in a mixed culture |
-
1990
- 1990-10-04 NL NL9002157A patent/NL9002157A/nl not_active Application Discontinuation
- 1990-11-27 AU AU69507/91A patent/AU6950791A/en not_active Abandoned
- 1990-11-27 WO PCT/NL1990/000178 patent/WO1991008305A1/en unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU6950791A (en) | 1991-06-26 |
| WO1991008305A1 (en) | 1991-06-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| NL9002157A (nl) | Dna fragmenten en daarop gebaseerde dna-probes en primers. | |
| US5989821A (en) | Universal targets for species identification | |
| Zapparoli et al. | Design and evaluation of malolactic enzyme gene targeted primers for rapid identification and detection of Oenococcus oeni in wine | |
| JP4176146B2 (ja) | 微生物検査室における日常的診断用の臨床検体からの通常の細菌病原体および抗生物質耐性遺伝子を迅速に検出および同定するための特異的および普遍的プローブおよび増幅プライマー | |
| US6015666A (en) | Rapid DNA test for detecting quinolone-resistant Staphylococcus aureus pathogens in clinical material | |
| KR950008574B1 (ko) | 미코박테리아 프라이머 및 탐침 | |
| JP2001504330A (ja) | 微生物研究室での診断のための臨床検体からの共通の細菌性及び真菌性病原体並びに関連する抗生物質耐性遺伝子を迅速に検出及び同定するための種特異的、属特異的及び普遍的プローブ及びプライマー | |
| Ullrich et al. | Molecular characterization of field isolates of Pseudomonas syringae pv. glycinea differing in coronatine production | |
| US5747257A (en) | Genetic markers and methods for the detection of escherichia coli serotype-0157:H7 | |
| US5489513A (en) | Specific gene probes and processes for the diagnostic investigation of Candida albicans | |
| Müller et al. | Multiplex PCR for the detection of Lactobacillus pontis and two related species in a sourdough fermentation | |
| JP2002537824A (ja) | 細菌の同定 | |
| US6013435A (en) | Drug resistance screening method using multiplex amplification | |
| US8673566B2 (en) | Method for detection of Staphylococcus epidermidis | |
| US5869642A (en) | Detection of the genus pectinatus | |
| JP2001510688A (ja) | 核酸分子、キットおよび使用 | |
| KR20010072357A (ko) | 세균 검출용 유전자 및 이를 이용한 세균의 검출방법 | |
| JPH10210980A (ja) | 乳酸菌検出用オリゴヌクレオチド及び該菌の検出方法 | |
| JPH1094396A (ja) | ランダムにプライムされた増幅を用いてヌクレオチド配列を取得する方法 | |
| NL8902926A (nl) | Werkwijze voor de bereiding van een dna-probe voor de detectie van methicilline-resistente staphylococcus-bacterien, daarmee verkrijgbare dna-probe en diagnostische test-kit die de dna-probe bevat. | |
| WO2000043545A2 (en) | Detection of drug resistant organisms | |
| JP4238319B2 (ja) | マイコプラズマの検出方法 | |
| JP2001520520A (ja) | 細菌の抗生物質耐性株の同定のためのｄｎａプローブ、方法およびキット | |
| JP4037926B2 (ja) | Ｓ．ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓの検出に用いるプライマー | |
| WO1994017203A1 (en) | Amplified dna fingerprinting method for detecting genomic variation |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| BV | The patent application has lapsed |