COMPOSICIONES Y MÉTODOS PARA LA PREVENCIÓN Y TRATAMIENTO DE CÁNCER EN LA PRÓSTATA HUMANO
Campo de la Invención La presente invención se refiere a un método y a un adjunto o composición complementaria a las terapias tradicionales para el tratamiento o prevención del cáncer de próstata en mamíferos, así como un método o composición útil para la prevención de la presentación del cáncer de próstata en mamíferos. La composición de la presente invención comprende Vitamina E, o un derivado de Vitamina E, en combinación con selenio, ya sea de una forma combinada o sin combinar, en cantidades que proporcionan efectos preventivos y terapéuticos para el carcinoma de próstata en mamíferos. Antecedentes de la Invención El cáncer de próstata es el cáncer más común en los mamíferos, especialmente entre los machos humanos de Norte América, y es la segunda causa principal de la muerte por cáncer en los hombres en los países Occidentales. Ver por ejemplo, la publicación de Parker SI , et al. , "Estadísticas del Cáncer 1997" ("Cáncer Statistics 1997") en CA Cáncer J Clin (1 997) 47: páginas 5 a 27. Varios factores tales como la etiología desconocida, la patología variable, una relación intrincada entre los factores endocrinos y la progresión anaplástica, contribuyen a la complejidad de esta enfermedad.
La evidencia proveniente de los estudios epidemiológicos clínicos y de laboratorio, soporta el concepto de que una interacción compleja entre el sistema de defensa antioxidante del huésped y los antioxidantes dietéticos, pueden participar en el origen y progreso del cáncer de próstata, así como otras formas de cáncer. Por ejemplo, el consumo suplementario de Vitamina E antioxidante ha estado asociada con una reducción de aproximadamente una tercera parte de la mortalidad ocasionada por el cáncer de próstata. Ver por ejemplo, la publicación de Fleshner NE. "La Vitamina E Inhibe el Crecimiento Establecido de los Tumores LNCaP de la Próstata Humana Promovido por la Dieta Alta en Grasas en Ratones Desnudos" ("Vitamin E I nhibits the High-Fat Diet Promoted Growth of Established Human Prostate LNCaP Tumors in Nude Mice") en J Urol (1 999) 1 61 : páginas 1651 a 1654. También se ha generado un interés considerable en el papel posible de los elementos de trazas en la prevención e intervención del cáncer. También ha sido reportada una correlación indirecta entre los niveles del selenio biodisponible en el ambiente humano y la mortalidad del cáncer. Ver la publicación de Hunter DJ, Morris JS, Stampfer MJ et al., "Un Estudio Prospecto de la Condición del Selenio y el Riesgo de Cáncer de Mama". ("A Prospective Study of Selenium Status and Breast Cáncer Risk") en JAMA (1990) 264: páginas 1 128 a 1 131 ; Ver la publicación de Van den Brandt PA, Goldbohn RA, Bode P et al. , "Un Estudio Prospecto de los Niveles de Selenio en las Uñas del Pie y el Riesgo de Cáncer Gastrointestinal" ("A Prospective Study on Toenail Selenium Levéis and Risk of Gastrointestinal Cáncer") en J Nati Cáncer Inst (1993) 85: páginas 224 a 229; ver la publicación de Van Den Brandt PA, Goldbohn RA, Bode P et al. , "Un Estudio Prospecto Sobre la Condición del Selenio y el Riesgo de Cáncer del Pulmón". ("A Prospective Study On Selenium Status And The Risk Of Lung Cáncer") Cáncer Res (1993) 53: páginas 4860 a 4865; Ver la Publicación de Helzlsouer KJ, Comstock GW, Morris JS et al., "El Selenio, Licopeno, A-Tocoperol, B-Caroteno, Retinol y el Cáncer de Vejiga Subsecuente" ("Selenium, Lycopene, A-Tocopherol, B-Carotene, Retinol and Subsequent Bladder Cáncer") en Cáncer Res (1 989) 49: páginas 6144 a 6148; Ver la publicación de Willett We, Polk BF, Morris JS et al. , "El Diagnóstico Previo de Selenio en el Suero y el Riesgo de Cáncer" ("Prediagnostic Serum Selenium and Risk of Cáncer") en Lancet (1 983) 2: páginas 1 30 a 134; Ver la publicación de Levander OA, "Explicación Científica para la Disminución Dietética Recomendada del Selenio" ("Scientific Rationale for the 1 989 Recommended Dietary Allowance for Selenium") en Perspect Pract (1 991 ) 91 : páginas 1572 a 1 576. La evidencia acumulativa sugiere que en muchos modelos de carcinogénesis experimental , la suplementación de la dieta con selenito de sodio da como resultado una disminución en la incidencia de los carcinomas inducidos por el carcinógeno químico. Ver la publicación de Heinonen OP, et al. , "Cáncer de Próstata y Suplementación con Alfa-Tocoferol y Beta-Caroteno: Incidencia y Mortalidad en un Ensayo Controlado" ("Prostate Cáncer and Supplementation with Alpha-Tocopherol and Beta-Carotene: Incidence and Mortality in a ControIIed Trial") en J Nati Cáncer Inst. (1 998) 90: páginas 440-446. Por lo tanto, los datos epidemiológicos y la investigación anterior, sugieren que la ingestión de micronutrientes y la dieta juegan un rol muy importante en la carcinogénesis de la próstata. También, los andrógenos han mostrado contribuir a la carcinogénesis de la próstata. Ver la publicación de Ripple MO, et al. , "Cambio Antioxidante-Pro-oxidante I nducido por el Tratamiento de Andrógenos en la Células del Carcinoma de Próstata Humano" ("Prooxidant-Antioxidant Shift Induced by Androgen Treatment of Human Prostate Carcinoma Cells") en J Nati Cáncer Inst. (1997) 89: páginas 40 a 48. El enlace entre la dieta y los andrógenos puede ser un esfuerzo oxidativo. Este proceso es ocasionado por un huésped de especie de oxigeno reactivo, el cual puede detonar la carcinogénesis. La investigación previa ha descubierto que los andrógenos exógenos aumentan el esfuerzo oxidativo en las líneas celulares de cáncer de próstata humano. Ver la publicación de Fleshner, en J Urol (1995) 161 : páginas 1651 a 1654. El reloj del ciclo celular orquesta el progreso de las células a través de ciclos de crecimiento y división. Por lo tanto, determina si una célula continúa su proliferación o se retira y entra en una condición de quietud. Por lo tanto, la duplicación del ADN y la mitosis son controlados por la activación de las cinasas de proteína dependientes de ciclina específicas de la fase S y la fase M (CDKs), respectivamente. Las su bu nidades catal íticas de las CDKs son activas solamente cuando son compiejadas con su bunidades regulatorias específicas, denominadas ciclinas. Los CDKs controlan los diferentes procesos celulares a través de la fosforilación de los substratos apropiados dentro de la célula, Ver, por ejemplo la publicación de Solomon MJ "Activación de Varias Proteínas cdk2/Cic!ina" ("Activation of the Various Cyclin/cdk2 Proteins") en Curr. Opin. Cell Biol. (1 993) 5: páginas 1 80 a 1 86. Las ciclinas gu ían , enlazan y di rigen las CDKs a los substratos apropiados durante varias fases del ciclo cel ular, dictando de este modo, en donde y cuando estos substratos llegaran a ser fosforilados. Ver la publicación de Hartwell L, "Los Defectos en la Revisión del Ciclo Celular Pueden Ser Responsables de la Inestabilidad Genómica de la Célu las Cancerígenas" ("Defects i n a Cell Cycle Checkpoint May Be Responsible for the Genomic I nstability of Cáncer Cells") en Cell ( 1 992) 71 : pág i nas 543 a 546. Otros componentes importantes son los inhi bidores de CDK (CKI s), tales como el p21 y el p27, que bloquean la acción de los com plejos de CDK de ciclina específicos. Esto evita la proliferación de células, forzando de este modo, a que entren en u n estado de q uietud denominado la fase G0. Ver la publicación de Sherr CJ et al. , en Genes Dev. (1 999) 13: pág inas 1 501 a 151 2. La proliferación descontrolada de las células es la antesala del cáncer. Las células de los tumores contienen o adquieren genes dañados q ue regulan directamente su ciclo celular. Igual que otros tipos de cáncer, el cáncer de próstata está asociado con la pérdida del control del ciclo celular que da como resultado una proliferación no regulada de las células. Se desconoce el mecanismo preciso por el que esto llega a ocurrir. Ver la publicación de La Thangue N B, "Introducción: Regulación del Ciclo Celular y Cáncer" ("Introduction: Cell Cycle Regulation and Cáncer") en Seminars in Cáncer Bíol. (1 995) 6: páginas 61 y 62. La detención del ciclo celular es portada por las p27 y p21 de los CKIs. Ver la publicación de Tslhlias J et al. , "Involucramiento de p27Kip1 en la detención de Gi por una Alta Dosis de 5a-dihidrotetosterona en la Células LNCaP de Cáncer de Próstata H umano" ("Involvement of p27Kip1 in d Arrest by High-Dose 5a-Dihydrotestosterone in LNCaP Human Prostate Cáncer Cells") en Oncogenes (2000) 1 9: páginas 670 a 679. Esta base de la maquinaria del control del ciclo celular comprende subunidades regulatorias de ciclina en complejo con las subunidades CDK de treonina/serina catalítica que fosforilan los substratos de un modo específico del ciclo celular. Ver por ejemplo, la publicación de Morgan DO, "Sinasas Dependientes de Ciclinas: Motores, Relojes y Microprocesadores" ("Cyclin-Dependent Kinases: Engines, Clocks and Microprocessors") en Ann. Rev. Dev. Biol. (1 997) 13: páginas 261 a 291. La activación de las CDK2 por medio de la ciclina E en el punto de restricción tardío d en/cerca del y por la ciclina A en la transición de la fase Gi-S y la activación de ciclina B de los CDK2 en la transición de la fase G2/M, sugiere el involucramiento de estos complejos de CDK-ciclina en los puntos de revisión regulatorios específicos del ciclo celular. Es conocido que el p21, un inhibidor de sinasa dependiente de la ciclina, puede inducir la detención del ciclo celular en G<¡ y/o G2 por medio de la inhibición de la actividad de sinasa. Adicionalmente, el p27 es regulado por un número de citosinas inhibitorias de la proliferación y mitogénicas y por inhibición de contacto. Ver la publicación de Polyak C et al., "p27Kip1, un Inhibidor de cdk-Ciclina, Enlaza el Factor-ß de Crecimiento de Transformación, y Hace Contacto con la Inhibición para la detención del Ciclo Celular" ("p27Kip1, a Cyclin-cdk Inhibitor, Links Transforming Growth Factor-ß and Contact Inhibition to Cell Cycle Arrest") en Genes Dev. (1994) 8: páginas 9 a 22. Aunque la detención del crecimiento no siempre está asociada con los niveles aumentados de proteína p27, es un portador importante de la detención de G-i debido a que actúa durante la fase G0 y G1 temprana del ciclo celular e inhibe los complejos D1-DCK4 de ciclina y E-CDK2 de ciclina. Ver la publicación de Pagano M et al., "Rol de la Trayectoria de Proteasoma-Ubiquitina en la Regulación de la Abundancia del Inhibidor p27 de Sinasa Dependiente de la Ciclina" ("Role of Ubiquitin-Proteasome Pathway in Regulating Abundance of the Cyclin-Dependent Kinase Inhibitor p27") en Science (1995) 269: páginas 682 a 685. Aunque los efectos anti-carcinogénicos de la Vitamina E y el selenio han sido observados y estudiados, no ha existido una descripción para el uso de una combinación de estos dos materiales para la prevención y/o tratamiento del carcinoma de próstata en mamíferos. Además, aunque existen otros agentes disponibles para la quimioterapia de tumores y otras opciones de tratamiento invasivo existentes para el cáncer de próstata, tales como la remoción de la próstata cancerosa o la colocación de semillas radioactivas diseñadas para encoger el tumor, sería más deseable proporcionar una composición de baja toxicidad útil como un adjunto o complemento a las terapias tradicionales para un paciente, la cual servirá como un agente anti-carcinogénico, especialmente para el cáncer de próstata. Alternativamente, es deseable proporcionar composiciones las cuales aumenten los niveles de p21 y/o p27, así como otros inhibidores de CDK para evitar y tratar el cáncer de próstata en mamíferos. Sumario de la Invención Un objeto de la presente invención es proporcionar una composición y método los cuales puedan ser utilizados para tratar y prevenir el carcinoma de próstata en los mamíferos. Un objeto adicional de la presente invención es proporcionar una composición que comprende Vitamina E o derivados de Vitamina E o análogos de Vitamina E y selenio o una sal de selenio o un derivado de selenio de una forma combinada o sin combinar, en la cual esta composición exhibe propiedades anti-carcinogénicas mejoradas especialmente para la prevención o tratamiento del carcinoma de próstata en mamíferos. Otro objeto de la presente invención es proporcionar un método y un adjunto o composición de complemento a las terapias tradicionales para el tratamiento o prevención de la presentación del cáncer de próstata en los mamíferos. Todavía otro objeto de la presente invención es proporcionar un método y una composición q ue i nhiban la formación de los complejos de proteína CDK-ciclina por medio de la estimulación del p21 ó p27, para la prevención y tratamiento del carcinoma de próstata en mamíferos . Breve Descripción de los Di bujos FIGU RAS 1 a y b Análisis FACS de la células LN CaP (a) y PC3 (b) tratadas con
20 g/ml de Vitami na E: Las cél u las fueron recolectadas y preparadas para el análisis FACS en diferentes intervalos de tiempo después de la adición de Vitamina E al med io de cultivo. Se observó la detención de Gi en las cél ulas LNCa P y la detención del G2/M en las células PC3. FIGU RAS 2a y b Reguladores del ciclo celular durante la detención por la Vitamina E: Las célu las fueron recolectadas en los intervalos de tiempo indicados después de la adición de Vitamina E al medio de cultivo . Se prepararon lisatos y se resolvieron utilizando SDS-PAGE (a) LNCaP (b) PC3. Las proteínas fueron detectadas por in munotinción con los anticuerpos indicados. FIGU RAS 3a y b (a) Complejos in m u nes a la ciclina E (LNCaP): Las células fueron recuperadas en diferentes intervalos de tiempo después de la adición de Vitamina E al medio de cultivo. La ciclina E fue inmunoprecipitada , los complejos se resolvieron por medio de SDS-PAGE, y los inmunoteñidos se hicieron reaccionar con anticuerpos para detectar las proteínas asociadas, (b) La p27 asociada con la ciclina E fue cuantificada por medio de densitometría a partir de las manchas en (a) anterior. Las células LNCaP mostraron un aumento de tres veces en el p27 enlazado a la ciclina E. FIGURAS 4a y b (a) Complejos inmunes a la ciclina E (PC3): Las células fueron recuperadas en intervalos posteriores a la adición de la Vitamina E al medio de cultivo. La ciclina E fue inmunoprecipitada, los complejos se resolvieron por SDS-PAGE y los inmunoteñidos se hicieron reaccionar con anticuerpos para detectar las proteínas asociadas, (b) p27 asociadas con ciclina E fueron cuantificadas por medio de densitometría a partir de las manchas en (a) anterior. Las células PC3 muestran un aumento de seis veces en la p27 enlazada a la ciclina E. FIGURA 5 La Vitamina E ocasiona un aumento en el nivel de p27 que satura la ciclina E/cdk2 objetivo: El p27 fue inmunodescongestionado en serie a partir de los lisatos de células LNCaP recolectadas en 48 horas en donde se observó la inhibición máxima después de la adición de Vitamina E. La proteína asociada con la ciclina E fue ensayada antes y después de la ¡nmunodescongestión de la p27 en muestras de las horas 0 y 48.
FIGURA 6 (a) Trazo punteado que muestra la asimilación de BrdU y Pl en la células LNCaP y PC3 en crecimiento asincrono, (b) La asimilación de BrdU disminuyó indicando la detención de la síntesis de ADN después de 72 horas de tratamiento con 2( g/ml de Vitamina E. FIGURAS 7a y 7b Análisis FACS de la células LNCaP (a) y PC3 (b) tratadas con 3?µg de selenio: Las células fueron recolectadas y preparadas para el análisis FACS en diferentes intervalos de tiempo después de la adición de selenio al medio de cultivo. Se observó una detención del G1 en las células LNCaP. FIGURAS 3a y 8b Reguladores del ciclo celular durante la detención por medio de selenio: Las células fueron recolectadas en los intervalos de tiempo indicados después de la adición de Selenio al medio de cultivo. Se prepararon lisatos y se resolvieron utilizando SDS-PAGE (a) LNCaP (b) PC3. Las proteínas fueron detectadas por inmunotinción con los anticuerpos indicados. FIGURAS 9a y 9b (a) Complejos inmunes a la ciclina E (LNCaP): Las células fueron recuperadas en diferentes intervalos de tiempo después de la adición de selenio al medio de cultivo. La ciclina E fue inmunoprecipitada, los complejos fueron resueltos por SDS-PAGE y los inmunoteñidos se hicieron reaccionar con anticuerpos para detectar las proteínas asociadas, (b) La p27 asociada con la ciclina E fue cuantificada por densitometría de las manchas en (a) anterior. Las células LNCa P m uestran un aumento en el p27 enlazado a la ciclina E. FIGU RAS 1 0a y 1 0b (a) Com plejo i nm unes a la ciclina E (PC3): Las cél ulas fueron recuperadas en d iferentes i ntervalos de tiempo después de la adición de selenio al medio de cultivo . La ciclina E fue inmunoprecipitada, los complejos fueron resueltos por SDS-PAG E, y los inmunoteñidos se hicieron reaccionar con anticuerpos para detectar las proteínas asociadas, (b) el p27 asociado con la ciclina E fue cuantificado por densitometría de las manchas en (a) anterior. Las células PC3 no mostraron niveles detectables del p27 enlazado a la ciclina E hasta 72 horas después del tratamiento. FIGU RA 1 1 Análisis de FACS de las células LNCaP tratadas con 20^g/ml de Vitamina E y 3C^g/m l de selenio. Las cél ulas fueron recolectadas y preparadas para el análisis FACS en diferentes intervalos de tiempo después de la ad ición de los micronutrientes al medio de cultivo . Se observaron efectos sinergísticos con la detención virtual del ciclo celular a las 72 horas. FIGURA 12 Los regu ladores del ciclo celular durante la detención por la combinación de Vitamina E y selenio en células LN CaP. Las células fueron recolectadas en diferentes intervalos de tiempo después de la exposición. Se prepararon lisatos y se resolvieron por SDS-PAGE.
Las proteínas fueron detectadas por inmunotinción con los anticuerpos indicados. Se observó la estimulación de la p27. La figura 1 3 muestra las fórmulas químicas de los derivados ilustrativos de Vitamina E. Descripción Detallada de la Invención El método de la presente invención es la administración de una composición que comprende Vitamina E o derivados de Vitamina E o análogos de Vitamina E y selenio o sal de selenio o derivados de selenio de forma combinada o sin combinar, en niveles de baja toxicidad para el consumidor, para aquellos mamíferos que han sido diagnosticados con carcinoma de próstata de mamíferos o aquellos mamíferos que desean evitar dicho carcinoma. Alternativamente, el método de la presente invención en la administración de una composición de una mezcla de agentes la cual inhibe la formación de los complejos de proteína CDK-ciclina, por medio de la estimulación de p21 ó p27, para la prevención y tratamiento del carcinoma de próstata en mamíferos. Estudios de laboratorio y mecanismos de la acción anti-cáncer de la Vitamina E v el selenio. Se hicieron estudios para determinar si los antioxidantes similares a la Vitamina E y el selenio biodisponible podrían estar transportando sus efectos induciendo la detención del ciclo celular en la fase G-i/S en las líneas celulares de cáncer de próstata humano a través de la modulación de los inhibidores CDK.
Métodos Experimentales Dos líneas celulares de cáncer de próstata humano establecidas, la LNCaP (con respuesta al andrógeno), y PC3 (independientemente del andrógeno) fueron obtenidas de la Colección de Cultivos de Tipo Americano (Rockville, MD). Las células LNCaP fueron cultivadas en un medio RPMI 1640 (Gibco BRL, Grand Island, NY), suplementadas con 10% de Suero Fetal de Bovino (PBS) y 100IU/ml de Penicilina, y ^0?µg/m\ de Estreptomicina, a una temperatura de 37°C en una atmósfera humidificada del 5% de C02 en aire. Las células PC3 fueron cultivadas en un medio D EM/F12 con 10% de PBS y antibióticos. Ambos conjuntos de cultivos celulares se cultivaron en una confluencia del 80% en placas de cultivo de tejidos de 10 cm y se dividieron 1 :8. Un conjunto de cultivos celulares LNCaP y PC3 fueron tratados con Vitamina E [Succinato de a-Tocoferol reconstituido en etanol al 95%] y se agregaron a los cultivos en una concentración de 20µg/ml. Un segundo conjunto de cultivos celulares LNCaP y PC3 fueron tratados con selenio [L-selenometionina reconstituido en HCI 0.005N] y se agregaron a los cultivos en una concentración de 30 g/ml. Los controles recibieron solamente vehículo. El tratamiento se inició después de 48 horas de la adhesión. El diseño experimental fue de hasta 72 horas en el cultivo antes de la recuperación para la citometría de flujo y el análisis de la proteína. Las células fueron marcadas por pulso con bromodesoxiuridina 1 0 mM (BrdU) durante 2 horas con o sin un tratamiento previo de Vitamina E o selenio para las células de crecimiento asincrono. Las células entonces fueron recolectadas, fijadas con 70% de etanol, tratadas con HCI al 0.1 % y calentadas durante 1 0 minutos a una temperatura de 90°C para exponer el ADN marcado. Las células fueron teñidas con FITC conjugado con anti-BrdU (Becton Dickinson), y se contratiñeron con yoduro de propidio. El análisis del ciclo celular se llevó a cabo en un Becton-Dickinson FACScan , utilizando un programa (sofware) Lysis I I. Luego las células fueron lisadas en hielo en un regulador helado de lisis NP-40 (0.1 % NP-40, 50nm de Tris pH 7.5, 1 50 mM de NaCI , 1 mM de fenilmetilsulfonilfluoruro, y 0.02 mg/ml de cada uno de aprotinina, leupepsina y pepstatina). Los lisatos fueron sonificados y clarificados por centrifugación. Las proteínas fueron cuantificadas por medio de un análisis Bradford, se resolvieron las proteínas 20-100 µg por filas, con electroforesis de gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE). La transferencia y la tinción fueron llevadas a cabo y las proteínas fueron detectadas por electroquimioluminiscencia (ECL). La densitometría se realizó utilizando un sistema de elaboración de I magen Molecular Dynamics y el programa (sofware) Image Quant para cuantificar las cantidades relativas de proteína p27 detectadas en los Western Blots. Para la detección de las proteínas asociadas con la ciclina E por medio del análisis de inmunoprecipitación-Western (I P-Western), la ciclina E fue inmunoprecipitada a partir de lisatos de proteína de 200µg, los complejos se resolvieron , fueron teñidos y las manchas se hicieron reaccionar con ciciina E, CDK2 , y anticuerpos p21 y p27. Para la inmunodescongestion del p27, el p27 fue inmunoprecipitado en serie (tres veces) a parti r de lisatos de proteína de 20C^g, y luego la ciciina E fue i nmunoprecipitada de los lisatos de p27 descongestionado . Las cantidades de la proteína de ciciina E que se podrían in munoprecipitar, asociadas con la proteína CDK2 y p27 antes y después del inmu nodescongestion de p27 fueron comparadas utilizando una tensión I P-Western . Los anticuerpos utilizados en los experimentos de inmunotinción fueron: monoclonal de ratón ß-actina proveniente de Sigma Laboratories; E1 72 monoclonal de ratón de ciciina E para la i n munoprecipitación , y E12 para la i nmunotinción , provenientes de E Harlow ( ass General , MA) ; el anticuerpo PSTAI RE monoclonal de CDK2 de ratón , u n obseq uio de S. Reed (The Scripps Research I nstitute, CA); el anticuerpo monoclonal p27 de ratón proveniente de Transduction Laboratories (Lexington , KY); y el anticuerpo policlonal p21 de conejo proveniente de Santa Cruz Biotechnology, Cedarlane, CA, y un conjugado a Brd U-FITS . La Vitamina E Ocasiona la Detención de G i^ en las Células LNCaP v G?/M en las células PC3 Los resultados de este experimento produjeron la detención del ciclo celular en tres de los cuatro medios de cultivos celulares. El tratamiento de la proliferación asincrona de las cél u las LNCaP y PC3 con Vitami na E fue por 72 horas e indujo una detención del GT de la LNCaP, y la detención G2/M del PC3, tan pronto como a las 24 horas después del tratamiento, como fue demostrado por los histogramas del contenido de ADN proveniente de los estudios de flujo citométrico. Entre las 24 y 72 horas del tratamiento con Vitamina E, la población celular aumentó de manera importante en la fase G2/M y estuvo asociada con los números de células disminuidos en la fase S, tal y como se observó en las células PC3. Después de 24 horas, el porcentaje y reducción de células en la fase S fue de 49.5% (figura 1 a), y 37.3% (figura 1 b), en las células LNCaP y PC3, respectivamente. La detención celular persistió durante 72 horas en un medio suplementado con Vitamina E reduciendo las células en la fase S por un máximo de 69.6% y 95.0% en las células LNCaP y PC3, respectivamente (Tabla 1 ). No se observó citoxicidad por su apariencia morfológica. No se observó detención de la proliferación en los controles que fueron tratados solamente con el vehículo. TABLA 1
EFECTO INHIBITORIO DE LA VITAMINA E Línea Celular % de Reducción Fase S 24 48 72 (horas) LNCaP 49.5 69.6 47.3 PC3 37.3 82.8 95.0 Alteración de los niveles de p21 y p27 durante la detención celular inducida por Vitamina E La p21 , un inhibidor de sinasa dependiente de ciclina, se conoce que está involucrada en la detención de la fase G2/M. Los datos del flujo de citometría (figura 1 b), demuestran que aunque la Vitamina E detuvo ambas líneas celulares, lo hizo en la fase G2/M de las células PC3. Por lo tanto, para investigar más si la p21 también estaba implicada en la inhibición de la proliferación celular de cáncer de próstata inducida por Vitamina E, fueron examinados los niveles de p21 , tanto en las células LNCaP como las células PC3, siguiendo la exposición a la Vitamina E. No existió un nivel importante en los niveles de p21 en las células LNCaP (figura 2a), sin embargo, los niveles de p21 fueron estimulados de una manera importante en las células PC3 (figura 2b). Esta elevación de los niveles de p21 se observó tan pronto como a las 24 horas del tratamiento. La inhibición de la actividad E/CDK2 de ciclina fue observada dentro de las 24 horas posteriores al tratamiento con Vitamina E. Para determinar si el aumento en la p21 era suficiente para el E/cdk2 de ciclina objetivo e inducir la detención del ciclo celular, la p27 fue inmunodescongestionada por tres inmunoprecipitaciones en serie tanto de los lisatos de control como de células LNCaP tratadas con Vitamina E. Los inmunocomplejos de ciclina E fueron examinados antes y después de la inmunodescongestión de la p27. La inmunodescongestión del p27 ocasionó una reducción en la proteína cdk2 y en la ciclina E (figura 5). Esto muestra una proporción substancial de las célu las en la fase G-? del ciclo celular. Las líneas celu lares LNCaP y PC3 muestran una curva de crecimiento característica de forma de campana en respuesta a la Vitamina E (fig uras 6a y 6b) . El estudio actual sugiere que el nivel aumentado de p27 y su enlace e inh i bición del E/cdk2 de ciclina contribuyen a la detención de la G-\ de las células LNCaP en respuesta a la Vitam ina E. Para mirar dentro del mecanismo de inhibición del E/cd k2 de ciclina estos complejos fueron examinados por inmu noprecipitación de la ciclina E seguido por Western Blotting para detectar las proteínas asociadas (figura 3a y 4a). En los cultivos celulares tratados con Vitamina E, la cantidad de p27 asociada con la ciclina E en las células LN Ca P aumentó de 3 a 4 veces por densitometría (figura 3b), conforme las cél u las se introd ujeron a la detención de Gi . Se observó u n aumento si milar con las cél ulas PC3 y se observaron niveles detectables de p27 48 horas después del tratamiento (Fig ura 4). Los reportes sugieren que se ha mostrado que dicho aumento en la p27 satura la ciclina E/CDK2. El selen io ocasiona la detención de la G -] en las células LNCaP sin efecto en las cél ulas PC3 El trata miento de célu las LNCaP y PC3 de proliferación asincrona con 30pg/ml de selenio por hasta 72 horas i ndujo un arresto de la LNCaP, tan pronto como a las 24 horas posteriores al tratamiento como lo demuestran los h istogramas del contenido de ADN proveniente de los estudios del flujo citométrico (Figura 7a). El porcentaje de reducción de células en la fase S fue de 58.1 % por 24 horas de tratamiento. La detención celular persistió durante 72 horas en medios suplementados con selenio, reduciendo las células en la fase S por un máximo de 80.3% (Tabla 2). No se observó citotoxicidad por su apariencia morfológica. No se observó detención de la proliferación en los controles tratados solamente con el vehículo. En contraste, el tratamiento de las células PC3 no mostró una alteración importante en el número de células de la fase S, aún después de 72 horas del tratamiento, por lo que se indica la ausencia de la detención de la proliferación (8.4%) (FIGURA 7b) (Tabla 2).
TABLA 2
EFECTO INHIBITORIO DEL SELENIO Línea Celular % de Reducción Fase S 24 48 72 (horas) LNCaP 58.1 70.0 80.3 PC3 3.6 6.9 8.4
Es conocido que la p21 , es un inhibidor de cinasa dependiente de ciclina que está involucrado en la detención de la fase G2 . Como no hubo duplicación del número de células en la fase G2 M, el estudio actual investigó si la p21 también estaba implicada en la inhibición de la proliferación de células de cáncer de próstata inducida por selenio. Los niveles de p21 fueron analizados, tanto en las células LNCaP como en las células PC3, después de la exposición al selenio. Los niveles de p21 fueron estimulados de manera importante en las células LNCaP (Figura 8a). Esta elevación en los niveles de p21 se observó tan pronto como a las 24 horas del tratamiento. No hubo alteración de los niveles de p21 en las células PC3 tratadas con Selenio (Figura 8b). La inhibición de la actividad E/cdk2 de ciclina fue observada en las células LNCaP y PC3 dentro de las 24 horas posteriores al tratamiento con selenio. Con el fin de evaluar el mecanismo de inhibición del E/cdk2 de ciclina, estos complejos fueron examinados por medio de inmunoprecipitacíón de la ciclina E seguida por Western Blotting para detectar las proteínas asociadas (FIGU RAS 9 y 10). Hubo un aumento del 25% en la cantidad de p27 asociada con ciclina E en las células LNCaP medidas por densitometría (FIGU RA 9b) conforme las células entraron a la detención de la G -¡ . En contraste, las células PC3 tratadas con selenio se comportaron de una manera muy diferente a las células LNCaP, debido a que los niveles de ciclina E fueron aumentados a las 72 horas. Los resultados fueron diferentes en los cultivos de células tratadas con selenio que en los tratados con vitamina E. En estos cultivos, hubo un aumento del 25% en la cantidad de p27 asociada con ciclina E en las células LNCaP medidas por densitometría conforme las células entraron a la detención de la G-j . En contraste, los niveles de ciclina E fueron aumentados a las 72 horas en el cultivo de las células PC3. El cultivo de células PC3 no mostró niveles detectables de p27 hasta el final del periodo de tratamiento;
se observaron dos bandas d iferentes de CDK2 en el SDS-PAGE únicamente a las 72 horas. Por lo tanto, se ha postu lado q ue las p21 y p27 aumentadas, y su enlace e inhi bición del E/CDK2 de cicli na, juega un rol importante en la i n hi bición de la proliferación celular, conforme se regenera el tejido prostético que pasa por la diferenciación. Por lo tanto , la investigación sugiere que el nivel aumentado de p27 contribuye a la detención de la G -j de las células del carcinoma de próstata hu mano LNCa P, en respuesta a la vitamina E, y que el nivel aumentado de p21 contribuye a la detención de la G2/M de fas células de cáncer de próstata PC3, en respuesta a la vitamina E. El efecto antiprol iferativo del selen io en las dos líneas celulares es diferente: no existió inhibición de la proliferación en las células PC3 independ ientes del and rógeno, comparadas con la reducción marcada en la fase S de las células LNCaP dependientes del andrógeno, debido a los niveles aumentados de p21 . Esto puede ser atribuido al hecho de q ue el selenio puede estar portando sus efectos a través del receptor de andrógeno y no debido a la velocidad de la proliferación cel ular. Aunque se conoce poco acerca del receptor de andrógeno, también se enlaza directamente a los componentes de la maqu inaria del ciclo celular y la forma en que dicha interacción podría modular la actividad de transactivación del receptor en el cáncer de próstata , los estrógenos y los andrógenos regulan la actividad de la célula CDKs modulando la expresión de las ciclinas o los inhi bidores de CDK, promoviendo de esta manera, el progreso a través de la transición G-j-S del ciclo celular. Evidencia de los Efectos Mejorados Utilizando Vitamina E y Selenio Las figuras 11 y 12 muestran los efectos sinergísticos del uso en combinación de vitamina E y selenio en el ciclo celular. Cuando las células LNCaP fueron tratadas con una combinación de vitamina E y selenio, el ciclo celular fue detenido de una manera más importante que cuando fue utilizado en un agente solo. A las 48 y 72 horas, la fase S fue reducida al 4% y el 1% respectivamente, con un aumento concomitante, tanto en los componentes G-j como G2/M. Esto dio como resultado una reducción del 63.1%, 84.2% y 94.7% en la fase S a las 24, 48 y 72 horas, respectivamente, comparado con los controles (Tabla 3). Los datos sugieren que las propiedades anticancerígenas por dichos agentes funcionan de una manera suficientemente diferente, de modo que los efectos sinergísticos son realizados si ambos son presentados a la célula. TABLA 3
La vitamina E es una vitamina soluble en grasas encontradas en los granos de cereal y vegetales de hojas verdes, la cual , además de sus propiedades anticancerígenas aquí observadas, evita también la oxidación de los ácidos grasos insaturados y en localizaciones tales como la membrana celular, ayudando de este modo a mantener su estructura. Esta puede ser ingerida, ya sea como a-tocoferol o como un éster de a-tocoferol , tal como succinato de tocoferol. El selenio es un elemento de trazaS que puede ser ingerido en formas tales como selenito de sodio o selenometionina. La composición puede ser tomada oralmente, ya sea en la forma de una cápsula, un aditivo de un alimento rico en ambos constituyentes. Alternativamente, estos agentes anticancerígenos pueden ser introducidos en el flujo sanguíneo por medio de una jeringa hipodérmica. Los componentes de la composición pueden ser administrados juntos o por separado. La administración de la composición puede ser parenteral , oral, intravenosa, rectal, intrapleural , intrarraquídea, intraperitonial, el aerosol, por administración transdérmica, para lograr los efectos preventivos o terapéuticos deseables. Cuando se administra oralmente, la composición puede ser en la forma de tabletas (solas o múltiples, recubiertas o sin recubrir), cápsulas, o grageas. Estas formulaciones orales pueden ser mezcladas con excipientes sólidos, tales como lactosa, sacarosa, almidón, celulosa micro cristalina, esterato de magnesio, o talco. Cuando puede ser indicada la administración parenteral pueden ser empleadas una solución acuosa o una formulación oleaginosa del agente. Las soluciones acuosas pueden ser preparadas en agua, solución salina fisiológica, solución de Ringer, y ya sea con o sin reguladores. La formulación oleaginosa puede ser hecha, por ejemplo, en aceites naturales (como en aceite de cacahuate o aceite de oliva) o en benzoato de bencilo. La cantidad de dosis real administrada puede ser determinada por factores físicos y fisiológicos, tales como la actividad del compuesto específico empleado, la edad, el peso corporal, la salud general, la dieta, el tiempo de administración, la ruta de administración, el índice de excreción, la combinación posible de fármacos, y la ideopatía y severidad del padecimiento del paciente consumidor. Las dosificaciones seguras y efectivas clínicamente de los compuestos con los cuales está relacionada la presente invención podrán ser determinados por ensayos clínicos, según como sea requerido, por las autoridades reguladoras en la técnica. Además, están disponibles para utilizarlos como agente anticáncer otros compuestos químicos seguros para el consumo humano, los cuales aumentan los niveles intracelulares de p21 y p27, y por lo tanto, aumentan la inhibición de los complejos CDK-ciclina. La vitamina E no es una sola entidad. Es un término que describe una familia de compuestos relacionados denominados tocoferoles y tocotrienoles. Ver la publicación de Brigelius-FIohe R, Traber MG, "Vitamina E: Función y Metabolismo" ("Vitamin E: Function and Metabolism ,") en FASEB (1 999) páginas 1 145 a 1 1 55. Existen 4 tocoferoles y 4 trocotrienoles: alfa, beta, gamma, y delta, respectivamente (FIGU RA 1 3). El alfa-tocoferol es la forma más abundante de la vitamina E, que representa aproximadamente el 90% de los tocoferoles en la mayor parte de los tejidos de los mamíferos. Éste tiene la actividad biológica más grande e invierte la deficiencia de vitamina E en los humanos. Ver la publicación de Traber MG, Arai
H , "Mecanismos Moleculares del Transporte de Vitamina E" ("Molecular Mechanisms of Vitamin E Transport,") en Annu Rev Nutr (1 999) páginas 343 a 355. Existen tres centros quirálicos en la familia de los tocoferoles que determinan su estereoespecifidad. Las formas naturales (predominantemente derivadas de las plantas) del ct-tocoferol, son exclusivamente en el isómero todo-dextro (RRR). Los suplementos de vitamina E, sin embargo, pueden contener, ya sea RRR natural (d-a-tocoferol) o vitamina E sintética. Las formas sintéticas de vitamina E, también conocidas como todos los rae a-tocoferoles (o dl-a-tocoferoles) contienen todos los ocho estereoisómeros posibles. Ver la publicación de Brigelius-FIohe R, Traber MG, "Vitamina E: Función y Metabolismo" ("Vitamin E: Function and Metabolism,") en FASEB (1 999) páginas 145 a 1 155. Las bioactividades de estos compuestos no son idénticas. Como regla general, utilizando el dl-a-tocoferol sintético como un estándar, el d-a-tocoferol (forma natural) poseería
I .49 veces esta bioactividad. Ver publicación de Prior WA, "Vitamina E y Enfermedad del Corazón: Ciencia Básica para los Ensayos de Intervención Clínica" ("Vitamin E and Herat Disease: Basic Science to Clinical I ntervention Triáis") en Free Radie Biol. Med (2000 Ene 1 ) páginas 141 a 164. La vitamina E disponible en el mercado viene, ya sea en la forma esterificada o sin esterificar. Todas las formas esterificadas de la vitamina E natural tienen una bioactividad similar. La conversión de miligramos a unidades internacionales depende de la formulación de la vitamina E. En general , una Ul es igual a la actividad de un mg de acetato de dl-a-tocoferol (por ejemplo, forma sintética). Existe una variedad de razones que explican la variación en la bioactividad de las diferentes formas de vitamina E, incluyendo: 1 ) actividades biológicas diferentes de los isómeros mismos; Ver la publicación de Brigelius-FIohe R, Traber MG, "Vitamina E: Función y Metabolismo" ("Vitamin E: Function and Metabolism,") en FASEB (1 999) páginas 1 145 a 1 155; 2) índices y modos diferentes de transporte; 3) existencia de mecanismos específicos de transporte para el RRR-a-tocoferol; Ver la publicación de Traber MG, Arai H, "Mecanismos Moleculares del Transporte de Vitamina E" ("Molecular Mechanisms of Vitamin E Transport,") en Annu Rev Nutr (1 999) páginas 343 a 355; y 4) Interacciones especificas de diferentes isómeros con los receptores; Ver la publicación de Traber MG, Arai H, "Mecanismos Moleculares del Transporte de Vitamina E" ("Molecular Mechanisms of Vitamin E Transport, ") en Annu Rev Nutr (1 999) páginas 343 a 355. La vitamina E es ingerida oralmente, ya sea por medio de los alimentos o suplementos alimenticios. Las buenas fuentes dietéticas de vitamina E tienden a representar alimentos ricos en aceites derivados de las plantas incluyendo: aguacates, nueces, huevos, manteca de cacahuate, frijol de soya y cereales para el desayuno de granos enteros listos para usarse. Los aceites de cocina tienden a ser la mayor fuente de vitamina E en la dieta. Ver la publicación de Rao AV, Fleshner N , AgarwaI S. Rao AV, Fleshner N , Agarwal S. , en Nutr Cáncer (1999) páginas 159 a 164. La ingestión diaria recomendada de vitamina E es de 10 mg/día. Esta cantidad es normalmente cubierta por las fuentes dietéticas para aquellos individuos que consumen una dieta saludable. Sin embargo, la dieta sola no puede suministrar las cantidades requeridas para evitar enfermedades crónicas. Esto es particularmente cierto, si se está deseando de un plan dietético bajo en grasas. Una comida rica en vitamina E posee problemas debido a que la vitamina E es soluble en la grasa y por lo tanto, se encuentra en las grasas. De una manera ideal, entonces la asimilación aumentada de Vitamina E es lograda mejor a través de la suplementación. Una vez que se ha ingerido, la vitamina E es absorbida por medio de los linfáticos intestinales junto con los ácidos grasos de cadena media. Luego es empacada en quilomicras, y transportada al hígado. Una vez que ha pasado a través del hígado, el a-tocoferol parece ser secretado preferentemente dentro del plasma. La proteina de transferencia del a-tocoferol (a-TTP), una proteína específica del hígado, es responsable por esta preferencia. Ver la publicación de Azzi A, Breyerl , Feher M, PastoriM, Ricciarelli R, Spycher S, Staffieri M , Stocker A, Zimmer S, Sing . JM, "Respuestas Celulares Específicas al Alfa-tocoferol" ("Specific Cellular Responses to Alpha - Tocopherol") en J Nutr (2000 Jul) 1 30(7): páginas 1 649 a 1652. Las formas ß-, d-, y ?-tocoferol son secretadas en su mayoría dentro de la bilis y excretadas por medio de las heces fecales. Los niveles en el plasma de Vitamina E son saturables en un nivel de 80 µ?; los niveles que exceden 80 µ? no se pueden lograr con una megadosis de Vitamina E. Para lograr niveles saturables en la sangre se requieren aproximadamente 800 Ul diarias. A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos aquí utilizados tienen los mismos significados que son entendidos generalmente por un experto en la técnica a la cual pertenece a esta invención. Aunque se pueden utilizar en la práctica cualesquiera métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos, para probar la presente invención, los métodos y materiales preferidos se han descrito ahora. Todas las publicaciones y documentos de patente a las que se ha hecho referencia en esta descripción, están incorporados a la presente solicitud como referencia en su totalidad , como si todas y cada una de las publicaciones y documentos de patente fueran incorporados en su totalidad específicamente en la presente descripción como referencia. La presente invención no está limitada en su alcance por modalidad alguna descrita, las cuales tienen la pretensión de ser un aspecto de la invención, ni por cualesquiera métodos los cuales sean funcionalmente equivalentes al alcance de la invención. I ndudablemente, aquellos expertos en la técnica apreciarán a partir de la descripción anterior, varias modificaciones de la invención, además de aquellas aqu í mostradas y descritas. Se tiene la intención de que dichas modificaciones se encuentren dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.