MXPA02007635A - Metodo para cargar un globulo rojo con un ajente. - Google Patents

Abstract

Se describe un metodo de produccion de un globulo rojo adecuado para suministrar un agente a un vertebrado, el metodo comprendiendo: (a) proveer un globulo rojo; (b) presensibilizar el globulo rojo; y (c) cargar el globulo rojo con un agente; tambien se describe el uso de un campo electrico y/o ultrasonido para incrementar la eficiencia de carga de un agente en un globulo rojo.

Description

MÉTODO PARA CARGAR UN GLÓBULO ROJO CON UN AGENTE CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un método para cargar un glóbulo rojo con un agente, dicha célula puede ser sensibilizada para ayudar en la liberación del agente.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Normalmente es deseable el suministro de agentes terapéuticos a tejidos específicos para asegurar que una dosis suficientemente alta de un agente dado sea suministrada a un tejido seleccionado. Además, frecuentemente es el caso que el agente terapéutico, aunque ventajosamente tiene efectos terapéuticos benéficos sobre el tejido enfermo, puede tener efectos secundarios indeseables sobre tejidos que no están enfermos. Por ejemplo, en el tratamiento de ciertos tipos de trastornos tales como cáncer es necesario usar una dosis suficientemente alta de un fármaco para destruir las células cancerígenas, sin destruir un número inaceptablemente alto de células normales. De esta manera, uno de los mayores desafíos del tratamiento de una enfermedad es identificar las formas de aprovechar vehículos de suministro celular de fármaco para incorporar y para liberar selectivamente agentes en un sitio objetivo deseado.

Se ha sugerido que los glóbulos rojos pueden ser aprovechados como vehículos de suministro de agente activo/fármaco (DeLoach y Sprandel, 1985, "Bibliotheca Haematologica"; Publ. Karger, Munich), ya que es posible incorporar agentes en glóbulos rojos humanos usando una variedad de técnicas. Un ejemplo de dicha técnica es el aprovechamiento de choque osmótico y modificaciones del mismo tales como choque hipotónico y recuperación subsecuente de isotonicidad y diálisis hipotónica inversa (Luque y Pinilla, 1993, ind. Farmac. 8, 53-59). Un método alternativo para cargar fármacos y agentes activos en glóbulos rojos es la electroporación. Usando este procedimiento, el agente de interés se mezcla con los glóbulos rojos vivos en un medio amortiguador y se aplican pulsaciones cortas de campos eléctricos altos. Las membranas de los glóbulos rojos se hacen transitoriamente porosos y los agentes de interés entran a las células. El procedimiento de electroporación es ventajoso porque se pueden obtener índices de carga muy altos dentro de un período muy corto (Flynn y otros, 1994, Cáncer Letts., 82, 225-229). Cuando se usan sistemas de empaquetamiento/vehículo/suministro, tales como glóbulos rojos, como sistemas de suministro in vivo, tienen la desventaja de que la función de suministro depende tanto de la acumulación de los glóbulos rojos como del rompimiento de la membrana de los glóbulos rojos en el sitio/tejido relevante. Como resultado, se ha intentado incorporar agentes sensibilizadores en los. vehículos celulares para facilitar tanto la acumulación como la liberación de un aQente de interés en un sitio objetivo. A manera de ejemplo, las solicitudes de patente del Reino Unido 9816583.0 y 9826676.0 (incorporadas como referencia) se refieren entre otras cosas a la incorporación de un compuesto colorante tal como una porfirína, que hace a un glóbulo rojo cargado susceptible de tratamiento con luz láser en un sitio objetivo. Este fenómeno, conocido como activación fotodinámica, es aprovechado para lograr la acumulación del vehículo en el sitio relevante y para lograr la liberación de la carga en ese sitio. Se han investigado fuentes alternativas de energía como herramientas para inducir liberación de carga útil de células cargadas y sensibilizadas. A manera de ejemplo, se ha investigado el ultrasonido como una alternativa a la activación fotodinámica inducida por luz, ya que tiene un grado más amplio de foco y penetra más profundamente en el cuerpo. Sin embargo, aunque también se ha aplicado el ultrasonido para efectuar lisis de glóbulos rojos in vitro, su uso ha estado limitado porque su efecto solo es significativo a concentraciones celulares inferiores (1-6x106 células) (Brayman y otros, 1996, Ultrasound in Med & Biol., 22: 497-514). Además, el ultrasonido no es específico en sus efectos, ocasionando lisis de glóbulos rojos tanto cargados como endógenos. Recientemente se ha encontrado que ciertos compuestos colorantes, en particular porfirinas, pueden lograr un efecto citopatogénico cuando el sitio de la enfermedad se somete a ultrasonido. Esta técnica es referida como terapia sonodinámica y se expone en WO98/52609.

WO98/52609 enseña que puede ser útil el ultrasonido en el tratamiento de enfermedad, pero solo cuando se combina con una cantidad efectiva de un agente de modificación de susceptibilidad de ultrasonido tal como una porfirina. En la solicitud de patente del Reino Unido No. 9917416.1 , incorporada como referencia, los autores han mostrado que el tratamiento de glóbulos rojos con un campo eléctrico aumenta su sensibilidad al rompimiento mediado por ultrasonido. Consecuentemente, se puede lograr descarga eficiente de agentes terapéuticos llevados por glóbulos rojos en un sitio de interés con exposiciones más bajas de ultrasonido, reduciendo el posible daño a los glóbulos rojos normales.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Los autores han mostrado ahora, además, que si los glóbulos rojos son sensibilizados previamente antes de un paso de carga de diálisis, se puede obtener cerca de 100% de eficiencia en el paso de carga. Un primer aspecto de la invención se refiere a este hallazgo. Sin embargo, también han encontrado que el paso de carga de diálisis reduce la sensibilidad al ultrasonido de las células cargadas. Esta reducción de sensibilidad puede ser revertida sometiendo las células a un paso de sensibilización adicional, sin importar si el paso adicional es realizado antes o después de la carga. Usando este procedimiento de presensibilización/sensibilización, se pueden producir glóbulos rojos que tienen excelentes características tanto de carga como de sensibilidad al ultrasonido. Consecuentemente, se puede obtener descarga altamente eficiente de agentes terapéuticos llevados por glóbulos rojos en un sitio de interés, a bajas exposiciones de ultrasonido. Esto representa un considerable mejoramiento sobre los métodos de la técnica anterior. La presente invención provee además un método mejorado para liberar selectivamente en un sitio objetivo un agente de un glóbulo rojo cargado, como aspecto adicional. De acuerdo con un primer aspecto de la presente invención, se provee un método de producción de un glóbulo rojo adecuado para suministrar un agente a un vertebrado, el método comprendiendo: (a) proveer un glóbulo rojo; (b) presensibilizar el glóbulo rojo; y (c) cargar el glóbulo rojo con un agente. Preferiblemente, la cantidad de agente que se carga en un glóbulo rojo presensibilizado es mayor que la cantidad cargada en un glóbulo rojo que no está presensibilizado. Muy preferiblemente, el método comprende además el paso de electrosensibilización de la célula para hacerla más susceptible a rompimiento por exposición a un estímulo, el paso de carga y el paso de electrosensibilización siendo realizados en cualquier orden. Se provee, de acuerdo con un segundo aspecto de la presente invención, un método para liberar selectivamente un agente de un glóbulo rojo, que comprende los pasos de: (a) presensibilizar un glóbulo rojo; (b) cargar la célula con un agente; (c) electrosensibilizar la célula; y (d) hacer que ef agente sea liberado de la célula sensibilizada aplicando ultrasonido a una frecuencia y energía suficientes para ocasionar rompimiento de la célula sensibilizada, pero insuficiente para ocasionar rompimiento de glóbulos rojos no sensibilizados, en donde los pasos (b) y (c) se pueden realizar en cualquier orden. Los autores de la presente proveen, de acuerdo con un tercer aspecto de la presente invención, un método para suministrar un agente a un sitio objetivo en un vertebrado, el método comprendiendo un método de acuerdo con el segundo aspecto de la invención, con el paso adicional de introducir la célula en un vertebrado entre los pasos (c) y (d). El glóbulo rojo puede ser PEGilado antes de ser introducido en el vertebrado. Preferiblemente, el vertebrado es un mamífero. En cada uno de los métodos arriba mencionados, el paso de presensibilización o el paso de electrosensibilización, o ambos, pueden ser un procedimiento in vitro o ex vivo. La presensibilización puede comprender un paso de aplicación de un campo eléctrico al glóbulo rojo. Alternativamente o adicionalmente, la presensibilización puede comprender un paso de aplicación de ultrasonido al glóbulo rojo. En una modalidad preferida de la invención, el glóbulo rojo se carga con el agente mediante diálisis hipotónica. Preferiblemente, la electrosensibilización comprende el paso de ^Í.^.??kk^?Éé??^^. ik^?^^ ll*'-A--^^ - -mj|^ aplicar un campo eléctrico al glóbulo rojo. Muy preferiblemente, el campo eléctrico es de aproximadamente 0.1 kV/cm a aproximadamente 10 kV/cm bajo condiciones in vitro. Muy preferiblemente, el campo eléctrico se aplica por entre 1 µs y 100 ms. Cuando donde el glóbulo rojo se somete a electrosensibilización, la electrosensibilización del glóbulo rojo se puede realizar después de la carga del agente. Alternativamente, la electrosensibilización del glóbulo rojo se realiza antes de la carga del agente. El ultrasonido se puede seleccionar del grupo que consiste de ultrasonido diagnóstico, ultrasonido terapéutico o una combinación de ultrasonido diagnóstico y terapéutico. Preferiblemente, la fuente de energía de ultrasonido aplicada está a un nivel de potencia de aproximadamente 0.05 W/cm2 a aproximadamente 100 W/cm2. Como un cuarto aspecto de la presente invención, se provee un vector de suministro de glóbulo rojo que ha sido presensibilizado a fin de que sea susceptible de ser cargado con una cantidad más grande de agente que un glóbulo rojo que no ha sido presensibilizado. Preferiblemente, el vector de suministro de glóbulo rojo ha sido presensibilizado por exposición a un campo eléctrico y/o ultrasonido. Muy preferiblemente, se sensibiliza el vector de suministro de glóbulo rojo para hacerlo más susceptible de rompimiento por exposición a un estímulo. De preferencia, el vector de suministro de glóbulo rojo se carga con un agente para ser suministrado. El agente se selecciona preferiblemente del grupo que consiste de una proteína, un polipéptido, un péptido, un ácido nucleico, un ácido nucleico peptídico (PNA), un virus, una partícula similar a virus, un nucleótido, un ribonucleótido, un desoxirribonucleótido, un desoxirribonucleótido modificado, un heterodúplex, una nanopartícula, un análogo sintético de un nucleótido, un análogo sintético de un ribonucleótido, un nucleótido modificado, un ribonucleótido modificado, un aminoácido, un análogo de aminoácido, un aminoácido modificado, un análogo de aminoácido modificado, un esteroide, un proteoglicano, un lípido, un ácido graso, un oligoscárido, una glicoproteína, un carbohidrato, y mezclas, fusiones, combinaciones o conjugados de los anteriores. El agente puede estar conjugado, fusionado, mezclado o combinado con un agente de imagen. Los autores de la presente proveen, de acuerdo con un quinto aspecto de la presente invención, un vector de suministro de glóbulo rojo obtenible por medio de un método que comprende: (a) presensibilizar un glóbulo rojo por medio de electrosensibilización de la célula; (b) cargar la célula con un agente; y (c) electrosensibilizar la célula, en donde los pasos (b) y (c) se pueden realizar en cualquier orden. La presente invención, en un sexto aspecto, provee el uso de un campo eléctrico y/o ultrasonido para incrementar la eficiencia de carga de un agente en un glóbulo rojo. Preferiblemente, la eficiencia de carga de una célula presensibilizada es de 50% o más alta, de preferencia 60% o más alta, de preferencia 70% o más alta, muy de preferencia 80% o más alta. En i eiergía suficientes para ocasionar el rompimiento de la célula sensibilizada, pero insuficiente para ocasionar el rompimiento de glóbulos rojos no sensibilizados, en donde los pasos (b) y (c) se pueden realizar en cualquier orden. Se provee, de acuerdo con un décimo aspecto de la invención, un equipo que comprende un glóbulo rojo presensibilizado que se carga con un agente, materiales de embalaje para el mismo e instrucciones de uso en un método que comprende los pasos de: (a) electrosensibilizar la célula; y (b) hacer que el agente sea liberado de la célula sensibilizada aplicando ultrasonido a una frecuencia y energía suficientes para ocasionar el rompimiento de la célula sensibilizada, pero insuficientes para ocasionar el rompimiento de glóbulos rojos no sensibilizados. Como un undécimo aspecto de la invención, los autores proveen un equipo que comprende un vector de suministro de glóbulo rojo de acuerdo con el quinto aspecto de la invención, materiales de embalaje para el mismo e instrucciones de uso que comprenden el paso de ocasionar que el agente sea liberado del vector de suministro de glóbulo rojo, aplicando ultrasonido a una frecuencia y energía suficientes para ocasionar rompimiento del vector de suministro de glóbulo rojo, pero insuficientes para ocasionar rompimiento de glóbulos rojos no sensibilizados. Preferiblemente, el equipo comprende también polietilenglicol. Muy preferiblemente, el equipo comprende también un líquido seleccionado del grupo que consiste de un regulador de pH, un diluyente u otro excipiente.

El líquido se puede seleccionar del grupo que consiste de un regulador de pH salino, un regulador de pH fisiológico, suero y plasma. Los autores de la presente proveen, de acuerdo con un duodécimo aspecto de la invención, una composición farmacéutica que comprende un glóbulo rojo preparado mediante un método de acuerdo con el primero, segundo o tercer aspecto de la invención, o un vector de suministro de glóbulo rojo de acuerdo con el cuarto o quinto aspecto de la invención, junto con un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. Se provee además un método y/o un vector de suministro de glóbulo rojo y/o un equipo y/o una composición farmacéutica sustancialmenté como se describen en la presente y con referencia a los ejemplos y figuras. Además, los autores proveen un dispositivo para producir un vector de suministro de glóbulo rojo de la presente invención, dicho dispositivo comprende: (a) una o más celdas de flujo y medios de electrosensibilización; (b) uno o más sistemas de diálisis; en donde la celda de flujo se une al sistema de diálisis mediante medios de conexión capaces de permitir la transferencia de glóbulos rojos de la celda de flujo al sistema de diálisis y viceversa. Opcionalmente, el dispositivo puede comprender más de una celda de flujo, por ejemplo dos celdas de flujo. El dispositivo también puede estar conectado a un dispositivo de recolección tal como una bolsa para sangre. En una modalidad preferida, el dispositivo también está conectado a una estación de cromatografía y/o filtración a fin de purificar los glóbulos rojos j-f?- • n tT A->tHt ¡? ^j ?ío alterar la composición de regulador de pH en la cual están suspendidas las células, después del procedimiento de sensibilización final.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1A muestra perfiles de citometría de flujo obtenidos después del análisis de eritrocitos humanos cargados con un oligonucleótido marcado fluorescentemente. El eje X representa la intensidad de fluorescencia exhibida por las células en cada preparación y el eje Y representa el número de recuentos detectados por el citómetro de flujo a una intensidad de fluorescencia dada. El control (indicado por RBC) representa el perfil exhibido por eritrocitos humanos que se habían puesto en contacto con el oligonucleótido. El movimiento del pico de la electroporación a la derecha es indicativo de la carga del oligonucleótido en la preparación. La figura 1B muestra perfiles de citometría de flujo obtenidos después de análisis de preparaciones celulares cargadas con oligonucleótido, usando diálisis convencional (-•-) y electropulsación combinada con diálisis (diálisis de Gendel, — ). Las muestras de control consisten de eritrocitos humanos solos (RBC) y eritrocitos junto con oligonucleótido sin ningún tratamiento adicional (oligo sin diálisis). El eje X representa la intensidad de fluorescencia y el eje Y representa el número de recuentos detectados a cualquier intensidad de fluorescencia dada. La figura 2A muestra perfiles de citometría de flujo obtenidos después del análisis de eritrocitos humanos cargados con anticuerpo marcado con FITC por medio de electroporación ( D) (pulsación de caída exponencial). La muestra de control (RBC+ab) representa el perfil exhibido por células expuestas a anticuerpo en ausencia de una pulsación de electroporación. El eje X representa la intensidad de fluorescencia y el eje Y representa el número de recuentos detectados a cualquier intensidad de fluorescencia dada. La figura 2B muestra perfiles de citometría de flujo obtenidos después del análisis de eritrocitos humanos cargados con anticuerpo marcado con FITC por medio de electroporación ( D) (pulsación de onda cuadrada). La muestra de control (RBC+ab) representa el perfil exhibido por células expuestas a anticuerpo en ausencia de una pulsación de electroporación. El eje X representa la intensidad de fluorescencia y el eje Y representa el número de recuentos detectados a cualquier intensidad de fluorescencia dada. La figura 3 muestra perfiles de citometría de flujo obtenidos después del análisis de eritrocitos humanos cargados con anticuerpo marcado con FITC mediante diálisis publicada convencional ( D) y mediante el procedimiento de diálisis que se describe en el ejemplo 1 ( D). El eje X representa la intensidad de fluorescencia y el eje Y representa el número de recuentos detectados a cualquier intensidad de fluorescencia dada. La figura 4 muestra perfiles de citometría de flujo obtenidos después del análisis de eritrocitos humanos cargados con anticuerpo marcado cero, indicando que la carga útil se retuvo en todo el período de almacenamiento. El eje X representa la intensidad de fluorescencia y el eje Y representa el número de recuentos detectados a cualquier intensidad de fluorescencia dada. La figura 8 es una gráfica que muestra la liberación mediada por ultrasonido de anticuerpo del vehículo de eritrocito. El eje X es densidad de potencia (W/cm2); el eje Y izquierda: µg de anti-vWF liberado (por 7x107 células tratadas con ultrasonido); eje Y derecha: porcentaje de células usadas por ultrasonido. Los cuadrados en negro representan µg de anticuerpo, células cargadas; los triángulos en negro representan µg de anticuerpo, células de control; los cuadrados en blanco representan % de lisis, células cargadas; los triángulos en blanco representan % de lisis, células de control. La figura 9 es una gráfica que muestra liberación mediada por ultrasonido de ß-galactosidasa del vehículo de eritrocito. Eje X: densidad de potencia (W/cm2), eje Y izquierda: porcentaje de lisis; eje Y derecha: % relativo de liberación de enzima. Los cuadrados en negro representan lisis de control, los triángulos en negro representan lisis de la muestra y los diamantes en negro representan liberación de la muestra (esto es, liberación de la enzima). La figura 10 es una gráfica que muestra liberación mediada por ultrasonido de oligonucleótido del vehículo de eritrocito. Eje X: densidad de potencia (W/cm2), eje Y izquierda: porcentaje de lisis celular; eje Y derecha: % de liberación de oligonucleótido. Los cuadrados en negro representan lisis de tma»a*iÉé*íiÉ ! — , — , imán DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Sensibilización/Presensibilización En el método de la presente invención las células se someten a por lo menos dos pasos de sensibilización, uno de los cuales se debe realizar antes del paso de carga o simultáneamente con el mismo, preferiblemente antes del paso de carga. Por esta razón, el primer paso de sensibilización es referido aquí como un paso de presensibilización. La finalidad del paso de presensibilización es incrementar la carga del agente, aunque también se puede lograr un incremento en la sensibilidad a la lisis mediada por ultrasonido. Los pasos adicionales de sensibilización se pueden realizar en cualquier paso del proceso después del paso de presensibilización. La finalidad del paso o pasos de sensibilización adicional es aumentar la sensibilidad de las células al ultrasonido. En dos modalidades particulares que se ejemplifican en la presente, se lleva a cabo un segundo paso de sensibilización antes del paso de presensibilización, pero antes de la carga por diálisis, o después de la carga por diálisis. Se pueden realizar más pasos de sensibilización según se requiera. Generalmente, los pasos de sensibilización y el paso de carga se separan temporalmente. Por ejemplo, normalmente las células se dejan reposar en regulador de pH tal como regulador de pH PBS/Mg/glucosa, durante al menos 30 minutos, preferiblemente al menos 60 minutos después *.**i ¿*M±**?* ?.*t*í ¿?¡ 7.?'?7 .Z. ' " * " k*& ¿Lá, íii de un paso de presensibilización, para permitir a las células recuperarse antes de los pasos de carga o sensibilización ulterior. Puede ser conveniente dejar reposar las células por varias horas, por ejemplo durante la noche, después del paso de carga. El paso de presensibilización aumenta la eficiencia de carga 6e un agente en un glóbulo rojo, en comparación con un glóbulo rojo que no ha sido sometido a presensibilización. La presensibilización puede tomar la forma de un paso de electrosensibilización, como se describe más aba o. Alternativamente o adicionalmente, la presensibilización se puede efectuar usando ultrasonido, como se describe más abajo y se muestra en los ejemplos. Se pueden usar otros métodos para presensibilizar células y aumentar la eficiencia de carga. Por ejemplo, se puede usar radiación electromagnética tal como microondas, ondas de radio, rayos gamma y rayos X. Además, se puede contemplar el uso de agentes químicos tales como DMSO y pirrolidinona. Adicionalmente, se puede impartir energía térmica a tos glóbulos rojos para presensibilizarlos. Esto se puede lograr elevando la temperatura de los glóbulos rojos por medios convencionales, por medio de choque de calor o mediante el uso de irradiación de microondas. En general, cualquier método que permita formar poros en la membrana de superficie de un glóbulo rojo, es un candidato adecuado para usar como un paso de presensibilización. Preferiblemente, el paso de sensibilización comprende un procedimiento de electrosensibilización como se describe a continuación. Los autores han encontrado que la eficiencia de sensibilización para parámetros eléctricos dados varía dependiendo de la densidad celular, y por lo tanto puede ser necesario realizar una titulación de densidad celular y/o parámetros eléctricos para establecer la concentración óptima. A manera de guía, los autores han encontrado que las células sensibilizadas a una densidad de aproximadamente 6-8x108 células/ml tienen buena sensibilidad al ultrasonido.

Electrosensibilización La presente invención abarca el uso de un campo eléctrico para sensibilizar un glóbulo rojo al ultrasonido ("electrosensibilización"). También se puede usar electrosensibiiización como un medio para presensibilizar glóbulos rojos. El término "electrosensibilización" abarca la desestabiiización de células sin causarles daño fatal. De acuerdo con este método, una exposición momentánea de una célula a una o más pulsaciones de campo eléctrico de alta fuerza provoca desestabilización de la membrana. La fuerza del campo eléctrico se ajusta hacia arriba o hacia abajo, dependiendo respectivamente de la elasticidad o la fragilidad de las células que se cargan y de la fuerza iónica del medio en el cual están suspendidas las células. La electrosensibilización incluye típicamente el uso de campos eléctricos que no poseen suficiente energía para electroporar las células. La electroporación, que facilita el pasaje de agentes hacia la célula sin pérdida significativa de contenido celular o viabilidad celular, es bien conocida en la srtfe y, aparte de los niveles de energía implicados, es similar a la electrosensibilización. En realidad, las células que se someten a electroporación se convierten en electrosensibilizadas. Sin embargo, la electrosensibilización se puede llevar a cabo a niveles de energía que son insuficientes para electroporar la célula y permitir el paso de sustancias a través de la pared celular y/o la membrana celular. En una modalidad muy preferida de la presente invención, la electrosensibilización de los glóbulos rojos se lleva a cabo a estos niveles de energía. La electroporación se ha usado en procedimientos tanto in vitro como in vivo para introducir material ajeno en células vivas. Con las aplicaciones in vitro, primero, una muestra de células vivas se mezcla con el agente de interés y se coloca entre electrodos tales como placas paralelas. Después, los electrodos aplican un campo eléctrico a la mezcla célula/implante. Ejemplos de sistemas que realizan electroporación in vitro incluyen el producto Electro Cell Manipulator ECM600, y el Electro Square Porator T820, ambos provistos por la BTX División de Genetronics Inc. (véase la patente de E.U.A. No. 5,869,326). Estas técnicas de electroporación conocidas (tanto in vitro como in vivo) funcionan aplicando una pulsación breve de voltaje alto a electrodos colocados alrededor de la región de tratamiento. El campo eléctrico generado entre los electrodos ocasiona que las membranas se hagan temporalmente porosas, después de lo cual las moléculas del agente de interés entran a las células. En aplicaciones de electroporación conocidas, este campo eléctrico comprende una sola pulsación dé onda cuadrada del orden de 1 kV/cm, de aproximadamente 100 µs de duración. Dicha pulsación puede ser generada, por ejemplo, en aplicaciones conocidas del Electro Square Porator T820. La electrosensibilización se puede realizar de una manera sustancialmente idéntica al procedimiento seguido para electroporación, con la excepción de que se pueden usar fuerzas más bajas de campo eléctrico, como se indica abajo. En un aspecto preferido de la presente invención, el campo eléctrico tiene una fuerza de aproximadamente 0.1 kV/cm a aproximadamente 10 kV/cm bajo condiciones in vitro, de preferencia aproximadamente 1.5 kV/cm a aproximadamente 4.0 kV/cm bajo condiciones in vitro. Muy preferiblemente, la fuerza del campo eléctrico es de aproximadamente 3.625 kV/cm bajo condiciones in vitro. Preferiblemente, el campo eléctrico tiene una fuerza de aproximadamente 0.1 kV/cm a aproximadamente 10 kV/cm bajo condiciones in vivo (véase WO97/49450). De preferencia, la fuerza del campo eléctrico es de aproximadamente 3.625 kV/cm bajo condiciones in vitro. Preferiblemente, la aplicación del campo eléctrico es en la forma de pulsaciones múltiples tales como pulsaciones dobles de la misma fuerza y capacitancia, o pulsaciones secuenciales de fuerza y/o capacitancia variable. Un tipo preferido de pulsación secuencial comprende suministrar una pulsación de menos de 1.5 kV/cm y una capacitancia mayor de 5 µF, seguida por una pulsación de más de 2.5 kV/cm y una capacitancia de menos de 2 µF, seguida por otra pulsación de menos de 1.5 kV/cm y una capacitancia de más de 5 µF. Un ejemplo particular es 0.75 kV/cm, 10 µF; 3.625 kV/cm, 1 µF y 0.75 kV/cm, 10 µF. Preferiblemente, la pulsación eléctrica se suministra como una forma de onda seleccionada de una forma de onda exponencial, una forma de onda cuadrada y una forma de onda modulada. Como se usa aquí, el término "pulsación eléctrica" incluye una o más pulsaciones a capacitancia y voltaje variables, e incluye onda exponencial y/o cuadrada y/o formas de onda moduladas. Se usan ampliamente otros procedimientos de electroporación y métodos que emplean dispositivos de electroporación en cultivo de células, y la instrumentación apropiada es bien conocida en la técnica. En una modalidad particularmente preferida se usa el siguiente protocolo de electrosensibilización. Las células se suspenden en PBS para producir concentraciones de aproximadamente 6-8x108 células/ml; se dispensan alícuotas de 0.8 ml en cubetas de electroporación estériles (0.4 cm de espacio de electrodo) y se retienen sobre hielo durante 10 minutos. Después se expone a las células a una estrategia de sensibilización que incluye el suministro de dos pulsaciones eléctricas (fuerza del campo= 3.625 kV/cm, a una capacitancia de 1 µF) usando un aparato BioRad Gene Pulser. Inmediatamente se lavan las células con PBS conteniendo MgCI2 (4 mM) (PBS/Mg) y se retienen a temperatura ambiente durante por lo menos 30 minutos en el regulador de pH PBS/Mg a una concentración de 7x108 élula$/ml piara facilitar resellado. Opcionalmente, las células sé lavan subsecuentemente y se suspenden a una concentración de 7x108 células/ml en PBS/Mg conteniendo glucosa 10 mM (PBS/Mg/glucosa) durante por lo menos 1 hora.

Presensibilización usando ultrasonido Como se indicó arriba, se puede usar ultrasonido para presensibilizar glóbulos rojos. Dicho uso de ultrasonido también es referido aquí como "sonoporación". Se cree que la exposición de glóbulos rojos a ultrasonido resulta en poración no destructiva y transitoria de la membrana (Miller y otros, 1998, Ultrasonics 36, 947-952). Como se usa aquí, el término "ultrasonido" se refiere a una forma de energía que consiste de vibraciones mecánicas cuyas frecuencias son tan altas que están por arriba de la escala de la audición humana. El límite de frecuencia más bajo del espectro ultrasónico se puede tomar generalmente como de aproximadamente 20 kHz. La mayoría de aplicaciones diagnósticas de ultrasonido emplean frecuencias en la escala de 1 a 15 MHz (de "Ultrasonics in Clinical Diagnosis", editado por PNT Wells, 2a. edición, Publ. Churchill Livingstone [Edinburgh, Londres y NY, 1977]. El ultrasonido se ha usado en aplicaciones tanto diagnósticas como terapéuticas. Cuando se usa como una herramienta diagnóstica ("ultrasonido diagnóstico"), el ultrasonido se usa típicamente en una escala de densidad de energía de hasta aproximadamente 100 mW/cm2 (recomendación de la FDA), aunque se han usado densidades de energía de hasta 750 mW/cm2. En fisioterapia, el ultrasonido se usa típicamente como una fuente de energía en una escala de hasta aproximadamente 3 a 4 W/cm2 (recomendación de la OMS). En otras aplicaciones terapéuticas se pueden emplear intensidades más altas de ultrasonido, por ejemplo, HIFU de 100 W/cm2 hasta 1 kW/cm2 (o incluso más alta) durante períodos cortos. El término "ultrasonido" como se usa en esta especificación abarca ultrasonido diagnóstico, terapéutico y enfocado. El ultrasonido enfocado (FUS) permite la liberación de energía térmica sin una sonda invasiva (véase Morocz y otros, 1998, Journal of Magnetic Resonance Imaging, Vol. 8, No.1 pp. 136-142). Otra forma de ultrasonido enfocado es el ultrasonido enfocado de alta intensidad (HIFU), el cual es revisado por Moussatov y otros en Ultrasonics, 1998, Vol. 36 No. 8, pp. 893-900, y TranHuuHue y otros en Acústica, Vol. 83, No.6, pp. 1103-1106. Preferiblemente, los glóbulos rojos son presensibilizados por exposición a ultrasonido que tiene una densidad de energía en la escala terapéutica. En una modalidad altamente preferida, el tratamiento es a 2.5 W/cm2 durante 5 minutos usando una cabeza de ultrasonido de 1 MHz. Esta combinación, sin embargo, no se considera limitativa. En realidad se pueden usar varias combinaciones de frecuencia, densidad de energía y tiempo de exposición para presensibilizar los glóbulos rojos a fin de aumentar su eficiencia de carga.

Carga Como se usa aquí, el término "carga" se refiere a introducir en un * glóbulo rojo por lo menos un agente. El agente puede ser cargado en el glóbulo rojo internándolo en el mismo, fijándolo a la superficie o andándolo en la membrana plasmática dei glóbulo rojo. Cuando el agente se fija o ancla a la membrana plasmática, la carga se puede lograr entrelazando el agente con cualquier molécula de la superficie celular. Alternativamente, el agente se puede conjugar o fusionar con un anticuerpo específico para una molécula de superficie celular. Se puede cargar un glóbulo rojo con más de un agente de tal manera que los agentes son cargados individualmente (en secuencia) o juntos (simultáneamente o concurrentemente). Generalmente, la carga se realiza en un procedimiento separado al procedimiento de "sensibilización". Los agentes se pueden mezclar primero en el momento del contacto con los glóbulos rojos o antes de ese momento. De acuerdo con la presente invención, los glóbulos rojos se cargan después del procedimiento de sensibilización o después de uno o más procedimientos de sensibilización, preferiblemente después de que las células han reposado. En esta modalidad, la carga se puede realizar mediante cualquier técnica deseada. Por lo tanto, la presente invención abarca la sensibilización de una célula presensibilizada y cargada. También abarca la carga de una célula presensibilizada y subsecuentemente sensibilizada. La carga se puede realizar por medio de un procedimiento seleccionado del grupo que consiste de electroporación, iontoforesis, sonoporación, microinyección, precipitación con calcio, intercalación de membrana, bombardeo de micropartículas, transfección mediada por lípido, infección viral, osmosis, pulsación osmótica, choque osmótico, difusión, endocitosis, fagocitosis, entrelazamiento con un componente de la superficie de un glóbulo rojo, entrelazamiento químico, perforación/restauración mecánica de la membrana plasmática por corte, inyección de célula única o una combinación de los mismos. La sonoporación como método para cargar un agente en una célula se describe por ejemplo en Miller y otros (19T8), Ultrasonics 36, 947-952. La iontoforesis utiliza corriente eléctrica para activar y para modular la difusión de una molécula cargada a través de una membrana biológica, tal como la piel, de una manera similar a la difusión pasiva bajo un gradiente de concentración, pero a una velocidad facilitada. En general, la tecnología de iontoforesis utiliza un potencial o corriente eléctrica a través de una barrera semipermeable. A manera de ejemplo, se ha mostrado el suministro de moléculas de heparina a pacientes usando iontoforesis, una técnica que utiliza baja corriente (c.d.) para impulsar especies cargadas en la pared arterial. La tecnología de iontoforesis y referencias relativas a la misma se describen en WO 97/49450. En una modalidad muy preferida, el glóbulo rojo es presensibilizado por electrosensibilización y cargado usando choque osmótico. Si se emplea más de un agente, se puede usar la misma técnica o una diferente para cargar el segundo agente en el glóbulo rojo. Preferiblemente, los glóbulos rojos de la presente invención son presensibilizados, sensibilizados y cargados in vitro o ex vivo. Preferiblemente, la carga se lleva a cabo por medio de un procedimiento de choque osmótico. El término "choque osmótico" se usa aquí como sinónimo del término "diálisis hipotónica" o "diálisis hipoosmótica". Un método preferido de choque osmótico/diálisis hipotónica se describe en los ejemplos y se basa en el método descrito por Eichler y otros, 1986, Res. Exp. Med. 186: 407-412. Este método preferido es como sigue. Se suspenden glóbulos rojos lavados en 1 ml de PBS (NaCI 150 mM, K2HPO4/KH2PO4 5 mM; pH 7.4) para obtener un hematocrito de aproximadamente 60%. La suspensión se coloca en tubería de diálisis (corte de peso molecular 12-14,000; Spectra-Por; preparada como se describe abajo) y el hinchamiento de las células se obtiene por diálisis contra 100 ml de K2HPO4/KH2PO4 5 mM, pH 7.4 durante 90 minutos a 4°C. El resellado se logra por diálisis subsecuente durante 15 minutos a 37°C contra 100 ml de PBS conteniendo glucosa 10 mM. Después se lavan las células en PB enfriado con hielo conteniendo glucosa 10 mM, usando centrifugación. Otros procedimientos de choque osmótico incluyen el método descrito en la patente de E.U.A. No. 4,478,824. Ese método incluye incubar una fracción de glóbulo rojo empaquetada en una solución que contiene un compuesto (tal como sulfóxido de dimetilo (DMSO) o glicerol) que se difunde rápidamente hacia adentro o hacia fuera de las células, creando rápidamente un gradiente osmótico de transmembrana por dilución de la suspensión de glóbulo rojo en solución con un medio acuoso casi isotónico. Este medio contiene un agente aniónico por introducir (tal como monofosfato de inosina o un inositol fosforilado, por ejemplo hexafosfato de inositol) que puede ser un efector alostérico de hemoglobina, causando así difusión de agua hacia las Células con hinchamiento consecuente de las mismas y aumento de la permeabilidad de las membranas externas de las células. Este aumento en permeabilidad es mantenido durante un período suficiente solo para permitir el transporte del agente aniónico hacia las células y la difusión del compuesto fácilmente difundible fuera de las células. Este método es de efectividad limitada cuando el agente que se desea cargar a las células no es aniónico, o es aniónico o polianiónico pero no está presente en el medio acuoso, casi isotónico, en concentración suficiente para ocasionar el incremento necesario en permeabilidad celular sin destrucción de la célula. La patente de E.U.A. No. 4,931,276 y WO 91/16080 también •describen métodos de carga de glóbulos rojos con agentes seleccionados usando una técnica de choque osmótico. Por lo tanto, estas técnicas se pueden usar para hacer posible la carga de los glóbulos rojos en la presente invención. Agentes efectivos que se pueden cargar ventajosamente en glóbulos rojos usando el método modificado provisto en la patente de E.U?. No. 4,931 ,276, incluyen péptidos, análogos de purina, análogos de pirimidina, agentes químioterapéuticos y agentes antibióticos. Estos agentes frecuentemente presentan problemas de suministro farmacológico. Los compuestos específicos incluyen, sin limitación, triptofano, fenilalanina y otros compuestos aminoácidos solubles en agua. Varios derivados de los análogos no naturales de las bases de ácido nucleico adenina, guanina, citosina y timina son bien conocidos como agentes terapéuticos útiles, por ejemplo 6- mercaptopurina (6MP) y azatioprina, que son usados comúnmente como inmunosupresores e inhibidores de crecimiento celular maligno, y azidotimidina (AZT) y análogos de la misma que son útiles como agentes antivirales, particularmente en el tratamiento de SIDA. Se ha mostrado que la acción de estos derivados de base no naturales depende de la conversión intracelular de los mismos a formas fosforiladas (Chan y otros, 1987, Pharmacology, 7: 165; 14 177; también Mitsuya y otros, 1986, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 83: 1911-1915). Un procedimiento de choque osmótico alternativo se describe en la patente de E.U.A. No. 4,931,276, que se incorpora aquí como referencia. Alternativamente, la carga se puede llevar a cabo por medio de un procedimiento de bombardeo de micropartículas. El bombardeo de micropartículas abarca recubrir partículas de oro con el agente a cargar, espolvorear las partículas sobre una bala calibre 22, y disparar la bala en un escudo de restricción hecho de un material a prueba de balas y que tiene un agujero más pequeño que el diámetro de la bala, de tal manera que las partículas de oro continúan en movimiento hacia las células in vitro y después > de hacer contacto con las Gélulas, perforarlas y suministrar ia carga útil al citoplasma de las células. Será apreciado por un experto en la materia que se pueden usar combinaciones de métodos para facilitar la carga de un glóbulo rojo con igent.es de interés de acuerdo con la invención. Asimismo, será apreciado ue se puede cargar un primero y un segundo agente de manera concurrente o secuencial, en cualquier orden, en un glóbulo rojo en cualquier método de la presente invención. Como sería evidente para un experto en la materia, se pueden usar cualquiera de una o más de las técnicas anteriores para cargar glóbulos rojos para usar en la invención, ya sea antes, de forma simultánea, separadamente o en secuencia con el procedimiento de sensibilización. Por ejemplo, la patente de E.U.A. No. 4,224,313 describe un procedimiento para preparar una masa de células cargadas suspendidas en una solución, aumentando la permeabilidad de las membranas celulares mediante presión osmótica o un campo eléctrico, o ambos, cargando los agentes por paso de una solución a través de las membranas de permeabilidad incrementada, restaurando la permeabilidad original sellando las membranas por efecto de regeneración, y separando las células de la solución en la cual se suspendieron. En ese procedimiento, los agentes en solución que se cargan incluyen (i) una sustancia farmacéutica que reacciona químicamente o físicamente con sustancias en el medio extracelular y que, cuando se carga en la célula destruiría prematuramente las membranas celulares, y (ii) por lo ffienos un azúcar y proteína compatibles con la sangre, capaces de proveer unión de puente de hidrógeno o de entrar en enlaces covalentes con la sustancia farmacéutica, inhibiendo así la reacción de la sustancia farmacéutica con las membranas celulares. Será apreciado por un experto en la materia que se pueden usar combinaciones de métodos para facilitar la carga de un glóbulo rojo con agentes de interés de acuerdo con la invención. Similarmente» será apreciado que se puede cargar un primero y un segundo agente de maneja concurrente o secuencíal, en cualquier orden, en un glóbulo rojo en cualquier método de la presente invención. Puede ser necesario optimizar la concentración de agente usada en el procedimiento de carga. Por ejemplo, los autores de la presente han mostrado que un anticuerpo FITC-lgG obtiene buena carga a concentraciones de 0.1 mg/ml a 2 mg/ml. Preferiblemente, la carga tiene lugar durante un período de por lo menos 30 minutos, muy preferiblemente alrededor de 90 minutos.

Liberación selectiva usando ultrasonido De acuerdo con la invención, los agentes que se cargan en un glóbulo rojo son liberados del glóbulo rojo en sus alrededores, en este caso o an o hacia el sitio, tejido o célula objetivo, mediante la aplicación de ultrasonido dirigido a un sitio, tejido y/o célula objetivo. Además, el agente puede ser suministrado al sitio objetivo por aplicación de ultrasonido a los vasos, por ejemplo los vasos sanguíneos, que alimentan el sitto objetivo. Se presentó arriba una exposición general sobre ultrasonido, incluyendo tipos diferentes de ultrasonido (por ejemplo ultrasonido diagnóstico, terapéutico y enfocado). Preferiblemente se emplea una combinación de ultrasonido diagnóstico y ultrasonido terapéutico para efectuar liberación selectiva. Esta combinación no se considera limitativa, sin embargo, y el lector experto apreciará que se puede usar cualquier variedad de combinaciones de ultrasonido. Adicionalmente se puede variar la densidad de energía, frecuencia de ultrasonido y período de exposición. Lo que es importante es que la aplicación de ultrasonido pueda romper selectivamente los glóbulos rojos sensibilizados para efectuar liberación del agente, sin romper ni dañar sustancialmente glóbulos rojos endógenos. De preferencia, el ultrasonido se aplica a una célula objetivo o a un tejido objetivo con la fuerza suficiente para romper glóbulos rojos cargados y sensibilizados, pero sin dañar el tejido objetivo ni los tejidos circundantes. En este contexto, el término "daño o dañar" no incluye una permeabilización transitoria del sitio objetivo por medio de la fuente de energía de ultrasonido. Dicha permeabüización puede facilitar ia incorporación de la carga útil liberada en el sitio objetivo. Preferiblemente, la exposición a una fuente de energía de ultrasonido es a una densidad de energía de aproximadamente 0.05 a aproximadamente 100 Wcm'2. Muy preferiblemente, la exposición a una fuente de energía de ultrasonido es a una densidad de energía de aproximadamente 1 a aproximadamente 15 Wcrt?2. Preferiblemente, la exposición a una fuente de energía de ultrasonido es a una frecuencia de aproximadamente 0.015 a aproximadamente 10.0 MHz. Muy preferiblemente, la exposición a una fuente de energía de ultrasonido es a una frecuencia de aproximadamente 0.02 a aproximadamente 5.0 MHz. Preferiblemente, la exposición es por períodos de aproximadamente 10 milisegundos a aproximadamente 60 minutos. Muy preferiblemente, la exposición es por períodos de aproximadamente 1 segundo a aproximadamente 5 minutos. Dependiendo de la cantidad de agente que se desea liberar, sin embargo, la exposición puede ser por un período más prolongado, por ejemplo 15 minutos. Particularmente se prefiere exponer al paciente a una fuente de energía de ultrasonido a una densidad de energía acústica de aproximadamente 0.05 Wcm*2 a aproximadamente 10 Wcm"2 con una frecuencia variando de aproximadamente 0.015 a aproximadamente 10 MHz (véase WO 98/52609). Sin embargo, también son posibles alternativas, por ejemplo, exposición a una fuente de energía de ultrasonido a una densidad de energía acústica de más de 100 Wcm*2, pero por períodos reducidos, por ejemplo 1000 Wcm"2 durante períodos en la escala de mllisegundos o menos. El uso de ultrasonido es ventajoso ya que, como la luz, puede ser enfocado exactamente sobre un objetivo. Además, el ultrasonido es ventajoso porque pude ser enfocado más profundamente hacia los tejidos, a üferencia de la luz. Por lo tanto, es más adecuado para penetración completa de tejido (por ejemplo, sin limitación, un lóbulo del hígado) o suministro al órgano completo (por ejemplo, sin limitación, todo el hígado o un músculo completo tal como el corazón) de agentes de acuerdo con la presente invención. Además, el ultrasonido puede inducir una permeabilización transitoria del sitio objetivo de tal manera que facilita la incoforación de una carga útil liberada en el sitio objetivo. Otra importante ventaja es que el ultrasonido es un estímulo no invasor que se usa en una amplia variedad de aplicaciones diagnósticas y terapéuticas. A manera de ejemplo, el ultrasonido es bien conocido en técnicas de imagenología médica y adicionalmente en terapia ortopédica. Además, los instrumentos adecuados para la aplicación de ultrasonido a un sujeto vertebrado están ampliamente disponibles y su uso es bien conoddo en la técnica. En los métodos de la invención, la liberación del agente es efectuada por exposición de glóbulos rojos, ya sea in vitro o ex vivo a una cantidad efectiva de una fuente de energía de ultrasonido diagnóstico o una fuente de energía de ultrasonido terapéutico, como se describe en la patente de E.U.A. No. 5558092 y WO 94/28873. El agente que es liberado de un glóbulo rojo para usar en la presente invención puede ser referido como la "carga útil" de esa célula. Preferiblemente, el agente es liberado del glóbulo rojo por tratamiento de un sitio, tejido o célula objetivo con ultrasonido.

La liberación selectiva del agente en el sitio objetivo se puede determinar observando (a) la cantidad que se ha liberado en el sitio, tejido o célula objetivo, y (b) su efecto sobre el sitio, tejido o célula objetivo, este último determinando si el suministro se debe incrementar, disminuir ^descontinuar.

Células de la sanare En una modalidad de la presente invención, los glóbulos rojos que se pueden cargar y administrar a un vertebrado de acuerdo con la invención se obtienen idealmente del individuo receptor considerado, antes de del procedimiento, a fin de asegurar completa inmunocompatibilidad. Alternativamente, las células se obtienen de un segundo individuo de la misma especie que el receptor; en tal caso, el segundo individuo debe compartir el tipo de sangre del receptor considerado o debe tener un tipo de sangre ínmunoneutra, tal como el tipo O en humanos. Alternativamente, el glóbulo rojo puede tener sus determinantes inmunológicos enmascarados por una sustancia tal como PEG y/o modificados por ejemplo por medio de una o más enzimas. Como se usa aquí, el término "glóbulo rojo" se refiere a glóbulo rojo vivo, sin núcleo (esto es, un eritrocito maduro) de un vertebrado. Preferiblemente, el glóbulo rojo es un glóbulo rojo de mamífero, convenientemente un glóbulo rojo humano. Como se usa aquí, "mamífero" se refiere a un miembro de la clase de Mammalía que incluye, sin limitación, un roedor, lagomorfo, cerdo o primate. Preferiblemente, el mamífero es un humano. Como se usa aquí, el término "introducción" incluye sin limitación > la administración de un glóbulo rojo y/o un agente en un vertebrado. £ ' Como se usa aquí con respecto a la administración de un agente a un vertebrado, el término "introducir" incluye sin limitación hacer que el agente entre al sistema circulatorio del vertebrado por transfusión o infusión del agente a un sitio objetivo. Se contempla que una aguja hueca, tal como una aguja o cánula hipodérmica se inserta a través de la pared de un vaso sanguíneo (por ejemplo una vena o arteria) y el glóbulo rojo se inyecta usando presión aplicada o se deja difundir o emigrar de otra manera hacia el vaso sanguíneo. Se entiende que el diámetro de la aguja es suficientemente grande y la presión suficientemente ligera para evitar daño de la célula por fuerzas cortantes. En un método de la invención, la introducción de un glóbulo rojo en un vertebrado es preferiblemente intraarterial o intravenosa. Los métodos de transfusión de células sanguíneas son bien conocidos en la técnica. Como se usa aquí, el término "vector de suministro de glóbulo rojo" significa un glóbulo rojo que se ha electrosensibilizado y cargado con uno o más agentes de acuerdo con los métodos de la invención, y se puede usar para suministrar el agente a un vertebrado. El vector de suministro de glóbulo rojo está hecho típicamente para liberar el agente en un sitio de interés en el vertebrado usando ultrasonido como se describió arriba.

Agente Como se usa aquí, el término "agente" incluye, sin limitación, un átomo o molécula, dicha molécula puede ser inorgánica u orgánica, una molécula efectora biológica y/o un ácido nucleico que codifica dicho agente tal como una molécula efectora biológica, una proteína, un polipéptido, un péptido, un ácido nucleico, un ácido nucleico peptídico (PNA), un virus, una partícula similar a virus, un nucleótido, un ribonucleótido, un análogo sintético de un nucleótido, un análogo sintético de un ribonucleótido, un nucleótido modificado, un ribonucleótido modificado, un aminoácido, un análogo de aminoácido, un aminoácido modificado, un análogo de aminoácido modificado, un esteroide, un proteoglicano, un lípido, un ácido graso y un carbohidrato. Un agente puede estar en solución o en suspensión (por ejemplo en forma cristalina, coloidal o en otra forma de partículas). El agente puede estar en la forma de un monómero, dímero, oligómero, etc., o de otra forma en complejo. El agente puede ser un agente de imagen, que significa un agente que puede ser detectado in vitro o en el contexto de un tejido, órgano u organismo en el cual está localizado el agente. El agente de imagen puede emitir una señal detectable tal como luz u otra radiación electromagnética. El agente de imagen puede ser un radioisótopo como se conoce en la técnica, por ejemplo 32P o 35S o "Te, o una molécula tal como un ácido nucleico, polipéptido u otra molécula como se explica más abajo conjugada con dicho radioisótopo. El agente de imagen puede ser opaco a la radiación tal como la íí.i ? *_ . . , .is . «.: , . r . fin -S**.. «á radiación de rayos X. El agente de imagen también puede comprender medios de dirección por medio de los cuales es dirigido a una célula, tejido, órgano u otro compartimiento particular dentro del cuerpo de un animal. Por ejemplo, el agente puede comprender un anticuerpo radiomarcado específico para moléculas, tejidos o células definidas en un organismo. El agente de imagen se puede combinar, conjugar o mezclar con cualquiera de los agentes que se describen en la presente. Será apreciado que no es necesario usar un solo agente y que es posible cargar dos o más agentes en el vehículo. Por consiguiente, el término "agente" también incluye mezclas, fusiones, combinaciones y conjugados de átomos, moléculas, etc., como los que se describen en la presente. Por ejemplo, un agente puede incluir, sin limitación: un ácido nucleico combinado con un polipéptido; dos o más polipéptidos conjugadas entre sí; una proteína conjugada con una molécula biológicamente activa (que puede ser una molécula pequeña tal como un profármaco); o una combinadón de una molécula biológicamente activa con un agente de imagen. Como se usa aquí, el término "molécula efectora biológica" o "molécula biológicamente activa" se refiere a un agente que tiene actividad en un sistema biológico, incluyendo, sin limitación, una proteína, un polipéptido o péptido que incluye sin limitación una proteína estructural, una enzima, una citocina (tal como un interferón y/o una interieudna), un antibiótico, un anticuerpo políclonal o monoclonal, o una parte efectiva dei mismo tal como un fragmento Fv, dicho anticuerpo o la parte del mismo puede ser natural, sintético o humanizado, una hormona péptido, un receptor, una molécula de señalización u otra proteína; un ácido nucleico como se define más abajo, incluyendo sin limitación, un oligonucleótido u oligonucleótido modificado, un oligonucleótido de antisentido u oligonucleótido de antisentido modificado, ADNc, ADN genómico, un cromosoma artificial o natural (por ejemplo un cromosoma artificial de levadura) o una parte del mismo, ARN incluyendo ARNm, ARNt, ARNr o un ribozima, un ácido nucleico peptídico (PNA); un virus o partículas similares a virus; un nucleótido o ribonucleótido o análogo Sintético del mismo, que puede ser modificado o no modificado; un aminoácido o análogo del mismo, que puede ser modificado o no modificado; una hormona no peptídica (por ejemplo esteroide); un proteoglicano; un lipido; o un carbohidrato. Si la molécula efectora biológica es un polipéptido, se puede cargar directamente en un glóbulo rojo de la invención; alternativamente, se puede cargar una molécula de ácido nucleico que lleva una secuencia que codifica el polipéptido, dicha secuencia ligada operativamente a elementos reguladores de transcripción y traducción activos en una célula en el sitio objetivo. Moléculas pequeñas, incluyendo agentes químicos inorgánicos u orgánicos, también son de uso en la presente Invención. En una modalidad particularmente preferida de la invención, la molécula biológicamente activa es un agente farmacéuticamente adivo, por ejemplo un isótopo. Clases particularmente útiles de moléculas efectoras biológicas incluyen, sin limitación, antibióticos, fármacos antiinflamatorios, agentes angiogérticos o vaáoactivos, factores de crecimiento y agentes citotóxicos (por ejemplo supresores de tumor). Agentes citotóxicos de uso en la invención incluyen, sin limitación, toxina de difteria, exotoxina de Pseudomonas, toxina de cólera, toxina de pertusis, y los profármacos peptidil-p-fenilendiamina- mostaza, glutamatos de mostaza de ácido benzoico, ganciclovir, 6- metoxipurina-arabinonucleósido (araM), 5-fluorocitosina, glucosa, hipoxantina, metotrexate-alanina, N-[4-(a-D-galactopiranosil)benciloxicarboníl]- daunorrubicina, amigdalina, mostazas de azobenceno, mostaza glutamil-p» fenilendiamínica, fenolmostaza-glucurónido, epirrubicina-glucurónido, vinca- cefalosporina, mostaza fenilendiamínica-cefalosporina, nitrógeno-mostaza- , cefalosporina, fosfato de mostaza fenólica, fosfato de doxorrubicina, fosfato de mitomicina, fosfato de etopósido, palitoxina-4-hidroxifenil-acetamida, doxorrubicina-fenoxiacetamida, melfalan-fenoxiacetamida, ciclofosfamida, ifosfamida o análogos de los mismos. Si un profármaco se carga en forma Inactiva, se puede cargar una segunda molécula efectora biológica en el glóbulo rojo de la presente invención. Dicha segunda molécula efectora biológica es convenientemente un polipéptido activador que convierte el profármaco inactivo a su forma de fármaco activo, y dicho polipéptido activador se selecciona del grupo que incluye, sin limitación, timidína cinasa viral (codificada por Genbank Accesión No. J02224), carboxipeptidasa A (codificada por Genbank Accession No. M27717), a-galactosidasa (codificada por Genbank Accession No. M13571), ß-glucuronidasa (codificada por Genbank Accession No. M15182), fosfatasa alcalina (codificada por Genbank Accesston No. J03252, J03512) o citócromo P-450 (codificada por Genbank Accession No. D00003 N00003), plasmina, carboxipeptidasa G2, citosina desaminasa, glucosa oxidasa, xantina oxidasa, ß-glucosidasa, azorreductasa, t-glutamil transferasa, ß-lactamasa o penicilina amidasa. Preferiblemente, el polipéptido capaz de activar un profármaco es DT diaforasa. Se puede cargar ya sea el polipéptido o el gen que lo codifica; si es este último, tanto el profárrnaco como el polipéptido activador pueden ser codificados por genes en la misma construcción de ácido nucleico recombinante. Preferiblemente, la molécula efectora biológica se selecciona del grupo que donsiste de una proteína, polipéptido, péptido, ácido nucleico, virus, partícula similar a virus, nucleótido, ribonucleótido, análogo sintético de nucleótido, análogo sintético de ribonucleótido, nucleótido modificado, ribonucleótido modificado, aminoácido, análogo de aminoácido, aminoácido modificado, análogo de aminoácido modificado, esteroide, proteoglicano, llpido y carbohidrato, o una combinación de los mismos (por ejemplo material cromosómico que comprende tanto componentes de proteína como de ADN, o un par o serie de efeGtores de los cuales uno o más convierten a otro a su forma activa, por ejemplo catalíticamente). La presente invención emplea ventajosamente agentes que no son capaces de difundirse a través de una pared intacta de eritrocito por medios pasivos o activos. Sin embargo, se contempla el suministro de agentes que se difunden a una cierta velocidad a través de la pared del eritrocito, particularmente cuando se busca un incremento de suministro del agente en un tiempo o localización particular. Se puede lograr incremento del suministro por administración de ultrasonido en el tiempo o localización apropiado. Los agentes, incluyendo moléculas efectoras biológicas, también pueden ser suministrados en las células como fusiones (por ejemplo fusiones de proteína o polipéptido) o conjugados con una proteína capaz de atravesar la membrana plasmática y/o la membrana nuclear. Preferiblemente, el agente/molécula efectora biológica se fusiona o conjuga con un dominio o secuencia de dicha proteína responsable de la actividad de traslocación. Los dominios y secuencias de traslocación preferidos incluyen dominios y secuencias de la proteína de activación de VIH-1 -trans (Tat), proteína de homeodominío de Antennapedia de Drosophila y la proteína VP22 de virus de herpes simple 1. Por este medio, el agente/molécula efectora biológica es capaz de entrar a la célula o su núcleo cuando es liberado en la cercanía de la célula, usando los métodos que se describen en la presente. La proteína de activación de VIH-1 -trans (Tat) agregada exógenamente puede transportarse a través de la membrana plasmática y alcanzar el núcleo para transactivar el genoma viral. Se ha identificado actividad traslocadonal en los aminoácidos 37-72 (Fawell y otros, 1994, Proc, Nati Acad. Sci. U.S.A, 91 , 664-668), 37-62 (Anderson y otros, 1993, Biochem, Biophys. Res. Commun. 194, 876-884) y 49-58 (que tiene la secuencia básica RKKRRQRRR) de VIH-Tat. Vives y otros (1997), J. Biol. Chem., 272, 16010-7, identificaron una secuencia que consiste de los aminoácidos 48-60 ?.\ , !m¿¡iAt ».. lllS¡kí¡Ssl**¡á«¿áí_Sl M ' -i tj^miiii (CGRKKRRQRRRPPQC), que parece ser importante para traslocación, localización nuclear y transactivación de genes celulares. La inyección infraperitoneal de una proteína de fusión que consiste de ß-gaJadosidasa y un dominio de transducción de proteína VIH-TAT, da como resultado la liberación de la proteína de fusión biológicamente activa a todos los tejidos en ratones (Schwarze y otros, 1999, Science 285, 1569-72). También se ha mostrado que la tercera hélice de la proteína de homeodominio de Antennapedia de Drosophila posee propiedades similares (revisado por Prochiantz A., 1999, Ann NY Acad Sci., 886-172-9). El dominio responsable de traslocación en Antennapedia ha sido localizado en un péptido de 16 aminoácidos de largo rico en aminoácidos básicos que tiene la secuencia RQIKIWFQNRRMKWK (Derossi y otros, 1994, J. Bbl. Chem. 269, 10444-50). Este péptido se ha usado para dirigir sustancias biológicamente activas al citoplasma y núcleo de células en cultivo (Theodore y otros, 1995, J. Neurosci 15, 7158-7167). La intemalización celular de la tercera hélice del homeodominío de Antennapedia parece ser independiente del receptor, y se ha sugerido que el proceso de traslocación implica interacciones directas con fosfolípidos de la membrana (Derossi y otros, J, Biol. Chem., 271 , 18188-93). La proteína de tegumento VP22 de virus de herpes simple es capaz de transporte intercelular en el cual la proteína VP22 expresada en una subpoblación de células se extiende a otras células en la población (Elliot y O'Hare, 1997, Cell 88, 223-33). Proteínas de fusión que consisten de GFP (EHiot y O'Hare, 1999, Gene Ther 6, 149-51), proteína timidina cinasa (Dilber y Otros, 1999, Gene Ther 6, 12-21) o p53 (Phelan y otros, 1998, Nat Biotéchnol 16, 440-3) con VP22, han sido dirigidas a células de esta manera. Por medio de estudios de mutagénesis o supresión pueden ser identificados dominios o secuencias particulares de proteínas capaces de traslocación a través de la membrana nuclear y/o plasmática. Alternativamente se pueden ligar péptidos sintéticos o expresados que tienen secuencias candidatos con reporteros y se puede probar su traslocación. Por ejemplo, se pueden conjugar péptidos sintéticos con fluoresceína y monitorearse la traslocación por microscopía de fluorescenda mediante los métodos que describen Vives y otros (1997), J. Biol. Chem., 272, 16010-7. Alternativamente se puede usar proteína fluorescente verde como reportero (Phelan y otros, 1998, Nat Biotechnol 16, 440-3). Se puede usar cualquiera de los dominios o secuencias o como señalaron arriba o identificados por tener actividad de traslocación, para dirigir los agentes (incluyendo moléculas efectoras biológicas) hacia el citoplasma o núcleo de una célula.

Acido nucleico Un ácido nucleico de uso en la invención puede comprender un vector de ADN o ARN viral o no viral, en donde los vectores no virales induyen, sin limitación, plásmidos, moléculas de áddo nucleico, cromosomas artificiales, partículas condensadas y vectores episomales. Se ha observado expresión de genes heterólogos después de inyección de ADN plasmídico en músculo (Wolff J.A. y otros, 1990, Science, 247: 1465-1468; Carson D.A. y otros, patente de E.U.A. No. 5,580,859), tiroides (Sykes y otros, 1994, Human Gene Ther., 5:837-844), melanoma (Vile y otros, 1993, Cáncer Res., 53: 962-967), piel (Hengge y otros, 1995, Nature Genet., 10: 161-166), hígado (Hickman y otros, 1994, Human Gene Therapy, 5: 1477-1483), y después de exposición de epitelio de vías respiratorias (Meyer y otros, 1995, Gene Therapy, 2: 450-460). Como se usa aquí, el término "ácido nucleico" se define que abarca ADN y ARN de origen tanto sintético como natural, dicho ADN o ARN puede contener desoxi- o didesoxi- nucleótidos o ribonucleótidos, modificados o no modificados, o análogos de los mismos. El ácido nucleico puede existir domo ADN o ARN de cadena sencilla o doble, un heterodúplex ARN/ADN o un copolímero ARN/ADN, en donde el término "copolímero" se refiere a ácido nucleico de una sola cadena que comprende tanto ribonudeótidos como desoxirribonucleótídos. El término "sintético", como se usa aquí, se define como lo que es producido por medio de síntesis química o enzimática in vitro, Las secuencias terapéuticas de ácido nucleico útiles de acuerdo con los métodos de la invención incluyen las que codifican receptores, enzimas, ligandos, factores reguladores y proteínas estructurales. Las secuencias de ácido nucleico terapéutico también incluyen secuencias que edifican proteínas nucleares, proteínas citoplásmicas, proteínas itocondriales, proteínas secretadas, proteínas asociadas con plasmalema, proteínas séricas, antígenos virales, antígenos bacterianos, antígenos de protozoario y antígenos de parásito. Las secuencias de ácido nucleico terapéutico útiles de acuerdo con la invención también incluyen secuencias que codifican proteínas, iipoproteínas, giicoproteínas, fosfoproteínas y ácidos nucleicos (por ejemplo ARNs tales como ribozimas o ácidos nucleicos de antisentido). Los ribozimas de la clase de cabeza de martio con los más pequeños conocidos y se prestan para síntesis in vitro y suministro a células (resumidos por Sullivan, 1994, J. Invest. Dermatol., 103: 85S-98S; Usman y Otros, 1996, Curr. Opin. Biol., 6: 527-533). Las proteínas o polipéptidos que pueden ser expresados por moléculas de ácido nucleico suministradas de acuerdo con la presente invención incluyen hormonas, factores de iifecimiento, neurotransmisores, enzimas, factores de coagulación, apolipoproteínas, receptores, fármacos, oncogenes, antígenos de tumor, supresores de tumor, proteínas estructurales, antígenos virales, antígenos de parásito y antígenos bacterianos. Los compuestos que se pueden incorporar están limitados solamente por la disponibilidad de la secuenda de ácido nucleico que codifica una proteína o polipéptido dado. Un experto en la materia reconocerá fácilmente que conforme se identifiquen más proteínas y polipéptidos, sus correspondientes genes se pueden donar en el vector o "Rectores de expresión genética de elección, y se pueden administrar a un tejido de un paciente receptor u otro vertebrado para ser expresados en ese tejido. i Suministro de agentes El método de la presente invención es útil para el suministro de agentes a un sitio seleccionado en un cuerpo de un vertebrado, ya sea un órgano, parte de un órgano o de otra forma, en presencia o ausencia de medios de dirección específicos. Esto se logra, como se señaló arriba, mediante el rompimiento selectivo por ultrasonido de glóbulos rojos electrosensíbilizados cargados con el agente de elección, en el sitio objetivo seleccionado. Los agentes útiles para usar en la presente invención se indicaron arriba. Los agentes preferidos incluyen aquellos útiles para imagenología de tejidos in vivo o ex vivo. Por ejemplo, se pueden usar agentes de imagen tales como anticuerpos, que son específicos para moléculas, tejidos o células definidas en un organismo, para reflejar partes específicas del cuerpo, liberándolos en una localización deseada usando ultrasonido. Esto permite usar agentes de imagen que no son completamente específicos para el objetivo deseado, y que de otra manera podrían conducir a una imagenología más general en todo el organismo, para reflejar tejidos o estructuras definidas. Por ejemplo, para reflejar vasculatura del hígado se puede usar un anticuerpo que es capaz de reflejar tejido endotelial, liberando el anticuerpo selectivamente en el hígado por aplicación de ultrasonido para lo mismo. s ; . » Equipos La invención también abarca varios equipos. Algunos de los equipos comprenden glóbulos rojos parcialmente o completamente tratados.

Otros equipos proveen un glóbulo rojo, un agente y materiales de embalaje para los mismos, junto con instrucciones para llevar a cabo los métodos de la invención. La presente invención abarca un equipo diseñado para un fácil «uministro de un agente a un vertebrado receptor, ya sea en instalaciones de investigación o clínicas. Un equipo toma una de varias formas como las que siguen: Un equipo para el suministro de un agente a un sujeto vertebrado conprende glóbulos rojos, el agente e instrucciones para realizar el método de la presente invención. Alternativamente, los glóbulos rojos se proveen cargados con el agente para conveniencia de uso del comprador. En el último caso, las células son suministradas en forma sensibilizada, listas p'ara uso rápido o presensibilizadas y cargadas pero requiriendo un paso de sensibilización final. Las células del equipo son típicamente específicas de especie para el vertebrado de interés, tal como un primate, induyendo un humano, canino, roedor, cerdo u otro, según se desee; en otras palabras, las células son de especies similares al receptor considerado. Las células del equipo son adictonalmenté específicas para el tipo de sangre del organismo receptor considerado, según sea necesario. Opcionalmente, el equipo comprende uno gm o más regulador de pHs para sensibilización de las células, lavado, resuspensión, dilución y/o administración a un vertebrado. Los regulador de pHs apropiados se seleccionan del grupo que incluye solución salina de fuerza iónica baja, regulador de pHs fisiológicos tales como PBS o solución de Ringer, medio de cultivo celular y plasma sanguíneo o fluido linfático. El equipo comprende adicionalmente materiales de embalaje (tales como tubos, frascos, botellas o bolsas o sacos sellados) para cada componente individual, y un envase externo tal como una caja, bote o enfriador, que contiene todos ios componentes del equipo. El equipo se envía refrigerado. Opcionalmente se suministran componentes no celulares a temperatura ambiente o congelados, según sea necesario para mantener su actividad durante almacenamiento y envío. Pueden estar en forma líquida o seca (esto es, en polvo). Un segundo equipo de la ¡nvención comprende un agente tal como una molécula efectora biológica, instrucciones para realizar el método de la presente invención y opcionalmente un dispositivo de sensibilización y regulador de pHs para los mismos (por ejemplo regulador de pH salino fisiológico, medio de cultivo, plasma o fluido linfático). Además, el equipo contiene materiales de embalaje apropiados como se describió arriba. Los componentes individuales pueden ser provistos en forma líquida o seca (esto es, en polvo), y pueden estar a temperatura ambiente, refrigerados o congelados según sea necesario para mantener su actividad durante almacenamiento y envío. Los glóbulos rojos para usar con este equipo se fy pueden obtener Independientemente (por ejemplo, se pueden recolectar del vertebrado receptor considerado). Un aspecto preferido de la invendón es un equipo que comprende un glóbulo rojo que se carga con un agente y materiales de 5 embalaje para el mismo. Preferiblemente, un equipo como el arriba descrito comprende además un aparato para aplicar el procedimiento de sensibilización. Preferiblemente, un equipo de la invención comprende además polietilenglicol. Preferiblemente el equipo comprende también un líquido 10 seleccionado de un regulador de pH, diluyente u otro excipiente. De preferencia, el líquido se selecciona de un regulador de pH salino, un regulador de pH fisiológico y plasma. Otro aspecto de la invención es una composición fisiológica que comprende un vector de suministro de glóbulo rojo de la invención, que 15 comprende una molécula efectora biológica mezclada con un regulador de pH fisiológicamente compatible. Como se usa aquí, el término "regulador de pH fisiológicamente compatible" o "regulador de pH fisiológico" se define aquí como una composición líquida que, cuando se pone en contacto con células vivas, permite a las células permanecer con vida durante un período de 20 minutos, horas o días. Como ta!, un regulador de pH fisiológico es sustancialmente isotónico con la célula, de modo que el volumen celular no cambia más de 20% debido a diferencias en la fuerza iónica interna y externa. Ejemplos no limitativos de regulador de pHs fisiológicamente compatibles o regulador de pHs fisiológicos incluyen solución salina diferida, que puede ser regulador de pH (por ejemplo solución salina regulador de pH de Hanks o solución regulador de pH de fosfatos-salina) u otras soluciones salinas fisiológicas (por ejemplo solución de Ringer), glucosa, sacarosa u otro azúcar diluido, glicerol diluido con o sin sales o azúcares, medio de cultivo celular como se conoce en la técnica, suero y plasma. Preferiblemente, el glóbulo rojo de la composición fisiológica e$ una célula humana.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Caraa del RBC con oliaonucleótidos En ef siguiente ejemplo se muestran y comparan tres protocolos para la carga y sensibilización de glóbulos rojos (RBC/eritrocitos). El primer procedimiento muestra la carga y sensibilización de § lóbulos rojos mediante carga de pulsación eléctrica de onda exponencial o de campo eléctrico de onda cuadrada. Dichas pulsaciones elédricas usadas para carga o sensibilización son abreviadas como ES. El segundo procedimiento consiste de carga y sensibilización de glóbulos rojos mediante una combinación de electrosensibilización seguida por carga de diálisis hipoosmótica (HD, diálisis o carga osmótica). La combinación se abrevia como ES+HD. El tercer proceUtnltento consiste de carga y sensibilización de glóbulos rojos por medio de un método que comprende electrosensibilización (presensibifización), seguido por diálisis hipoosmótica, reposo durante la noche y tratamiento adicional de las células con electrosensibilización. Esta combinación es abreviada como ES+HD+ES. En el primer procedimiento, se cargan glóbulos rojos con un oligonucleótido por medio de un procedimiento de electroporación convencional como se describe en la técnica anterior, usando pulsaciones eléctricas de onda exponencial. Brevemente, se extrajo sangre humana por venopunción y se lavó dos veces en PBS (solución regulador de pH de fosfatos-salina) por centrifugación. Las células se suspendieron en PBS conteniendo 60 µg/ml de un oligonucleótido aleatorio de 30 nucleótidos marcado con FITC para producir concentraciones de 3.5x108 células/ml y se dispensaron alícuotas de 0.8 ml en cubetas estériles de electroporación (0.4 cm de espacio de electrodo) y se retuvieron sobre hielo 10 minutos. Después las células se expusieron a una estrategia de electroporación que incluye suministro de dos pulsaciones eléctricas (fuerza del campo* 3.625 kV/cm a una capacitancia de 1 µF), usando un aparato BioRad Gene Pulser. Las células se lavaron inmediatamente con PBS conteniendo MgCfe (4 mM, PBS/Mg) y se retuvieron a temperatura ambiente durante 30 minutos en el regulador de pH PBS/Mg para facilitar resellado. Subsecuentemente las células se lavaron y suspendieron a una concentración de entre 7 y 14x108 células/ml en PBS/Mg conteniendo glucosa 10 mM (PBS/Mg/glucosa) durante por lo menos 1 hora. El segundo procedimiento empleado es esencialmente como se describe en la solicitud de patente del Reino Unido 9917416.1 de los presentes autores, incorporada como referencia. Brevemente, se extraen 10 5 ml de sangre venosa periférica por venopunción, en tubos que contienen anticoagulante de heparina de litio y se mezcla suavemente. Después se vacía la sangre completa en un tubo de polipropileno f se centrifuga a 300g por 15 minutos a temperatura ambiente. Se remueven el plasma y los glóbulos blancos (capa leucocitaria). Se agrega solución regulador de pH de fosfatos-salina 1x (PBS, hecha de tabletas Oxoid, código BR14a pH7.3) y las células se centrifugan a 700g durante 5 minutos. El sobrenadante se remueve y la pella de las células remanentes se resuspende en PBS 1x enfriada con hielo. Después se repite una vez el procedimiento de rotación/lavado y las células se suspenden en PB$ enfriado con hielo a 6x108 células/ml. Después, las células se electrosensíbilizan dispensando 800 µl de RBC en cubetas estériles de electroporación y se ponen sobre hielo. Para tlectrosensibilizar las células, se exponen a un campo eléctrico a 3.625 kV/cm, 1 µF (2 pulsaciones) en ausencia de carga útil. Después se retiran los RBC y se reúnen en tubos de polipropileno. Las células se centrifugan una vez a 700g durante 5 minutos a temperatura ambiente (RT). Las células se pueden diluir en PBS/MgCI= (4 mM). Después se resuspenden las células en PBS/MgCl2 y se centrifugan a SÍÍSMS * i ; 700g durante 5 minutos. Finalmente, las células se resuspenden en PBS/MgC a aproximadamente 7x108 células/ml y se dejan reposar 30 minutos a temperatura ambiente. Las células se cargan entonces con olígonucleótido por medio de diálisis hipoosmótíca, de acuerdo con un protocolo adaptado de Eichier y otros (1986) Clin. Pharmacol. Ther. 40:300-303. Se sigue el siguiente procedimiento: 1 Regulador de pHs: Regulador de pH de abastecimiento de fosfato de potasio: K2HP043H20 5 mM (FW 228.2g) =>1.14 g/L KH2P04 5 mM (MW 136.1g) = 0.68 g/L Guardado a 4°C Mezclar como sigue: Para un regulador de pH de fosfatos K2H/KH2, pH7.4= aprox. ß.1:3.9 partes Mezclar las dos soluciones de abastecimiento como y cuando se requiera. Regulador de pH #1 (PBS isoosmótico): regulador de pH de fosfatos K2H/KH2, pH7.4 NaCI 150mM = 8.76g/L verificar y ajustar pH (NaOH 1 M) Reguiador de pH #2 (regulador de pH de diálisis): b Ü. iJ Lá? -Lí ¿Í4ÁÍÍ jHH ^l^ regulador de pH de fosfatos K2H/KH2 pH7.4 verificar y ajustar pH (NaOH 1M) Regulador de pH #3 (regulador de pH de resellado) regulador de pH de fosfatos K2H/KH2 pH7.4 NaCI 150 mM = 8.76g/L glucosa 10mM = 1.8g/L verificar y ajustar pH (NaOH 1M) 2 Tubería de diálisis Spectrapor: 1 Se usan tubería de corte de MW 3.5kDa, 0.32ml/cm. 2 Preparación: calentar a 80°C/30 min en EDTA f mM/bicarbonato de sodio 2% (Sigma). Enjuagar bien, dentro y fuera con H20 dd. 3 Lavar dentro y fuera con regulador de pH #1. 4 Guardar sumergido en una pequeña cantidad de regulador de pH #1 si no se usa inmediatamente. 3 Preparación de RBC: 1 Se lavan RBC electrosensibilizados reposados, en PBS, dos veces a 700g durante 5 minutos. 2 Para el lavado final, las células se lavan en el regulador de pH #1. 3 Las células se manipulan como una suspensión de células remoció de sobrenadante del lavado final lulas en tubería: 1 El protocolo recomienda 60% de hematocrito (HCT). La suspensión de células empaquetadas es aproximadamente 75% HCT y se, diluye consecuentemente. 2 Mezclar las células con el oligonucleótido y regulador de pH #1 para dar ia concentración y volumen finales requeridas de oligonucleótido. 5 Diálisis: 1 La tubería se sujeta para asegurar que el área de superficie permanezca constante para el volumen de las células. 2 Dializar RBC (volumen de células empaquetadas en regulador de pH #1 ) contra regulador de pH #2 durante 90 minutos a 4°C. 3 Colocar las membranas en 100-200 mf de regulador de pH #2 ((asegurar que la membrana se sumerge) en matraz de vidrio con pulga magnética. 4 Colocar este matraz dentro de otro matraz que contiene hielo, sobre el agitador magnético, cubrir con lámina delgada de plata. 6 Calentar una alícuota del reguiador de pH #3 a 37°C. 7 Remover el regulador de pH de diálisis, reemplazarlo con el regulador de pH #3 de resellado caliente. > 8 Colocar el matraz con tubería de diálisis y el regulador de pH #3 en un matraz más grande soportado por agua a 37°C, cubrir y dejar 15 minutos. 9 Recoger las células en tubos de polipropileno de 12 ml. 10. Lavar 3x en regulador de pH #3 de resellado enfriado con hielo a 300g, 10 minutos a 4°C. 11 Lavar 1x en PBS/Mg/glucosa y centrifugar a 700g 5 minutos, 4°C. 12 Contar las células y resuspenderlas a 7x108 células/ml en PBS/Mg/glucosa. 13 Guardar a 4°C durante la noche. En el presente ejemplo, la diálisis se realiza en presencia de 10 µg de oligonucleótido por ml de células. Las células se suspenden a 7x108 células/ml. En el tercer procedimiento, las células se preparan como se describe para el segundo procedimiento, pero se exponen a un paso de electrosensibilización adicional después de cargar por diálisis, de acuerdo con el siguiente protocolo. 1 Después de almacenamiento durante la noche, lavar RBC una ,¥ez en PBS 700g, 5 minutos, 4°C. 2 Contar las células y resuspender a 6x108 c/ml, en PBS enfriado con hielo. 3 Dispensar 800 µl de RBC en cubetas estériles de t-f* r ambiente (RT). Las células se pueden diluir en PBS/MgCl2 (4mM). 8 Resuspender en PBS/MgCI2, centrifugar a 700g durante 5 ^minutos. 9 Repetir el paso 6. 10 10 Resuspender en PBS/MgCI2 a aproximadamente 7x108 c/ml. 11 Dejar reposar las células 30 minutos a RT. 12 Centrifugar una vez a 700g durante 5 minutos a temperatura ambiente (RT). Las células se pueden diluir en PBS/MgCb/glucosa. 13 Resuspender las células en PBS/MgCfe/glucosa, centrifugar a 15 700g durante 5 minutos. 14 Repetir el paso 13. 15 Resuspender las células en PBS/MgCb/glucosa a 7x10& c/ml. 16 Dejar reposar las células en PBS/MgCb/glucosa durante 60 minutos. 20 Las células preparadas de acuerdo con los tres procedímienteé se analizaron para determinar los niveles de carga de células y se sometieron a rompimiento con ultrasonido. Los resultados se muestran en la figura 1. Para las células electroporadas mostradas en la figura 1A, el oligonucleótido (oligo) no se unió específicamente a RBC ya que la intensidad de fluorescencia media (MFl) fue de 1. La MFl se define como la relación de fluorescencia asociada con células cargadas dividida entre la fluorescencia asociada con unión no específica. Las células electrocargadas tienen un Incremento de fluorescencia con una MFl de 5.6. La sensibilidad al ultrasonido se midió a 0.75 W/cm2, 3MHz, 30 segundos, 0% de células usadas de control, en comparación con 20% de las células electroporadas. Para las células cargadas por electrosensibilización seguida por diálisis hipoosmótica (ES+HD), la unión no específica es despreciable (MFI=1). La carga por ES+HD resulta en un notable incremento de fluorescencia con una MFl de 80. La incorporación del segundo paso de electrosensibilización (ES+HD+ES) tiene poco efecto sobre el nivel de fluorescencia con una MFl de 93, indicando retención de la carga útil durante el procedimiento. La sensibilidad al ultrasonido se midió a 3 W/cm2, 1 MHz, 35 segundos en un TMM (medio imitador de tejido). Las células sometidas a un procedimiento de una sola electrosensibilización y diálisis (ES+HD) mostraron 28% de lisis, mientras que las células sometidas al paso adicional de electrosensibilización (ES+HD+ES) mostraron 89% de lísis.

EJEMPLO 2 Carga de RBC con anticuerpos Para fines comparativos se cargaron anticuerpos en RBC por medio de electroporación. El anticuefo usado es un anticuerpo anti-vWF conjugado con FITC (Sigma). Los resultados se muestran en la figura 2. En un primer procedimiento (figura 2A), las células se cargaron como se describe en el ejemplo 1, exponiendo 3.5x108 células/ml a 3 pulsaciones de un campo eléctrico de onda exponencial en presencia de anticuerpo a 0.25 mg/ml. Se observó una MFl de 3.98, con 100% de sensibilidad a ultrasonido. Sin embargo, en este procedimiento la recuperación de las células es baja, de aproximadamente 11%. En un segundo procedimiento (figura 2B), se usaron 10 pulsaciones de un campo eléctrico de onda cuadrada, en presencia de 0.5 mg/ml de anticuerpo (las condiciones se optimizaron para cada protocolo). Se ven dos picos en la población celular después de la carga, con una MFl de 1.73 y 184.8. Se recuperaron 40% de las células, de las cuales 97% fueron sensibles al ultrasonido cuando se expusieron a ultrasonido a una energía de 1.25 W/cm2 usando una sonda de 3MHz durante 3 segundos. Se recuperaron 0.005 pg de anticuerpo por célula. La figura 3 muestra los resultados de carga de diálisis hipoosmótíca de anticuefo de acuerdo con el procedimiento de Eichier y otros, y de la presente invención (véase el ejemplo 1 ). La MFl relativa es de segundo paso de sensibilización (ES+HD+ES) no hay fuga/perdida aparente de la carga útil y aproximadamente 90-100% de ías células son sensibles al ultrasonido (véase el cuadro del ejemplo 6). Se recuperaron 0,22 pg de anticuerpo/célula.

EJEMPLO 3 Regulador de PHS de resellado Se probó un regulador de pH de resellado alternativo para determinar el impacto sobre el rendimiento del método de acuerdo con la invendón. Se comparó el regulador de pH de Bax y otros (1999), Clinical Science 96:171-178, con el regulador de pH adaptado de Eichier y otros como se usa en el ejemplo 1 (ES+HD). Como puede verse en la figura 4, el rendimietito de los dos regulador de pHs es casi idéntico. En ambos casos, las células se cargaron con anticuerpo anti-v WF conjugado con FiTC como se describe en el ejemplo 2, y se sometieron a un segundo procedimiento de electrosensibilización de acuerdo con la presente invención. Las intensidades de fluorescencia medias observadas para los regulador de pHs de Eichier y Bax fueron de 186 y 126, respectivamente. Las pérdidas de células observadas fueron 27% y 16%. Las sensibilidades a ultrasonido se midieron en un TMM, a 3W/cm2, durante 35 segundos; se observó una lisis celular de 68% y 72%, respectivamente.

EJEMPLO 4 Liberación mediada por ultrasonido de carga útil de anticuerpo en un sistema de riñon de rata perfundido En la figura 5 se muestra la liberación de anticuerpo conjugado con FITC por ultrasonido, en tejido de riñon perfundido en PBS. Se cargó RBC con anticuerpo anti-v WF-FITC como se describe en el ejemplo 2 arriba, de acuerdo con la presente invención, y se administró a riñones perfundidos en PBS, de acuerdo con el siguiente protocolo: 1. Perfundir la rata a través del corazón con PBS/EDTA hasta que el riñon quede libre de sangre. 2. Remover la aorta dorsal del corazón e insertar una aguja de cebadura en el vaso. Atar la aguja a la aorta dorsal usando sutura. 3. Cerrar la aorta dorsal y la vena cava posterior justo después de la unión que lleva al riñon. 4. Cerrar la arteria y vena adrenal izquierda y la arteria esentérica anterior y la arteria celíaca. 5. Cerrar la uretra y la arteria y vena iliolumbar izquierdas. 6. Crear un punto de salida insertando una aguja de cebadura en 5 te vena cava justo antes del hígado. Atar la aguja usando sutura. 7. Lavar con 10 ml de PBS/4mM Mg/10mM glucosa y verificar que no haya fugas. 8. Bloquear el punto de salida insertando una jeringa de 2 ml en la aguja de cebadura. » 10 9. Cargar 1 ml de 7x108 células/ml a través de la aorta dorsal en "* el riñon. 10. Tratar con U/S usando una sonda de 1MHz. 11. Incubar el riñon tratado durante 1 hora. 12. Remover la jeringa de 2 ml y lavar con 2 ml de 15 PBS/Mg/glucosa. 13. Recolectar el lavado completo para recuento de células y ELISA 14. Lavar con 50 ml de PBS/EDTA 15. Lavar con 20 ml de regulador de pH de formalina neutra al 20 4% (NBF). 16. Remover el riñon tratado con U/S y cortar en dos mitades y fijar en NBF. 17. Preparar secciones de tejido (12 µm) y marcar usando un equipo Vectastain ABC (V#eta; Labs) como se indica en el instructivo del fabricante. Preparación de RBC: eritrocitos cargados con anticuerpo, ¿Balizados y electrosensibilizados (ES+HD+ES): Rata 1 Sin tratamiento de ultrasonido Rata 2 Tratamiento con ultrasonido a 3 W/cm2 durante 40 segundos. Se marcaron células endoteliales en glomérulos por medio del anticuerpo anti-vWF conjugado con FITC después de tratamiento con 10 ultrasonido para liberar el anticuerpo, como se muestra en la figura 5A. En ausencia de tratamiento de ultrasonido no se observó marcación (figura 5B).

EJEMPLO 5 Estabilidad de las células cargadas 15 Se cargaron RBC por diálisis de acuerdo con la presente invención (ES+HD+ES), como se describe en los ejemplos 1 y 2, con anticuerpo conjugado con FITC. Después de la segunda sensibilización, las células se guardaron a 7x108 células/ml en regulador de pH SAGM (regulador 20 de pH de servicio de transfusión de sangre, obtenible de Baxter Health Care). Las células se guardaron con exclusión máxima de aire a 4°C. Durante un período de 35 días, se determinó mantenimiento de sensibilidad a ultrasonido, número de células y carga útil.

A JA S?.

La figura 6 muestra los niveles de números de células y sensibiKdad a ultrasonido en células en almacenamiento. La sensibilidad a ultrasonido, medida a 3 W/cm2, 35 segundos, en un TMM, se mantuvo o estuvo por arriba del nivel inicial de 90% durante 25 días, y cae aproximadamente a 65% después de 35 días. Los números de células son estables durante un período de 30 días. La figura 7 muestra la retención de carga útil durante 30 días bajo condiciones idénticas a las de arriba. No se observó pérdida de carga Útil.

EJEMPLOS Comparación de diferentes secuencias de sensibilización v pasos de carga osmótica El protocolo de carga de diálisis hipoosmótica que se describe en el ejemplo 1 se realizó en dos configuraciones diferentes para determinar él electo sobre la eficiencia de carga y la susceptibilidad a lisis mediada por ultrasonido, cuando el paso de carga se realiza antes del segundo paso de sensíbiiizadón, como en el ejemplo 1 , y viceversa. Los pasos de electrosensibilización y diálisis se llevaron a cabo como se describe en el ejemplo 1, excepto que los pasos de etectrosensíbilización se llevaron a cabo dos veces. La sensibilidad al uttrasonido se determinó en un TMM como se describe en el ejemplo 1.

Los resultados arriba mostrados en el cuadro 1 , similares a los obtenidos en el ejemplo 1, indican que la secuencia de las dos sensibilizaciones no es crítica para obtener sensibilidad mejorada.

EJEMPLO 7 Liberación de carga útil de vehículo cargado v sensibilizado ert un sistema imitador de tejido TMM) Se ha demostrado que se puede lograr incremento de carga de células, exponiéndolas a campos eléctricos en combinación con modalidades de carga de diálisis hípoosmótica. En los estudios presentados en los ejemplos aquí descritos, las células fueron cargadas con anticuerpo, enzima y oligonueleóiSdo, exponiendo primero las células a presensibilizacíón de pulsaciones eléctricas y subsecuentemente llevando a cabo carga hipoosmótica. Después las células se electrosensibilizaron exponiéndolas a pulsacione eléctricas. Este protocolo es definido como ES+HD+ES éh los ejemplos anteriores (véase el ejemplo 1). En los experimentos que aquí se describen el objetivo fue demostrar el incremento de carga para confirmar los ejemplos anteriores y demostrar la liberación mediada por ultrasonido de la carga útil relevante usando un sistema imitador de tejido. En estos experimentos el objetivo se puso a una distancia de 1.3 cm de la superficie emisora de la cabeza de ultrasonido y el espacio intermedio se llenó con un material imitador de tejido (TMM) que atenúa el ultrasonido de la misma manera que un tejido blando. El TMM elegido para este trabajo ha sido descrito por Madsen y otros (1998, Ultrasound Med & Biol., 24, 535-542) y después de la preparación se tuvo cuidado para asegurar que el material tuviera una densidad de 1.03 g/ml.

I. Liberación mediada por ultrasonido de anticuerpo del vehículo Se cargó anticuefo en los eritrocitos y se llevó a cabo Sensibilización usando el procedimiento denotado como ES+HD+ES como se describe en el ejemplo 1. Las células sensibilizadas cargadas con anticuerpo se expusieron después a ultrasonido a una distancia de 1.3 cm de la superficie emisora de la cabeza de ultrasonido. El espacio intermedio se llenó con el TMM como se describió arriba y se expusieron alícuotas de 0.1 ml de 7x108 células/ml a ultrasonido. En estos estudios se empleó como la carga útil un anticuerpo anti-factor de von Wiltebrand humano de oveja. Se cuantificó la cantidad de anticuerpo en las células y liberada después de b ti i to con ultrasonido usawdq un sistema ELISA.

I. Resultados En el protocolo de carga y sensibilización, las células se ca aron a una concentración de 1.1 mg de anticuerpo por ml de volumen de células empaquetadas (PCV). Alícuotas de 0.1 ml de células a 7x108 células/ml se expusieron a ultrasonido a las intensidades mostradas en la figura 7 y se analizaron muestras para determinar la lisis celular por recuento directo. Además, se determinó la cantidad de anticuerpo liberado después de tratamiento con ultrasonido por medio de análisis ELISA de sobrenadantes celulares recolectados después de centrifugación. Los resultados obtenidos se muestran en ia figura 7 y demuestran que las células se usaron preferentemente a densidades de energía de ultrasonido mayores de 2 W/om2. Las células de control exhibieron poco o ningún efecto cuando se trataron con ultrasonido a estas densidades de energía. Además, y por arriba de 2 W/cm2, se detectó carga útil de anticuerpo en sobrenadantes recolectados después del tratamiento con ultrasonido. Además, cuando se comparó la cantidad total de anticuerpo liberado de las células usando ultrasonido con el liberado después de lisis hipotónica en Tritón X100 0.01% (v/v) se encontró que 77% del anticuerpo total se liberó en el primero. El resto podría ser encontrado en los desechos que se recuperaron por centrifugación después del tratamiento con ultrasonido. Los resultados demuestran que el tratamiento de células con el protocolo ES+HD+ES resulta en sensibilización al ultrasonido de* esa población cargada. La liberación de carga útil mediada por ultrasonido se podría lograr usando ultrasonido de baja intensidad y usando condiciones que tengan poco o ningún efecto sobre eritrocitos normales. Los resultados también demuestran liberación de carga útil mediada por ultrasonido a una profundidad de 1.3 cm, y demuestran con ello una de las mayores ventajas asociadas con el uso de ultrasonido como el estímulo de liberación de penetración a profundidad en tejidos. Puesto que todo el anticuerpo incorporado en los experimentos de tratamiento con ultrasonido, podría ser recuperado como se mostró usando ELISA basada en la funcionalidad de la carga útil, esto sugiere que el ultrasonido no tiene efecto nocivo sobre la funcionalidad.

II. Liberación mediada por ultrasonido de enzima (ß-aalactosidasa) del vehículo Se recolectaron células, se prese sibilizaron por exposición a putsadones eléctricas y se cargaron con ß-galactosidasa (de Escherichia coli, Sigma) como se describió arriba para la carga de anticuerpo. Las células se expusieron subsecuentemente a pulsación eléctrica para sensibilización y se expusieron a ultrasonido a una concentración de 7x108 células/ml en el sistema TMM como se describió arriba para el vehículo cargado con anticuerpo. Los Usados obtenidos después de exposición del vehículo cargado y sensibilizado a ultrasonido se analizaron para determinar su actividad ß-galactosídasa a 37°C usando el substrato coloriméfrico p-nitrofenil-p-D-galactosidasa (5mM en regulador de pH de fosfatos 50mM, pH 7.0). Se determinó la concentración de p-nitrofenol a 450 nm y se expresó la actividad como µrnotes de p-nitrofenol producido por minuto por ml di muestra. La liberación de la enzima en muestras recolectadas después de tratamiento con ultrasonido, se expresó como un porcentaje relativo a la cantidad de enzima contenida en las células antes del tratamiento. Este último se determinó midiendo la cantidad de enzima liberada de las células después de la lisis por congelación-descongelación en regulador de pH de fosfatos 5mM, pH 7.2.

II. Resultados En estos experimentos, las células cargadas contenían aproximadamente 1 mg de enzima por ml de volumen celular empaquetado. Los resultados obtenidos después de tratamiento de estas preparaciones con ultrasonido se muestran en la figura 8. Las muestras se trataron a las densidades de energía indicadas y se analizaron para determinar lisis celular por recuento de células. La lisis aumentó con densidad de energía creciente hasta un máximo a aproximadamente 3 W/cm2. La exposición de células normales de control a condiciones similares de ultrasonido tuvo poco o ningún efecto sobre la lisis celular y esto se confirmó por la ausencia de hemoglobina en sobrenadantes después de la remoción de células por centrifugadón. Cuando se recolectaron los sobrenadantes por centrifugación después de exposición de las células sensibilizadas y cargadas a ultrasonido, y se analizó * i ?|u contenido de enztana, se encontró que se liberaron cantidades crecientes de enzima al aumentar la densidad de energía hasta un máximo de 3 W/cm2. Los resultados demuestran que las células cargadas usando el protocolo ES+HD+ES son sensibles al ultrasonido, y la carga útil de la enzima 6 -r puede ser liberada del vehículo después de exposición a ultrasonido de baja intensidad. La liberación mediada por ultrasonido de la carga útil se obtiene a 1.3 cm de la cabeza de emisión de ultrasonido, indicando que el uso de ultrasonido para este propósito ofrece la ventaja de penetración a profundidad en los tejidos. Además, puesto que se logró 100% de recuperación de la 10 enzima liberada (entre 2.5-3 W/cm2), el estímulo de ultrasonido resultante en te Iteración de la enzima no tuvo efecto nocivo sobre la funcionalidad de la arga útil liberada. lll. Liberación mediada por ultrasonido de oligonucleótido del 15 vehículo Se recolectaron y presensibilizaron células por exposición a pulsaciones eléctricas como se describió arriba. Después, las células se cargaron usando el procedimiento de diálisis hipoosmótica arriba descrito para te carga de anticuerpo, y una cantidad de 300 µg de oligonucleótido (de 30 20 nucleótidos, aleatorio, marcado con támara, provisto por Oswel, Reino Unido) se ezdó con 250 µl de células empaquetadas. Después, las muestras se t Cometieron a pulsaciones eléctricas de electrosensibilización y subsecuentemente se suspendieron en PBS MgCI2/glucosa a una r 3 concentración de 7x108 células/ml. Las muestras se expusieron a ultrasonido usando el sistema TMM arriba descrito para liberación de anticuerpo y enzima, y se determinó la cantidad de oligonucleótido liberado usando un espectrofluorímetro (Shimadzu) con excitación a 540 nm y emisión a 590 nm. Se construyó una curva patrón para determinaciones cuantitativas y se tomaron en consideración las eficiencias de extracción. lll. Resultados En estos experimentos la cantidad máxima de oligonudeótido cargado fue de aproximadamente 300 µg de oligonucleótido por ml de volumen celular empaquetado. Los resultados obtenidos después del tratamiento con ultrasonido de estas preparaciones cargadas se muestran en la figura 9. Como con tos dos ejemplos anteriores, ocurre lisis celular de la preparación sensibilizada y cargada a entre 2 y 3 W/cm2. Bajo estas condiciones de ultrasonido, hay poco o ningún efecto sobre tos eritrocitos de control. Además, el oligonucleótido comienza a aparecer en sobrenadantes recolectados a entre 2 y 3 W/cm2, demostrando la liberación mediada por ultrasonido de la carga útil de oligonucleótido del vehículo.

EJEMPLO 8 incremento de ia carga de eritrocitos reemplazando ei paso de ES inicial con un tratamiento sonoporativo Los resultados de arriba demuestran que las células cargadas usando el protocolo ES+HD+ES están cargadas más eficientemente que usando ES o HD solos. Estos resultados también demuestran liberación de la carga útil del vehículo. En muchos de los ejemplos anteriores, la sensibilización y la carga se lograron por medio de presensibilización de la célula usando electrosensibilización y subsecuentemente procesamiento mediante protocolos de carga hipoosmótica y una exposición ulterior a pulsaciones eléctricas (ES+HD+ES). Las preparaciones resultantes se cargaron eficientemente con la carga útil relevante y las preparaciones también exhibieron sensibilidad al ultrasonido. Puesto que se consideró que el evento de presensibilización inicial, que se reportó crea poración transitoria de la membrana, contribuyó positivamente a cargar hipoosmóticamente, fue de interés determinar si otros métodos poratívos podrían contribuir o no de una manera similar. La sonoporación representa una técnica alternativa conocida para crear poradón transitoria de membrana. Esto implica el uso de ultrasonido, y se ha reportado que ayuda a crear poración no destructiva y fransitoria de membranas biológicas (Miller y otros, 1998, Ultrasonics, 36, 947-952). Por lo tanto, fue de interés determinar si la exposición a ultrasonido de eritrocitos antes de la carga hipoosmótica, podría o no contribuir positivamente a cargar dichas células y si así fuera, si podrían dichas Gélulas hacerse sensibles al ultrasonido exponiéndolas subsecuentemente a pulsación eléctrica de sensibilización. Para los fines anteriores, se recolectaron eritrocitos humanos y se cargaron con anti-lgG de rata marcada con fluoresceína usando el protocolo original de electrosensibilización (presensibilización)-diálisis hipoosmótica-electrosensibilización (ES+HD+ES), diálisis hipoosmótica sola (HD) y un protocolo de sonoporación-diálisis hipoosmótica-electrosensibilización (SP+HD+ES). Los primeros dos se realizaron como se describió arriba y el último consistió del protocolo original ES-HD-ES, excepto que el primer paso de ES se reemplazó con un paso de sonoporación. Esto incluyó suspender eritrocitos lavados en PBS a una concentración de 7x108 células/ml. Después se dispensaron alícuotas de 1.5 ml en pozos individuales en una placa de cultivo de tejidos de 24 pozos. Las células se sometieron a tratamiento con ultrasonido a 2.5 W/cm2 durante 5 minutos, usando una cabeza de ultrasonido de 1MHz. Después del tratamiento, las células se lavaron por centrifugación y se suspendieron en PBS/MgC^. Después, las células se procesaron como para el protocolo ES+HD+ES y se determinó la carga de anticuerpo usando citometría de flujo. Además, se determinó la sensibilidad de esas células exponiendo las células a ultrasonido a 3 W/cm2 usando el sistema TMM.

Resultados del eiemplo 8 Cuando las células se trataron con el protocolo ES+HD+ES y se expusieron subsecuentemente a ultrasonido a 3 W/cm2 usando el TMM, se obtuvo más de 90% de lisis y esto concuerda con los resultados previos. Cuando las células se trataron con el protocolo SP+HD+ES y se expusieron a ultrasonido de la manera arriba descrita, ocurrió 30% de lisis. Los resultados demuestran que las células se habían sensibilizado usando el protocolo alternativo, aunque no al mismo grado que con el protocolo original que incluye el uso del paso preliminar de presensibilización por electrosensibilización. Cuando se examinó la carga de células usando citometría de flujo, se encontró que la carga con HD sola dio como resultado dos picos de células fluorescentes como se muestra en la figura 11. Esto indica que la carga de las células fue insuficiente, ya que más de la mitad de la población de tes células quedó sin cargar o se cargó mínimamente. Cuando las células se cargaron usando el protocolo ES+HD+ES, se detectó un pico mayor desviado a la derecha y esto indica que casi todas las células (88%) de la población estaban cargadas al máximo (figura 11). Cuando se analizó en de flujo el protocolo que emplea un paso de presensibilización por sonoporación antes de diálisis hipotónica, se encontró nuevamente que la mayoría de las células que residían en un pico se desviaron bien a la derecha de la figura 11. Esto indica nuevamente que casi todas las células (93%) se cargaron con el anticuerpo fluorescente. Sin embargo, puesto que la ' ie^viadón a te derecha en este pico no fue tan grande GCfm© el que se* encontró eri la muestra tratada con el protocolo ES+HEHES, 4a cantidad de anticuerpo fluorescente asociado con las células en este pico no es tan grande, y esto es indicado por las intensidades de fluorescencia medias i indicadas en el cuadro 2 siguiente. También se debe notar que los fehdimient s usando el método de sonoporación no fueron tan altos como los de los dos métodos alternativos. El protocolo mediado por ultrasonido provee ventaja sobre diálisis hipotóníca en términos de carga de la población completa de células. Aunque el protocolo de sonoporación no es tan eficiente 10 en términos de carga útil incorporada, provee un medio alternativo para incrementar la carga obtenida por electrosensibilización (presensibilización) y diálisis hipoosmótica sola. Cuando las células se cargaron con el protocolo SP+HD, no exhibieron sensibilidad al ultrasonido. Sin embargo, cuando se llevó a cabo 15 exposidón subsecuente a pulsaciones eléctricas, esto es, SP+?D+ES, se ftbservó 30% de lisis de la población (7x108 células/ml) cuando se trató usando el sistema TMM arriba descrito. s * » t t t CUADRO 2 MFl* Intensidad de fluorescencia media, que es = intensidad de fluorescencia de muestra/intensidad de fluorescencia exhibida como resultado de unión no específica Los valores entre paréntesis representan los rendimientos de células obtenidos de cada protocolo EJEMPLO 9 Liberación mediada por ultrasonido de carga útil dei vehículo cargado. sensibilizado, ert un sistema circulante a 37°C y a alto hematocrito (H€T) En los estudios arriba indicados se muestra que se pueden cargar eritrocitos humanos con alta eficiencia, se pueden sensibilizar a ultrasonido de baja intensidad y se puede obtener rompimiento mediado por ultrasonido y/o liberación de la carga útil in vitro y en un sistema ex vivo de riñon de rata perfundido. En estos sistemas se muestra el rompimiento y/o Bberación de carga útil a 7x108 células/ml, que es equivalente a aproximadamente 5% HCT. Además, esos estudios se realizaron a temperatura ambiente. Es de interés demostrar que la sensibilidad en términos de liberación de carga útil puede ser retenida a 37°C y a HCT más alto. También es de interés determinar si esto ocurre o no mientras las células objetivo se mueven a través de un sistema de drcuteción en mucho igual a los sistemas circulatorios in vivo. Para tal fin, se recolectaron y cargaron eritrocitos humanos con 5 anttouerpo anti-factor de von Willebrand como se describe en el ejemplo 7. Después de sensibilización, las células se volvieron a mezclar junto con células humanas normales lavadas en proporciones de una parte de 7x1o8 células/ml y cuatro partes de 4x109 células/ml. La mezcla se introdujo en un sistema circulatorio que consiste de un depósito cHíndríco lleno con PBS y * 1© mantenido a 37°C por circulación. El fondo del cilindro consiste de una lámina ligera de polietileno a través de la cual se suministra ultrasonido. La sangre se hizo circular a través de tubería C-flex (diámetro interno 4mm) que pasa a través del regulador de pH termoestabüizado, y el área objetivo de la tubería C-flex se colocó a una distancia de 1.3 cm de la cabeza emisora de 15 ultrasonido. Se hizo circular sangre a través del sistema a una velocidad de 14.5 ml/min. Durante la exposidón a ultrasonido (5 W/cm2 a 1MHz durante los tiempos indicados) se recogieron muestras del sistema y los sobrenadantes se recolectan por centrifugación. Después se analizan estos para determinar anticuefo usando una prueba ELISA como se describió 20 arriba. El control en estos experimentos consistió de célwtes cargadas y sensibilizadas pasadas a través del sistema en ausencia de ultrasonido. También es importante notar que la circulación de células normales a través del sistema mientras se suministra el ultrasonido, no produce daño aparente según se determinó por la falta de hemoglobina en los sobrenadantes después del tratamiento.

Resultados del eiemoto 9 Los resultados se muestran en la figura 12 y muestran las cantidades detedables de anticuerpo liberadas del vehículo a entre 2 y 5 minutos de tratamiento con ultrasonido. Se detectó poco o nada de anticuerpo en las muestras de control que consistieron de las células cargadas y sensibilizadas, circuladas a través del sistema en ausencia de ultrasonido. Los resultados demuestran que el fenómeno de sensibilización por ultrasonido está intacto a 37°C, y que se obtiene liberación mediada por ultrasonido de la carga útil a hematocrito alto (HCT, esto es, 40%) y en un sistema de objetivo móvil. Todas las publicaciones mencionadas en la especificación anterior se incoforan aquí como referencia. Varias modificaciones y variaciones de los métodos y el sistema descritos de la invención serán evidentes para los expertos en la materia, sin apartarse del espíritu y alcance de la invención. Aunque la invención se ha descrito con respecto a modalidades específicas, se debe entender que la invención reclamada no se debe limitar indebidamente a tales modalidades específicas. En realidad, varias modificaciones de los modos descritos para llevar a cabo la invención, que son obvias para los expertos en biología molecular o en campos relacionados, están consideradas dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.

Claims (1)

1. *< NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES 5 1.- Un método vitro de producción de un glóbulo rojo adecuado * para suministrar un agente a un vertebrado, el método comprendiendo: (a) proveer un glóbulo rojo; (b) presensibilizar el glóbulo rojo; y (c) cargar el glóbulo rojo con un agente. « 2.- El método de conformidad con la reivindicación 1f en dónde ia 10 » cantidad de agente que se carga en un glóbulo rojo sensibilizado es más alta que la cantidad cargada en un glóbulo rojo que no está presensibifizado. 3.- El método de conformidad con la reivindicación 1 o Z, caracterizado además porque comprende el paso de electrosensibilízar la célula para hacerla más susceptible a rompimiento por exposición a un 15 estímulo; el paso de carga y el paso de electrosensibilftación siendo realizados en cualquier orden. 4.- Un método in vitro para liberar selectivamente un agente de un glóbulo rojo, que comprende los pasos de: (a) presensibflízar un glóbulo « * rojo; (b) cargar la célula con un agente; (c) electrosensibilizar la célula; (d) £0 ocasionar que el agente sea liberado de la célula sensibilizada por aplicación de ultrasonido a una frecuertda y energía sufidentes para causar rompimiento de la oélula sensibilizada, pero insuficientes para causar rompimiento de glóbulos rojos no sensibilizados; en donde los pasos (b) y (c) se pueden realizar en cualquier orden. 5.- El método de conformidad con la reivindicación 4, en donde el glóbulo rojo es PEGilado después de ser electrosensibilizado. 6.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el paso de presensibilización y el paso de electrosensibilización son un procedimiento in vitro o ex vivo. 7.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la presensibilización comprende un paso de aplicación de un campo eléctrico al glóbulo rojo. 8.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la presensibilización comprende un paso de aplicación de ultrasonido al glóbulo rojo. 9.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el glóbulo rojo es cargado con el agente por medio de diálisis hípotónica. 10.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicadones 3 a 9, en donde la electrosensibilización comprende el paso de aplicar un campo eléctrico al glóbulo rojo. 11.- El método de conformidad con la reivindicación 10, en donde el campo eléctrico es de aproximadamente 0.1 kV/cm a aproximadamente 10 kV/cm bajo condiciones in vitro. 12.- El método de conformidad con la reivindicación 10 o 11, en donde el campo eléctrico se aplica por entre 1 µs y 100 ms. 13.- El método de conformidad con cualquiera de tes reivindicactones 3 a 12, en dónde la electrosensibílizadón del 'glóbulo rojo se realiza después de cargar el agente. 14.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 12, en donde la electrosensibilizadón del glóbulo rojo se realiza antes de cargar el agente. 15.- El método de conformidad con cualquiera de tes reivindicaciones precedentes, en donde el ultrasonido se selecciona del grupo que consiste de ultrasonido diagnóstico, ultrasonido terapéutico y una combinación de ultrasonido diagnóstico y terapéutico. 16.- El método de conformidad con la reivindicación 15, en donde la fuente de energía ultrasónica aplicada está a un nivel de potencia de aproximadamente 0.05 W/cm2 a aproximadamente 100 W/cm2. 17.- Un vector de suministro de glóbulo rojo que ha sido presensibilizado, de modo que es susceptible de ser cargado con una cantidad más grande de un agente que un glóbulo rojo que no ha sido présensibilizado. 18.- El vector de suministro de glóbulo rojo de conformidad con te reivindicación 17, caracterizado además porque ha sido presensibilizado por exposición a un campo eléctrico y/o ultrasonido. 19.- El vector de suministro de glóbulo rojo de conformidad con te reivindicación 17 o 18, el cual es sensibilizado para hacerlo más susceptible a rompimiento por exposición a un estímulo. 20.- El vector de suministro de glóbulo rojo de conformidad con la reivindicación 17, 18 o 19, el cual es cargado con un agente para ser liberado. 21.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, o el vector de suministro de glóbulo rojo de conformidad con la reivindicación 17, 18 o 19, en donde el agente se selecciona de un grupo que consiste de una proteína, un polipéptido, uh péptido, un ácido nucleico, un ácido nucleico peptídico (PNA), un virus, un ? partícula similar a virus, un nucleótido, un ribonucleótído, un desoxirribonucleótido, un desoxirribonucleótido modificado, un heterodúplex, una nanopartícula, un análogo sintético de un nucleótido, un análogo sintético de un ribonucleótido, un nucleótido modificado, un ribonucleótido modificado, un aminoácido, un análogo de aminoácido, un aminoácido modificado, un análogo de aminoácido modificado, un esteroide, un proteoglícano, un lípido, un ácido graso, un oligoscárido, una glícoproteína, un carbohidrato, y mezclas, fusiones, combinaciones o conjugados de los anteriores. 22.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicadones 1 a 16 y 21, o el vedor de suministro de glóbulo rojo de conformidad con la reivindicación 17, 18, 19 o 21, en donde el agente está conjugado, fusionado, mezclado o combinado con un agente de imagen. 23.- Un vector de suministro de glóbulo rojo obtenible por medio de un método que comprende: (a) presensibilizar un glóbulo rojo mediante electrosensibilización de la célula; (b) cargar la célula con un agente; y (c) lecfrosensibilizar la célula, en donde los pasos (b) y (c> se pueden realizar en cualquier orden. 24.- El uso de un campo eléctrico y/o ultrasonido para incrementar la eficiencia de carga de un agente en un glóbulo rojo. 25.- Un método in vitro de presensibilización de un glóbulo rojo x>n un campo eléctrico y/o ultrasonido, caracterizado porque la cantidad de agente que puede ser cargada en el glóbulo rojo presensibifizado es más alta que la que puede ser cargada en un glóbulo rojo que no está presensibilizado. 26.- Un equipo que comprende un glóbulo rojo preparado por medio de un método como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, 21 y 22, o un vector de suministro de glóbulo rojo como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 17 a 23, materiales de embalaje para el mismo e instrucciones de uso. 27,- Un equipo que comprende un glóbulo rojo, un agente, materiales de embalaje para los mismos e instrucciones de uso en un método que comprende los pasos de: (a) presensibilizar el glóbulo rojo; (b) cargar la célula con un agente; (c) electrosensibilizar ta célula; y (d) ocasionar que el agente sea liberado de la célula sensibilizada aplicando ultrasonido a una frecuencia y energía suficientes para ocasionar rompimiento de la célula sensibilizada, pero insuficiente para ocasionar rompimiento de glóbulos rojos BP sensibilizados; en donde los pasos (b) y (c) se pueden realizar en cualquier orden. 28.- Un equipo que comprende un glóbulo rojo presensibilizado .4 el líquido se selecciona dei grupo que consiste de un regulador de pH salino, un regulador de pH fisiológico, suero y^plasma. 33.- Una composición farmacéutica que comprende un glóbulo rojo preparado por medio de un método como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, 21 y 22, o un vector de suministro de glóbulo rojo como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 17 a 23, junto con un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. 34.- Un dispositivo para producir un vector de suministro de glóbulo rojo como el que se reclama en la presente invención, dicho dispositivo comprendiendo: (a) una o más celdas de flujo y medios de electrosensibilizadón; (b) uno o más sistemas de diálisis, en donde la celda de flujo está unida al sistema de diálisis medíante medios de cortexión capaces de permitir te transferencia de glóbulos rojos de la celda de flujo al sistema de diálisis y viceversa. ? 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