MXPA01006822A - Hidrolizado de proteina de leche para enfrentar un desorden oseo o den - Google Patents

Abstract

Se describe una composición para la prevención o el tratamiento de un desordenóseo o dental, que comprende un hidrolizado de proteína de leche, el uso del hidrolizado de proteína de leche en la fabricación de una composición para el tratamiento o prevención de un desordenóseo o dental, y un método de tratamiento que comprende el administrar una cantidad efectiva de un hidrolizado de proteína de leche. En las modalidades preferidas, el hidrolizado de proteína de leche es un hidrolizado de caseína, en particular un caseinoglucomacropéptido (CGMP), un mimético, homólogo o fragmento del mismo en una forma biodisponible que conserva la habilidad del CGMP para inhibir la resorciónósea o la pérdidaósea;o favorecer la absorción del calcio, la retención o la calcificación o una combinación de los mism

Description

HIDROLIZADO DE PROTEINA DE LECHE PARA ENFRENTAR UN DESORDEN ÓSEO O DENTAL DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere al uso de un hidrolizado de proteína de leche en la fabricación de una composición para el tratamiento o prevención de un desorden óseo o dental; y a un método de tratamiento o prevención de un desorden óseo o dental que comprende la administración de una cantidad efectiva del hidrolizado de proteína de leche. Dentro del contexto de esta especificación, la palabra "comprende" se entiende que significa "incluye, entre otras cosas" . No se pretende que sea considerada como "consiste únicamente de" . Dentro del contexto de esta especificación, el término "biodisponible" significa capaz de cruzar la barrera intestinal y ser recuperada en una forma activa en la sangre. El término "desorden óseo o dental" se entiende que significa una condición en la cual está implicado el calcio y afecta la salud del tejido óseo incluyendo absorción, retención o resorción de calcio, o calcificación.

Se utiliza CGMP como una abreviatura para caseino-glucomacropéptido, CGMP-Ca y CGMP-Na se utilizan como abreviaturas para las sales de calcio y de sodio del mismo. Un nombre alternativo para el caseino-glucomacropéptido es k-caseinogluco-péptido . "Hidrolizado de Proteína de Leche" se pretende que signifique un polipéptido que puede ser extraído de la leche, después de al menos hidrólisis parcial por ejemplo, con la enzima tripsina. "Polipéptido" se refiere a cualquier polipéptido o proteína que comprende dos o más aminoácidos unidos mediante enlaces peptídicos o enlaces peptídicos modificados por ejemplo, isósteros de péptido. Estos pueden contener aminoácidos diferentes de los 20 aminoácidos codificados por el gen. "Polipéptidos" incluye secuencias de aminoácidos modificadas ya sea mediante procesos naturales ya sea como procesamiento post- traduccional , o mediante técnicas de modificación química que son bien conocidos en la técnica. Tales modificaciones son bien descritas en los textos básicos y con más detalle en monografías, así como en el literatura de investigación voluminosa. Las modificaciones pueden ocurrir en cualquier lugar en un polipéptido, incluyendo la cadena principal del péptido, las cadenas laterales de aminoácido y los extremos carboxilo o amino. Se apreciará que el mismo tipo de modificación puede estar presente al mismo grado o variar en diversos sitios en un polipéptido dado. También, un polipéptido dado puede contener muchos tipos de modificaciones. Los polipéptidos pueden ser ramificados como resultado de ubiquitinación o éstos pueden ser cíclicos, con o sin ramificación. Los polipéptidos cíclicos, ramificados o cíclicos ramificados pueden resultar de procesos naturales de post- traducción o pueden ser realizados mediante métodos sintéticos. Las modificaciones incluyen acetilación, acilación, ADP-ribosilación, amidación, acoplamiento covalente de flavina, acoplamiento covalente de una porción hemo, acoplamiento covalente de un nucleótido o derivado de nucleótido, acoplamiento covalente de un lípido o derivado de lípido, acoplamiento covalente de fosfotidilinositol , reticulación, ciclización, formación de enlace disulfuro, desmetilación, formación de reticulaciones covalentes, formación de cistina, formación de piroglutamato, formilación, gamma-carboxilación, glucosilación, formación de ancla GPI, hidroxilación, yodación, metilación, miristoilación, oxidación, procesamiento proteolítico, fosforilación, prenilación, racemización, selenoilación, sulfatación, adición de aminoácidos a proteínas, mediada por transferencia de ARN, tales como arginilación, y ubiquitinación (ver, por ejemplo, PROTEINS -STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2a. ed., T.E. Creighton, .H. Freeman and Company, New York, 1993; old, F., Posttranslational Protein Modifications: Perspectives and Prospects, páginas 1-12 en POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B.C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, 1983; Seifter, y colaboradores, "Análisis for protein modifications and nonprotein cofactors" , Meth Enzymol (1990) 182: 626-646 y Rattan, y colaboradores, "Protein Syntesis: Post-translational Modifications and Aging", Ann NY Acad Sci (1992) 663: 48-62) . Dentro del contexto de esta especificación los términos "mimético" y "homólogo" son como se definen en la técnica y significan variantes que retienen la actividad establecida. "Variante" se refiere a un polipéptido que difiere de un polipéptido de referencia, pero que retiene propiedades esenciales. En general, las diferencias se limitan a aquéllas de las secuencias del polipéptido de referencia y las variantes son casi completamente similares y, en muchas regiones, idénticas. Un polipéptido de referencia y una variante puede diferir en la secuencia de aminoácidos por una o más sustituciones, adiciones, supresiones en cualquier combinación. Un residuo de aminoácido sustituido o insertado puede o no ser codificado por un código genético. Una variante de un polipéptido puede ser de un origen natural tal como una variante alélica, o ésta puede ser una variante que no es conocida como de origen natural . Las variantes de origen no natural de polinucleótidos y polipéptidos pueden ser realizadas mediante técnicas de mutagénesis o mediante síntesis directa. "Homología" , como se conoce en la técnica es una relación entre dos o más secuencias polipeptídicas, como se determina mediante la comparación de secuencias. En la técnica, "identidad" también significa el grado de similitud secuencial entre las secuencias de polipéptidos o polinucleótidos como pueda ser el caso, como se determina mediante la concordancia de cadenas de tales secuencias. La "identidad" u "homología" pueden ser fácilmente calculadas mediante métodos conocidos, incluyendo pero no limitados a aquéllos descritos en (Computational Molecular Biology, Lesk, A.M. , ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing : Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed. , Academic Press, Nueva York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Parte I, Griffin, A.M., y Griffin, H.G. eds., Humana Press, Nueva Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. Y Devereux, J., eds., M Stockton Press, Nueva York, 1991; y Carillo, H., y Lipman, D., SIAMJ. Applied Math., 48: 1073 (1998). Los métodos preferidos para determinar la identidad están diseñados para dar la concordancia más grande entre la secuencias probadas. Los métodos para determinar el grado de identidad u homología se codifican en programas de computadora disponibles públicamente. Los métodos de programa de computadora preferidos para determinar la identidad o la similitud entre dos secuencias incluyen, pero no están limitados a, el paquete de programa GCG (Devereux, J., y colaboradores, Nucleic Acids Research 12 (1): 387 (1994)), BLASTP, BLASTN, y FASTA (Atschul, S.F., y colaboradores, J. Molec. Biol.. 215: 403-410 (1990) . El programa BLAST X es públicamente disponible de NCBI y otras fuentes (BLAST Manual, Altschul, S., y colaboradores, NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894; Altschul, S., y colaboradores, J. Mol. Biol.. 215: 403-410 (1990) . El algoritmo de Smith Waterman bien conocido, puede también ser utilizado para determinar la identidad. Los parámetros preferidos para la comparación de secuencia de polipéptidos incluyen los siguientes: Algoritmo: Needleman, y colaboradores, J. Mol. Biol.. 48 : 443-453 (1990) . Matriz de comparación: BLOSSUM62 de Hentikoff y Hentikoff, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 89:10915-10919 (1992) . Penalidad por Espacio Vacío: 12; Penalidad por Longitud de Espacio Vacío: 4. Un programa útil con estos parámetros es públicamente disponible como el programa "gap" (espacio vacío) de Genetics Computer Group. Los parámetros anteriormente mencionados son los parámetros por omisión para las comparaciones de péptidos (junto con la no penalidad para espacios vacíos de extremo) . BLAST, que significa Basic Local Alignment Searcch Tool (Altschul SF (1993) J. Mol Evol 36: 290-300; Altschul, SF y colaboradores (1990) J. Mol Biol 215: 403-10), produce alineamientos tanto de secuencias de nucleótidos como de aminoácidos para determinar la similitud de secuencias. Debido a la naturaleza local de los alineamientos, BLAST es especialmente útil para determinar las concordancias exactas o en la identificación de homólogos. Otros algoritmos, por ejemplo descritos en Smith R F y T F Smith (1992 Protein Engineering 5: 35-51), pueden ser utilizados cuando se trata con patrones de secuencia primaria y penalidades por espacio vacío de estructura secundaria. El procedimiento BLAST (1993; Proc Nat Acad Sci 90: 5873-7), incorporado en la presente por referencia, busca concordancias entre una secuencia en duda y una secuencia de base de datos, para evaluar la significancia estadística de cualesquiera concordancias encontradas, y para reportar únicamente aquellas concordancias que satisfagan el umbral o significancia seleccionados por el usuario. En esta solicitud, el umbral es ajustado al menos a 40% de identidad u homología. CGMP es un hidrolizado de proteína de leche. Este es un macropéptido sialinado y representa aproximadamente 40% de la fracción de K-caseina. CGMP puede ser generado de diversas maneras, incluyendo digestión intestinal de la K-caseina donde éste es el producto de la primera hidrólisis resultante de la acción de proteasas gástricas (quimosina y/o pepsina) . CGMP es también liberado por la acción de quimosina durante la fase primaria de la coagulación de la leche y entra en la fracción del suero de leche (suero de leche dulce) , mientras que la parte N-terminal de K-caseina co-precipita con las fracciones de caseína. CGMP puede entonces ser industrialmente separado del suero de leche dulce y eluido en la forma de sodio-CGMP (NaCGMP) , calcio-CGMP (CaCGMP) que es generado a partir de NaCGMP mediante un paso adicional . Es conocido que CGMP puede adherirse a diferentes tipos de superficies, por ejemplo, poliestireno (J.R. Neeser y colaboradores, Infection and Immunity, 56, 12, 3201-3208, 1988) e hidroxiapatita recubierta con saliva (J. R. Neeser y colaboradores, Oral Microbiol Immunol, 9, 193-201, 1994), con lo cual se previene la adherencia bacteriana a los dientes recubiertos con película. Esto puede de esta manera proteger contra la caries mental mediante la inhibición de la adherencia de las bacterias cariogénicas que inducen la caries. B. Chabance y colaboradores (Biochimie 80, 155-165, 1998) han mostrado que después de la alimentación, diversos derivados de a-, ß- o K-caseinas, incluyendo CGMP, pueden ser detectados en el estómago y en la sangre por hasta 8 horas y esto indica que CGMP puede cruzar la barrera intestinal. Hasta la fecha, la acción biológica principal que ha sido atribuida a los péptidos absorbidos es la reducción de la agregación plaquetaria o la coagulación sanguínea. Se ha sido mostrado que mecanismo para esta acción se debe a las homologías estructurales que existen entre el fibrinógeno y el undecapéptido de CGMP (residuos 106-116) . Se ha demostrado en una serie de experimentos in vi tro e in vi vo que este undecapéptido puede enlazarse a receptores de integrina sobre plaquetas activadas, a las cuales se enlaza normalmente la cadena gamma de fibrinógeno y con lo cual se reduce la coagulación. Un ejemplo de un desorden óseo que es reconocido como un problema de salud pública mayor es la osteoporosis. Por supuesto, las fracturas por osteoporosis post-menopaúsicas afectan aproximadamente a 1.5 millones de personas por año. Aproximadamente 300,000 nuevos casos de fracturas de cadera, 650,000 de vértebras y 200,000 de antebrazo distal por osteoporosis son reportados anualmente en los Estados Unidos. La mortalidad en los primeros años después de las fracturas de cadera alcanza 20% (AMER. J. Epidem. 1001-1005 (1993)) y el costo estimado del tratamiento para estos pacientes está en el intervalo de 6-10 mil millones de dólares anualmente. Mientras que diversos fármacos efectivos son disponibles para reducir la pérdida ósea, existen también oportunidades para alternativas nutricionales que pudieran ser utilizadas en combinación con o independientemente de los fármacos. La investigación hasta la fecha sobre la investigación nutricional de la pérdida ósea se ha enfocado principalmente en los nutrientes más clásicos, tales como el calcio y la vitamina D. Existe un límite, no obstante, para la habilidad de los nutrientes clásicos para prevenir la pérdida ósea. Notablemente, se ha encontrado ahora que una composición que comprende CGMP tiene un efecto positivo sobre el mantenimiento de la salud ósea o dental o el tratamiento de desórdenes óseos o dentales . En pruebas in vi tro, se encontró que CGMP reduce también la actividad de las células de degradación ósea (osteoclastos) e incrementa la actividad de las células formadoras de hueso (osteoblastos) indicando beneficios potenciales de CGMP para la salud ósea. En un modelo de desarrollo animal de pérdida ósea se encontró que CaCGMP reduce significativamente la pérdida ósea y existió mayor retención de calcio en animales que consumieron ya sea CaCGMP y NaCGMP en pruebas in vi tro sobre la formación ósea y las células de degradación ósea (por ejemplo, osteoblastos y osteoclastos) . Además, se ha encontrado que CaCGMP y NaCGMP puede reducir la pérdida ósea en un modelo animal de pérdida ósea menopáusica (la rata ovariectomizada) . Además, se ha encontrado que diferentes formas de CGMP y sus péptidos tienen beneficios para la salud ósea en diferentes etapas del ciclo de vida. Los efectos de CGMP son inesperados debido a que aunque el efecto benéfico de la leche para beber es bien descrito se ha encontrado ahora sorprendentemente que un hidrolizado de proteína de leche tiene un efecto sobre la prevención o el tratamiento de un desorden óseo o dental . No obstante, no existe indicación en la técnica anterior del uso de un hidrolizado de proteína de leche, en particular CGMP, para la prevención o tratamiento de un desorden óseo, por ejemplo mediante la inhibición de resorción ósea o pérdida ósea; o que favorezca la absorción o la retención de calcio, o la calcificación; o una combinación de los mismos en un mamífero. La presente invención está dirigida a los problemas descritos anteriormente. En consecuencia, en un primer aspecto la invención proporciona una composición para la prevención o el tratamiento de un desorden óseo o dental, que comprende un hidrolizado de proteína de leche . En un segundo aspecto, la invención proporciona el uso de un hidrolizado de proteína de leche en la fabricación de una composición para el tratamiento o prevención de un desorden óseo o dental . En un tercer aspecto, la invención proporciona un método para el tratamiento de un desorden óseo o dental, que comprende la administración de una cantidad efectiva de un hidrolizado de proteína de leche. Una ventaja de la presente invención, es que ésta proporciona una composición que puede ser administrada oralmente. Esta es más segura y más conveniente para un paciente que un tratamiento convencional administrado mediante inyección. Preferentemente, el hidrolizado de proteína de leche es capaz de inhibir la resorción ósea o la pérdida ósea; o favorecer la absorción de calcio, la retención o la calcificación; o una combinación de los mismos . Preferentemente, el hidrolizado de proteína de leche comprende un hidrolizado de caseína, más preferentemente un caseino-glucomacropéptido (CGMP) , un mimético, homólogo o fragmento del mismo en una forma biodisponible que conserva la habilidad de CGMP para inhibir la resorción ósea o la pérdida ósea,- o favorece la absorción o la retención de calcio, o la calcificación; o una combinación de los mismos. Más preferentemente, éste es una sal de sodio o de calcio de CGMP o una mezcla de los mismos. Más preferente, ésta es la sal de sodio de CGMP. Preferentemente, la cantidad de CGMP en una modalidad de la composición es de aproximadamente 0.01% hasta aproximadamente 10% en peso de materia seca, y preferentemente aproximadamente 0.5% hasta aproximadamente 5% en peso de materia seca. Preferentemente, una modalidad de la composición comprende calcio. Preferentemente, una composición de acuerdo a una modalidad de la invención comprende aproximadamente 15% hasta aproximadamente 64% de RDA de calcio por 250 g (RDA de calcio es 1000 mg) ; por ejemplo 75 mg hasta aproximadamente 320 mg por 125 g de la composición. Más preferentemente, éste comprende de aproximadamente 50% de RDA de calcio por 250 g; por ejemplo 250 mg por 125 g de la composición. Preferentemente, una modalidad de la composición comprende una fuente de proteína y al menos 0.01% en peso con base en la materia seca de CGMP en una forma biodisponible. Como una fuente de proteína, una proteína dietética es preferentemente utilizada en una forma apropiada. La proteína de leche, proteína de suero de leche, proteína de soya o una mezcla de dos o más de las mismas son particularmente preferidas. La composición puede también contener una fuente de carbohidratos y/o una fuente de grasa. Preferentemente, la invención proporciona un suplemento alimenticio y/o un producto alimenticio que contiene al menos 0.01% en peso con base en la materia seca de CGMP en una forma biodisponible, para la inhibición de la resorción ósea o la pérdida ósea; o favorecer la absorción de calcio, la retención o la calcificación; o una combinación de los mismos en un mamífero. Preferentemente, la composición comprende una fuente de carbohidratos, una fuente de grasa o una fuente de proteína o una combinación que comprende al menos dos de los mismos. Más preferentemente, ésta comprende desde aproximadamente 15 hasta aproximadamente 25% de calorías totales de proteína, desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 30% de calorías totales de grasa, y desde aproximadamente 40 hasta aproximadamente 60% de calorías totales de carbohidratos. Preferentemente, al menos una porción de la proteína se proporciona como caseinoglucomacropéptido (CGMP) . Preferentemente, la composición comprende minerales y vitaminas suficientes para cumplir con los requerimientos diarios.

Preferentemente, la composición nutricional se incorpora en una fórmula alimenticia, por ejemplo una fórmula infantil. Preferentemente, la composición comprende desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 50 gramos, preferentemente desde 5 hasta aproximadamente 25 gramos, y más preferentemente desde 5 hasta aproximadamente 10 gramos de CGMP por 100 g de fórmula alimenticia . Preferentemente, la composición es administrada para proporcionar suficiente CGMP para inhibir la resorción ósea o la pérdida ósea; o favorecer la absorción de calcio, la retención o la calcificación; o una combinación de los mismos en humanos o animales de compañía. La cantidad exacta debería ser determinada sin dificultad al administrar CGMP hasta que se observe el efecto correcto. La dosis de CGMP es preferentemente desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 50 gramos por día, más preferentemente desde 9 hasta aproximadamente 18 gramos por día, y más preferentemente desde 3 hasta aproximadamente 6 gramos por día consumidos dos o tres veces a lo largo de un día. Preferentemente, CGMP es obtenido mediante un tratamiento de intercambio iónico de una materia prima láctea líquida que contiene CGMP. Los materiales iniciales adecuados de origen lácteo pueden incluir por ej emplo : el producto de la Hidrólisis con cuajo de una caseína nativa obtenida mediante precipitación acida de leche descremada con un ácido mineral o fermentos acidificantes, opcionalmente con adición de iones calcio, el producto de hidrólisis de un caseinato con cuajo, un suero de leche dulce obtenido después de la separación de caseína coagulada con cuajo, un suero de leche dulce o tal como un suero de leche desmineralizado, por ejemplo, mediante electrodiálisis y/o intercambio iónico y/u osmosis inversa, un concentrado del suero leche dulce, un concentrado de proteína de suero de leche obtenido mediante ultrafiltración y diafiltración de suero de leche dulce, licores madre de la cristalización de lactosa proveniente de un suero de leche dulce, un permeado de ultrafiltración de un suero de leche dulce.

Un método preferido para la obtención de CGMP se describe, por ejemplo, en la solicitud de patente internacional WO 98/53702 e incluye la descationización de la materia prima líquida, tal que el pH tiene un valor de 1 hasta 4.5, poniendo al líquido en contacto con una resina aniónica débil de matriz hidrofóbica, predominantemente en forma alcalina hasta un pH estabilizado, luego la separación de la resina y el producto líquido que es recuperado, y la desorción de CGMP a partir de la resina. Preferentemente, una composición de acuerdo a una modalidad de la invención comprende una bacteria probiótica. Preferentemente, la bacteria es una bacteria de ácido láctico. Más preferentemente, ésta se selecciona del grupo que comprende Lactobacillus acidophilus , Lactobacillus crispatus , Lactobacillus amylovorous , Lactobacillus gallinarum, Lactobacillus gasseri y Lactobacillus johnsonii ; Lactobacillus paracasei , Lactobacillus reuteri , Lactobacillus hheellvveettiiccuuss,, Lactobacillus brevis; Lactobacillus fermentu ; Lactobacillus plantarum; Lactobacillus casei particularmente L. casei, Lactobacillus paracasei y L. rhamnosus ; Lactobacillus delbrueckii particularmente L. delbrueckii subsp lactis, L. delbruecki subsp. Delbruecki y L. delbrueckii subsp. Bulgaricus; y bifidobacteria, particularmente Bifidobacterium in ant s , Bifidobacterium breve, Bifidobacterium adolescentis , Bifidobacterium lactis Bifidobacterium longum; y Leuconostoc mensenteroides particularmente L . mesenteroides subsp cre oris . Más preferentemente, la bacteria es Lactobacill us acidophilus LalO (ATCC 11975) . Una ventaja proporcionada por estas bacterias es que éstas tienen un efecto positivo impresionante sobre el mejoramiento de la absorción de calcio. Notablemente, los efectos sobre la formación ósea y la resorción ósea son particularmente sorprendentes cuando la composición comprende Lactobacill us acidophilus LalO (LalO) . Preferentemente, una composición de acuerdo a una modalidad de la invención comprende desde aproximadamente 107 hasta aproximadamente 109 ufc/ml o /g de bacteria probiótica. Más preferentemente, ésta comprende desde aproximadamente 108 ufc/ml de bacteria probiótica . Preferentemente, una dosis de aproximadamente 250 hasta aproximadamente 300 g de una composición de acuerdo a una modalidad de la invención, es proporcionada por dos dosis al día. Más preferentemente, la dosis es de aproximadamente 250 por día, por ejemplo dos dosis de aproximadamente 125 por día.

Preferentemente, una modalidad de una composición de acuerdo a la invención comprende nutrientes/no nutrientes seleccionados del grupo que comprende: entre aproximadamente 15 y aproximadamente 50% de RDA por 250 g de la composición de magnesio, citrato-malato de calcio o citrato-lactato de calcio; o calcio, fósforo, hierro, yodo, zinc, cobre, selenio de leche; desde aproximadamente 7.5 hasta aproximadamente 25% de RDA por 125 g de la composición de vitaminas D, D3, A, Bl, B2, B6, B12, C, E, K, niacina, ácido fólico, ácido pantoténico, entre aproximadamente 15 y aproximadamente 33% de RDA por 125 g de la composición de biotina; de aproximadamente 6 hasta aproximadamente 40 g por 250 de probióticos (por ejemplo, fibras, celulosa) , de aproximadamente 50 mg a aproximadamente 2 g por 250 g de la composición de péptido de caseína (CPP) ; desde aproximadamente 25 hasta aproximadamente 50 mg por 250 g de la composición de isoflavona; desde aproximadamente 1.5 hasta aproximadamente 2.5 ng por mg de proteína de péptido bioactivo derivado de leche por ejemplo TGF-, PTHrp . Características y ventajas adicionales de la presente invención se describen en, y serán aparentes a partir de la descripción de las modalidades actualmente preferidas que se describen más adelante con referencia a los dibujos, en los cuales: La Figura 1 muestra los niveles de excreción media de [H3] -tetraciclina y las barras de error estándar para control, los grupos NaCGMP y CaCGMP.

Cada línea representa la excreción de [H3] -tetraciclina (resorción ósea) para cada grupo en un periodo de 13 días . La Figura 2 muestra el efecto de CaCGMP y NaCGMP a largo plazo de la pérdida de densidad ósea trabecular en la rata ovariectomizada . Notablemente, se ha encontrado que diferentes formas de CGMP (NaCGMP y CaCGMP) tienen efectos biológicos sobre la absorción de calcio y el metabolismo óseo. Sin desear comprometerse por teoría alguna, se lanza la hipótesis de que CaCGMP (que contiene 2.3% de calcio) puede mantener el calcio de una manera soluble en el intestino, de una manera similar a los fosfopéptidos de caseína e incrementar de este modo la biodisponibilidad del calcio. En segundo lugar, a la luz de sus propiedades anti-adhesión y afinidad por la hidroxipatita, se emite la hipótesis de que los péptidos de CGMP pueden tener una acción biológica directa sobre el hueso, tal vez mediante el deterioro de la adhesión de los osteoclastos a la superficie ósea y por lo tanto la reducción de la pérdida ósea. En apoyo a esta hipótesis, los estudios mostraron que la forma de Na de CGMP reduce la actividad de resorción ósea de los osteoclastos en aislamiento sobre rebanadas de dentina. Con el fin de probar la hipótesis, se estudiaron los efectos de las composiciones que comprenden dos formas de CGMP (NaCGMP y CaCGMP) , a aproximadamente a 4.5% de la dieta total, sobre pérdida ósea en la rata marcada con tetraciclina, el cual es un modelo animal validado de pérdida ósea (Am. J. Physiol 259: R679-R689) . Bajo circunstancias de pérdida ósea "inducida" , este modelo ha mostrado ser altamente sensible a inhibidores farmacológicos y no farmacológicos de pérdida ósea (por ejemplo, bisfosfonatos, componentes derivados de vegetales) dentro de un corto espacio de tiempo (<14 días) . Además, debido a la factibilidad de la recolección diaria de orina y de las heces durante el periodo experimental, fue posible utilizar este modelo para medir la cantidad de calcio que fue absorbido, retenido y excretado (por ejemplo, balance de calcio) . En resumen, este modelo animal de pérdida ósea fue considerado que es suficientemente versátil y sensible para probar los efectos a corto plazo de CGMP derivado de la dieta, sobre la pérdida ósea y la absorción de calcio . Preferentemente, una modalidad de la composición comprende al menos una fuente de proteína y CGMP. La proteína en dieta es preferentemente utilizada como una fuente de proteína. Las proteínas de la dieta pueden ser cualquier proteína de dieta adecuada; por ejemplo proteína animal (tal como proteína de leche, proteína de carne o proteína de huevo) ; proteína vegetal (tal como proteína de soya, proteína de trigo, proteína de arroz, o proteína de chícharo) ; una mezcla de aminoácidos libres; o una combinación de los mismos . La proteína de leche tal como caseína, proteína de suero de leche o proteína de soya, son particularmente preferidas. La composición también puede contener una fuente de carbohidratos y/o una fuente de grasa. Una modalidad preferida de la composición comprende una fuente de grasa, la fuente de grasa preferentemente proporciona de aproximadamente 5% hasta aproximadamente 55% de la energía de la fórmula nutricional; por ejemplo de aproximadamente 20% hasta aproximadamente 50% de la energía. Los lípidos que constituyen la fuente de grasa, puede ser de cualquier grasa adecuada o mezcla de grasas. La grasa vegetal es particularmente adecuada; por ejemplo aceite de soya, aceite de palma, aceite de coco, aceite de cártamo, aceite de girasol, aceite de maíz, aceite de cañóla, lecitinas, o similares, o una mezcla de dos o más de los mismos. La grasa animal tal como grasa de leche, también puede ser agregada si se desea. Una modalidad preferida de la composición comprende una fuente de carbohidratos . Esta preferentemente proporciona de aproximadamente 40% hasta aproximadamente 80% de la energía de la composición nutricional. Cualquier carbohidrato adecuado puede ser utilizado, por ejemplo, sucrosa, lactosa, glucosa, fructosa, sólidos de jarabe de maíz y maltodextrinas, o una mezcla de dos o más de los mismos. Una modalidad preferida de la composición comprende fibra de dieta. Si se utiliza, ésta preferentemente comprende hasta aproximadamente 5% de la energía de la fórmula nutricional. La fibra de dieta puede ser de cualquier origen adecuado, incluyendo por ejemplo soya, chícharo, avena, pectina, goma guar, goma arábiga, fructo-oligosacárido o una mezcla de dos o más de los mismos. Una modalidad preferida de la composición comprende uno o más vitaminas y/o minerales adecuados que pueden ser incluidos en una modalidad de la composición, en una cantidad para cumplir los lineamientos apropiados. Una modalidad preferida de la composición comprende uno o más emulsificantes de grado alimenticio, que pueden ser incorporados en la fórmula nutricional si se desea; por ejemplo, los esteres del ácido diacetil-tartárico de mono- y di-glicéridos, lecitina, y mono- y di-glicéridos o una mezcla de dos o más de los mismos. Similarmente, las sales y estabilizadores adecuados pueden ser incluidos. Una modalidad preferida de la composición es administrable en forma enteral ; por ejemplo en la forma de un polvo, un concentrado líquido, o una bebida lista para beber. Si se desea producir una versión en polvo de una fórmula nutricional, la mezcla homogeneizada es transferida a un aparato de secado adecuado tal como un secador por rocío o liofilizador y convertido a polvo. En una modalidad adicional, un producto alimenticio típico puede ser enriquecido con CGMP. Por ejemplo, una leche fermentada, un yogurt, un queso fresco, una leche cuajada, una barra de confitería, hojuelas o barra de cereal para desayuno, bebidas, polvos de leche, productos basados en soya, productos fermentados no de leche o suplementos nutricionales para la nutrición clínica. Entonces, la cantidad de CGMP agregada es preferentemente de al menos aproximadamente 0.01% en peso. En una modalidad alternativa, la composición puede ser incorporada en un artículo de confitería, por ejemplo un endulzante, o bebida endulzada. Los siguientes ejemplos se dan a manera de ilustración únicamente y no están diseñados como limitantes de la materia de interés de la presente solicitud. Los porcentajes y partes están en peso, a no ser que se indique de otro modo.

Ejemplo 1: Preparación de CGMP Suero de leche, dulce, de bovino, se concentró a 17% de materia seca, se desmineralizó mediante electrodiálisis, se liberó de cationes sobre una columna de resina catiónica fuerte, se liberó de aniones sobre una columna de resina aniónica débil y se secó por rocío en una torre de secado. Su composición se indica en seguida: % Proteínas (GMP incluido) 11.7 Lactosa 81.7 Ceniza 1 Lípidos 1 Agua cbp 100 El polvo de suero de leche desmineralizado fue solubilizado en agua desionizada. Después de la eliminación de los cationes, la solución tiene un pH inicial de 3.8. En la planta precedente, 392 kg de esta solución se trataron a la temperatura de 8°C, mientras que se agitaba en un reactor en presencia de 23 kg de resina aniónica débil de matriz hidrofóbica basada en poliestireno (IMAC HP 661®, Rohm y Haas, regenerado en forma de OH) por 4 horas . La estabilización del pH a 4.89 indica el final de la reacción. El líquido se retiró y la resina se recuperó como se indica anteriormente. Después de la concentración del líquido hasta 45% de materia seca mediante evaporación, el concentrado se secó por vacío en una torre de secado. El análisis del concentrado mediante HPLC mostró que la reacción eliminó 89% del CGMP inicial. Además, el polvo contenía 9.1% de la proteína de suero de leche, el cual corresponde a un rendimiento de 90% de las proteínas de suero de leche.

Para recuperar CGMP, la resina se lavó sucesivamente con agua desionizada, con 30 litros de una solución acuosa al 0.5% de ácido clorhídrico y con 30 litros de agua desionizada, y el CGMP se eluyó dos veces con 40 litros de solución acuosa al 2% de Ca(0H)2. Se llevó a cabo el enjuague con 30 litros de agua desionizada. Después de la combinación del eluido y los volúmenes de enjuague, la combinación se concentró hasta un volumen de 25 litros mediante ultrafiltración con una membrana que tiene un corte nominal de 3000 daltones. El retenido fue liofilizado y 900 g de CGMP fueron obtenidos, correspondiendo a un rendimiento de 80% con relación al CGMP inicial.

Ejemplo 2: Resorción de Dentina Por Osteoclastos Desagregados, Aislados de Hueso de Rata Materiales y Métodos Se aislaron osteoclastos provenientes de fémur y tibia disectados de ratas de 1 a 2 días de edad. El hueso se cortó con un escalpelo en MEM que contenía sal de Earle con NaHC03 15 mM y 10% de suero fetal bovino (FBS) . La suspensión celular se agregó a rebanadas de marfil y las células se dejaron adherir por 40 minutos de tiempo de incubación. Después del lavado de las células no adherentes, las rebanadas individuales se colocaron en placas de cultivo de tejidos de 48 pozos y se incubaron por 24 horas con medio que contenía 10% de FBS y diferentes concentración de CGMP como se preparó en el Ejemplo 1. Las células fueron fijadas y teñidas para fosfatasa acida resistente al tartrato (TRAP) , un marcador específico para osteoclastos y subsecuentemente fueron contadas. Las células fueron luego retiradas mediante ultrasonido. Después del lavado y secado, las rebanadas fueron chisporroteadas con oro y las depresiones se calificaron utilizando una fuente de luz tangencial. En un experimento, rebanadas de marfil fueron pretratadas con CGMP por 1 hora. Después de esto, el medio que contenía CGMP se retiró y a los osteoclastos se les permitió adherirse a la superficie mineral de la dentina. CGMP y albúmina sérica bovina se disolvieron en alfa-MEM a una concentración de 10 mg/ml unido a aproximadamente a 0.3 hasta 0.4 mM y aproximadamente a 0.2 mM de calcio, respectivamente, como se midió con un electrodo de calcio.

Resultados Los resultados se dan en la Tabla 1. Primeramente, fue evaluado el efecto de CGMP sobre la formación de osteoclastos con el "Ensayo de Resorción de Osteoclastos" . Se agregó CGMP a diferentes concentraciones a las células que comprendían una mezcla de osteoclastos de rata pre- y maduros, osteoblastos que habían sido dejados adherirse a la superficie de las rebanadas de dentina (4.0 x 4.0 x 0.1) mm, antes de agregar la sustancia de prueba. Excepto donde se marcó, todos los cultivos se llevaron a cabo en presencia de suero bovino fetal al 10% (FBS) . Como proteína control se utilizó la albúmina sérica bovina. Las células se cultivaron por 24 horas. Después de esto, se contó el número de células multinucleadas positivas a la fosfatasa acida resistentes al tartrato (TRAP + MNC) , sobre 16 rebanadas de dentina cultivadas individualmente, utilizando dos diferentes combinados de osteoclastos (fila 1) . Después de calificar a los osteoclastos, los mismos fueron retirados mediante ultrasonido.

Después de esto, las rebanadas se lavaron, se secaron al aire y se montaron sobre discos de metal en donde éstas fueron recubiertas por chisporroteo con oro.

Utilizando un microscopio de luz equipado con una fuente de luz tangencial, las excavaciones fueron enumeradas por dos diferentes personas. Los datos muestran el porcentaje de depresiones evaluadas sobre 16 rebanadas de dentina cultivadas individualmente, utilizando dos diferentes combinados de osteoclastos (fila 2) . La fila 3 describe la proporción de depresiones y TRAP + MNC mostradas en las filas 1 y 2. Posteriormente, se investigó el efecto de CGMP cuando la proteína se agregó al medio después de que los osteoclastos se habían acoplado a la superficie mineral. Como se muestra en la Tabla 1, fila 1, CGMP tuvo únicamente un efecto débil sobre el número de osteoclastos. La disminución significativa en 10 mg/ml parece no ser específica ya que la albúmina tuvo un efecto similar. En contraste, el número de depresiones por marfil fue disminuido por CGMP y fue incrementado por la albúmina a una concentración de 10 mg/ml (Tabla 1, fila 2) . Calculando a partir de las filas 1 y 2, el número de depresiones por osteoclastos demostró que CGMP inhibe la actividad de resorción ósea de los osteoclastos desagregados a una concentración de 1 y 10 mg/ml altamente significativa (Tabla 1, fila 3), mientras que la albúmina estimula esta actividad.

Tabla 1: El efecto de CGMP sobre la formación de osteoclastos (fila 1) , sobre la actividad de resorción de los osteoclastos (fila 2) y sobre la actividad de resorción de osteoclastos (fila 3) .

Efectos de CGMP y albúmina Albúmina (mg/ml ) CGMP (mg/ml ) sobre : Ctrl. 1.0 10.0 10.0 Ctrl. 0.01 0.1 1.0 10.0 * - el reclutamiento de osteoclastos (por 100 96 60 40 100 80 80 95 68 ciento de TRAP + MNC/rebanada de dentina) - el número de depresiones de 100 90 180 107 100 72 64 55 35 resorción (Por ciento de depresiones/rebanada de dentina) - la actividad de resorción de 100 85 305 280 100 90 78 58 54 osteoclastos (proporción de depresiones/TRAP+MNC) sin FBS Ejemplo 3: Efectos de CGMP sobre la viabilidad/proliferación de células de osteosarcoma Se determinó el efecto de CGMP sobre la viabilidad de células de osteosarcoma (células similares a osteoblastos) y su proliferación.

Materiales y métodos Cél ulas Células de osteosarcoma HOS58 humanas Esta línea celular se caracterizó como una línea celular altamente diferenciada de osteosarcoma similar a osteoblastos (Kern y colaboradores, 1990, Calcif. Tiss. Int. 46, Suppl . 2, A54), la cual bajo condiciones apropiadas puede ser estimulada hacia un fenotipo altamente diferenciado, como se indica por la expresión y mineralización de los receptores de vitamina D.

Células de osteosarcoma TE85 humanas Esta línea celular se obtuvo de la ATCC (CRL1543), una línea celular de osteosarcoma osteogénico derivada de un sujeto femenino 13y humano. Esta se dejó desarrollar ya sea a alta o a baja densidad, dependiendo de la composición del medio. Estas células se desarrollaron rápidamente como células similares a osteoblastos con características de osteoblastos tempranos deficientemente diferenciados. 2. Ensayo colorimétrico para cuantificar la proliferación y viabilidad celulares con MTT-tetrazolio .

Un método modificado del sistema de ensayo de T. Mosman (J. Immunol . Methods (1983) 65, 55-63) se utilizó para medir la proliferación celular en células en desarrollo y la viabilidad de células en reposo en cultivos detenidos en su desarrollo. Al final de los periodos de tratamiento, ya sea a las 48 ó 72 horas, las células se incubaron por 4 horas con 10 litros de solución de reserva de MTT-tetrazolio (Sigma, 5 mg/m 1 de PBS) por 100 litros de medio de cultivo celular en un incubador de C02 a 37°C. Después del periodo de reacción, la mezcla del medio-sustrato se retiró cuidadosamente mediante la succión y los cristales de formazan azul oscuro se disolvieron toda la noche a 37°C en 100 litros de dodecilsulfato de sodio al 20% (SDS) . Se midió la densidad óptica de la solución colorante a 550 nm.

Resultados Los efectos del CGMP sobre la viabilidad/proliferación celular se llevaron a cabo inicialmente a partir de cultivos celulares de alta densidad, que habían sido primeramente desarrollados por un día en FCS al 10%, seguido por 2 días en FCS al 1% y finalmente por 3 días en medio suplementado con BSA libre de suero, con ambos agentes o a densidad celular inicial inferior por un día con FCS al 10%, seguido inmediatamente por el tratamiento con el CGMP en medio suplementado con BSA libre de suero (tabla 2) .

Tabla 2 : El efecto de CGMP sobre células de osteosarcoma HOS 58 (fila 1) , sobre la reacción a MTT de células de osteosarcoma TE85 humano (fila 2) .

CGMP ( mg/ml ) Ctrl 0.1 0.3 1 3 10 - Efectos de CGMP sobre la reacción a MTT 0.16 0.18 0.19 0.3 0.33 0.37 de células de osteosarcoma HOS 58 - Efectos de CGMP sobre la reacción a MTT 0.17 0.22 0.31 0.43 0.56 de células de osteosarcoma TE85 humano Los resultados de ambas series de experimentos mostraron que los efectos totales fueron similares en ambas condiciones de cultivo. CGMP indujo un incremento dependiente de la dosis en las reacciones de MTT con células TE85 que fueron las que más respondieron al tipo celular hacia ambos agentes. Como se muestra en la tabla 2, una dosis de 10 mg/ml de CGMP estimuló en forma máxima la actividad metabólica de TE85 por más de 3 veces. El mismo patrón también se observó en células HOS 58 (Tabla 2) .

Ejemplo 4: Leche fermentada que contiene CGMP Se preparó una leche fermentada tradicional con 1-4% de contenido en grasa, como sigue: Después de estandarizar leche entera, leche con bajo contenido de grasa o una mezcla de ambas, se agregó 0.05% en peso de CGMP como se preparó en el ejemplo 1. La totalidad se pasteurizó en un intercambiador de placa, el líquido se enfrió hasta la temperatura de fermentación, se agregó un fermento láctico mesofílico o termofílico y la incubación se llevó a cabo hasta que se obtuvo un pH <5. El llenado y el sellado subsecuente de los recipientes tuvo lugar de una manera convencional. Se prepararon modalidades alternativas que tienen adiciones de 0.1%, 0.25% y 0.5% en peso de CGMPs .

Ejemplo 5: Leche gelificada y fermentada enriquecida en CGMP que contiene bacterias probióticas Se prepararon leches gelificadas y fermentadas enriquecidas en bacterias probióticas. Se mezclaron 89.3 partes de leche que contiene grasa con 3.7 partes de leche en polvo descremada y aproximadamente 0.05 partes en peso de CGMP como se preparó en el ejemplo 1, luego la mezcla se precalentó a 70°C y se pasteurizó a 92°C/6 minutos, y después de que se hubo combinado a 43°C, la mezcla se inoculó con 2% de un iniciador de yogurt común que comprende Streptococcus thermophi lus y Lactobacillus bulgaricus y con 5% de Lactobacillus johnsonii (La-1, CNCMI-1225) . Después de vaciar en recipientes, se llevó a cabo la fermentación a 38°C hasta un pH de 4.6 y los recipientes fueron luego enfriados a 6°C. Se agregaron las siguientes cantidades de CGMP: 0.1%, 0.25% y 0.5% en peso. Los productos obtenidos de este modo mostraron tener un efecto estimulador incrementado, sobre la actividad metabólica de las células formadoras de hueso y un efecto inhibitorio sobre la resorción ósea.

Ejemplo 6: Leche gelificada y fermentada enriquecida en bacterias probióticas que contienen CGMP Se prepararon leches gelificadas y fermentadas como se describe en el ejemplo previo, en donde la cepa Lactobacillus j ohnsonii fue reemplazada por Lactobacill us acidophilus La-10 (Nestlé Culture collection, Lausanna, Suiza) (ATCC 11975) .

Ejemplo 7: Composición enteral que contiene CGMP Se preparó una composición enteral con una densidad de energía de 6.3 kJ/ml y 8% (p/v) de proteínas a partir de leche en polvo descremada a "baja temperatura" por ejemplo, leche descremada deshidratada bajo condiciones térmicas controladas. 20 kg de la leche en polvo descremada a baja temperatura se dispersaron en 100 kg de agua desmineralizada a una temperatura de aproximadamente 50-55°C. Esta dispersión se microfiltró al pasar agua desmineralizada a través de ésta hasta que se eliminaron 600 kg del permeado. El retenido fue posteriormente concentrado hasta aproximadamente 60 kg, lo que representa un contenido de materia seca de 21% con un contenido de proteína, con base en materia seca, de 82%.

Para preparar la composición enteral, se mezclaron 2.3 kg de retenido líquido a 55°C con 600 g de maltodextrina, 200 g de sucrosa, 20.3 g de citrato de Tri-K>H20, 9.2 g de MgCl2»6H20, 5.8 g de cloruro de sodio y aproximadamente 0.5 a 1% en peso de CGMP que se preparó como en el ejemplo 1. Después de que se disolvieron los ingredientes en el retenido, el agua desmineralizada se agregó hasta un peso total de la dispersión de 4.7 kg . El pH se ajustó a 6.8, después de lo cual se introdujeron 300 g de fase grasa, el peso total de la dispersión fue de 5 kg . Después de la homogeneización y esterilización, el producto tuvo un sabor azucarado adecuado. Esto mostró que tenía un efecto inhibitorio sobre la resorción ósea y efecto estimulador sobre la calcificación.

Ejemplo 8: Barra de cereal que contiene CGMP Con el fin de preparar un producto inicial expandido, se trató harina de cebada, trigo, maíz o avena en un extrusor de doble tornillo por aproximadamente 15 segundos a una velocidad del tornillo de aproximadamente 350 r.p.m. en presencia de aproximadamente 12% de agua. Después del tratamiento, el producto expandido abandonó el extrusor en la forma de granulos de 2 a 3 mm de longitud, los cuales se secaron por 20 minutos a 100°C. El producto obtenido de esta manera tuvo una estructura celular y tiene la siguiente composición: Fibras comestibles 31% Proteínas 21% Glúcidos 37.5 Lípidos 6.5% Ceniza 2.4% Agua 1.6% El producto expandido se incorporó en una barra diseñada para el tratamiento de la diabetes, la cual tuvo la siguiente composición: Producto expandido 39.4% Hojuelas de avena 16.7% Sorbitol 8.4% Fructosa 8.5% Cubos de manzana 6.1% Arroz inflado 4.1% Gelatina 4.0% Polvo de albaricoque 2.5% Aceite de palma 3 . 0 % CGMP 2 . 5 % ( como se preparó en el ej emplo 1 ) Agua 4.8% Ejemplo 9: Suplemento alimenticio que contiene CGMP Un cultivo de la cepa Lactobacillus j ohnsoni i La-1 (CNCM- I -1225) de origen humano, se mezclo con CGMP como se preparó en el ejemplo 1 y se secó mediante rocío de acuerdo al proceso dado en la solicitud de patente Europea EP0818529 para obtener un suplemento alimenticio que contiene una cantidad de aproximadamente 5% de CGMP. El polvo obtenido se puede utilizar como un suplemento alimenticio. Un cereal para desayuno, producto lácteo u otro producto alimenticio puede luego ser espolvoreado con este polvo que contiene CGMP.

Ejemplo 10: Suplemento alimenticio que contiene CGMP Se preparó un suplemento alimenticio como se describe en el ejemplo 9. No obstante, Lactobacillus johnsoni i fue reemplazado por Lactobacillus acidophil us , La-10 (Nestec collection, Lausanna, Suiza) o una mezcla de las dos cepas.

Ejemplo 11: Efecto de CGMP sobre la pérdida ósea y el balance de calcio en un modelo de pérdida ósea (rata marcada con tetraciclina) Un modelo validado de pérdida de hueso (rata en desarrollo marcada con tetraciclina) se utilizó para probar CaCGMP y NaCGMP al 4.5% de la pérdida ósea a corto plazo con dieta reducida y absorción de calcio influenciada. Se mostró que el consumo de CaCGMP redujo significativamente la pérdida ósea por aproximadamente 20% en comparación al control (p=0.01) . NaCGMP redujo la pérdida ósea por 10% en comparación al control (no significativo) . Además, la absorción de calcio fue más alta en animales que consumieron ya sea CaCGMP o NaCGMP, en comparación al grupo control. La proporción de retención de calcio fue significativamente más alta en ambos grupos de CaCGMP y NaCGMP en comparación a los controles. En el modelo utilizado, CaCGMP y NaCGMP influyeron positivamente sobre la absorción y la retención del calcio ingerido. Se redujo significativamente la pérdida ósea por CaCGMP en comparación al control, sugiriendo características benéficas adicionales de la forma calcica del CGMP sobre la forma sódica.

Efecto de NaCGMP y CaCGMP sobre la absorción y retención de Calcio aparentes Los valores medios (con la desviación estándar entre paréntesis) para la absorción de calcio aparente (%) , retención de calcio (mg/día) y proporción de retención de calcio (%) para el NaCGMP, CaCGMP y grupos control, se muestran en la Tabla 3 (siguiente) y se representan gráficamente en la Figura 1. No se encontraron ausencias aparentes, y la distribución de los datos indica que son apropiads lo métodos clásicos de Análisis de Varianza (ANDEVA) para la medición de las diferencias entre los grupos.

Tabla 3. Valores promedio para la absorción de calcio aparente (%) , retención (mg/día) y proporción de retención (%) (con la desviación estándar entre paréntesis) para el control, los grupos de NaCGMP y CaCGMP .

Absorción de calcio La absorción de calcio aparente para los grupos de CaCGMP y NaCGMP fue, en promedio, 5.6% y 5.8% (respectivamente) mayor que la absorción de calcio aparente promedio para el grupo control . La comparación estadística de los tres grupos utilizando la prueba de Dunnet por comparación múltiple mostró que al menos un grupo en promedio fue significativamente diferente. No obstante, utilizando un nivel de confianza de 95%, la diferencia en la absorción de calcio entre los dos grupos de CGMP y el grupo control no fue estadísticamente significativa. No se encontró diferencia entre los grupos CaCGMP y NaCGMP.

Retención de calcio En promedio, el grupo control retuvo 26.1 (2.3) mg de Ca/día, el grupo de CaCGMP retuvo 30.4 (2.5) mg/día y el grupo de NaCGMP retuvo 28.1 (2.0) mg/día, por lo tanto, el incremento estimado en la retención de calcio en comparación al control fue en promedio 4.25 mg/día para el grupo de CaCGMP y 1.98 mg/día para el grupo de NaCGMP. Los valores de retención de calcio para los dos grupos de CGMP en comparación al grupo control utilizando la prueba de Dunnett por comparación múltiple que mostró que el grupo de CaCGMP tuvo retención de calcio significativamente mayor (p<0.05) en comparación al control. El grupo de NaCGMP mostró una tendencia para retención más alta de calcio, lo cual no fue significante estadísticamente. Los dos grupos de CGMP se compararon utilizando la prueba múltiple de Turkey y no se encontró diferencia significativa entre los grupos de CaCGMP y NaCGMP.

Proporción de retención de calcio La proporción de retención de calcio se calculó con el fin de expresar la cantidad de calcio retenido como un porcentaje de la cantidad de calcio consumido, tomando en cuenta de este modo las pequeñas diferencias en las ingestiones de calcio entre los grupos. El análisis de la proporción de la retención de calcio mediante ANDEVA de una vía dio un valor de p de 0.088, significando que al menos un valor medio podría ser significativamente diferente. Utilizando la prueba de Dunnett por comparaciones múltiples y un nivel de significancia de 10%, se demostró que CaCGMP y NaCGMP tienen una retención de proporción de calcio que es en promedio aproximadamente 5.2% (absoluto) mayor que el control, no obstante estas diferencias estuvieron ambas en el límite de la significancia.

Pérdida ósea como se cuantificó por los niveles de [H3] -tetraciclina urinaria La excreción de [H3] -tetraciclina se midió diariamente por 13 días, con el fin de cuantificar la pérdida ósea. Las medias de los grupos se representan en la figura 1. Se puede observar claramente en la figura 1 que los niveles de excreción para [H3] -tetraciclina son aproximadamente los mismos que al inicio del experimento (Día 1) no obstante, los tres grupos parecen separarse uno del otro en el día 13. La comparación estadística de los tres grupos utilizando la prueba de Dunnett por comparación múltiple mostró que al menos un grupo en promedio fue significativamente diferente (p=0.01). Los grupos fueron comparados además utilizando la prueba de comparación múltiple de Turkey en donde la diferencia entre CaCGMP y el Control se encontró que es estadísticamente significativa (p<0.05). Notablemente, la cantidad de CaCGMP consumido (aproximadamente 660 mg/día) redujo significativamente la excreción de tetraciclina urinaria y por lo tanto la pérdida ósea, por aproximadamente 20%, en comparación al control, en el modelo animal de pérdida ósea utilizado. El consumo de 720 mg de NaCGMP reduce la excreción de tetraciclina por aproximadamente 10% en comparación al control, lo cual no fue significativo. Las dietas secas que contienen 4.5% de CaCGMP y 4.7 de NaCGMP y después de la mezcla de las dietas con aproximadamente 40% de agua, el consumo aproximado diario, (calculado a partir de la cantidad de alimento consumido durante los últimos 5 días del periodo experimental) de CGMP fue de 660 mg de CaCGMP y 720 mg de NaCGMP. Para un adulto de tamaño promedio esto podría ser equivalente a aproximadamente 18 g de CGMP por día. Si CaCGMP está finalmente dirigido a la reducción de pérdida ósea en mujeres postmenopaúsicas o de la tercera edad (cuyo consumo de proteína puede ser subóptimo) , un producto del tipo que reemplaza al alimento que contiene un límite superior de 18 g de CGMP podría ser la aplicación más prometedora.

Ejemplo 12: Efecto de CGMP sobre la pérdida ósea y balance de calcio en un modelo de pérdida ósea menopáusica (rata ovariectomizada de edad avanzada) Se determinó que CGMP podría reducir la pérdida ósea inducida por deficiencia en estrógenos en la rata ovariectomizada en un periodo de tres meses. Cuarenta ratas de edad avanzada fueron repartidas aleatoriamente a uno de cuatro grupos, Grupo A, B, C o D. El grupo A fue operado por SHAM (procedimiento quirúrgico que se llevó a cabo sin ligadura de ovarios) y los grupos B, C y D fueron ovariectomizados (por ejemplo, ligadura de los ovarios) . Los grupos A y B fueron los grupos control y consumieron una dieta que estuvo libre de proteína de leche. La dieta del grupo C contenía 4.5% de CaCGMP y la del Grupo D contenía 4.5% de NaCGMP. Las mediciones de la densidad ósea en línea base fueron tomadas a 6 mm distales al espacio articular antes de la ovariectomía utilizando tomografía computarizada cuantitativa (pQCT) . La medición se repitió 5 semanas después de la ovariectomía y nuevamente 5 semanas más tarde. Como se esperaba, no existió cambio en la densidad ósea trabecular (TBD) en el Grupo A (control SHAM) , el Grupo B (control ovariectomizado) perdió aproximadamente 16% de TBD y sorprendentemente el Grupo C (que consumió CaCGMP) y el grupo D (que consumió NaCGMP) perdieron 4.6% y 6.4% respectivamente, de su TBD original (Figura 2) . Esto muestra que CGMP juega un papel importante en la reducción de pérdida ósea. Se debe entender que diversos cambios y modificaciones a las modalidades actualmente preferidas descritas en la presente, serán aparentes para aquellos expertos en la técnica, tales cambios y modificaciones pueden ser realizados sin apartarse del espíritu y alcance de la presente invención y sin disminuir sus ventajas pretendidas. Por lo tanto, se pretende que tales cambios y modificaciones sean cubiertos por las reivindicaciones anexas.

Claims (5)

REIVINDICACIONES

1. El uso de una composición que comprende una sal de sodio o de calcio del caseinoglucomacropéptido (CGMP) , un mimético, homólogo o fragmento del mismo el cual retiene la habilidad de CGMP para inhibir la resorción ósea o la pérdida ósea; o favorecer la absorción o la retención de calcio, o la calcificación, en la fabricación de un medicamento para inhibir la resorción ósea o la pérdida ósea, o favorecer la absorción o la retención de calcio, o la calcificación; o una combinación de los mismos.

2. El uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde la composición comprende una cantidad de aproximadamente 0.01% a aproximadamente 10% en peso de materia seca de CGMP.

3. El uso de conformidad con cualquier reivindicación precedente, para el tratamiento de un humano o animal de compañía.

4. El uso de conformidad con cualquier reivindicación precedente, en donde la composición contiene una fuente de proteína que proporciona de 7 a 25% de la energía total , una fuente de carbohidrato que proporciona de 28 a 66% de la energía total, una fuente de lípidos que proporciona de 25 a 60% de la energía total, minerales y vitaminas para cumplir los requerimientos diarios.

5. Un método de tratamiento o prevención de un desorden óseo o dental, que comprende el administrar una cantidad efectiva de una composición que comprende una sal de sodio o de calcio de caseinoglucomacropéptido (CGMP) , un mimético, homólogo o fragmento del mismo que conserva la habilidad de CGMP para inhibir la resorción ósea o la pérdida ósea, o favorecer la absorción o retención de calcio o la calcificación.