MX2012008950A - Ensayo mediante adcc nk facs tridimensional. - Google Patents

Abstract

Se informa en la presente sobre una tecnología analítica celular basada en un ensayo de cocultivo tridimensional de esferoides/agregado, donde el esferoide o el agregado se forman a partir de un tumor y linfocitos citolíticos espontáneos. Este método es útil para el análisis funcional in vitro de anticuerpos en formato individual y de alto rendimiento.

Description

ENSAYO MEDIANTE ADCC NK FACS TRIDIMENSIONAL Se informa en la presente sobre un novedoso ensayo por FACS de citotoxicidad dependiente de anticuerpos basado en un esferoide tridimensional o un agregado formado por células linfomatosas y linfocitos citolíticos espontáneos. Este ensayo es útil para el análisis funcional in vitro de inmunoglobulinas terapéuticas en un formato individual asi como de alto rendimiento.

Antecedentes de la Invención Los cultivos monocapa de lineas de la célula tumoral establecidas se usan con frecuencia en investigación de biología tumoral y desarrollo de medicamentos antitumorales . Sin embargo, un modelo de cultivo plano y bidimensional refleja insuficientemente la arquitectura tumoral (3D) tridimensional. Por lo tanto, los aspectos específicos relacionados con el desarrollo in vivo de gradientes de la difusión del soluto sólo pueden estudiarse en un sistema del cultivo tridimensional similar por ejemplo el esferoide tumoral multicelular o modelo agregado. Los esferoides tumorales o los agregados imitan regiones tumorales avasculares, caracterizadas por el suministro nutritivo limitado debido a barreras de la difusión capas a través de multicelulares.

Sin embargo, el uso generalizado de cultivos 3D en la investigación es limitado por generación inoportuna y tramitación. Por lo tanto, un método simple y rápido se desarrolla para generar esferoides individuales o agregados en el cultivo de suspensión de una forma de alto rendimiento. Los esferoides individuales o los agregados con tamaños iguales y geometría esférica homogénea pueden generarse en pocilios individuales de una placa de 96 pocilios dentro de un período del cultivo de 24 horas. Es un formato del cultivo estandarizado con acceso fácil para la tramitación compuesta y recolección del esferoide para el análisis subsecuente. El tamaño uniforme y la geometría garantizan el desarrollo de gradientes de la difusión casi idénticos en cada esferoide o agregado (Ivascu, A. y Kubbies, M., J. Biomol. Screening 11 (2006) 922-932) . El protocolo de generación del esferoide conocido incluye la adición de un extracto de la membrana basal del murino (rBM) , una mezcla de proteínas de la matriz extracelulares que induce una compactación del agregado a un esferoide.

Inami, K., et al. incluye en un informe la actividad antitumoral de anti-C-ERC / anticuerpo monoclónico de mesotelina in vivo (Cáncer Sci. 101 (2010) 969-974) .

Breve Descripción de la Invención Se ha descubierto que con la combinación de células tumorales y linfocitos citolíticos espontáneos en un esferoide o agregado tridimensional, la evaluación de inmunoglobulinas puede elaborarse por una parte más in vivo similar y por otra parte se adecúa ahora para el análisis de alto rendimiento.

Un primer aspecto como incluyó en un informe aquí es un método para la detección in vitro de la función efectora de un anticuerpo que comprende la etapa de incubar un esferoide o agregado tridimensional que comprende células tumorales y linfocitos citoliticos espontáneos con la inmunoglobulina.

En una modalidad el método comprende las etapas que siguen : a) marcar células con especificidad de objetivo al tumor con un primer tinte fluorescente, b) mezclar linfocitos citoliticos espontáneos y células con especificidad' de objetivo al tumor, c) adicionar aproximadamente 104 células por 200µ1 a un pocilio de una placa multipocillo, d) centrifugar la placa multipocillo e iniciar asi la formaciónde un esferoide celular tridimensional, e) adicionar la inmunoglobulina a los pocilios de la placa multipocillo, f) incubar la placa multipocillo durante aproximadamente 2? horas hasta aproximadamente 72 horas, g) marcar células muertas en los pocilios con un segundo tinte fluorescente, y i) analizar las células en los pocilios de la placa multipocillo por citofluorimetro de flujo (FACS) y asi detección de la función efectora del anticuerpo.

En una modalidad, los linfocitos citoliticos espontáneos son linfocitos citoliticos espontáneos de humano y tienen una pureza del 90% o más. En otra modalidad los linfocitos citoliticos espontáneos y las células con especificidad de objetivo tumorales se mezclan en una proporción de 10:1 a 1:10. En otra modalidad la proporción es de 1:3 a 1:10. En otra modalidad la proporción es de 1:2 a 1:4. En una modalidad la centrifugación es para 10 minutos en 100 a 1,000 revoluciones por minuto. En otra modalidad la centrifugación es de aproximadamente 1,000 revoluciones por minuto. En una modalidad el segundo tinte fluorescente es el propilyoduro . En una modalidad la incubación es durante aproximadamente 20 horas hasta aproximadamente 28 horas.

En una modalidad, las células tumorales son células linfomatosas . En otra modalidad la célula linfomatosa se selecciona a partir del grupo que comprende células de Raji, células de SU-DHL4 y células Z138. En otra modalidad el anticuerpo se agrega en una concentración final en el pocilio de 100 g/ml a 0.001 g/ml. En otra modalidad el anticuerpo se agrega en una concentración final en el pocilio de 20µg/ml a O.l g/ml. En una modalidad el anticuerpo se agrega en una concentración final en el pocilio de 8pg/ml a 12pg/ml.

Un aspecto adicional, como se incluye en un informe, el uso de un esferoide o agregado tridimensional que comprende células tumorales y linfocitos citoliticos espontáneos para el análisis de alto rendimiento de la combinación de' anticuerpos múltiples y células tumorales múltiples.

Otro aspecto como incluyó en un informe aquí es un método para determinar in vitro un anticuerpo con la función efectora que comprende: a) proporcionar al menos un anticuerpo, b) marcar células tumorales mediante un primer tinte fluorescente, c) mezclar linfocitos citoliticos espontáneos y células con especificidad de objetivo al tumor, d) adicionar aproximadamente 104 células por 200µ1 a los pocilios de una placa multipocillo, e) centrifugar la placa multipocillo e iniciar asi la formaciónde un esferoide celular tridimensional, f) adicionar cada uno de los anticuerpos proporcionados a un pocilio individual de la placa multipocillo, g) incubar la placa multipocillo durante aproximadamente 20 horas hasta aproximadamente 72 horas h) marcar células muertas en cada uno de los pocilios incubados con un segundo tinte fluorescente, i) analizar cada pocilio de la placa multipocillo por citofluorimetro de flujo, y j) determinar el anticuerpo con la proporción más elevada o una proporción de más de 1 de células muertas a células viables como anticuerpo con función efectora.

También un aspecto como incluyó en un informe aquí es un kit que comprende:- a) una célula tumoral marcada por un tinte fluorescente, b) linfocitos citoliticos espontáneos aislados, c) una placa multipocillo de 96 pocilios, y d) propilyoduro .

En una modalidad, la placa multipocillo es una placa multipocillo de 96 pocilios.

Descripción Detallada de la Invención Se en la presente, sobre una tecnología analítica celular basada en el uso de un esferoide tridimensional o ensayo del cocultivo agregado, donde los esferoides o los agregados comprenden células tumorales y linfocitos citoliticos espontáneos. Este ensayo es útil en una modalidad para el análisis funcional in vitro de inmunoglobulinas en el formato individual y de alto rendimiento. En una modalidad un esferoide tridimensional individual o el agregado se colocan en cada pocilio de una placa multipocillo inferior redonda de 96 pocilios que se ha recubierto con polyHEMA (poli (hidroxietilo metacrílico) el ácido) . En otra modalidad las células NK son células del asesino natural (NK) de humano diploides normales. En una modalidad las células NK se han seleccionado al aplicar un método de selección negativo, i.e. las células no se tocan durante la etapa de selección (ver p.ej a Horgan, K. et al., Curr. Prot . Immunol. (2009), el Capitulo 7, Unidad 7.4. Immunomagnetic purification of T cell subpopulations y Neurauter, A. A., et al., Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 106 (2007) 41-73). Se descubre esto es posible con estas células NK cuantificar porcentajes correctos de células viables y muertas.

La mayor parte de los experimentos in vitro en el campo de la biología tumoral se llevan a cabo con cultivos monocapa ya que éstos son fáciles y convenientes para el mango. Sin embargo, aunque éstos proporcionen un modelo valioso para estudiar funciones distintas, los- cultivos monocapa insuficientemente reflejan la patobiologia tumoral debido a la carencia de componentes del estroma, matriz extracelular y diferencias geométricas fundamentales entre (2dos) cultivos de dos dimensiones y tumores sólidos (3D) tridimensionales. La organización tridimensional de células proporciona una red compleja de interacciones celulares y celulares y celulares y de la matriz relevantes p.ej para distribución y función de hormonas, factores .de crecimiento y nutrientes que influyen en diferenciación celular, proliferación y supervivencia.

En una modalidad el método para la generación de esferoides tridimensionales de agregados comprende la adición de la matriz de sótano reconstituida derivada de tumor del murino Engelbreth-Holm-Swarm (rBM, Matri3elTM) f un gel proteico que contiene componentes de la matriz extracelulares como colágenos, laminina, fibronectina, entactina (nidogen) y proteoglucanos , al medio de cultivo. La arquitectura tridimensional permite co-cultivo de células tumorales con el fibroblasto, inmunitario y células endoteliales, permitiendo la investigación de efectos de interacción de tumor/estroma in vitro (Friedrich, J., et al., Intervalo. J. Radiat. Biol. 83 (2007) 849-871) .

En el centrifugo (Sutherland, R.M. y Durand, R.E., Recent Results Cáncer Res. 95 (1984) 24-49) y el método de rotación giratorio (Moscona, A., Exp. Res celular. 22 (1961) 455-475) las células tripsinizadas se colocan en un vaso del cultivo con un agitador magnético que inhibe la unión celular del sustrato y favorece la adherencia celular celular. En un método más recientemente desarrollado, los esferoides se cultivan en una disminución colgante de una microplaca invertida (Kelm, J.M., et al., Biotechnol. Bioeng. 83 (2003) 173-180) . Sin embargo, todos estos métodos se limitan antes de largo periodo de tiempo de cultivo, formación de esferoides del tamaño ¦ desigual o antes de accesibilidad mecánica difícil. Además, en cultivos de suspensión, muchas líneas de la célula tumoral crecen mal en esferoides compactos tridimensionales (Mueller-Klieser, W., Crit. El Rev Oncol. Hematol. 36 (2000) 123-139) .

El uso de esferoides o agregados de una forma de alto rendimiento en la investigación requiere un protocolo estandarizado que rápidamente genera esferoides del tamaño homogéneo con gradientes ¦ de la difusión similares y fisiología celular en un formato de la placa multipocillo que es fácilmente accesible para el análisis bioquímico o celular subsecuente. Además tal protocolo debería ser aplicable a la variedad espaciosa de líneas de la célula tumoral.

Se descubre esa esta necesidad puede realizarse con los métodos como incluyó en un informe aqui. Por lo tanto, un aspecto como incluyó en un informe aquí es un ensayo para la detección de la función efectora de un anticuerpo que comprende : a) marcar linfoma (objetivo) células con el fluoróforo verde C FDA (diacetato de 5-clorometilfluoresceina) , b) aislamiento de células del asesino natural (NK) normales de humano de sangre de humano, en una modalidad con una pureza de más del 90%, c) mezclar NK y linfoma apuntan con especificidad de objetivo células en una proporción de 1:10 a 10:1, d) adicionar aproximadamente 104 células por 200µ1 a unos o todos los pocilios de una placa multipocillo, e) centrifugar la placa multipocillo, f) adicionar la inmunoglobulina de interés a los pocilios de la placa multipocillo, g) incubar la placa multipocillo para hasta 72 h, en una modalidad para 20 h a 72 h, h) adicionar propilyoduro a los pocilios, y i) analizar las células en los pocilios de la placa multipocillo por FACS.

Se descubre ' esto por la combinación de células linfomatosas y linfocitos citoliticos espontáneos un dependiente del anticuerpo sensible el ensayo de la citotoxicidad celular puede proporcionarse. En una modalidad la detección de función efectora de un anticuerpo es una detección o la determinación del dependiente del anticuerpo la citotoxicidad celular de un anticuerpo. Además una apertura del ensayo tridimensional de tumor y células de la función efectora immuno también es ventajosa. En una modalidad los métodos como incluyó en un informe aquí son métodos in vitro. En otra modalidad el mezclado de las células tumorales y los linfocitos citoliticos espontáneos da como resultado la formación de un esferoide tridimensional.

En Figuras 1 y 2 la distribución de células viables y muertas analizadas por FACS se muestra. La Figura la muestra la distribución de células de Raji viables y muertas marcadas por C FDA determinado por el análisis FACS. Las células de Raji viables se ubican en el sector de la esquina inferior derecha del diagrama de FACS. Las Figuras Ib y le muestran la distribución de células viables y muertas de un cocultivo de células de Ra i y linfocitos citoliticos espontáneos en ausencia de un anticuerpo adicionado. Los linfocitos citoliticos espontáneos viables se ubican en el sector de la esquina inferior izquierda del diagrama de FACS, las células de Raji viables se ubican en el sector de la esquina inferior derecha del diagrama de FACS, los linfocitos citoliticos espontáneos muertos se ubican en el sector de la esquina superior izquierda del diagrama de FACS y las células de Raji muertas se ubican en el sector de la esquina superior derecha del diagrama de FACS. De Figuras Ib (la proporción de Raji a células NK de 1:1) y le (la proporción de Raji a células NK de 1:10) puede observarse que en ausencia del anticuerpo e independiente de la proporción de células de Raji a linfocitos citoliticos espontáneos el porcentaje de las células linfomatosas viables y muertas respectivas no se cambia considerablemente.

La Figura 2a muestra el análisis FACS de células de Raji viables y muertas después de la incubación con un anticuerpo. En comparación con el diagrama FACS de la Figura la puede observarse esto al incubar las células de Raji con el anticuerpo sólo, la fracción de aumentos de células muertos debido a la función de inducción de muerte celular directa del anticuerpo. En la presencia de células NK la cantidad de aumentos de células de Raji muertos incluso más debido a la función efectora ADCC (conglomerados de la esquina superior derecha: Figura 2b proporción de Raji/NK 1:1 y Figura 2c proporción de Raji/NK 1:10). Puede observarse que mediante la adición de linfocitos citoliticos espontáneos puede aumentarse la sensibilidad del ensayo.

En el ensayo las placas multipocillos se centrifugan en una modalidad para 10 minutos en 1,000 g. Durante centrifugación todas las células dentro de cada pocilio son granuladas en el fondo del pocilio. Esto asegura cantidades celulares iguales para la iniciación de la formación de un esferoide individual o agregado en cada pocilio.

En Figura 3 el efecto de la secuencia de la adición de los componentes individuales, i.e. Células de Raji, linfocitos citoliticos espontáneos y anticuerpo, en el ensayo se muestra. Puede observarse a que la adición de tres componentes en paralelo dio origen ligeramente, pero no considerablemente, tasas de muerte celular más elevadas. Sin embargo, para imitar más estrechamente la situación in vivo, en una modalidad el ensayo comprende la formación del linfoma-NK esferoide o agregado tridimensionals antes de la adición del anticuerpo para analizarse.

El ensayo como incluyó en un informe aquí puede llevarse a cabo con cualquier célula (con especificidad de objetivo) tumoral. En una modalidad la célula tumoral es una célula linfomatosa . En otra modalidad la célula linfomatosa se selecciona a partir de la célula de Raji, la célula de SU-DHL4 y la célula Z138.

En una modalidad al usar carcinoma adherentemente creciente o células tumorales del sarcoma como células tumorales la formación del esferoide tridimensional se lleva a cabo en la presencia de la membrana basal ' reconstituida (rBM) liquida. En una modalidad una concentración del 2.5% rBM (v/v) se usa. En esta modalidad todas las células se incorporan en un esferoide distinto con una geometría redonda. La formación y la compactacion se completan después de 24 horas del periodo de tiempo del cultivo. Por lo tanto, en una modalidad la incubación es durante 20 horas a 28 horas. Las concentraciones inferiores de rBM no aseguraron la incorporación de todas las células en el esferoide, y las concentraciones más elevadas disminuyeron la geometría redonda de los esferoides. Después de la etapa de centrifugación de 10 minutos, todas las células dentro de un pocilio se incorporan en un sedimento plano. Tres horas más tarde, cierto nivel de la compactacion se hace evidente en la presencia y ausencia de rBM. Sin rBM, ningún apretamiento adicional de los agregados puede observarse después de 6 horas y 24 horas. En una modalidad la célula tumoral es una célula de Raji y rBM está ausente en todas las etapas del método.

En una modalidad cinco mil células se centrifugan en 1640 RPMI con FCS del 10% (suero fetal de ternera) y el 2.5% rBM (v/v) . El tamaño del esferoide se analiza después de un periodo del cultivo de 24 horas. Todos los esferoides son regulares en · la forma, muestran una geometría redonda uniforme y muestran una variación del tamaño estrecha.

En la Figura 4 el ensayo como incluyó en un informe aquí se lleva a cabo con diferente tumor del linfoma líneas celulares (con especificidad de objetivo) y con diferentes concentraciones del anticuerpo. Puede observarse que el ensayo como incluyó en un informe aquí puede llevarse a cabo con diferentes líneas de la célula linfomatosa en la misma eficacia. Puede observarse adicionalmente que el ensayo puede llevarse a cabo en una concentración del anticuerpo de 10 g/ml a 0.1 g/ml. Por lo tanto, en una modalidad el ensayo como incluyó en un informe aquí comprende la adición del anticuerpo en una concentración de 0. lpg/ml a 15pg/ml, en otra modalidad de 8pg/ml a 12pg/ml.

En la Figura 5 la sensibilidad del ensayo como incluyó en un informe aquí según la proporción de células linfomatosas a linfocitos citolíticos espontáneos se muestra. Puede observarse que una proporción de 1:1 a 1:10 del linfoma (objetivo) células a linfocitos citolíticos espontáneos indica la función efectora ADCC de células NK. Por lo tanto, en una modalidad la proporción de célula linfomatosa al linfocito citolítico espontáneo es de 1:1 a 1:10, en otra modalidad de 1:3 a 1:10, en otra modalidad de 1:2 a 1:4.

Con el ensayo como incluyó en un informe los esferoides tridimensionales aquí individuales o los agregados con una distribución del tamaño estrecha y geometría esférica homogénea pueden generarse en un pocilio individual o en pocilios múltiples de una placa multipocillo en paralelo dentro de un período del cultivo de 24 horas. Se ha mostrado que esto puede ser un formato del cultivo estandarizado con acceso fácil para la tramitación compuesta y recolección del esferoide para el análisis subsecuente. El tamaño casi •uniforme y la geometría de los esferoides o agregados garantizan el desarrollo de gradientes de la difusión similares en cada esferoide. Por lo tanto, un aspecto como incluyó en un informe aquí es un ensayo automatizado o de alto rendimiento que comprende el ensayo como descritos anteriormente. El protocolo de generación del esferoide incluye la adición de un extracto de la membrana basal del murino (rBM) , una mezcla de proteínas de la matriz extracelulares que induce una compactación del agregado a un esferoide.

En la Figura 6 un Esquema de Reacción ejemplificante de la generación de esferoides tridimensionales se muestra.

Aquí se reporta un método para la detección in vitro de la función efectora de un anticuerpo que comprende la incubación de un esferoide o agregado tridimensional que comprende células tumorales y linfocitos citolíticos espontáneos con el anticuerpo.

En una modalidad el método comprende las etapas que siguen: - mezclar linfocitos citolíticos espontáneos y células tumorales, - adicionar aproximadamente 104 células por 200µ1 a los pocilios de una placa multipocillo, - centrifugar la placa multipocillo y así inducción de la formación de un esferoide o agregado tridimensional, - adicionar la inmunoglobulina a los pocilios de la placa multipocillo, - incubar la placa multipocillo durante aproximadamente 20 horas hasta aproximadamente 72 horas, y - analizar las células en los pocilios de la placa multipocillo por citofluorímetro de flujo y así detección de la función efectora del anticuerpo.

En otra modalidad el método comprende además la etapa que sigue como la primera etapa: - marcar células tumorales mediante un primer tinte fluorescente .

En otra modalidad el método comprende las etapas adicionales : - marcar células muertas por un segundo tinte fluorescente, y - analizar las células en los pocilios de la placa multipocillo por citofluorimetro de flujo y asi detección de la función efectora del anticuerpo.

En una modalidad los linfocitos citoliticos espontáneos son linfocitos citoliticos espontáneos de humano. En también una modalidad los linfocitos citoliticos espontáneos y las células tumorales se mezclan en una proporción de 10:1 a 1:10. En otra modalidad la proporción es de 1:2 a 1:4.

En una modalidad la incubación es durante aproximadamente 20 horas hasta aproximadamente 28 horas.

En una modalidad la centrifugación es de 1,000 revoluciones por minuto durante 10 minutos.

En una modalidad la célula tumoral es una célula linfomatosa. En otra modalidad la célula linfomatosa es una célula de Raji, o una célula SU-DHL4 o una célula Z138.

En una modalidad el anticuerpo se agrega en una concentración de 15pg/ml a 0.1 g/ml. En otra modalidad el anticuerpo se agrega en una concentración de 8µg/ml a 12ug/ml.

Otro aspecto como incluyó en un informe aquí es el uso de un esferoide o agregado tridimensional que comprende células tumorales y linfocitos citoliticos espontáneos para la determinación de la función efectora de una combinación de anticuerpos múltiples con células tumorales múltiples.

Un aspecto adicional como incluyó en un informe aquí es un método para determinar in vitro un anticuerpo con la función efectora que comprende las etapas: mezclar linfocitos citoliticos espontáneos y las células tumorales, - adicionar aproximadamente 104 células por 200µ1 a los pocilios de una placa multipocillo, - centrifugar la placa multipocillo y asi inducción de la formación de un esferoide o agregado tridimensional, - adicionar el anticuerpo a un pocilio individual de la placa multipocillo, - incubar la placa multipocillo durante aproximadamente 20 horas hasta aproximadamente 72 horas, y - determinación del anticuerpo con una proporción de muerto para células viables como anticuerpo con función efectora.

En una modalidad el método comprende además las primeras etapas que siguen: - suministro de al menos un anticuerpo, y - marcar células tumorales mediante un primer tinte fluorescente .

En otra modalidad el método comprende las etapas: - adicionar cada uno de los anticuerpos proporcionados a un pocilio individual de la placa multipocillo, por lo cual a cada pocilio como máximo un anticuerpo se agrega, - marcar células muertas en cada uno de los pocilios incubados con un segundo tinte fluorescente, analizar las células en cada pocilio de la placa multipocillo por citofluorimetro de flujo, y - determinación del anticuerpo con la proporción más elevada de muerto para células viables como anticuerpo con función efectora.

El ensayo y el método como incluyó en un informe aqui se ejemplifican con un anticuerpo anti-CD20 como incluyó en un informe en WO 2005/044859 (incorporado por referencia aqui) . Este anticuerpo sólo se ha seleccionado para ejemplificar la invención actual y no deberla interpretarse como la restricción. El alcance de la invención se expone en las reivindicaciones .

Los siguientes ejemplos y las figuras se proporcionan para ayudar a la comprensión de, la presente invención, el alcance verdadero de que se expone en las reivindicaciones anexadas. Se entiende que las modificaciones pueden elaborarse en los procedimientos establecidos sin apartarse del espíritu de la invención.

Breve Descripción de las Figuras Figura 1: análisis por FACS de células de Raj i viables y muertas y linfocitos citolíticos espontáneos (NK) en ausencia de un anticuerpo. Cuadrantes: esquina inferior izquierda : células K viables, esquina superior izquierda: células NK muertas, esquina inferior derecha: células de Raji viables, esquina superior derecha: células de Raji muertas. Panel A: Células de Raji sólo, panel B: Células de Raji y células NK en una proporción de 1:1, panel C: Células de Raji y células asesinas naturales 1:10.

Figura 2: análisis por FACS de células de Raji viables y muertas y linfocitos citolíticos espontáneos en la presencia de un anticuerpo anti-CD20 adicionado (??µ?/???). Cuadrantes: esquina inferior' izquierda: células NK viables, esquina superior izquierda: células NK muertas, esquina inferior derecha: células de Raji viables, esquina superior derecha: células de Raji muertas. Panel A: Células de Raji sólo, panel B: Células de Raji y células NK en una proporción de 1:1, panel C: Células de Raji y células NK en una proporción de 1:10.

Figura 3: Optimización de linfoma / cocultivo agregado por el esferoide por variación de célula linfomatosa, célula NK y horario de aplicación del anticuerpo. Células linfomatosas : Células de- Raji.

Figura 4: Porcentajes de células linfomatosas viables en la presencia de células NK como una función de la concentración del anticuerpo anti-CD20. Panel A: Células de Raji, panel B: células de SU-DHL4, panel C: células de Z138. Célula NK a proporción de la célula linfomatosa (proporción de E:T) de 3:1.

Figura 5: Porcentajes de células linfomatosas viables en la presencia de la concentración del anticuerpo anti-CD20 como una función del efector (NK) : proporción con especificidad de objetivo (linfoma) . Panel A: Células de Raji, panel B: células de SU-DHL4, panel C: células de Z138. Concentración del anticuerpo Anti-CD20: 10pg/ml.

Figura 6: método e emplificante esquemático.

Figura 7: imágenes microscópicas de células de Raji sólo y célula de Raji co-cultivada con células NK purificadas.

Ejemplo 1 Material y métodos Lineas celulares: Las células de Raji, las células de SU-DHL4 y las lineas celulares Z138 se obtienen de ATCC (Manassas, Virginia, los EE. UU) , de DSMZ (Braunschweig, Alemania) y del catedrático. M de Tintorero (universidad de Leicester, el Reino Unido) , respectivamente. Las células de Raji y las células SU-DHL4 se cultivan en el medio de 1640 RPMI (PAN Biotech, Gato. núm. P04-18500) y Z138 en medio D EM (PAN Biotech, Gato., núm. P04-02500) complementado con FCS del 10% (Gibco, Gato. núm. 10500-064) y Pen/Strep (Roche, Gato. núm. 11 074 440 001) en 37 °C en una incubadora humedecida. Células crecientes exponenciales con la viabilidad celular del 90% o más se usa para los experimentos de co-cultivo de la célula NK.

Purificación de células NK: La sangre con todas sus fracciones se retira de donantes sanos normales en tubos vacutainer (Becton Dickinson, Cat . núm. 368484) . PBMC se obtienen por la preparación de Ficoll (PAN Biotech Cat. núm. P04-60125) . Para dejar las células NK intocadas, las células NK se purifican al usar una célula NK, kit de selección negativo (Miltenyi, Cat. núm. 130-092-657) . En resumen PBMCs aislados de Ficoll se suspenden de nuevo en el MACS-amortiguador (% de PBS/0.5 mM de BSA/2 EDTA) en .1x107 cells/ ?µ?. ??µ? de un cóctel del Anticuerpo de la Biotina Celular NK se agrega a las células e incubado para 10 minutos en 4 °C, seguidos mediante la adición de 30µ1 amortiguador de MACS . A partir de entonces, 20µ1 del cóctel de la microperla de la Célula asesina natural se agrega a las células e incubado para 15 minutos en 4 °C. 2 mi del MACS-amortiguador se agregan y las células se centrifugan para 10 minutos en 300 g. El sedimento se suspende de nuevo en 500µ1. MACS-amortiguador y se carga en la columna de la separación que se equilibra con 500µ1 MACS-amortiguador antes. La columna se lava posteriormente tres veces con 500µ1 el MACS-amortiguador y la cantidad celular se determinan en el eluato total al usar el Contador Celular CASY (Sistema de Scharfe) .

La pureza de la preparación de la célula NK se determina mediante la tinción de una parte alícuota del eluato MACS. En el corto sobre 2xl05 de células se suspenden de nuevo en ???µ? RPMI 1640/10% FCS y se tiñen con ??µ? cada uno de anti-CD56-PE y anticuerpos anti-CD3-FITC (Becton Dickinson, Gato. núm. 555516 y 555339, respectivamente) durante 15 minutos en 4 °C. A partir de entonces, 2 mi de RPMI 1640/10% FCS se agregan a las células que se centrifugan para 5 minutos en 400 g. El sedimento se suspende de nuevo en 0.5 mi RPMI 1640/10% FCS y el porcentaje del positivo CD56 pero la fracción celular negativa CD3 dentro de la puerta de la dispersión del linfocito se analiza al usar una Exploración de FACS o instrumento de Canto II FACS (Becton Dickinson) .

Purificación de monocitos: La sangre con todas sus fracciones se retira de donantes sanos normales en tubos vaccutainer (Becton Dickinson, Cat . núm. 368484). PBMC se obtienen por la' preparación de Ficoll (PAN Biotech Cat. núm. P04-60125) . Para dejar los monocitos intocados, los monocitos se purifican al usar una selección negativa, kit de enriquecimiento del monocito (Stem Cell Technologies, número de Cat: 19059).

Tinción de CMFDA de células linfomatosas : El producto liofilizado CMFDA (Invitrogen Cat. núm. C7025) se suspende de nuevo en DMSO para obtener una solución madre de 10 mm. 1x106 las células linfomatosas se incuban para 30 minutos en 37 °C en el medio completo de 1 mi complementado con ?µ? CMFDA. A partir de entonces, las células son granuladas, lavadas una vez en el medio completo y suspendidas de nuevo finalmente en el medio completo en 1x106 células/ml.

Ejemplo 2 Generación de esferoides/agregados 3D de lineas de la célula linfomatosa La cantidad de la célula linfomatosa se determina mediante la utilización de un instrumento CASY (Scharfe-sistemas, Reutlingen) y la suspensión celular se diluye en el medio helado a 2.5 x 104 células/ml (para 5, 000 células por esferoide/agregado) y 5 x 104 células/ml (para 10, 000 células por esferoide/agregado) . Un volumen de 200µ1 de la suspensión celular se agrega a cada pocilio de una placa de 96 pocilios con la ronda (Corning Inc., Nueva York, los EE. UU) o cónico (Nunc, Roskilde, Los Países Bajos) fondo. Para prevenir la unión celular las placas se prerecubren de 50µ1 el 0.5% polyHEMA ( Policiencias , Eppelheim, Alemania) en etanol del 95% (v/v) y se secan al aire en 37 °C durante tres días. La formación del esferoide es iniciada por centrifugación de las placas en 1, 000 g para 10 minutos al usar Eppendorf 5810 centrifugan (Eppendorf AG, Hamburgo, Alemania) con baldes balanceadores. Las placas se incuban en afecciones del cultivo celular convencionales en 37 °C y Co2 del 7% en incubadoras humedecidas.

Ejemplo 3 Generación de esferoides/agregados 3D de lineas celulares del tumor sólido Las células monocapa se separan con Accutase (PAA Laboratories GmbH, Innsbruck, Austria) para generar una suspensión de la célula individual. La cantidad celular se determina mediante la utilización de un instrumento CASY (Schárfe-sistemas, Reutlingen) y la suspensión celular se diluye en el medio helado a 2.5 x 104 células/ml (para 5,000 células por esferoide/agregado) y 5 x 104 células/ml (para 10,000 células por esferoide/agregado). El rBM se descongela en hielo durante la noche y se adiciona en una concentración final del 2.5% (v/v) con puntas de la pipeta heladas a la suspensión celular. Un volumen de 200µ1 de la suspensión celular se agrega a cada pocilio de una placa de 96 pocilios con la ronda (Corning Inc., Nueva York, los EÉ. UU) o cónico (Nunc, Roskilde, Los Países Bajos) fondo. Para prevenir la unión celular las placas se prerecubren de 50µ1 el 0.5% polyHEMA ( Policiencias , Eppelheim, Alemania) 'en etanol del 95% y se secan al aire en 37 °C durante tres días. La formación del esferoide es -iniciada por centrifugación de las placas en 1, 000 g para 10 minutos al usar Eppendorf 5810 centrifugan (Eppendorf AG, Hamburgo, Alemania) ' con baldes balanceadores. Las placas se incuban en afecciones del cultivo celul.ar convencionales en 37 °C y C02 del 7% en incubadoras humedecidas.

Ejemplo 4 Linfoma del esferoide/agregado / NK co-cultivo e incubación con anticuerpo La secuencia de co-cultivo celular y adición del anticuerpo puede hacerse variar. En un experimento de co-cultivo ejemplificante, las células linfomatosas (CMFDA marcado) y células NK se mezclan en proporciones como se indica en 6 placas del' pocilio. Por ejemplo, un E:T (célula NK a la célula linfomatosa) proporción de 3:1 corresponde a una mezcla celular de 3+1 (e. g. Células NK del 75% y células linfomatosas del 25%) . 200µ1 de la suspensión celular se agrega a un pocilio individual de un polyHEMA recubierto 96 V-placa del pocilio (Nunc, Gato. núm. 249662) . Recubrimiento de PolyHEMA: 50µ1 del 0.5% de polyHEMA en el 95% de etanol por pocilio; secando para 72 h en 37 °C (Policiencias, Número en catálogo 18894) . Las placas se centrifugan para 10 minutos en 1,000 g. Los anticuerpos se agregan a partir de entonces en concentraciones como se indica mayor a, y los agregados/esferoides celulares se incuban en 37 °C, C02 al 7% en una incubadora humedecida. Las imágenes microscópicas de células de Raji sólo y célula de Raji co-cultivada con células NK purificadas se muestran en la Figura 7, asi como imágenes de Raji co-culto y células del monocito para ilustrar co-cultivo 3D de células tumorales con otras células inmunitarias entonces células NK.

Ejemplo 5 Célula viable y análisis de muerte celular Los esferoides/agregados se generan al usar 10,000 células e incubado con el anticuerpo como detallado en Ejemplos 2 y 3. La identificación de células tumorales del linfoma viables es asi: los agregados individuales de pocilios individuales que representan afecciones experimentales idénticas se combinan, disociados por la agitación con pipeta y se centrifugan en 300 g para 10 minutos. Los esferoides individuales se combinan, se lavan una vez con la solución salina amortiguada con fosfato (PBS) , suspendieron de nuevo en la solución de Accutase e incubaron en 37 °C. Cada cinco minutos, los esferoides/agregados son suspendidos de nuevo por la agitación con pipeta y la disolución está completa dentro de 5 a 15 minutos. Las células se lavan al usar el medio completo, los sedimentos centrifugados y celulares se suspenden de nuevo en el medio completo y el propilyoduro se agrega en una concentración de lpg/ml (Sigma, Gato. núm. P4170) . El análisis de la fluorescencia se lleva a cabo por el análisis FACS (Becton Dickinson, instrumento de Canto II) .

Las células linfomatosas viables se identifican como se muestra en la Figura Ib. El cuadrante de la esquina superior derecha de PI y células positivas CMFDA representa las células linfomatosas muertas y el cuadrante de la esquina inferior derecha de la PI las células positivas negativas pero CMFDA representan la fracción celular con especificidad de objetivo de tumor de linfoma viable. En la esquina inferior izquierda el cuadrante es células NK viables, mientras que las células NK muertas se ubican en el cuadrante de la esquina superior izquierda.

En una alternativa que ajusta un ensayo de apoptosis puede llevarse a cabo. Los esferoides/agregados se generan al usar 10,000 células e incubado con el anticuerpo como detallado en Ejemplos 2 y 3. Para el análisis de apoptosis, los esferoides/agregados se transfieren en una placa cónica e inferior de 96 pocilios, lavada una vez con la solución salina amortiguada con fosfato (PBS), suspendida de nuevo en la solución de Accutase e incubada en 37 °C. Cada cinco, minutos, los esferoides/agregados son suspendidos de nuevo por la agitación con pipeta y la disolución está completa dentro de 5 a 15 minutos. Las suspensiones de la célula individual de ocho esferoides/agregados se combinan y las células se tiñen con anexina-V-fluos y propilyoduro en la presencia de CaCl2 de 2 mm complementado, (anexina-V-fluos kit tinción de, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania) . La fluorescencia de 10,000 células se adquiere al usar un citómetro de flujo (instrumento de exploración de FACS, Becton Dickinson, San José, California, los EE. UU) . La estadística del cuadrante se aplica en punto gráfica, con la cantidad de células viables ubicadas en el cuadrante de la esquina inferior izquierda.

Para obtener la cantidad absoluta de células muertas y viables, la cantidad de células totales de los esferoides/agregados se cuenta al usar una célula de Fuchs-Rosenthal contar la cámara y se multiplica con el porcentaje de células viables o muertas de los mismos esferoides/agregados que se determina a partir de la tinción por anexina-V-fluos/PI .

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Un método para la detección in vitro de la función efectora de un anticuerpo que comprende la incubación de un esferoide o agregado tridimensional que comprende células tumorales y linfocitos citoliticos espontáneos con el anticuerpo .

2. El método según la reivindicación 1, que comprende las etapas que siguen: a) mezclar linfocitos citoliticos espontáneos y células tumorales, b) adicionar aproximadamente 104 células por 200µ1 a los pocilios de una placa multipocillo , c) centrifugar la placa multipocillo e inducir asi la formación de un esferoide o agregado tridimensional, d) adicionar el anticuerpo a los pocilios de la placa multipocillo, e) incubar la placa multipocillo durante aproximadamente 20 horas hasta aproximadamente 72 horas f) analizar las células en los pocilios de la placa multipocillo por citofluorimetro de flujo y detectar asi la función efectora del anticuerpo.

3. El método según la reivindicación 2, caracterizado porque los linfocitos citoliticos espontáneos son linfocitos citoliticos espontáneos de humano.

. El método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque los linfocitos citolíticos espontáneos y células tumorales se mezclan en una proporción de 10: 1 a 1: 10.

5. El método según la reivindicación 4, caracterizado porque la proporción es de 1:2 a 1:4.

6. El método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la incubación es durante aproximadamente 20 horas hasta aproximadamente 28 horas.

. El método según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, caracterizado porque la centrifugación es de 1,000 revoluciones por minuto durante 10 minutos.

8. El método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la célula tumoral es una célula linfomatosa.

9. El método según la reivindicación 8, caracterizado porque la célula linfomatosa es una célula de Raji, o una célula SU-DHL4 o una célula Z138.

10. El método según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 9, caracterizado porque el anticuerpo se agrega en una concentración de 15pg/ml a 0.1 g/ml.

11. El método según la reivindicación 10, caracterizado porque el anticuerpo se agrega en una concentración de 8µg/ml a 12pg/ml .

12. El uso de un esferoide o agregado tridimensional que comprende células tumorales y linfocitos citolíticos espontáneos para la determinación de la función efectora de una combinación de anticuerpos múltiples con células tumorales múltiples.

13. Un método para determinar in vi tro un anticuerpo con la función efectora que¦ comprende : a) mezclar linfocitos citolíticos espontáneos y células tumorales , b) adicionar aproximadamente 104 células por 200µ1 a los pocilios de una placa multipocillo, c) centrifugar la placa multipocillo e inducir asi la formación de un esferoide o agregado tridimensional, d) adicionar cada uno de los anticuerpos proporcionados a un pocilio individual de la placa multipocillo, e) incubar la placa multipocillo durante aproximadamente 20 horas hasta aproximadamente 72 horas, y f ) determinar el anticuerpo, con una proporción de más de 1 inviable con respecto a células viables como anticuerpo con función efectora.

14. Un kit que comprende: a) una célula tumoral marcada por un tinte fluorescente, b) linfocitos citolíticos espontáneos aislados, c) una placa multipocillo de 96 pocilios, y d) propilyoduro .