KR20130106044A - 효소 기질의 고분자화에 의한 그라핀옥사이드의 형광저하를 이용한 바이오센서 및 이를 이용한 검출방법 - Google Patents

효소 기질의 고분자화에 의한 그라핀옥사이드의 형광저하를 이용한 바이오센서 및 이를 이용한 검출방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 효소 기질의 고분자화에 의한 그라핀옥사이드의 형광저하를 이용한 바이오센서 및 이를 이용한 검출방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 형광 염료의 사용없이 그라핀옥사이드 자체의 고유한 형광 특성을 이용하여, 검출 물질의 존재 여부를 광학적으로 식별할 수 있는 효소 기질의 고분자화에 의한 그라핀옥사이드의 형광저하를 이용한 바이오센서 및 이를 이용한 검출방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 효소 기질의 고분자화에 의한 그라핀옥사이드의 형광저하를 이용한 바이오센서는 형광 염료의 사용없이 그라핀옥사이드 자체의 형광 특성을 이용한 바이오 물질 검출센서로, 합성 공정이 복잡하고 비싼 염료의 사용이 제한되므로 경제성이 우수하다. 또한, 직접적으로 다양한 표적 물질을 검출할 수 있고, 간단한 공정으로 바이오센서의 검출 한도를 향상시킬 수 있다.

Description

효소 기질의 고분자화에 의한 그라핀옥사이드의 형광저하를 이용한 바이오센서 및 이를 이용한 검출방법{Biosensor Using the Graphene Oxide by the Polymer of Enzyme Substrate and Method of Detecting Using It}
본 발명은 효소 기질의 고분자화에 의한 그라핀옥사이드의 형광저하를 이용한 바이오센서 및 이를 이용한 검출방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 형광 염료의 사용없이 그라핀옥사이드 자체의 고유한 형광 특성을 이용하여, 검출 물질의 존재 여부를 광학적으로 식별할 수 있는 효소 기질의 고분자화에 의한 그라핀옥사이드의 형광저하를 이용한 바이오센서 및 이를 이용한 검출방법에 관한 것이다.
최근에 의료비 절감 및 생명 연장을 위해서 질병의 조기 진단에 대한 필요성이 점점 증가하고 있다. 특정 질병 여부를 알려주는 생체지표물질은 대부분의 경우, 매우 낮은 농도로 시료 속에 존재하기 때문에, 생체지표물질의 존재 및 농도를 고감도로 측정할 수 있는 바이오 센서가 필요하다.
바이오센서란 생체감지물질(bio receptor)과 신호 변환기(signal transducer)로 구성되어 인식 가능한 신호로 변환하여 분석하고자하는 물질을 선택적으로 감지하는 장치이다. 생체감지물질로는 특정 물질과 선택적으로 반응 및 결합할 수 있는 효소, 항체, 항원, 호르몬 수요체 등이 있으며, 신호 변환 방법으로는 전기화학, 형광, 발색, SPR(surface plasmon resonance), FET(fieldeffecttransistor), QCM(quartz crystal microbalance), 열센서 등 다양한 물리화학적 방법을 사용한다.
상기의 바이오센서의 신호 변환 방법 중에서 형광 방식은 물질간의 결합에 따른 형광 특성 변화를 유도하기 위하여 염료를 사용하고, 표적 물질(센싱 대상 물질)과 프로브 물질(특정 물질과 선택적으로 반응 및 결합하는 물질)을 염료로 표지화(labeling)시켜야하므로 제조 공정이 복잡하고, 염료의 높은 가격으로 인해 경제성이 떨어지는 문제점이 있다.
이에, 한국 출원특허 제10-2009-0084855호는 그라핀옥사이드를 이용하여, 표적 물질(센싱 대상 물질)을 금 나노입자로 표지화한 다음, 금 나노입자의 성장으로 인하여 그라핀옥사이드의 형광 특성을 감소시키는 바이오센서를 제조하였으나, 표적 물질에 금 나노입자를 표지화하는 공정이 복잡하고, 표적물질인 단일 스트랜드 DNA의 길이가 짧거나 긴 경우에는 금 나노입자에 의한 형광 저하가 발생하지 않아 표적 물질을 검출하지 못하는 문제점이 있다.
이에, 본 발명자들은 상기 문제점을 해결하기 위하여 예의 노력한 결과, 그라핀옥사이드층에 고정화된 포획 항체와 표적 항원을 결합시키고, 효소를 함유하는 검출 항체를 결합시켜 효소 기질을 첨가한 다음, 효소 기질의 고분자화를 유도하여 표적 항원을 검출할 경우, 형광 염료의 사용없이 우수한 검출 한도를 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 형광 염료의 사용없이 그라핀옥사이드 자체의 고유한 형광 특성을 이용하여, 검출 물질의 존재 여부를 광학적으로 식별할 수 있는 효소 기질의 고분자화에 의한 그라핀옥사이드의 형광저하를 이용한 바이오센서 및 이를 이용한 검출방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 기판 상에 그라핀옥사이드층을 형성하는 단계; (b) 상기 형성된 그라핀옥사이드층에 포획 항체(capture antibody)를 고정화시키는 단계; (c) 상기 고정화된 포획 항체에 표적 항원을 결합시키는 단계; (d) 상기 결합된 표적 항원에 효소를 함유하는 검출 항체(detecrion antibody)를 결합시키는 단계; (e) 상기 결합된 효소를 함유하는 검출 항체에 효소 기질을 첨가하여 효소 기질의 고분자화를 유도하는 단계; 및 (f) 상기 효소 기질의 고분자화가 유도된 그라핀옥사이드의 형광 강도를 측정하여 표적 항원을 검출하는 단계를 포함하는 효소 기질의 고분자화에 의한 그라핀옥사이드의 형광저하를 이용한 표적 항원의 검출방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 그라핀옥사이드층; 상기 그라핀옥사이드층에 고정화된 포획 항체; 상기 포획 항체에 결합된 표적 항원; 및 상기 표적 항원에 결합된 효소를 함유하는 검출 항체를 포함하며, 여기서 상기 효소를 함유하는 검출 항체의 효소와 효소 기질이 결합하는 경우, 효소 기질의 고분자화에 의해 그라핀옥사이드의 형광강도를 감소시키는 것을 특징으로 하는 효소 기질의 고분자화에 의한 그라핀옥사이드의 형광저하를 이용한 바이오센서를 제공한다.
본 발명에 따른 효소 기질의 고분자화에 의한 그라핀옥사이드의 형광저하를 이용한 바이오센서는 형광 염료의 사용없이 그라핀옥사이드 자체의 형광 특성을 이용한 바이오 물질 검출센서로, 합성 공정이 복잡하고 비싼 염료의 사용이 제한되므로 경제성이 우수하다. 또한, 직접적으로 다양한 표적 물질을 검출할 수 있고, 간단한 공정으로 바이오센서의 검출 한도를 향상시킬 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 효소 기질의 고분자화에 의한 그라핀옥사이드의 형광저하를 이용한 바이오센서의 개략도로, (a)는 효소와 효소 기질의 반응 전이고, (b)는 효소와 효소 기질의 반응 후이다.
도 2는 본 발명에 따른 그라핀옥사이드의 UV-Vis 스펙트럼 결과 그래프로, (a)는 그라핀옥사이드 수용액 내의 그라핀옥사이드이고, (b)는 그라핀옥사이드층이 형성된 아민-개질된 유리 슬라이드의 그라핀옥사이드이다.
도 3은 본 발명에 따른 그라핀옥사이드의 형광도 그래프로, (a)는 DAB 중합 전 그라핀옥사이드이고, (b)는 DAB 중합 후 그라핀옥사이드이다.
도 4는 본 발명에 따른 아민-개질된 유리 및 DAB 중합 전·후 그라핀옥사이드 증착 유리의 라만 스펙트럼 결과 그래프이다.
도 5는 본 발명에 따른 DAB 중합 전·후 그라핀옥사이드 증착 유리 표면의 UV-Vis 스펙트럼 결과 그래프이다.
도 6은 본 발명에 따른 그라핀옥사이드의 AFM 분석으로, (a)는 그라핀옥사이드 증착-아민-개질된 유리 표면이고, (b)는 항IL-5 항체를 고정시킨 그라핀옥사이드의 표면이다.
도 7은 본 발명에 따른 IL-5의 농도 변화에 따른 그라핀옥사이드의 상대 형광도 그래프이다.
도 8은 본 발명에 따른 효소 기질의 고분자화에 의한 그라핀옥사이드의 형광저하를 이용한 바이오센서의 사이토카인의 종류에 대한 상대 형광도 그래프이다.
도 9는 본 발명에 따른 효소 기질의 고분자화에 의한 그라핀옥사이드의 형광저하를 이용한 바이오센서의 인간 혈청 내의 IL-5에 대한 상대형광도 그래프이다.
본 명세서에서 사용되는 '포획 항체(capture antibody)'는 원하는 항원과 특이적, 선택적으로 결합 가능한 항체를 의미하고, '표적 항원'은 센싱 대상 항원을 의미한다. 또한, 본 명세서에 사용되는 '검출 항체(detecrion antibody)'는 센싱 대상 항원과 특이적, 선택적으로 결합 가능한 항체를 의미한다.
본 발명은 일 관점에서, (a) 기판 상에 그라핀옥사이드층을 형성하는 단계; (b) 상기 형성된 그라핀옥사이드층에 포획 항체(capture antibody)를 고정화시키는 단계; (c) 상기 고정화된 포획 항체에 표적 항원을 결합시키는 단계; (d) 상기 결합된 표적 항원에 효소를 함유하는 검출 항체(detecrion antibody)를 결합시키는 단계; (e) 상기 결합된 효소를 함유하는 검출 항체에 효소 기질을 첨가하여 효소 기질의 고분자화를 유도하는 단계; 및 (f) 상기 효소 기질의 고분자화가 유도된 그라핀옥사이드의 형광 강도를 측정하여 표적 항원을 검출하는 단계를 포함하는 효소 기질의 고분자화에 의한 그라핀옥사이드의 형광저하를 이용한 표적 항원의 검출방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른, 바이오센서는 다양한 표적 항원을 검출하기 위하여 고유한 형광 특성을 가진 그라핀옥사이 상에 포획 항체, 표적 항원 및 효소를 함유하는 검출 항체가 연결되어 결합하고, 여기서 검출 항체의 효소가 효소 기질과 결합하여 생성된 고분자에 의하여 그라핀옥사이드의 형광 강도를 감소시켜 표적 항원을 검출한다.
상기 그라핀옥사이드(graphene oxide)는 그래파이트(graphite)를 강산과 강산화제 하에서 산화시켜 제조되며, 판상의 면 부분에 다수의 에폭시기, 알콜기 또는 카보닐기를 포함하고 판상의 끝부분에는 카르복실기를 포함하는 형태로 이루어져 있다. 또한, 그라핀옥사이드는 그라핀(graphene)에 비하여 불규칙적이고 다양한 모양의 판상 구조를 형성하며, 상기 에폭시기, 알콜기 또는 카보닐기에 의하여 판상과 판상 사이의 거리를 그라핀에 비하여 넓게 유지하고 있어 용매 및 다른 유기물의 침투를 용이하게 하기 때문에 용매 및 고분자 물질과의 상용성을 향상시킬 수 있다. 특히, 상기 알콜기 및 카르복실기의 경우 친수성을 가지기 때문에 그라핀에 비하여 물이나 극성용매에 대하여 우수한 분산성을 보인다. 또한, 그라핀옥사이드는 들뜬 에너지를 광자로 방출하는 형광 특성을 자기고 있다. 이에, 본 발명은 그라핀옥사이드의 고유한 형광 특성을 바이오센서에 이용하여 검출 물질의 존재 여부를 광학적으로 식별하는 것을 핵심 요지로 한다.
본 발명에 따른 그라핀옥사이드 기반 항체-항원-항체 바이오센서는 도 1에 나타낸 바와 같이, 기판상에 그라핀옥사이드(10), 포획 항체(11), 표적 항원(12), HRP-검출 항체(13)를 포함한다. 일 실시예에서는 포획 항체, 표적 항원 및 검출 항체에 IL-5를 사용하였으나, 본 발명의 범위는 이에 제한되지 않는다.
상기 기판은 실리콘(silicon), 석영(quartz), 알루미나, 타티타니아, 세라믹(ceramic) 및 유리(glass)로 구성된 군에서 선택되고, 바람직하게는 유리를 사용할 수 있다. 또한, 상기 (a)단계에서 그라핀옥사이드층의 형성은 아민, 암모니움 및 아실 양이온으로 구성된 군에서 선택하여 사용할 수 있으며, 바람직하게는 아민을 사용하여 기능기로 기판을 개질시킨 다음, 그라핀옥사이드와 반응시켜 수행할 수 있다.
일 실시예로, 상기 개질된 기판 상에 그라핀옥사이드의 함량이 10-6 ~ 10-3 중량부인 그라핀옥사이드 수용액을 도핑한 다음, 항온항습기에서 12시간동안 배양을 수행하여 증착시킬 수 있다.
상기 포획 항체는 모든 질병에 관한 항체가 가능하고, 바람직하게는 인터류킨-2(IL-2) 항체, 인터류킨-5(IL-5) 항체, 인터류킨-6(IL-6) 항체, 인터류킨-7(IL-7) 항체, 인터페론-감마(INF-γ) 항체, aFGF/FGF-1 항체, CDKN2D 항체, Prostatic Acid Phosphatase 등의 암생체표식체(cancer biomarker) 및 hCG 항체, LH 항체, HIV 항체, HVC 항체, HBV 항체, HepA 항체, HepB 항체 등의 병원성 단백질 항체로 구성된 군에서 선택하여 사용할 수 있으며, 이에 한정하는 것은 아니다. 상기 (b)단계에서 포획 항체의 고정화는정전기 결합, 안히드라이드, 불화페틸에스터 및 카르보디이미드-간접 아미드화 반응으로 구성된 군에서 선택되고, 바람직하게는 카르보이미드-간접 아미드화 반응 및 정전기 결합 반응을 사용하여 그라핀옥사이층에 고정시킨다. 일 실시예로, 포획 항체의 고정화는 3시간 동안 온도 10℃ ~ 20℃에서 수행되고, 바람직하게는 10℃에서 수행할 수 있다. 30℃를 벗어날 경우, 항체 및 항체의 특이적 활성 저하의 문제점이 있다.
또한, 상기 포획 항체와 결합하는 표적 항원은 모든 질병에 관한 항체가 가능하고, 바람직하게는 인터류킨-2(IL-2) 항원, 인터류킨-5(IL-5) 항원, 인터류킨-6(IL-6) 항원, 인터류킨-7(IL-7) 항원, 인터페론-감마(INF-γ) 항원, aFGF/FGF-1 항원, CDKN2D 항원, Prostatic Acid Phosphatase 등의 암생체표식체(cancer biomarker) 및 hCG 항원, LH 항원, HIV 항원, HVC 항원, HBV 항원, HepA 항원, HepB 항원 등의 병원성 단백질 항원으로 구성된 군에서 선택하여 사용할 수 있으며, 이에 한정하는 것은 아니다. 일 실시예로, 상기 (c)단계에서 표적 항원의 결합은 1시간 동안 온도 2℃ ~ 25℃에서 수행되고, 바람직하게는 10 ℃에서 수행할 수 있다. 30℃를 벗어날 경우, 항원 및 항원의 특이적 활성 저하의 문제점이 있다.
상기 효소를 함유하는 검출 항체는 모든 질병에 관한 항체가 가능하고, 바람직하게는 인터류킨-2(IL-2) 항체, 인터류킨-5(IL-5) 항체, 인터류킨-6(IL-6) 항체, 인터류킨-7(IL-7) 항체, 인터페론-감마(INF-γ) 항체, aFGF/FGF-1 항체, CDKN2D 항체, Prostatic Acid Phosphatase 등의 암생체표식체(cancer biomarker) 및 hCG 항체, LH 항체, HIV 항체, HVC 항체, HBV 항체, HepA 항체, HepB 항체 등의 병원성 단백질 항체로 구성된 군에서 선택하여 사용할 수 있으며, 이에 한정하는 것은 아니다. 상기 (d)단계에서 효소를 함휴하는 검출 항체는 표적 항원에 대응하여 결합할 수 있다.
상기 효소는 시토크롬c 과산화효소(cytochrome c peroxidase), 글루타티온 과산화효소(glutathione peroxidase), 미엘로퍼옥시다아제(myeloperoxidase), vanadium bromoperoxidase(바나듐 브로모과산화효소), 타이로이드 과산화효소(thyroid peroxidase), 락토페르옥시다아제(lactoperoxidase) 및 호스래디시 과산화효소(HRP ; horseradish peroxidase)로 구성된 군에서 선택되고, 바람직하게는 호스래디시 과산화효소(HRP ; horseradish peroxidase)를 사용할 수 있다. 또한, 상기 효소 기질은 N,N-bis(4-sulfobutyl)-3,5-dimethylaniline, N-ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3-methoxyaniline, N-ethyl-N-(3-sulfopropyl)-3-methoxyaniline, N-ethyl-N-(3-sulfopropyl)aniline, N-ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-dimethoxyaniline, N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-dimethoxyaniline, N-ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-dimethylaniline, N,N-bis(4-sulfobutyl)-3-methylaniline, N-ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3-methylaniline, N-ethyl-N- (3-sulfopropyl)-3-methylaniline로 구성된 군에서 선택되는 화합물과 4-aminoantipyrine의 혼합물, N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol, 3-Amino-9-ethylcarbazole, N-(6- aminohexyl)-N-ethylisoluminol, 4-aminophthalhydrazide, 5- aminosalicylic acid, 2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid), 2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium, 4-chloro-1-naphthol, 4-chloro-7-nitrobenzofurazan, o-dianisidine, dicarboxidine dihydrochloride, guaiacol, iodonitrotetrazolium chloride, MTT formazan, nitrotetrazolium blue chloride, o-phenylenediamine, 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine (TMB), tetrazolium violet, 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride, 3,3’-diaminobenzidine tetrahydrochloride 및 디아미노벤지딘(DAB;3,3' -diaminobenzidine)으로 구성된 군에서 선택되고, 바람직하게는 디아미노벤지딘(DAB;3,3' -diaminobenzidine)을 사용할 수 있다.
상기 (e)단계에서 효소 기질을 첨가한 다음, 검출 항체의 효소와 결합하여 진한 갈색의 oxidized DAB 또는 polymerized DAB이 그라핀옥사이층 위에 박막을 생성하여 그라핀옥사이드의 형광 특성을 감소시킨다. 즉, 본 발명은 검출 물질의 유무를 확인하기 위하여, 그라핀옥사이드의 형광 특성 및 그라핀옥사이드의 형광 강도를 저하시킬 수 있는 효소와 효소 기질의 고분자화에 의한 oxidized DAB 또는 polymerized DAB의 박막 형성을 이용한다.
본 발명은 다른 관점에서, 그라핀옥사이드층; 상기 그라핀옥사이드층에 고정화된 포획 항체; 상기 포획 항체에 결합된 표적 항원; 및 상기 표적 항원에 결합된 효소를 함유하는 검출 항체를 포함하며, 여기서 상기 효소를 함유하는 검출 항체의 효소와 효소 기질이 결합하는 경우, 효소 기질의 고분자화에 의해 그라핀옥사이드의 형광강도를 감소시키는 것을 특징으로 하는 바이오센서에 관한 것이다.
구체적으로, 효소 기질의 고분자화에 의한 그라핀옥사이드의 형광저하를 이용한 바이오센서는 형광 염료의 사용없이 그라핀옥사이드 자체의 형광 특성과 효소와 효소 기질의 고분자화에 의한 oxidized DAB 또는 polymerized DAB의 박막 형성을 이용하여 검출 물질의 존재 여부 및 농도를 광학적으로 식별할 수 있다. 또한, 직접적으로 다양한 표적 물질을 검출할 수 있고, 간단한 공정으로 바이오센서의 검출 한도를 향상시킬 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 : 그라핀옥사이드를 이용한 바이오센서 제조
1-1 : 그라핀옥사이드 제조
천연 그래파이트(Graphit Kropfmuhl AG, Germany)를 변형된 Hummer법에 의해 제조하였다. 흑연 플래이크를 NaNO3 및 KMnO4 와 함께 진한 황산에 넣고 산화시킨 후 5 중량%의 질산으로 세척한 후 과산화수소용액으로 산화시킨 후 염산 및 증류수로 세척하고 투석한다.
1-2 : 그래핀옥사이드층이 형성된 유리 슬라이드 제조
유리 슬라이드를 피라니아 용액(황산:H2O2 = 1:3)에 침지시켜 70℃에서 15분간 처리했다. 피라니아 용액으로 처리한 유리 슬라이드는 2차 증류수와 에탄올로 세척한 다음, 실온에서 4시간 동안 1% 3-아미노프로필 트리메틸실록산(APTMS, 3-aminopropyltrimethoxysilane; Sigma Aldich, USA) 에탄올 용액에 침지시켰다. 침지 후 유리 슬라이드를 120℃에서 30분간 건조하여 아민-개질된 유리 슬라이드를 생성하였다.
아민-개질된 유리 슬라이드 상에 그라핀옥사이드 수용액(~1mg/ml)을 떨어뜨린 다음, 24시간 동안 항온항습기에서 배양하였다. 배양 후, 수득된 그라핀옥사이드층이 형성된 유리 슬라이드는 H2O2로 세척하고 건조하여 어두운 곳에 보관하였다.
1-3 : 효소 기질의 고분자화에 의한 그라핀옥사이드의 형광저하를 이용한 바이오센서 제조
상기 실시예 1-1에서 수득된 그라핀옥사이드층이 형성된 유리 슬라이드 상에 40mM 1-에틸-3-(디메틸아미노프로필)카르복디이미드 (EDC,1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide; Sigma Aldich, USA)와 10mM N-하이드록시석신이미드(NHS, N-hydroxysuccinimide; Sigma Aldich, USA)가 함유된 pH 6.0인 10mM 인산 완충용액(phosphate buffer, PB)을 15분간 첨가한 다음, IL-5 포획 항체 2㎕/㎖ 용액이 함유된 pH 7.0인 10mM 인산 완충용액을 실온에서 3시간 동안 배양시킨 후, 인산 완충 식염수(PBS, phosphate buffer saline)로 세척하여 항체가 고정화된 그라핀옥사이드층이 형성된 유리 슬라이드를 수득하였다. 상기 항체가 고정화된 그라핀옥사이드층이 형성된 유리 슬라이드의 특정 스폿에 소 혈청 알부민(BSA, borvine serum albumin) 30mg/㎖를 첨가하고, 실온에서 1시간 30분 동안 배양시켰다. 이후, 0.001% tween 20과 PBS를 함유한 IL-5 용액을 항체가 고정화된 스폿에 첨가하여 1시간 동안 실온에서 배양시킨 다음, PBS로 세척하였다. 비오틴-항 IL-5 항체(BD Pharmingen, USA) 10㎍/㎖에 스트렙타아비딘-홀스래디쉬 퍼옥시다아제 칸저게이트(STA-HRP, streptavidin-horseradish peroxidase conjugate; BD Pharmingen, USA)를 첨가하여 1시간 동안 혼합한 다음, 비오틴-BSA 5.2㎍/㎖를 첨가하여 1시간 동안 혼합하여 제조한 항 IL-5 항체-HRP 용액 2.5㎍/㎖를 IL-5를 첨가한 스폿에 떨어뜨렸다. 항체-HRP 용액으로 세척하고 건조한 다음, 2mM H2O2를 함유한 1mM 3,3'-디아미노벤지딘(DAB, 3,3'-diaminobenzidine; Sigma Aldich, USA)을 첨가하고 8분 동안 반응시켰다.
실험예 1 : UV 특성 분석
실시예 1-2에 의해 수득된 그라핀옥사드층이 형성된 유리 슬라이드의 표면에 그라핀옥사이드층의 형성을 확인하기 위해 UV/Vis 스펙트럼(Jasco, Japan)으로 측정하였다.
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, (a)와 (b)의 그라핀옥사이드는 각각 230nm와 220nm에서 전형적인 강한 흡수 밴드를 나타냈고, 그라핀옥사이드 수용액의 310nm로에서 그라핀옥사이드층이 형성된 아민-개질된 유리 슬라이드의 320nm로 피크가 이동한 것은 그라핀옥사이드의 음전하와 유리 표면의 양전하사이의 결합에 의한 미세 환경 변화 때문이다.
또한, 그라핀옥사이드의 DAB 중합 전 후 형광도를 확인하기 위해 UV/Vis 스펙트럼(Jasco, Japan)으로 측정하였다. 그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, DAB 중합 전 그라핀옥사이드는 480nm에서 최대 545nm까지 광범위한 형광 방출 밴드를 보여주지만, DAB 중합 후 그라핀옥사이드의 형광도는 95%이상 감소한다. 이와 같은 현상은 그라핀옥사이드층이 형성된 아민-개질된 유리 슬라이드에서도 확인하였다(도 3의 Inset graph). DAB는 HRP와 H2O2에 의해 산화 중합 반응을 통해 진한 갈색의 고분자화합물을 생성하고 이에 의해 그라핀옥사이드의 형광 특성을 감소시킨다. 또한, 도 4에 나타낸 바와 같이, DAB 중합 전·후로 그라핀옥사이드의 고유한 특성 피크인 1338㎝- 1(D)와 1597㎝-1(G)의 피크가 감소함을 확인하였고, 도 5의 UV/Vis 스펙트럼 측정 결과에서도 DAB 중합 전 그라핀옥사이드의 흡수 밴드가 450nm에서 DAB 중합 후 300nm ~ 700nm로 넓은 흡수 밴드로 변화를 보여주었다.
실험예 2 : AFM 특성 분석
실시예 1-2에 의해 수득된 그라핀옥사이드층이 형성된 아민-개질된 유리 슬라이드와 실시예 1-3에 의해 수득된 항IL-5 항체를 고정시킨 그라핀옥사이드의 단면을 확인하기 위해 Nanoscope IIID Multimode AFM(Digital Instrument Inc., USA)으로 측정하였다. 그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 단면 분석에 의해 그라핀옥사이드 상에 고정화된 항IL-5 항체의 높이는 그라핀옥사이드에 부착된 항체의 방향에 따라 0.8 ~ 1.7nm로 측정되었다.
실험예 3 : 상대 형광도 특성 분석
실시예 1-3에 의해 수득된 효소 기질의 고분자화에 의한 그라핀옥사이드의 형광저하를 이용한 바이오센서의 상대 형광도를 확인하기 위해 GenePix Professional 4200A(Axon Instrument, USA)로 측정하였다.
그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, 그라핀옥사이드의 형광 강도를 감소시키는 DAB와 비례 관계인 IL-5의 농도가 증가할수록 그라핀옥사이드의 상대 형광도가 감소함을 보여준다. 그라핀옥사이드를 이용한 바이오센서의 형광도는 IL-5의 농도가 4.0ng/㎖일 때, 약 20%정도 감소하였다. 본 발명에 따른 그라핀옥사이드를 이용한 바이오센서의 IL-5 검출 한도는 5pg/㎖로 다른 IL-5 센서보다 우수하였다.
또한, 도 8에 나타난 바와 같이, 실시예 1-3에서 수득된 효소 기질의 고분자화에 의한 그라핀옥사이드의 형광저하를 이용한 바이오센서에 각각 IL-2, IL-5, IL-6, IL-7 및 INF-γ와 같은 사이토카인의 종류에 따른 그라핀옥사이드의 상대 형광도의 경우, IL-5가 50%의 상대 형광도 감소를 나타내어 효소 기질의 고분자화에 의한 그라핀옥사이드의 형광저하를 이용한 바이오센서가 IL-5 검출에 가장 우수함을 확인하였다.
또한, 도 9에 나타난 바와 같이, 항IL-5 항체와 BSA에 대한 그라핀옥사이드를 이용한 바이오센서의 상대 형광도는 IL-5의 농도 변화에 따른 BSA와 결합한 그라핀옥사이드의 상대 형광도 변화는 거의 없었다. 반면에, 항IL-5 항체가 고정화된 그라핀옥사이드의 상대 형광도는 IL-5의 농도가 0 ~ 100ng/㎖ 까지 증가할 때, 50% 정도 감소하였다. 인간 혈청 용액을 이용한 검출 한도는 PBS 완충용액을 이용한 검출 한도 10pg/㎖와 같았다.
그라핀옥사이드를 이용한 바이오센서는 포획 항체를 변경하여 다른 화학물질의 검출과 분자생물학에서 다양한 타겟 단백질의 고속 대량 분석에 적용할 수 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
10 : 그라핀옥사이드
11 : 포획 항체
12 : 표적 항원
13 : HRP-검출 항체

Claims (18)

  1. 다음의 단계를 포함하는, 효소 기질의 고분자화에 의한 그라핀옥사이드의 형광저하를 이용한 표적 항원의 검출방법 :
    (a) 기판 상에 그라핀옥사이드층을 형성하는 단계;
    (b) 상기 형성된 그라핀옥사이드층에 포획 항체를 고정화시키는 단계;
    (c) 상기 고정화된 포획 항체에 표적 항원을 결합시키는 단계;
    (d) 상기 결합된 표적 항원에 효소를 함유하는 검출 항체를 결합시키는 단계;
    (e) 상기 결합된 효소를 함유하는 검출 항체에 효소 기질을 첨가하여 효소 기질의 고분자화를 유도하는 단계; 및
    (f) 상기 효소 기질의 고분자화가 유도된 그라핀옥사이드의 형광 강도를 측정하여 표적 항원을 검출하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 상기 기판은 실리콘(silicon), 석영(quartz), 세라믹(ceramic), 알루미나, 타이타니아 및 유리(glass)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 효소 기질의 고분자화에 의한 그라핀옥사이드의 형광저하를 이용한 표적 항원의 검출방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 (a)단계에서 그라핀옥사이드층의 형성은 아민, 암모니움 및 아실 양이론으로 구성된 군에서 선택되는 기능기로 기판을 개질시킨 다음, 그라핀옥사이드와 반응시켜 수행하는 것을 특징으로 하는 효소 기질의 고분자화에 의한 그라핀옥사이드의 형광저하를 이용한 표적 항원의 검출방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 포획 항체는 인터류킨-2(IL-2) 항체, 인터류킨-5(IL-5) 항체, 인터류킨-6(IL-6) 항체, 인터류킨-7(IL-7) 항체, 인터페론-감마(INF-γ) 항체, aFGF/FGF-1 항체, CDKN2D 항체, Prostatic Acid Phosphatase, hCG 항체, LH 항체, HIV 항체, HVC 항체, HBV 항체, HepA 항체 및 HepB 항체로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 효소 기질의 고분자화에 의한 그라핀옥사이드의 형광저하를 이용한 표적 항원의 검출방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 (b)단계에서 포획 항체의 고정화는 정전기 결합, 안히드라이드, 불화페틸에스터 및 카르보디이미드-간접 아미드화 반응으로 구성된 군에서 선택되는 방법으로 그라핀옥사이드층에 고정화시키는 것을 특징으로 하는 효소 기질의 고분자화에 의한 그라핀옥사이드의 형광저하를 이용한 표적 항원의 검출방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 표적 항원은 인터류킨-2(IL-2) 항원, 인터류킨-5(IL-5) 항원, 인터류킨-6(IL-6) 항원, 인터류킨-7(IL-7) 항원, 인터페론-감마(INF-γ) 항원, aFGF/FGF-1 항원, CDKN2D 항원, Prostatic Acid Phosphatase, hCG 항원, LH 항원, HIV 항원, HVC 항원, HBV 항원, HepA 항원 및 HepB 항원으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 효소 기질의 고분자화에 의한 그라핀옥사이드의 형광저하를 이용한 표적 항원의 검출방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 검출 항체는 인터류킨-2(IL-2) 항체, 인터류킨-5(IL-5) 항체, 인터류킨-6(IL-6) 항체, 인터류킨-7(IL-7) 항체, 인터페론-감마(INF-γ) 항체, aFGF/FGF-1 항체, CDKN2D 항체, Prostatic Acid Phosphatase, hCG 항체, LH 항체, HIV 항체, HVC 항체, HBV 항체, HepA 항체 및 HepB 항체로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 효소 기질의 고분자화에 의한 그라핀옥사이드의 형광저하를 이용한 표적 항원의 검출방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 효소는 시토크롬c 과산화효소(cytochrome c peroxidase), 글루타티온 과산화효소(glutathione peroxidase), 미엘로퍼옥시다아제(myeloperoxidase), vanadium bromoperoxidase(바나듐 브로모과산화효소), 타이로이드 과산화효소(thyroid peroxidase), 락토페르옥시다아제(lactoperoxidase) 및 호스래디시 과산화효소(HRP ; horseradish peroxidase)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 효소 기질의 고분자화에 의한 그라핀옥사이드의 형광저하를 이용한 표적 항원의 검출방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 효소 기질은 N,N-bis(4-sulfobutyl)-3,5-dimethylaniline, N-ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3-methoxyaniline, N-ethyl-N-(3-sulfopropyl)-3-methoxyaniline, N-ethyl-N-(3-sulfopropyl)aniline, N-ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-dimethoxyaniline, N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-dimethoxyaniline, N-ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-dimethylaniline, N,N-bis(4-sulfobutyl)-3-methylaniline, N-ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3-methylaniline, N-ethyl-N- (3-sulfopropyl)-3-methylaniline로 구성된 군에서 선택되는 화합물과 4-aminoantipyrine의 혼합물, N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol, 3-Amino-9-ethylcarbazole, N-(6- aminohexyl)-N-ethylisoluminol, 4-aminophthalhydrazide, 5- aminosalicylic acid, 2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid), 2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium, 4-chloro-1-naphthol, 4-chloro-7-nitrobenzofurazan, o-dianisidine, dicarboxidine dihydrochloride, guaiacol, iodonitrotetrazolium chloride, MTT formazan, nitrotetrazolium blue chloride, o-phenylenediamine, 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine (TMB), tetrazolium violet, 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride, 3,3’-diaminobenzidine tetrahydrochloride 및 디아미노벤지딘(DAB;3,3' -diaminobenzidine)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 효소 기질의 고분자화에 의한 그라핀옥사이드의 형광저하를 이용한 표적 항원의 검출방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 (f)의 표적 항원을 검출하는 단계는 효소 기질 존재하에 표적 항원과 효소가 함유된 검출 항체가 결합하는 경우, 효소 기질의 고분자화가 이루어져 그라핀옥사이드의 형광 특성을 감소시키는 것을 특징으로 하는 효소 기질의 고분자화에 의한 그라핀옥사이드의 형광저하를 이용한 표적 항원의 검출방법.
  11. 그라핀옥사이드층; 상기 그라핀옥사이드층에 고정화된 포획 항체; 상기 포획 항체에 결합된 표적 항원; 및 상기 표적 항원에 결합된 효소를 함유하는 검출 항체를 포함하며, 여기서 상기 효소를 함유하는 검출 항체의 효소와 효소 기질이 결합하는 경우, 효소 기질의 고분자화에 의해 그라핀옥사이드의 형광강도를 감소시키는 것을 특징으로 하는 바이오센서.
  12. 제11항에 있어서, 상기 기판은 실리콘(silicon), 석영(quartz), 세라믹(ceramic), 알루미나, 타이타니아 및 유리(glass)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 바이오센서.
  13. 제11항에 있어서, 상기 포획 항체는 인터류킨-2(IL-2) 항체, 인터류킨-5(IL-5) 항체, 인터류킨-6(IL-6) 항체, 인터류킨-7(IL-7) 항체, 인터페론-감마(INF-γ) 항체, aFGF/FGF-1 항체, CDKN2D 항체, Prostatic Acid Phosphatase, hCG 항체, LH 항체, HIV 항체, HVC 항체, HBV 항체, HepA 항체 및 HepB 항체로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 바이오센서.
  14. 제13항에 있어서, 상기 표적 항원은 인터류킨-2(IL-2) 항원, 인터류킨-5(IL-5) 항원, 인터류킨-6(IL-6) 항원, 인터류킨-7(IL-7) 항원, 인터페론-감마(INF-γ) 항원, aFGF/FGF-1 항원, CDKN2D 항원, Prostatic Acid Phosphatase, hCG 항원, LH 항원, HIV 항원, HVC 항원, HBV 항원, HepA 항원 및 HepB 항원으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 바이오센서.
  15. 제13항에 있어서, 상기 효소를 함유하는 검출 항체는 인터류킨-2(IL-2) 항체, 인터류킨-5(IL-5) 항체, 인터류킨-6(IL-6) 항체, 인터류킨-7(IL-7) 항체, 인터페론-감마(INF-γ) 항체, aFGF/FGF-1 항체, CDKN2D 항체, Prostatic Acid Phosphatase, hCG 항체, LH 항체, HIV 항체, HVC 항체, HBV 항체, HepA 항체 및 HepB 항체로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 바이오센서.
  16. 제11항에 있어서, 상기 효소는 시토크롬c 과산화효소(cytochrome c peroxidase), 글루타티온 과산화효소(glutathione peroxidase), 미엘로퍼옥시다아제(myeloperoxidase), vanadium bromoperoxidase(바나듐 브로모과산화효소), 타이로이드 과산화효소(thyroid peroxidase), 락토페르옥시다아제(lactoperoxidase) 및 호스래디시 과산화효소(HRP ; horseradish peroxidase)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 바이오센서.
  17. 제11항에 있어서, 상기 효소 기질은 N,N-bis(4-sulfobutyl)-3,5-dimethylaniline, N-ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3-methoxyaniline, N-ethyl-N-(3-sulfopropyl)-3-methoxyaniline, N-ethyl-N-(3-sulfopropyl)aniline, N-ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-dimethoxyaniline, N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-dimethoxyaniline, N-ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-dimethylaniline, N,N-bis(4-sulfobutyl)-3-methylaniline, N-ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3-methylaniline, N-ethyl-N- (3-sulfopropyl)-3-methylaniline로 구성된 군에서 선택되는 화합물과 4-aminoantipyrine의 혼합물, N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol, 3-Amino-9-ethylcarbazole, N-(6- aminohexyl)-N-ethylisoluminol, 4-aminophthalhydrazide, 5- aminosalicylic acid, 2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid), 2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium, 4-chloro-1-naphthol, 4-chloro-7-nitrobenzofurazan, o-dianisidine, dicarboxidine dihydrochloride, guaiacol, iodonitrotetrazolium chloride, MTT formazan, nitrotetrazolium blue chloride, o-phenylenediamine, 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine (TMB), tetrazolium violet, 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride, 3,3’-diaminobenzidine tetrahydrochloride 및 디아미노벤지딘(DAB;3,3' -diaminobenzidine)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 바이오센서.
  18. 제11항의 바이오센서에 의해 표적 항원을 검출하는 방법.
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