KR20110076217A

KR20110076217A - 혼합 배양을 이용한 미생물의 배양방법

Info

Publication number: KR20110076217A
Application number: KR1020090132866A
Authority: KR
Inventors: 김승욱; 이환효; 김은지; 김진
Original assignee: 고려대학교 산학협력단
Priority date: 2009-12-29
Filing date: 2009-12-29
Publication date: 2011-07-06
Also published as: KR101103246B1

Abstract

본 발명은 혼합배양을 이용한 미생물의 배양 방법에 관한 것으로, 보다 자세하게는 항생물질, 유기산 등과 같은 대사 산물을 생산하는 미생물의 배양 시 세포활성이 조절된 다른 미생물을 첨가하여 혼합 배양함으로써 미생물의 생장 및 대사 산물의 생산성을 향상시키는 미생물의 배양 방법에 관한 것이다.

미생물, 혼합 배양, 대사 산물, 항생물질

Description

혼합 배양을 이용한 미생물의 배양방법{A METHOD OF MICROBE CULTIVATION BY MIXED CULTURE}

본 발명은 혼합배양을 이용한 미생물의 배양 방법에 관한 것으로, 보다 자세하게는 항생제, 유기산 등과 같은 대사 산물을 생산하는 미생물의 배양 시 세포활성이 조절된 다른 미생물을 첨가하여 혼합 배양함으로써 미생물의 생장 및 대사 산물의 생산성을 향상시키는 미생물의 배양 방법에 관한 것이다.

미생물은 배양(또는 발효) 과정 중 항생물질, 유기산, 아미노산 등과 같은 대사 산물을 생산하는 것으로 알려져 있다. 예를 들어 균사체 미생물인 아크레모늄 크로시게눔(Acremonium chrysogenum)은 세팔로스포린 C(이하, ‘CPC’)라는 물질을 생산하는데, 이는 박테리아 질환의 치료용으로 널리 쓰이는 β-락탐계 항생제, 세팔로스포린의 원료가 된다. 미생물의 대사 산물은 이와 같이 의약/제약 분야, 생물 반응 공정 분야 등 여러 분야에서 유용하게 사용되므로, 이의 생산성을 높일 수 있는 미생물의 배양 방법에 대한 관심은 점점 커지고 있다.

한편 미생물 배양 시 모폴로지(morphology)의 변화, 접종원의 상태, 미생물의 종류, 작용 효소 등은 세포들의 물질대사에 깊은 관련을 가짐으로써 미생물의 생장과 대사 산물의 생산에 큰 영향을 미치는 것으로 보고되고 있다. 미생물로부터 생산되는 대표적인 중요 물질 중 특히 항생제는 이러한 배양 조건들과 밀접한 연관을 가진다.

이와 관련하여 JP2004-275189호는 유산균 및 비피도박테리움(Bifidobacterium)속 미생물의 프로바이오틱스 기능성을 높이기 위한 복수 미생물의 배양 방법, 미생물 유래 제제의 제법 등에 관해 개시하고 있다. 이 특허는 유산균 및 비피도박테리움 속의 미생물 중 적어도 하나와, 곰팡이균 등의 사상균을 각각 액체 배양한 뒤 각 액체 배양물을 액상인 채로 또는 건조 후에 혼합하여 배양하는 것을 특징으로 한다.

그러나 이 기술은 유산균 또는 비피도박테리움 속 미생물의 프로바이오틱스 기능을 보다 향상시키기 위한 것으로, 항생제 등의 대사 산물의 생산성을 높이기 위한 목적이나 효과에 대해서는 개시하고 있지 않다. 따라서 당업계에서는 대사 산물의 생산성을 향상시킬 수 있는 새로운 배양 기술의 개발이 계속 요구되고 있다.

본 발명은 이러한 기술적 배경 하에서 고안된 것으로, 본 발명의 목적은 여러 분야에서 유용하게 사용되는 미생물의 대사 산물, 특히 항생물질의 생산성 및 효율을 증가시키기 위한 새로운 미생물의 배양 방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 대사 산물을 생산하는 제1 미생물의 배양 시 세포활성이 조절된 제2 미생물을 혼합하여 배양하는 것을 특징으로 하는 미생물의 배양 방법을 제공한다.

일 실시예에 따르면, 상기 세포활성이 조절된 제2 미생물은, 세포활성이 제거된 미생물 또는 세포활성이 약화된 미생물이다.

일 실시예에 따르면, 상기 대사 산물은 항생물질, 유기산, 아미노산, 핵산, 알코올 및 비타민으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상이다.

일 실시예에 따르면, 상기 대사 산물은 항생물질이고, 바람직하게는 세팔로스포린 C이다.

일 실시예에 따르면, 상기 제1 미생물은 아크레모늄 속(Acremonium sp.)미생물이고, 상기 제2 미생물은 대장균(E.coli), 안키스트로데스무스 속(Ankistrodesmus sp.)및 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 아종(S. hygroscopicus subsp.)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상이다.

일 실시예에 따르면, 상기 제1 미생물은 아크레모늄 크리소게눔(Acremonium chrysogenum)이고, 상기 제2 미생물은 세포활성이 제거된 안키스트로데스무스 속 미생물, 세포활성이 약화된 대장균 또는 세포활성이 약화된 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 아종 하이그로스코피쿠스(S. hygroscopicus subsp. hygroscopicus)이다.

일 실시예에 따르면, 상기 제1 미생물은 제2 미생물을 혼합하기 전에 미리 배양될 수 있는데, 그 배양시간은 10시간 내지 300시간 일 수 있다.

본 발명의 미생물 배양 방법에 의하면, CPC와 같은 대사 산물의 생산성을 기존의 배양방법에 비해서 약 30% 정도 향상시킬 수 있는 뛰어난 효과가 있다. 따라서 본 발명은 대사 산물을 필요로 하는 각종 의약 및 제약산업, 그리고 생물 반응 공정 연구 등의 분야에서 매우 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명에 대하여 상세히 설명한다.

본 발명은 대사 산물을 생산하는 제1 미생물의 배양 시 세포활성이 조절된 제2 미생물을 혼합하여 배양하는 것을 특징으로 하는 미생물의 배양방법에 관한 것이다.

이 때, 상기 세포활성이 조절된 제2 미생물은, 세포활성이 제거되거나 또는 약화된 미생물이다. 세포활성을 어떻게 조절할 것인지는 미생물의 종류에 따라 달라질 수 있으나, 대체로 세포활성을 약화시킨 미생물이 세포활성을 제거한 미생물 (비활성 미생물) 보다 대사 산물의 생산성 향상 면에서 더 바람직하다.

제2 미생물로서 세포활성이 제거된 미생물을 사용하는 경우에는, 상기 제2 미생물 내의 효소 또는 DNA 입자가 대사 산물의 생산성 증가에 영향을 주는 것으로 생각된다. 또한 제2 미생물로서 세포활성이 약화된 미생물을 사용하는 경우에는, 상기 제2 미생물이 제1 미생물의 면역 반응 등을 유도하여 과도한 항생제 분비 등을 이끌어 냄으로써 대사 산물의 생산성을 증가시키는 것으로 생각된다.

본 발명에서, 대사 산물을 생산하는 제1 미생물로는, 대사 산물을 생산하는 것이면 특별히 제한 없이 사용 가능하다. 이 때, 상기 대사 산물의 예로는 항생물질, 유기산, 아미노산, 핵산, 알코올, 비타민 등을 들 수 있는데, 바람직하게는 항생물질을 들 수 있으며, 보다 바람직하게는 세팔로스포린 C를 들 수 있다.

본 발명에서 제1 미생물과 제2 미생물의 조합은, 얻고자 하는 대사 산물의 종류, 미생물의 종류, 미생물의 배양특징 또는 활성 특징 등에 따라 당업자가 적절히 결정할 수 있으나, 바람직하게는 제1 미생물로 항생물질을 생산하는 아크레모늄 속(Acremonium sp.)을 사용하고, 그에 혼합되는 제2 미생물로 대장균(E.coli), 안키스트로데스무스 속(Ankistrodesmus sp.)또는 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 아종(S. hygroscopicus subsp.)등을 1종 이상 사용할 수 있다.

보다 바람직하게는 제1 미생물로 세팔로스포린 C를 생산하는 아크레모늄 크리소게눔(Acremonium chrysogenum)을 사용하고, 상기 제2 미생물로는 세포활성이 제거된 안키스트로데스무스 속 미생물, 세포활성이 약화된 대장균, 세포활성이 약화된 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 아종 하이그로스코피쿠스(S. ygroscopicus subsp. hygroscopicus)등을 1종 이상 사용한다.

한편 제2 미생물의 세포활성을 제거 또는 약화시키는 방법으로는 당업계에서 공지된 방법을 제한 없이 사용할 수 있다.

예를 들어 제2 미생물의 세포활성을 제거하는 방법으로는 다음의 방법을 사용할 수 있다: 선택된 제2 미생물은 아가(agar)를 제외한 각각의 액체 배지에서 정치 배양한 다음, 유리 비드와 함께 볼텍스 믹서(vortex mixer) 등으로 믹싱하여 세포를 파쇄시킴으로써 비활성으로 만들 수 있다. 이때 상기 제2 미생물이 안키스트로데스무스 속인 경우에는 상기 정치 배양시 빛을 차단하는 것이 바람직하다.

제2 미생물의 세포활성을 약화시키는 방법으로는, 백신 제조 과정을 응용하는 방법, 또는 미생물을 열악한 환경(최적 배지가 아닌 기타 배지 사용, 주요필수성분을 제거한 배지 사용, 최적 조건이 아닌 조건에서 배양 등)에서 계대 배양하는 방법 등을 사용할 수 있다.

예를 들어, 제2 미생물로 대장균을 사용하는 경우에는, 이를 PDA(potato dextrose agar), 아가, PDA 및 아가 배지에서 순서대로 계대 배양하고, 다시 이를 PDB(potato dextrose broth) 배지에서 각각 일정 시간 배양하는 방법을 통해 그 세포활성을 약화시킬 수 있다.

한편 제1 미생물과 제2 미생물의 혼합 배양시의 배양 조건은, 사용되는 미생물들의 종류(특히 제1 미생물의 종류), 배지의 종류 등에 따라 당업자가 적절히 결정할 수 있다. 예를 들어 본 발명의 일 실시예에서는 제1 미생물로 아크레모늄 크리소게눔을, 그리고 제2 미생물로는 대장균 등을 사용하는데, 이 때의 혼합 배양 조건은 150~500rpm, 20~40℃, 12~240시간인 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는 200~400rpm, 23~35℃에서 48~200시간 동안, 더더욱 바람직하게는 70~180시간 동안 배양하는 것이 좋다.

또한 상기 제1 미생물은 제2 미생물을 혼합하여 배양하기 전에 시드 배지(seed medium)에서 미리 배양한 것을 사용하는 것이 대사 산물의 생산성 면에서 바람직하다.

이 때, 배양시간은 미생물의 종류 등에 따라 달라질 수 있으나, 예를 들면 10~300시간을 들 수 있다. 바람직하게는 60시간 이상 충분히 배양한 후 제2 미생물과 혼합 배양하는 것이 대사 산물의 생산성 증가에 효과적이다. 기타의 구체적인 배양 조건은 역시 미생물의 종류, 배지의 종류 등에 따라 달라질 수 있으나, 예를 들면 200~400rpm으로 23~35℃에서 배양할 수 있다.

상기에서 제1 미생물을 미리 배양하기 위한 시드 배지는 미생물의 종류에 따라 결정될 수 있다. 예를 들어 아크레모늄 크리소게늄의 경우, 기본 시드 배지(basal seed medium)로는 스크로오스, 글루코오스, 콘 스팁 리커(corn steep liquor; CSL) 및 (NH₄)₂SO₄로 구성된 것을 사용할 수 있고, 주 배지(main medium)로는 글루코오스, 콘 스팁 리커, (NH₄)SO₄, KH₂PO₄, K₂HPO₄, 0DL-메티오닌 및 미량원소 용액으로 구성된 것을 사용할 수 있다. 미생물의 형태학적 분화를 향상시키기 위하여, 상기 기본 시드 배지에 대두박, 면실가루, CaCO₃를 더 첨가할 수도 있다.

한편 제1 미생물과 제2 미생물의 혼합비율은 각 미생물의 종류, 배지의 양 등에 따라 당업자가 적절히 결정하여 사용할 수 있다. 예를 들면, 상기의 혼합비율은 제1 미생물: 제2 미생물 = 100: 0.001~10 (부피비)일 수 있는데, 바람직하게는 제1 미생물: 제2 미생물 = 100: 0.005~5 (부피비), 더 바람직하게는 제1 미생물: 제2 미생물 = 100: 0.01~3 (부피비)이다. 미생물들의 혼합비율이 상기 범위를 만족하면, 제2 미생물 내의 효소, DNA 입자, 제2 미생물에 의한 면역 반응의 정도가 적절한 범위를 유지하여 제1 미생물에 의한 대사 산물의 생산성에 긍정적인 영향을 미칠 수 있다.

이상과 같은 본 발명의 미생물 배양 방법에 의해 획득된 대사 산물의 생산량 향상은, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의한 대사 산물(예: CPC)의 농도 측정, 생물 배양액의 용존 산소량(DO) 측정, 건조 균체량 측정 등을 통해 확인할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세히 설명한다. 그러나, 하기의 실시예는 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 하기의 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

[제조예: 미생물의 배양]

1. 미생물 종류

제1 미생물로서, CPC를 생산하는, 아크레모늄 크리소게눔 ATCC 20339에서 발생된 돌연변이 종인 아크레모늄 크리소게눔 M35를 사용하였다. 또한 혼합배양을 위한 제 2 미생물로, 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 아종 하이그로스코피쿠스 KCTC 9846, 대장균 JM109 ATCC 53323 또는 안키스트로데스무스 속 KMCC FC 107을 각각 사용하였다.

2. 제 1 미생물인 아크레모늄 크리소게눔 M35의 배지와 배양조건

포테이토 덱스트로스 아가(potato dextrose agar: PDA) 실란트 상에 2주 마다 미생물을 이동시켜 보존 배양(stock culture)을 유지하였다. 기본 시드 배지는 2.5% 수크로오스, 1.0% 글루코오스, 2.5% 콘 스팁 리커 및 0.4% (NH₄)₂SO₄로 구성되었다. 미생물의 형태학적 분화를 향상시키기 위하여, 상기 기본 시드 배지에 3.0% 대두박(soy bean meal), 1.0% 면실가루 및 0.5% CaCO₃를 첨가하였다.

주 배지로는 1.95% 글루코오스, 5% 콘 스팁 리커, 0.8% (NH₄)SO₄, 0.3% KH₂PO₄, 0.5% K₂HPO₄, 0.5%DL-메티오닌 및 0.4% 미량원소 용액으로 구성된 것을 사용하였다.

상기 기본 시드 배지의 준비시, 당, (NH₄)₂SO₄ 및 콘 스팁 리커를 다른 성분들과는 별도로 살균하였고, 상기 주 배지를 준비할 때에도, 당, (NH₄)₂SO₄ 및 DL-메티오닌를 다른 성분들과는 별도로 살균하였다. 상기 기본 시드 배지에 CaCO₃ 등을 첨가하고, 살균하기 전에, 1N NaOH를 넣어 pH를 7.0으로 조절하였다. 상기 주 배지에 리놀레산 4%(v/v)를 추가하였다.

상기 기본 시드 배지 200㎖를 함유하는 2L 삼각플라스크(Erlenmeyer flask) 내에서, 아크레모늄 크리소게눔 M35을 27℃, 280rpm으로 72시간 동안 미리 배양하였다.

3. 제2 미생물들의 배지 및 배양 조건

(1) 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 아종 하이그로스코피쿠스

방선균(actinomycete)의 일종인 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 아종 하이그로스코피쿠스를 배양하기 위하여, pH 7.3에서 0.4% 이스트 추출물, 1.0% 맥아 추출물, 0.4% 글루코오스 및 2.0% 아가로 구성된 배지를 사용하였다. 이 때 배양온도는 26℃이었다.

(2) 대장균

대장균의 배양 배지로는, pH 7.0에서 0.5% 이스트 추출물, 1.0% 트립톤, 1.0% 소디움 클로라이드 및 1.5% 아가로 구성된 것을 사용하였다. 이 때 배양온도는 37℃이었다.

(3) 안키스트로데스무스 속

조류(algae)인 안키스트로데스무스 속은 1일 당 10시간씩 3,000 lux의 조도로 JM(Jaworski’s medium)에서 정치배양하였다. 이 때, 배양온도는 20℃이었다.

4. 제2 미생물의 세포활성 제거

안키스트로데스무스 속의 세포활성을 제거하기 위해, 먼저 아가(agar)를 제외한 JM 배지에서 빛을 차단하고 52℃에서 32시간 동안 정치 배양 한 후 다시 25℃에서 24시간 동안 배양하였다. 이 과정을 3회 반복하였다.

그 다음, 얻어진 배양액 5㎖를 6개의 유리 비드(glass bead 1, Glastechnique Mfg., Germany)와 함께 볼텍스 믹서로 10분 동안 믹싱하여 세포를 파쇄(lysis)시켰다.

5. 제2 미생물의 세포활성 약화

제2 미생물의 세포활성을 약화시킨 방법은 하기와 같다.

(1) 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 아종 하이그로스코피쿠스를 PDA, 아가, PDA 및 아가 배지에서 각각 7일 동안 30℃로 계대 배양하였고, 그 후에 PDB 배지에서 30℃, 120rpm으로 7일 동안 배양하였다.

(2) 대장균은 배지를 PDA, 아가, PDA 그리고 다시 아가 배지로 계속 바꿔 가면서 41℃에서 각각 7일 동안 계대 배양하였고, 끝으로 포테이토 덱스트로스 액(PDB) 배지에서 7일 동안 41℃, 120rpm으로 배양하였다.

(3) 안키스트로데스무스 속은 Ca(NO₃)_2·4H₂O, MgSO₄·7H₂O, NaNO₃ 및 Na₂HPO₄·12H₂O를 함유하지 않는 JM 배지에서 28℃로 60일 동안 정치 배양하였다. 이 때, 조도의 세기는 1일당 10시간, 1,000lux로 유지하였다.

[실시예 1~14 및 비교예 1~2: 미생물의 혼합배양]

실시예 1 내지 12

상기 과정을 통해 72시간 동안 미리 배양한 아크레모늄 크리소게눔 M35(제1 미생물)와, 세포활성을 제거 또는 약화시킨 제2 미생물을, 각각 주 배지 20㎖를 함유하는 250㎖ 삼각플라스크에서 27℃, 340rmp으로 7일간 혼합 배양하였다. 이 때, 혼합 배양된 제2 미생물의 종류 및 첨가량은 하기 표 1에 나타내었다.

비교예 1

제2 미생물을 첨가하지 않은 것을 제외하고는 실시예 1 내지 12와 동일한 조건으로 실험을 수행하였다.

실시예 13 내지 14

또한 72시간 동안 미리 배양된 아크레모늄 크리소게눔 M35(제1 미생물)와 세포활성을 제거 또는 약화시킨 제2 미생물을, 각각 5L 탱크 교반형 미생물 배양기(Kobiotech Co., Ltd., Korea)에서 27℃, 340rmp으로 7일간 혼합 배양하였다. 이 때, 작동 볼륨은 3.0L, 에어 유동률은 1.2vvm이었다. 본 실시예에서 제1 미생물과 혼합 배양된 제2 미생물의 종류 및 첨가량을 역시 하기 표 1에 나타내었다.

비교예 2

제2 미생물을 첨가하지 않은 것을 제외하고는 실시예 13 내지 14와 동일한 조건으로 실험을 수행하였다.

	제 1 미생물	제 2 미생물		배양공간
	종류	종류	함량(㎖)	배양공간
실시예 1	a-1	b-1	0.05	250㎖ 삼각플라스크
실시예 2	a-1	b-1	0.10	250㎖ 삼각플라스크
실시예 3	a-1	b-1	0.15	250㎖ 삼각플라스크
실시예 4	a-1	b-1	0.20	250㎖ 삼각플라스크
실시예 5	a-1	b-2	0.05	250㎖ 삼각플라스크
실시예 6	a-1	b-2	0.10	250㎖ 삼각플라스크
실시예 7	a-1	b-2	0.15	250㎖ 삼각플라스크
실시예 8	a-1	b-2	0.20	250㎖ 삼각플라스크
실시예 9	a-1	b-3	0.05	250㎖ 삼각플라스크
실시예 10	a-1	b-3	0.10	250㎖ 삼각플라스크
실시예 11	a-1	b-3	0.15	250㎖ 삼각플라스크
실시예 12	a-1	b-3	0.20	250㎖ 삼각플라스크
실시예 13	a-1	b-1	30	5㎖ 배양기
실시예 14	a-1	b-3	30	5㎖ 배양기
비교예 1	a-1	-	-	250㎖ 삼각플라스크
비교예 2	a-1	-	-	5㎖ 배양기

a-1: 아크레모늄 크리소게눔 M35

b-1: 세포활성이 제거된 안키스트로데스무스 속

b-2: 세포활성이 약화된 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 아종 하이그로스코피쿠스

b-3: 세포활성이 약화된 대장균

[시험예: 혼합 배양된 미생물의 특성 평가]

1. 분석방법

(1) 24시간 마다 CPC 농도를 역상 컬럼의 μ Bondapak C-18과 254㎚로 설정된 UV 검출기를 이용하는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC, Young Lin M930, Young Lin Instrument Co., Korea)로 측정하였다. 아세토니트릴-포스페이트 버퍼를 이동상으로 사용하였다. 용리 혼합물로는 0.9 mL/min의 유동률을 갖는 98% (v/v) 포스페이트 버퍼와 2% (v/v) 아세토니트릴을 이용하였고, CPC 징크염(Sigma, USA)을 표준시료로 사용하였다.

(2) 셀 형상은 이미지 Pro 3.0 소프트웨어(Media cybernetics, Inc. USA)와 광학현미경(Nicon eclipse 80i, Nicon Co., Japan)을 이용하여 찍은 현미경 사진으로 연구하였다.

2. 결과

도 1은 실시예 1 내지 실시예 4 및 비교예 1에서의 시간대별 CPC 농도를 나타낸 그래프이다. 도 1을 참조하면, 실시예 1 내지 실시예 4의 CPC 농도가 비교예 1에 의한 CPC 농도 보다 높은 것을 알 수 있다. 특히, 실시예 4의 CPC 농도는 84시간 배양시 3.7g/L에서 132시간 배양시 7.9g/L로 급격하게 증가하였다. 따라서 도 1의 결과로부터 아크레모늄 크리소게눔 M35의 CPC 생산은, 세포활성이 제거된 안키스트로데스무스 속과의 혼합 배양에 의해 긍정적인 영향을 받았음을 알 수 있다. 이 때, 상기 영향의 원인은 불활성화된 안키스트로데스무스 속 미생물의 효소 때문인 것으로 생각된다.

도 2는 실시예 5 내지 실시예 8 및 비교예 1의 시간대별 CPC 농도를 나타낸 그래프이다. 도 2를 참조하면, 실시예 5 내지 실시예 8의 CPC 농도가 비교예 1의 CPC 농도보다 높은 것을 알 수 있다. 또한, 실시예 5 내지 실시예 8 및 비교예 1은 모두 120시간 배양시에 CPC 농도가 최고조에 다다랐다. 이 중에서 세포활성을 약화시킨 스트렙토마이세스를 0.10 mL 첨가하여 혼합 배양한 실시예 6의 CPC 농도가 최대값을 나타내었는데, 120시간 배양시 CPC 농도가 8.7g/L이었다. 하지만, 132시간이 경과한 이후에는, 실시예 5 내지 실시예 8 및 비교예 1 모두 CPC 농도가 급격히 떨어졌다.

도 3은 실시예 9 내지 실시예 12 및 비교예 1의 시간대별 CPC 농도를 나타낸 그래프이다. 도 3을 참조하면, 실시예 9 내지 실시예 12는 108 시간 배양시 CPC 농도가 최고조에 다다랐다. 특히 세포활성을 약화시킨 대장균을 0.20 mL 첨가하여 혼합 배양한 실시예 12의 CPC 농도가 최대값을 나타내었는데, 84시간 배양과 108 시간 배양 사이에서, CPC 농도가 3.6 g/L에서 9.16g/L로 급격하게 증가하였다. 반면에 비교예 1은 120 시간 배양시에 CPC 농도가 최고조, 약 5.3g/L에 다다랐고, 120 시간을 기점으로 CPC 농도가 하락하였다.

도 4는 5L 배양기에서 실시예 13, 실시예 14 및 비교예 2의 조건으로 혼합 배양하였을 때, 아크레모늄 크리소게눔 M35의 형태학적인 변화를 위상차 현미경으로 관찰한 사진을 나타낸 것이다. 도 4에서 (a)는 비교예 2의 3일간 배양시의 사진이고, (b)는 비교예 2의 5일간 배양시의 사진이고, (c)는 실시예 13의 5일간 배양시의 사진이고, (d)는 실시예 14의 5일간 배양시의 사진이다.

도 4의 (a) 내지 (d)를 참조하면, 비교예 2를 3일간 배양하였을 때에는 많은 사상균과 팽창된 균사파편이 존재하는 것을 알 수 있다. 하지만, 비교예 2, 실시예 13, 실시예 14를 각각 5일간 배양하였을 때에는, 아크레모늄 크리소게눔 M35의 형태학적 변화가 유사한 것을 알 수 있다.

도 5는 실시예 13, 실시예 14 및 비교예 2의 시간대별 CPC 농도를 나타낸 그래프이다. 도 5를 참조하면, 실시예 13의 경우, CPC 농도의 최대값이 6일째 되는 날에 나타났는데, 그 값이 2.0g/L이었다. 실시예 14는 CPC 농도 최대값이 4일째 되는 날에 나타났으며, 그 값이 2.2g/L이었다. 반면 비교예 2의 경우, CPC 농도 최대값이 5일째 되는 날에 나타났고, 그 값이 1.7g/L이었다.

이상 도 1 내지 도 5의 결과로부터, 아크레모늄 크리소게눔 M35를 세포활성이 제거되거나 약화된 제 2 미생물과 혼합 배양하는 경우, 아크레모늄 크리소게눔 M35를 단독 배양하는 경우보다 CPC 생산이 향상되는 것을 확인할 수 있었다. 그 중 세포활성이 약화된 미생물과의 혼합 배양이, 세포활성이 제거된 미생물과의 혼합 배양보다, 아크레모늄 크리소게눔 M35에 의한 CPC 생산에 보다 효과적이었다. 이는 살아있는 미생물이 아크레모늄 크리소게눔에 의한 면역반응과 밀접한 연관이 있어서, 그 면역 반응(방어 반응)에 의해 액침 배양에서 항생제의 과도한 분비가 유도되기 때문인 것으로 생각되었다. 특히 여러 미생물의 조합 중, 아크레모늄 크리소게눔 M35와 세포활성이 약화된 대장균을 혼합 배양하는 경우에, CPC 생산이 보다 빠르고 급격하게 증가되는 양상을 보여줌을 알 수 있었다.

도 1은 실시예 1 내지 실시예 4 및 비교예 1의 시간대별 CPC 농도를 나타낸 그래프이다.

도 2는 실시예 5 내지 실시예 8 및 비교예 1의 시간대별 CPC 농도를 나타낸 그래프이다.

도 3은 실시예 9 내지 실시예 12 및 비교예 1의 시간대별 CPC 농도를 나타낸 그래프이다.

도 4는 5L 배양기에서 실시예 13, 실시예 14 및 비교예 2의 조건으로 혼합 배양하였을 때, 아크레모늄 크리소게눔 M35의 형태학적인 변화를 위상차 현미경으로 관찰한 사진이다.

도 5는 실시예 13, 실시예 14 및 비교예 2의 시간대별 CPC 농도를 나타낸 그래프이다.

Claims

대사 산물을 생산하는 제1 미생물의 배양 시 세포활성이 조절된 제2 미생물을 혼합하여 배양하는 것을 특징으로 하는 미생물의 배양 방법.
청구항 1에 있어서,

상기 세포활성이 조절된 제2 미생물은, 세포활성이 제거된 미생물 또는 세포활성이 약화된 미생물인 것을 특징으로 하는 미생물의 배양 방법.
청구항 1에 있어서,

상기 대사 산물은 항생물질, 유기산, 아미노산, 핵산, 알코올 및 비타민으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 미생물의 배양 방법.
청구항 1에 있어서,

상기 대사 산물은 항생물질인 것을 특징으로 하는 미생물의 배양 방법.
청구항 4에 있어서,

상기 항생물질은 세팔로스포린 C인 것을 특징으로 하는 미생물의 배양 방법.
청구항 1에 있어서,

상기 제1 미생물은 아크레모늄 속(Acremonium sp.)미생물이고,

상기 제2 미생물은 대장균(E.coli), 안키스트로데스무스 속(Ankistrodesmus sp.) 및 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 아종(S. hygroscopicus subsp.)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 미생물의 배양 방법.
청구항 1에 있어서,

상기 제1 미생물은 아크레모늄 크리소게눔(Acremonium chrysogenum)이고,

상기 제2 미생물은 세포활성이 제거된 안키스트로데스무스 속 미생물, 세포활성이 약화된 대장균, 세포활성이 약화된 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 아종 하이그로스코피쿠스(S.hygroscopicus subsp. hygroscopicus)인 것을 특징으로 하는 미생물의 배양 방법.
청구항 1에 있어서,

상기 제1 미생물은 제2 미생물을 혼합하기 전에 미리 배양되는 것을 특징으로 하는 미생물의 배양 방법.
청구항 8에 있어서,

상기 제1 미생물은 10시간 내지 300시간 동안 미리 배양되는 것을 특징으로 하는 미생물의 배양 방법.