KR20050114262A - 마크로라이드의 결정화 및 정제 - Google Patents

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KR20050114262A
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macrolide
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macrolides
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KR1020057018227A
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빌모스 케리
안드레아 소르바시
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테바 기오기스제르갸르 레스즈베니타르사사그
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Abstract

본 발명은 타크로리무스, 시로리무스, 피메크로리무스 또는 에버로리무스 등의 마크로라이드의 결정화 및 정제 방법에 관한 것으로서, 마크로라이드와 극성 용매, 쌍극성 비양성자성 용매 또는 탄화수소 용매의 배합물을 pH 7 이상에서 제공하는 단계를 포함한다.

Description

마크로라이드의 결정화 및 정제{CRYSTALLIZATION AND PURIFICATION OF MACROLIDES}
발명의 분야
본 발명은 마크로라이드류(macrolides), 특히 타크로리무스(tacrolimus), 시로리무스(sirolimus)(라파마이신), 피메크로리무스(pimecrolimus) 및 에버로리무스(everolimus)의 결정화 및 정제에 관한 것이다.
관련 출원
본 출원은 2003년 10월 20일에 출원된 미국 가명세서 출원 60/512,887호, 2003년 4월 9일에 출원된 미국 가명세서 출원 60/461,707호, 및 2003년 3월 31일에 출원된 미국 가명세서 출원 60/459,591호의 출원일을 우선일로서 주장하며, 이들 문헌의 내용은 본원에서 참고 인용한다.
발명의 개요
본 발명은 마크로라이드, 특히 타크로리무스, 시로리무스, 피메크로리무스 및 에버로리무스의 결정화 및 정제 방법에 관한 것으로서, 마크로라이드 출발 물질; 극성 용매, 특히 알칸산의 알킬 에스테르, 알콜, 에테르, 지방족 케톤, 지방족 니트릴 또는 쌍극성 비양성자성 용매인 극성 용매; 탄화수소 용매, 특히 비환형 또는 환형 지방족 탄화수소 또는 방향족 탄화수소(예, 톨루엔); 및 물의 배합물(combination)을 pH 약 7 이상, 특히 약 8 이상에서 제공하는 단계; 약 -15℃∼약 50℃의 온도, 바람직하게는 약 -5℃∼약 40℃의 온도, 가장 바람직하게는 -2℃∼약 35℃의 온도에서 약 1 시간 이상, 바람직하게는 약 48∼약 100 시간 동안 상기 배합물을 유지하는 단계; 및 결정질 마크로라이드를 분리하는 단계를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 마크로라이드, 특히 타크로리무스, 시로리무스, 피메크로리무스 및 에버로리무스의 결정화 및 정제 방법에 관한 것으로서, 극성 용매, 특히 알칸산의 알킬 에스테르, 알콜, 에테르, 지방족 케톤, 지방족 니트릴 또는 쌍극성 비양성자성 용매인 극성 용매 중에서 마크로라이드 함유 생체물질(biomatter)의 완전-브로스(whole-broth) 추출로부터 농축 잔류물을 제공하는 단계; 상기 용액을 임의의 순서로 물 및 탄화수소 용매, 특히 비환형 또는 환형 지방족 탄화수소 또는 방향족 탄화수소(예, 톨루엔)와 배합하는 단계[이 때 pH는 약 7 이상, 특히 약 8 이상임]; 결정화 기간 동안 결정화 온도에서 상기 배합물을 유지하는 단계; 및 결정질 마크로라이드를 분리하는 단계를 포함한다.
추가의 측면에서, 본 발명은 마크로라이드, 특히 타크로리무스, 시로리무스, 피메크로리무스 및 에버로리무스의 결정화 및 정제 방법에 관한 것으로서, 소수성 추출 용매(예, 부틸 아세테이트)로 마크로라이드 함유 생체물질을 추출하여 얻은 용액을 농축하여 얻은 농축물인 오일을 임의의 순서로, 극성 용매, 특히 알칸산의 알킬 에스테르, 알콜, 에테르, 지방족 케톤, 지방족 니트릴 또는 쌍극성 비양성자성 용매인 극성 용매; 탄화수소 용매, 특히 비환형 또는 환형 지방족 탄화수소 또는 방향족 탄화수소(예, 톨루엔); 및 물과 배합하는 단계[이 때, pH는 약 7 이상, 특히 8 이상임]; 제1 결정화 기간 동안 제1 결정화 온도에서 상기 배합물을 유지하는 단계; 및 결정질 마크로라이드를 분리하는 단계를 포함한다.
임의의 전술한 측면에서, 배합물을 제2 결정화 기간 동안 제2 결정화 온도에서 유지할 수 있으나, 그럴 필요는 없다.
발명의 상세한 설명
측정량과 관련하여 본 명세서에서 사용된 용어 "약"은 측정을 실시 또는 해석하고, 사용된 측정 기기의 정밀성과 측정 대상에 따라서 적당한 정도의 주의를 기울였을 때 당업자가 예측할 수 있는 바와 같은 측정량의 변화량을 의미한다.
본 명세서에 사용된 상온은 약 18℃∼약 25℃의 온도를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 "RN"은 미국 오하이오주 콜럼버스 소재의 CAS(Chemical Abstracts Service)가 화합물에 대해 할당하는 등록 번호를 의미한다.
본 발명의 방법은 마크로라이드-함유 출발 물질로부터 마크로라이드를 결정화 및 정제하는 데 적용된다. 마크로라이드는 치환체로서 하나 이상의 데옥시 당을 갖는 다원 락톤 고리이다. 에리트로마이신, 아지트로마이신 및 클래리트로마이신은 정균 및/또는 살균 활성을 가지는 마크로라이드이다. 마크로라이드류인 타크로리무스(FK506) 및 시로리무스(라파마이신)는 본 발명의 실시에 사용하기 위한 바람직한 마크로라이드이다. 마크로라이드류인 피메크로리무스(아스코마이신의 33-에피클로로 유도체; RN = 137071-32-0) 및 에버로리무스(40-O-(2-히드록시에틸)-라파마이신; RN = 159351-69-6)도 본 발명의 실시에 사용하기 위한 바람직한 마크로라이드이다.
합성 경로가 어느 정도 알려져 있지만, 통상 마크로라이드는 발효로 얻는다. 본 발명의 실시에 사용하기 위한 마크로라이드 출발 물질은 임의의 공급원으로부터 유래한 것일 수 있다. 마크로라이드 함유 생체물질로부터의 전체 발효 브로스("완전 브로스법")의 추출물을 농축하여 생기는 농축 잔류물을 본 발명의 방법을 위한 마크로라이드 출발 물질로서 사용할 수 있다. 농축하고자 하는 용액을 얻기 위한 추출에 있어서 소수성 추출 용매를 사용하면 균사체를 한 단계로 제거하면서 효과적인 추출 수율을 얻을 수 있으며, 대부분 수용성인 불순물이 남게 된다. T > 25℃에서의 감압 및 감압 하의 농축은 마크로라이드의 침전 또는 분해 없이 용매의 증발율을 높이며, 본 발명의 실시에 사용하기 위한 마크로라이드 출발 물질을 제공한다. 본 발명의 실시시 마크로라이드 출발 물질로서 사용하기 위한 농축 잔류물은 미국 2003/01666924 A1으로도 공개되고 참고로 그 전문이 인용된 미국 특허 출원 10/366,266호에 개시된 바와 같이 얻을 수 있다.
마크로라이드 생성 절차로부터 얻은 오일성 잔류물을 출발 마크로라이드 출발 물질로서 사용할 수 있다.
본 발명의 실시를 위한 마크로라이드 출발 물질의 공급원일 수 있는 바람직한 마크로라이드 함유 생체물질은, 본 명세서에 참고 인용된 미국 특허 4,894,366호, 5,116,756호, 5,624,842호, 5,496,727호 및 5,622,866호에 개시된 바와 같이, 타크로리무스 함유 생체물질, 특히 타크로리무스 생성 미생물, 예를 들어, 스트렙토마이시스 츠쿠바엔시스(Streptomyces tsukubaensis), 이의 돌연변이된 신규 균주, 스트렙토마이시스 히그로스코피커스(Streptomyces hygroscopicus) 및 스트렙토마이시스 리비단스(Streptomyces lividans)를 사용하여 발효시켜 얻을 수 있는 발효 브로스를 포함한다. 시로리무스 함유(라파마이신 함유) 생체물질도 바람직한 마크로라이드 함유 생체물질이다. 시로리무스(라파마이신)는, 본원에 참고 인용된 미국 특허 3,993,749호에 개시된 바와 같이, 스트렙토마이시스 히그로스코피커스, NRRL 5491의 발효로 생성할 수 있다. 피메크로리무스 함유 생체물질 및 에버로리무스 함유 생체물질도 본 발명의 방법을 실시하는 데 있어서 사용하기 바람직한 마크로라이드 함유 생체물질의 예이다. 아스코마이신 함유 생체물질 또한 본 발명의 실시에 사용하기 위한 바람직한 마크로라이드 함유 생체물질이다.
본 발명의 방법은 극성 용매, 탄화수소 용매 및 염기(알칼리)를 사용한다.
극성 용매는 상온에서 보통 액체이고, 마크로라이드, 특히 타크로리무스, 시로리무스, 피메크로리무스 또는 에버로리무스를 용해시키는 유기 화합물이다. 본 발명의 실시에 유용한 극성 용매는 에스테르, 알콜, 지방족 니트릴, 비환형 및 환형 지방족 에테르, 지방족 케톤 및 쌍극성 비양성자성 용매를 포함한다.
본 발명의 실시에 유용한 에스테르는 화학식 R1-C(O)O-R2[이 때, R1은 H 또는 직쇄 또는 분지쇄 C1-6 알킬이고, R2는 직쇄 또는 분지쇄 C1-6 알킬임]로 표시된다. 에스테르의 예로서 몇가지만 언급하자면 메틸 아세테이트, 에틸 아세테이트, n-프로필 아세테이트, 이소프로필 아세테이트, n-부틸 아세테이트, 이소부틸 아세테이트, 메틸 포르메이트, n-프로필 포르메이트, 이소프로필 포르메이트, n-부틸 포르메이트 및 이소부틸 포르메이트가 있다. 본 발명의 실시에 유용한 알콜(알칸올, 글리콜 및 방향족 알콜)로서 몇가지만 언급하자면, 메탄올, 에탄올, n-프로판올, 이소프로판올, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 아밀 알콜 및 벤질 알콜 등이 있다.
본 발명의 실시에 유용한 지방족 케톤은 화학식 R1-C(O)-R2[이 때, R1 및 R2는 독립적으로 직쇄 또는 분지쇄 C1-4 알킬기임]로 표시된다. 지방족 케톤의 예로서 3가지만 언급하자면 아세톤, 메틸 에틸 케톤 및 메틸 이소부틸 케톤을 포함한다.
본 발명의 실시에 유용한 지방족 니트릴의 예로서 3가지만 언급하자면 아세토니트릴, 프로피오니트릴 및 부티로니트릴을 포함한다.
본 발명의 실시에 유용한 에테르는 비환형 및 환형 지방족 에테르를 포함한다. 비환형 지방족 에테르는 화학식 R1-O-R2[이 때, R1 및 R2는 상기한 바와 같음]로 표시된다. 비환형 지방족 에테르의 예로서 몇가지만 언급하자면, 디에틸 에테르, 디-n-프로필 에테르 및 에틸 n-프로필 에테르 등이 있다. 테트라히드로푸란 및 디옥산은 본 발명의 실시에 유용한 환형 지방족 에테르의 예이다.
쌍극성 비양성자성 용매는 당업자에게 잘 알려져 있다. 디메틸 아세트아미드(DMAC), 디메틸 포름아미드(DMF), N-메틸-2-피롤리돈(NMP), 아세트아미드, 디옥산 및 디옥살란은 본 발명의 실시에 유용한 쌍극성 비양성자성 용매의 예이다.
탄화수소 용매는 보통 상온에서 액체이고, 마크로라이드에 대해 좋지 않은 용매인 유기 화합물이다. 탄화수소 용매는 지방족 탄화수소 용매이거나, 또는 방향족 탄화수소 용매일 수 있다.
지방족 탄화수소 용매는 비환형 또는 환형일 수 있다. 비환형 탄화수소 용매는 직쇄 또는 분지쇄일 수 있고, 화학식 CnH2n+2[이 때, n은 약 5∼약 10임]로 표시된다. n-헥산, n-헵탄, 옥탄 및 이소옥탄은 바람직한 비환형 지방족 탄화수소 용매의 예이다. 시클로헥산 및 메틸시클로헥산은 환형 지방족 탄화수소 용매의 예이다. 방향족 탄화수소 용매의 예로서 몇가지만 언급하면 벤젠, 톨루엔, 크실렌 및 테트랄린 등이 있다.
유기 또는 무기의 임의의 염기를 본 발명의 실시에 사용할 수 있다. 무기 염기의 예로서 몇가지만 언급하면 암모니아, 알칼리 및 알칼리 토금속의 수산화물, 중탄산염 및 탄산염 등이 있다. 아민은 본 발명의 실시에 사용할 수 있는 유기 염기의 예이다.
본 발명은 결정화 용기 중에 마크로라이드 출발 물질, 극성 용매, 탄화수소 용매 및 물의 배합물을 제공하여 물 농축 상을 형성하는 단계를 포함하는, 마크로라이드, 바람직하게는 타크로리무스, 시로리무스, 피메크로리무스 또는 에버로리무스의 결정화 및 정제 방법을 제공한다. 물 농축 상(water-rich phase)은 용매의 대부분이 물이고 다른 용매 또는 용질을 포함할 수 있는 상이다. 물 농축 상의 pH는 약 7 이상, 바람직하게는 약 8 이상이거나, 또는 약 7 이상, 바람직하게는 약 8 이상으로 조정할 수 있다. 염기를 첨가하여 pH를 조정할 수 있다.
바람직하게는 교반하면서 배합물을 제공하고, 약 -15℃∼약 50℃, 바람직하게는 약 -5℃∼약 40℃, 가장 바람직하게는 약 -2℃∼약 35℃의 온도에서 약 1 시간 이상, 바람직하게는 약 48∼약 100 시간 동안 상기 배합물을 유지하여, 마크로라이드 농축 상을 형성한다.
제공된 배합물을 모으는(assemble) 방식은 본 발명의 실시와 무관하다. 배합물의 성분들을 임의 순서로 모으거나, 또는 동시에 모을 수 있다.
마크로라이드, 극성 용매, 탄화수소 용매 및 물의 배합물을 교반기가 구비된 결정화 용기(결정화 스페이스)에 제공한다. 결정화 용기의 디자인과 고유 특성은 중요하지 않으며, 당업자는 배합물의 부피 및 공정 변수를 기초로 결정화 용기 및 교반기를 선택할 수 있을 것이다.
제1 결정화 기간이 시작되면, 제공된 배합물은 2 이상의 상을 포함하고, 이중 하나 이상은 물 농축 상이다. 물 농축 상의 pH는 약 7 이상, 바람직하게는 약 8 이상이다. 물 농축 상의 pH는 전체 결정화 기간에 걸쳐 일정하거나, 또는 결정화 기간 동안 변할 수 있지만, 단 pH는 항상 약 7 이상이어야 한다.
목적하는 pH는 임의의 이용 가능한 무기 또는 유기 염기의 사용에 따라 정해지고, 목적하는 pH는 임의의 방식 또는 순서로 정해질 수 있다. 예를 들어, 배합물을 모으는 데 사용되는 물의 pH를, 배합물을 모으기 전에 무기 또는 유기 염기로 조정할 수 있다. 따라서, 제공된 배합물과 관련하여 본 명세서에서 사용되는 "물"은 무기 또는 유기 염기의 묽은 수용액(물의 용액), 예컨대, N/10 NaOHaq, N/10 KOH, N/10 Ca(OH)2, N/10 NH3aq, N/10 (C2H5)3Naq, N/10 디메틸아민 또는 트리에틸 아민, N/10 피리딘 등을 포함하는 것으로 이해될 것이다. 물을 도입하기 전에 저비점 아민, 예컨대 메틸아민을 첨가하여, 물 농축 상이 형성되기 전에 염기를 첨가할 수 있다. 당업자는 물 농축 상의 목적하는 pH를 얻는 다수의 대안을 알고 있을 것이다.
배합물을 모은 후에, 니트(neat), 특히 기체로서, 또는 적절한 용매(예, 물) 중의 용액으로서 무기 염기를 첨가하여 pH를 조정할 수 있다. 점차로 pH를 조정할 수 있다. 예를 들어, 배합물을 모으는 데 사용되는 물의 pH를, 예컨대 약 7로 조정한 다음 배합물을 모으고, 모은 후에 니트 또는 용액으로서 염기를 첨가하여 물 농축 상의 pH를, 예컨대 8로 추가 조정할 수 있다.
전체 결정화 기간 동안, 하나 이상의 마크로라이드 농축 상이 형성되며, 이로부터 실질적으로 불순물 없이 마크로라이드가 결정화된다. 전체 결정화 기간이 완료된 후에, 임의의 통상적인 방법, 2가지만 예로 들자면 여과(중력 또는 압력 보조) 또는 원심분리로 결정질 마크로라이드를 분리한다. 분리된 결정질 마크로라이드의 순도는 다회통과(multipass) 크로마토그래피에 의해 정제된 마크로라이드의 순도와 유사하다.
일 구체예에서, 제공된 배합물은, 극성 용매 중에서 마크로라이드의 추출, 바람직하게는 타크로리무스, 시로리무스, 피메크로리무스 또는 에버로리무스의 추출로부터 얻은 농축물 또는 마크로라이드의 용액인 마크로라이드 출발 물질을 제공하는 단계, 및 상기 용액을 임의의 순서로 탄화수소 용매 및 물과 배합하는 단계로 모은다.
제공된 용액을 임의의 방식 또는 방법으로 제조할 수 있다. 제공된 용액의 농도는 중요하지 않으며, 일반적으로 약 0.05 g/㎖(마크로라이드의 g/극성 용매의 ㎖)∼약 0.3 g/㎖이다. 마크로라이드는 임의의 공급원으로부터 얻을 수 있으며, 고체, 반고체 또는 오일(특히, 마크로라이드 함유 생체물질의 완전 브로스 추출로부터 얻은 추출 농축물 유래의 잔류물인 오일)일 수 있다.
용액, 물 및 탄화수소 용매의 상대적 부피는 중요하지 않다. 통상적으로, 용액의 부피 대 탄화수소 용매의 부피의 비는 약 1:2∼약 1:10이다. 용액의 부피 대 물의 부피의 비는 통상적으로 약 1:8∼약 1:25이다.
물 농축 상의 pH를 조정하고, 상기한 바와 같이 배합물을 처리할 수 있다.
또 다른 구체예에서, 제공된 배합물은 임의의 순서로 마크로라이드 출발 물질, 바람직하게는 타크로리무스, 시로리무스, 피메크로리무스 또는 에버로리무스 출발 물질, 탄화수소 용매, 극성 용매 및 물을 배합하여 모으는 데, 이 때, 타크로리무스 출발 물질은 마크로라이드 함유 생체물질을 수소성 추출 용매로 추출하여 얻은 용액을 농축하여 얻은 농축물인 오일상이고, 특히 상기 소수성 추출 용매는 아세트산 또는 포름산의 C2-6 직쇄 및 분지쇄 에스테르, C3-6 직쇄 또는 분지쇄 지방족 케톤, 할로겐화된 메탄, 및 25℃에서 액체이고 대기압에서 비점이 약 150℃ 미만인 방향족 탄화수소로 구성된 군에서 선택되고, 추출은 약 2℃∼약 70℃, 특히 약 30℃∼약 70℃의 온도, 약 5.5∼약 13, 특히 약 7.5∼약 13의 pH에서 실시하여 소수성 추출 용매 중의 마크로라이드 용액을 얻는다.
오일(마크로라이드 출발 물질)을 먼저 극성 용매 또는 탄화수소 용매 또는 물과 배합할 수 있다. 그 순서는 본 발명의 실시와 무관하다. 목적하는 pH를 얻는데 필요한 염기를 임의의 지점 또는 결정화 기간 전 또는 도중의 몇몇 시점에서 도입할 수 있다. 염기를 니트 또는 용액(예, 수용액)으로서 도입할 수 있다.
본 발명의 일부 구체예는 하기 비제한적인 실시예에 의해 예시된다.
실시예 1:
추출:
타크로리무스(3.42 kg)를 함유하는 발효 브로스(22.2 m3)를 pH 9.0∼9.5에서 6.4 m3 이소부틸 아세테이트로 추출하였다. 이소부틸 아세테이트 용액을 pH 6.0∼8.0에서 물로 세척하였다. 세척된 이소부틸 아세테이트 상을 40∼45℃의 온도에서 감압 하에 오일 유사 잔류물로 농축하였다.
오일 유사 잔류물을 이소부틸 아세테이트로 부피 31 ℓ로 용해시켰다. 이 농축물을 167.5 ℓ 메탄올 및 18.6 ℓ 물로 희석하였다. 물-메탄올 용액을 139.6 ℓ n-헥산으로 세척하였다. 물-메탄올 상을 감압 하에 부피 44 ℓ로 농축하고, 농축물을 물 44 ℓ로 희석하였다.
얻은 혼합물을 88 ℓ 에틸 아세테이트로 추출하였다. 에틸 아세테이트 추출물을 22.4 ℓ 부피로 농축하였다.
결정화:
에틸 아세테이트 추출 농축물을 0.1M 트리에틸 아민 수용액 158.4 ℓ 및 n-헥산 67.3 ℓ와 합하였다. 3 시간 동안 20∼25℃에서 혼합물을 교반하였다. 이 혼합물을 48 시간 동안 (매시간 1분 교반) 0∼25℃에서 정치시켰다.
형성된 결정을 여과로 분리하고, 0.1M 트리에틸 아민 수용액 83 ℓ 중에 먼저 현탁시킨 후, n-헥산 83 ℓ 중에 현탁시켰다. 여과로 결정을 분리하였다.
결정을 감압 하에 40℃에서 건조하였다. 건조된 미정제 타크로리무스는 분석 결과 83%였다. 미정제 생성물은 1.9 kg 타크로리무스를 포함한다.
결정화 단계의 수율은 91%였다.
실시예 2:
하기 실시예에서, 마크로라이드 함유 생체물질의 완전 브로스 추출로부터의 유성 농축물로서 마크로라이드(타크로리무스)를 극성 용매, 탄화수소 용매 및 염기를 함유하는 물과 배합하였다. 전체 결정화 기간 동안 결정화 온도에서 배합물을 유지하였다. 전체 결정화 기간이 종료되면, 결정질 마크로라이드를 분리하였다. 성분들의 비율, 공정 변수 및 결과는 표 I에 제시되어 있다.
실시예 3:
아스코마이신을 함유하는 발효 브로스를 실시예 1에 따라 처리하였다. 처리 결과 미정제 아스코마이신에 대한 수율이 60%였다.

Claims (36)

  1. a) 마크로라이드(macrolide) 출발 물질, 극성 용매, 탄화수소 용매 및 물을 배합하여 2 이상의 상을 형성하는 단계로서, 상기 2 이상의 상 중 하나 이상은 물 농축 상(water-rich phase)이며, 물 농축 상의 pH는 약 7 이상인 단계,
    b) 상기 배합물을 1 시간 이상 동안 유지하여, 마크로라이드가 결정화되는 마크로라이드 농축 상을 형성하는 단계
    를 포함하는, 마크로라이드 출발 물질로부터 마크로라이드를 결정화하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 결정화되는 마크로라이드를 분리하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 단계 b)의 배합물을 약 -15℃∼약 50℃의 온도에서 유지하는 것인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 단계 b)의 배합물을 약 -5℃∼약 40℃의 온도에서 유지하는 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 단계 b)의 배합물을 약 -2℃∼약 35℃의 온도에서 유지하는 것인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 단계 b)의 배합물을 48∼100 시간 동안 유지하는 것인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 극성 용매는 알콜, 에스테르, 니트릴 및 에테르로 구성된 군에서 선택되는 것인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 극성 용매는 에틸 아세테이트, 아세토니트릴, 메탄올, 에탄올, n-프로판올, 이소프로판올, n-부탄올, 이소부탄올, 아세톤, 디이소프로필 에테르, 디메틸 포름아미드 및 디메틸 아세트아미드로 구성된 군에서 선택되는 것인 방법.
  9. 제8항에 있어서, 극성 용매는 에틸 아세테이트인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 탄화수소 용매는 n-헥산, n-헵탄, 옥탄, 이소옥탄, 시클로헥산, 메틸시클로헥산, 벤젠, 톨루엔 및 크실렌으로 구성된 군에서 선택되는 것인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 탄화수소 용매는 n-헥산인 방법.
  12. 제1항에 있어서, 물 농축 상의 pH는 약 8 이상인 방법.
  13. 제1항에 있어서, 물은 NaOH, KOH, Ca(OH)2, NH3, Et3N, 디에틸아민 및 피리딘으로부터 선택된 염기를 포함하는 것인 방법.
  14. 제1항에 있어서, 마크로라이드는 타크로리무스(tacrolimus), 시로리무스(sirolimus), 피메크로리무스(pimecrolimus), 에버로리무스(everolimus) 및 아스코마이신(ascomycin)으로 구성된 군에서 선택되는 것인 방법.
  15. a) 극성 용매 중에서 마크로라이드 함유 생체물질(biomatter)의 완전 브로스(whole-broth) 추출로부터 얻은 농축 잔류물을 탄화수소 용매 및 물과 배합하여 2 이상의 상을 형성하는 단계로서, 상기 2 이상의 상 중 하나 이상은 물 농축 상이고, 물 농축 상의 pH가 약 7 이상인 단계,
    b) 상기 배합물을 1 시간 이상 동안 유지하여, 마크로라이드가 결정화되는 마크로라이드 농축 상을 형성하는 단계
    를 포함하는, 마크로라이드 출발 물질로부터 마크로라이드를 결정화하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 결정화된 마크로라이드를 분리하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  17. 제15항에 있어서, 상기 단계 b)의 배합물을 약 -15℃∼약 50℃의 온도에서 유지하는 것인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 단계 b)의 배합물을 약 -5℃∼약 40℃의 온도에서 유지하는 것인 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 단계 b)의 배합물을 약 -2℃∼약 35℃의 온도에서 유지하는 것인 방법.
  20. 제15항에 있어서, 상기 단계 b)의 배합물을 48∼100 시간 동안 유지하는 것인 방법.
  21. 제15항에 있어서, 극성 용매는 알콜, 에스테르, 니트릴 및 에테르로 구성된 군에서 선택되는 것인 방법.
  22. 제21항에 있어서, 극성 용매는 에틸 아세테이트, 아세토니트릴, 메탄올, 에탄올, n-프로판올, 이소프로판올, n-부탄올, 이소부탄올, 아세톤, 디이소프로필 에테르, 디메틸 포름아미드 및 디메틸 아세트아미드로 구성된 군에서 선택되는 것인 방법.
  23. 제22항에 있어서, 극성 용매는 에틸 아세테이트인 방법.
  24. 제15항에 있어서, 탄화수소 용매는 n-헥산, n-헵탄, 옥탄, 이소옥탄, 시클로헥산, 메틸시클로헥산, 벤젠, 톨루엔 및 크실렌으로 구성된 군에서 선택되는 것인 방법.
  25. 제24항에 있어서, 탄화수소 용매는 n-헥산인 방법.
  26. 제15항에 있어서, 물 농축 상의 pH는 약 8 이상인 방법.
  27. 제15항에 있어서, 물은 NaOH, KOH, Ca(OH)2, NH3, Et3N, 디에틸아민 및 피리딘으로부터 선택된 염기를 포함하는 것인 방법.
  28. 제15항에 있어서, 마크로라이드는 타크로리무스, 시로리무스, 피메크로리무스, 에버로리무스 및 아스코마이신으로 구성된 군에서 선택되는 것인 방법.
  29. a) 마크로라이드 출발 물질, 에틸 아세테이트, n-헥산, 및 NaOH, KOH, Ca(OH)2, NH3, (C2H5)3N, 디에틸아민 및 피리딘으로부터 선택된 염기의 수용액을 약 20℃∼약 25℃의 온도에서 배합하여 2 이상의 상을 형성하는 단계로서, 상기 2 이상의 상 중 하나는 물 농축 상이며, 물 농축 상의 pH는 > 약 7인 단계,
    b) 상기 배합물을 약 20℃∼약 25℃의 온도에서 1 시간 이상 동안 유지하여, 마크로라이드가 결정화되는 마크로라이드 농축 상을 형성하는 단계,
    c) 상기 배합물을 1 시간 이상 동안 약 0℃∼약 20℃의 온도에서 유지하는 단계, 및
    d) 결정화된 마크로라이드를 회수하는 단계
    를 포함하는, 마크로라이드 출발 물질로부터 마크로라이드를 결정화하는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 마크로라이드는 타크로리무스, 시로리무스, 피메크로리무스, 에버로리무스 및 아스코마이신으로 구성된 군에서 선택되는 것인 방법.
  31. 제29항에 있어서, 물 농축 상의 pH는 약 8 이상인 방법.
  32. a) 에틸 아세테이트 중에서 마크로라이드 함유 생체물질의 완전 브로스 추출로부터 얻은 농축 잔류물, n-헥산 및 NaOH, KOH, Ca(OH)2, NH3, (C2H5)3N, 디에틸아민 및 피리딘으로부터 선택된 염기의 수용액을 약 20℃∼약 25℃의 온도에서 배합하여 2 이상의 상을 형성하는 단계로서, 상기 2 이상의 상 중 하나는 물 농축 상이며, 물 농축 상의 pH는 > 약 7인 단계,
    b) 상기 배합물을 약 20℃∼약 25℃의 온도에서 1 시간 이상 동안 유지하여, 마크로라이드가 결정화되는 마크로라이드 농축 상을 형성하는 단계,
    c) 상기 배합물을 1 시간 이상 동안 약 0℃∼약 20℃의 온도에서 유지하는 단계, 및
    d) 결정화된 마크로라이드를 회수하는 단계
    를 포함하는, 마크로라이드 출발 물질로부터 마크로라이드를 결정화하는 방법.
  33. 제32항에 있어서, 마크로라이드가 타크로리무스, 시로리무스, 피메크로리무스, 에버로리무스 및 아스코마이신으로 구성된 군에서 선택되는 것인 방법.
  34. 제32항에 있어서, 물 농축 상의 pH는 약 8 이상인 방법.
  35. 마크로라이드 출발 물질로부터 마크로라이드를 결정화하는 방법에 있어서, 마크로라이드 출발 물질, 극성 용매, 탄화수소 용매 및 물을 배합하여, 2 이상의 상을 형성하는 단계를 포함하고, 상기 2 이상의 상 중 하나 이상은 물 농축 상이고, 물 농축 상의 pH는 약 7 이상인 것이 특징인 방법.
  36. 극성 용매 중에서 마크로라이드 함유 생체물질의 완전 브로스 추출로부터 얻은 농축 잔류물로부터 마크로라이드를 결정화하는 방법에 있어서, 극성 용매 중 마크로라이드 농축물, 탄화수소 용매 및 물을 배합하여 2 이상의 상을 형성하는 단계를 포함하고, 상기 2 이상의 상 중 하나 이상은 물 농축 상이고, 물 농축 상의 pH는 약 7 이상인 것이 특징인 방법.
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