KR20050108381A - 만성 림프성 백혈병 세포로부터 유래된 폴리펩티드와 항체및 이들의 용도 - Google Patents

만성 림프성 백혈병 세포로부터 유래된 폴리펩티드와 항체및 이들의 용도 Download PDF

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Abstract

OX-2/CD200 및/또는 OX-2/CD200 수용체에 결합할 수 있는 폴리펩티드, 예를 들면, 항체를 투여하는 방법을 개시한다. 이들 폴리펩티드는 암과 CLL을 비롯한 OX-2/CD200의 상향조절된 수준으로 특성화되는 질병 상태를 치료하는데 유효하다.

Description

만성 림프성 백혈병 세포로부터 유래된 폴리펩티드와 항체 및 이들의 용도{POLYPEPTIDES AND ANTIBODIES DERIVED FROM CHRONIC LYMPHOCYTIC LEUKEMIA CELLS AND USES THEREOF}
본원은 2003년 12월 15일자로 제출된 U.S. 출원 No. 10/736,188의 일부 계속 출원이고, 상기 출원은 2003년 3월 4일자로 제출된 U.S. 출원 No. 10/379,151의 일부 계속 출원이고, 상기 출원은 2001년 12월 10일자로 제출된 PCT/US01/47931의 일부 계속 출원이고, 상기 국제 출원은 200년 12월 8일자로 제출된 U.S. 분할 출원 No. 60/254,113에 우선권을 주장한다. 상기한 U.S. 출원, 국제 출원, 분할 출원은 순전히 참조로 한다.
만성 림프성 백혈병(CLL) 세포로부터 유래된 세포 및 CLL과 다른 질환의 연구와 치료에서 이들의 용도를 개시한다. 특히, 본원은 부다페스트 조약(Budapest Treaty)에 따라 ATCC 수탁번호 PTA-3920로 American Type Culture Collection(Manassas, Virginia, USA)에 2001년 11월 28일자로 기탁된 CLL 세포주, “CLL-AAT”에 관한다.
만성 림프성 백혈병(CLL)은 백혈구 질환이며, 서반구에서 가장 일반적인 백혈병 형태이다. CLL은 느리게 성장하지만 장기간 존재하는 악성 림프구의 성장과 관련된 다양한 질환군을 대표한다. CLL은 예로써 고전형과 혼성형의 B-세포 만성 림프성 백혈병(B-CLL), B-세포와 T-세포 전림프성 백혈병, 모상 세포 백혈병, 대과립성 림프성 백혈병을 비롯한 다양한 종류로 분류된다.
상이한 유형의 CLL 중에서, B-CLL은 전체 백혈병의 대략 30%를 차지한다. 상기 질환은 비록 50세 이상의 개체에서 더욱 빈번하게 발병하긴 하지만, 젊은 사람에게서 발병 빈도가 증가하고 있다. B-CLL은 형태학적으로 정상이지만 생물학적으로 미성숙한 B-림프구의 축적 및 이에 따른 기능 상실로 특성화된다. 정상 상태의 림프구는 감염을 억제하는 기능을 한다. 하지만, B-CLL에서, 림프구는 혈액과 골수에 축적되고 림프절의 팽창을 유발한다. 정상적인 골수와 혈액 세포의 생산이 감소되고, 환자는 줄어든 혈소판 개체수뿐만 아니라 심각한 빈혈증을 종종 경험하게 된다. 이는 치명적인 출혈의 위험 및 백혈구 개체수의 감소로 인한 심각한 감염의 발생을 초래할 수 있다.
백혈병과 같은 질환을 더욱 명확하게 이해하기 위하여, 병인, 질병발생, 생태 연구를 위한 도구로서 이용될 수 있는 적절한 세포주를 확보하는 것이 중요하다. 악성 인간 B-림프성 세포주의 실례는 전구-B 급성 림프성 백혈병(Reh), 미만성 대세포 림프종(WSU-DLCL2), 왈덴스트롬 거대 글로브린혈증(Waldenstrom's macroglobulinemia, WSU- WM) 등이다. 불행하게도, 대부분의 기존 세포주는 백혈병과 림프종의 임상적으로 가장 일반적인 유형을 대표하지 못한다.
시험관내에서 엡스타인 바르 바이러스(Epstein Barr Virus, EBV) 감염의 이용은 일부 CLL 유래된 세포주, 특히, 악성 세포를 대표하는 B-CLL 세포주를 결과하였다. 이들 세포주의 표현형은 생체내 종양의 표현형과 상이하며, 오히려 B-CLL 세포주의 특징은 림프원성(lymphoblastoid) 세포주의 특징과 유사하다. EBV 감염으로 B-CLL 세포를 영속화하려는 시도는 성공하지 못하였다. 이의 원인은 불확실하지만, EBV 수용체 발현, 결합 또는 흡수의 부재에 기인하지는 않는 것으로 알려져 있다. Wells 등은 B-CLL 세포가 세포주기의 G1/S 단계에서 정지되고, 형질전환 연관된 EBV DNA가 발현되지 않는다는 것을 발견하였다. 이는 EBV와 B-CLL 세포의 상호작용이 정상적인 B 세포와의 상호작용과 상이하다는 것을 암시한다. 게다가, EBV-형질전환된 CLL 세포주는 분화되는 것으로 보이며, EBV에 의해 영속화된 림프원성 세포주(LCL)와 더욱 유사한 형태를 보유한다.
EBV-음성 CLL 세포주, WSU-CLL은 이미 확립되었다(Mohammed et al.,(1996) Leukemia 10(1):130-7). 하지만, 다른 이와 같은 세포주는 알려져 있지 않다.
다양한 기전이 암과 CLL을 비롯한 질병 상태에 대한 신체 반응에서 일정한 역할을 수행한다. 가령, CD4+T 보조 세포는 작동자 세포(effector cell)에 자극 인자를 제공함으로써 다양한 악성 종양에 대한 효과적인 면역 반응에서 중요한 역할을 수행한다. 세포독성 T 세포는 암 세포를 제거하는데 가장 효과적인 세포로서 간주되며, T 보조 세포는 Th1 사이토킨, 예를 들면, IL-2와 IFN-γ를 분비함으로써 세포독성 T 세포를 기폭시킨다. 다양한 악성 종양에서, T 보조 세포는 건강한 개체에서 발견되는 세포에 비하여 변형된 표현형을 보유하는 것으로 밝혀졌다. 변형된 주요 특징중의 하나는 감소된 Th1 사이토킨 생산 및 Th2 사이토킨 생산으로의 전환이다(참조: Kiani, et al., Haematologica 88:754-761(2003); Maggio, et al., Ann Oncol 13 Suppl 1:52-56(2002); Ito, et al.,; Cancer 85:2359-2367(1999); Podhorecka, et al., Leak Res 26:657-660(2002); Tatsumi, et al., J Exp Med 196:619-628(2002); Agarwal, et al., Immunol Invest 32:17-30(2003); Smyth, et al., Ann Surg Oncol 10:455-462(2003); Contasta, et al., Cancer Biother Radiopharm 18:549-557(2003); Lauerova, et al., Neoplasma 49:159-166(2002)). Th1 프로필로 사이토킨 전환의 반전은 T 세포의 항-종양 효과를 강화시키는 것으로 입증되었다(참조: Winter, et al. , Immunology 108:409-419(2003); Inagawa, et al., Anticancer Res 18:3957-3964(1998)).
T 보조 세포의 사이토킨 발현을 Th1에서 Th2로 전환시키는 종양 세포 능력의 기초 기전의 11-10이나 TGF-β와 같은 사이토킨의 분비뿐만 아니라 면역계 세포와 상호작용하는 표면 분자의 발현을 포함한다. 면역글로분린 유전자 계통의 분자와 상당한 수준의 상동성을 보유하는 수상돌기 세포의 표면에서 발현되는 분자인 OX-2/CD200은 면역 억제에 관여하며(Gorczynski et al., Transplantation 65:1 106-1114(1998)), OX 2/CD200-발현 세포가 Th1 사이토킨 생산의 자극을 저해할 수 있다는 증거가 제공되었다. Gorczinski 등은 생쥐 모델에서 OX-2/CD200 Fc가 백혈병성 종양 세포를 이용한 동물 모델에서 종양 세포의 거부 반응을 억제한다는 것을 입증하였다(Clin Exp Immunol 126:220-229(2001)).
암 또는 CLL 환자를 치료하는 향상된 방법은 특히, T 세포의 활성을 강화시킬 수 있는 정도까지 요구된다.
요약
한 구체예에서, EBV를 이용한 영속화로 확립되지 않은 악성 기원의 CLL 세포주를 제시한다. 상기 세포주는 일차 CLL 세포로부터 유래되고, ATCC 수탁번호 PTA-3920로 기탁된다. 바람직한 구체예에서, 세포주는 CLL-AAT이다. CLL-AAT는 B-CLL 일차 세포로부터 유래된 B-CLL 세포주이다.
다른 관점에서, CLL-AAT 세포주는 CLL의 진단 및/또는 치료에 유효한 단클론 항체를 산출하는데 이용된다. 항체는 본원에 개시된 세포를 면역원으로서 이용하고, 단클론 항체가 분리되는 동물에서 면역 반응을 유발함으로써 산출된다. 항체의 서열을 결정하고, 재조합 기술로 이들 항체 또는 이의 변이체를 산출한다. 이런 관점에서, “변이체”는 단클론 항체의 서열에 기초한 키메라 항체, CDR-융합된 항체, 인간화 항체, 완전 인간 항체를 포괄한다.
더 나아가, 본원에 기술된 세포 또는 이로부터 유래된 폴리펩티드를 표적 특이성에 기초한 항체를 분리하는 미끼로 이용하여, 재조합 라이브러리로부터 유래된 항체(“파지 항체(phage antibody)”)를 선별할 수 있다.
또 다른 관점에서, 항체는 일차 CLL 세포 또는 이로부터 유래된 항원을 이용하여 항체 라이브러리를 패닝(panning)하여 산출하고, CLL 세포주, 예를 들면, 본원에 기술된 CLL 세포주를 이용하여 더욱 선별하거나 특성화시킨다. 따라서, CLL에 특이적인 항체를 특성화하는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 CLL 세포주에 대한 항체의 결합을 사정하는 단계를 포함한다.
또 다른 관점에서, CLL-AAT 세포주를 이용하여 당분야에 공지된 방법, 예를 들면, 면역침전검사 및 이후의 질량 분광분석으로 CLL 세포에서 독특하게 발현되는 단백질을 확인하는 방법을 제시한다. 이들 단백질은 CLL-AAT 세포주, 또는 CLL 환자로부터 유래된 일차 세포에서 독특하게 발현된다.
세포의 성장 특성을 조절할 수 있는 작용제를 확인하는 세포-기초한 검사에서 CLL-AAT 세포주를 이용하여 소형 분자 라이브러리(대부분 상업적으로 입수가능)를 선별할 수 있다. 가령, CLL-AAT 세포주에서 아폽토시스를 조절하거나, 이의 성장 및/또는 증식을 저해하는 작용제를 확인할 수 있다. 이런 작용제는 치료 화합물의 개발을 위한 후보이다.
CLL-AAT 세포주로부터 분리된 핵산은 CLL-특이적 유전자를 확인하는 마이너스 혼성화 실험, 또는 마이크로 어레이 분석(가령, 유전자 칩 실험)에 이용될 수 있다. CLL 세포에서 전사가 조절되는 유전자를 확인할 수 있다. 이런 방식으로 확인된 폴리펩티드 또는 핵산 유전자 산물은 CLL용 항체 또는 소형 분자 치료제의 개발을 위한 선도물질로서 유효하다.
바람직한 관점에서, CLL-AAT 세포주는 세포에 의해 내재화되는 세포 표면 성분에 결합되는 내재 황체(internalizing antibody)를 확인하는데 이용된다. 이들 항체는 치료 용도의 후보이다. 특히, 세포질에서 안정적으로 존재하고 세포내 결합 활성을 유지하는 단일-사슬 항체가 이런 방식으로 선별될 수 있다.
또 다른 관점에서, 악성 종양 세포에 의해 상향조절되는 폴리펩티드의 존재를 환자에서 조사하고, 이런 상향조절된 폴리펩티드의 대사 경로를 간섭하는 항체를 환자에 투여하는 치료 방법을 제시한다.
또한, 본 발명은 OX-2/CD200이 개체에서 상향조절되는 지를 결정하고, 이런 경우에 OX-2/CD200에 결합하는 폴리펩티드를 상기 개체에 투여하는 방법에 관한다. 다른 구체예에서, 폴리펩티드는 OX-2/CD200 수용체에 결합한다.
또 다른 관점에서, 본 발명에 따른 방법은 OX-2/CD200 또는 OX-2/CD200 수용체에 결합하는 폴리펩티드를 병든 개체에 투여함으로써 OX-2/CD200이 상향조절되는 질병 상태를 상기 개체에서 치료하는데 이용된다. 한 구체예에서, 이들 방법으로 치료되는 질병 상태는 암, 특히 CLL이다.
도 1에서는 자성-활성화된 세포 분류(MACS)로 항체 라이브러리의 세포 표면 패닝(cell surface panning)에 관여하는 전형적인 단계를 개략적으로 예시한다.
도 2는 일차 B-CLL 세포에 대한 선별된 scFv 클론의 결합 및 정상적인 인간 PBMC에 대한 결합의 부재를 입증하는 전체 세포 ELISA의 결과를 보여주는 그래프이다. 도면에서 2˚+3˚는 생쥐 항-HA 및 검출 항-생쥐 항체 단독으로 염색된 음성 대조 웰을 나타낸다. 도면에서 RSC-S 라이브러리는 최초 토끼 scFv 라이브러리로부터 제조된 가용성 항체를 나타낸다. 도면에서 R3/RSC-S Pool은 3회 패닝이후 scFv 항체의 전체 풀(pool)로부터 제조된 가용성 항체를 나타낸다. 항-CD5 항체는 동수의 B-CLL과 PBMC 세포가 각 웰에 도말되는 지를 검증하는 양성 대조로서 이용된다.
도 3은 일차 B-CLL 세포와 정상적인 인간 B 세포에 대한 선별된 scFv 항체의 결합을 비교하는 전체 세포 ELISA의 결과를 보여주는 그래프이다. 항-CD19 항체는 동수의 B-CLL과 정상 B 세포가 각 웰에 도말되는 지를 검증하는 양성 대조로서 이용된다. 다른 대조는 도 2의 범례에 기술된 바와 동일하다.
도 4a와 4b에서는 scFv 클론이 환자-특이적(즉, 이디오타입) 또는 혈액형-특이적(즉, HLA) 항원에 결합하는 지를 결정하는데 이용되는 전체 세포 ELISA의 결과를 도시한다. 각 클론은 3명의 상이한 B-CLL 환자로부터 분리된 PBMC에 대한 결합을 검사하였다. 하나의 환자 샘플에 결합된 클론은 환자 또는 혈액형-특이적으로 간주된다.
도 5a와 5b에서는 일차 B-CLL 세포와 3가지 인간 백혈병성 세포주에 대한 scFv 클론의 결합을 비교하는 전체 세포 ELISA의 결과를 도시한다. Ramos는 버킷 림프종(Burkitt's lymphoma)으로부터 유래된 성숙 B 세포주이다. RL은 비-호지킨 림프종으로부터 유래된 성숙 B 세포주이다. TF-I은 적백혈병(erythroleukemia)으로부터 유래된 적혈구원성 세포주이다.
도 6a, 6b, 6c는 일차 B-CLL 세포 및 CLL-AAT, B-CLL 환자로부터 유래된 세포주에 대한 scFv 클론의 결합을 비교하는 전체 세포 ELISA의 결과를 도시한다. TF-I 세포는 음성 대조로서 포함된다.
도 7에서는 삼색 유세포분석에서 본 발명에 따른 scFv 항체의 결합 특이성을 도시한다. 정상적인 말초혈 단핵 세포에서, scFv-9에 의해 인식되는 항원은 B 림프구에서 보통 수준으로 발현되고 T 림프구의 부집단에서 약하게 발현된다. 정상 공여자로부터 PBMC는 항-CD5-FITC, 항-CD19-PerCP, scFv-9/항-HA-비오틴/스트렙타비딘-PE를 이용한 삼색 유세포분석으로 분석하였다.
도 8a, 8b, 8c에서는 본 발명에 따른 scFv 항체에 의해 인식되는 항원의 발현 수준을 도시한다. scFv-3과 scFv-9에 의해 인식되는 항원은 CLL-AAT 세포주가 유래된 일차 CLL 종양에서 과다-발현되었다. CLL-AAT 세포주를 확립하는데 이용되는 CLL 환자로부터 유래된 일차 PBMC 또는 정상 공여자로부터 유래된 PBMC는 scFv 항체로 염색하고 유세포분석법으로 분석하였다. scFv-3과 scFv-9는 평균 형광 강도에 의한 측정에서 정상 PBMC보다 훨씬 밝게 CLL 세포를 염색한다.
도 9a, 9b, 9c에서는 선별된 scFv 항체의 CDR 서열과 결합 특이성의 요약을 제공한다. 도 9b에 도시된 바와 같이, 좌측 칼럼에 있는 클론 번호는 아래와 같이 scFv 번호로 인용된다: A2c(scFv-1), G12.1c((scFv-2), B4.2a(scFv-17), E1c(scFv-3), F2d(scFv-18), E5e(scFv-4), H6.2b(scFv-5), G10.1(scFv-9), D11.1c(scFv-6), A5.2c(scFv-20), F1d(scFv-7), F1e(scFv-8), E4.2(scFv-21), E2c(scFv-9), A9c(scFv-9), E11e(scFv-10), A1.1(scFv-11), F5.2(scFv-12), F10b(scFv-22), F7a(scFv-23), F6b(scFv-13), C12b(scFv-24), D2.1b(scFv-14), D1.1(scFv-25), D2.2a(scFv-15), D2.2b(scFv-16).
도 10은 도 8a-8c에 기술된 일차 CLL 세포 vs. 정상적인 PBMC에서 scFv 항원의 발현 수준을 비교하는 유세포분석 결과의 요약한 표이다.
도 11은 10명의 CLL 환자로부터 분리된 말초혈 단핵 세포에서 CD38+ 세포의 비율로 scFv-9 항원의 발현 수준을 비교하는 유세포분석 결과의 요약한 표이다.
도 12에서는 면역침강과 질량 분광법으로 scFv 항원의 확인을 도시한다. CLL-AAT 세포는 PBS pH 8.0에 담긴 0.5 ㎎/㎖ 설포-NHS-LC-비오틴(Pierce) 용액으로 30'동안 라벨하였다. PBS로 폭넓게 세척하여 반응하지 않은 비오틴을 제거한 이후, 세포는 질소 캐비테이션(nitrogen cavitation)으로 파괴하고, 마이크로솜 분획물은 편차 원심분리(differential centrifugation)로 분리하였다. 마이크로솜 분획물은 NP40 용해 완충액에 재부유시키고 정상적인 토끼 혈청과 단백질 A 세파로오스로 폭넓게 처리하여 안정성을 사전에 담보하였다. 항원은 쥐 항-HA 아가로오스 비드(Roche)에 결합된 HA-표지된 scFv 항체로 면역침강시켰다. 면역침강이후, 항원은 SDS-PAGE로 분리하고 스트렙타비딘-알칼리성 포스파타아제(AP)를 이용한 웨스턴 블랏 또는 Coomassie G-250 염색으로 검출하였다. CLL-AAT 세포에 결합하지 않는 항체인 scFv-7은 음성 대조로 이용하였다. 항원 띠는 Coomassie-염색된 겔로부터 절개하고 질량 분광법(MS)으로 확인하였다. MALDI-MS는 Proteomics Core Facility of The Scripps Research Institute(La Jolla, CA)에서 수행하였다. μLC/MS/MS는 Harvard Microchemistry Facility(Cambridge, MA)에서 수행하였다.
도 13에서는 3가지 scFv 항체가 인간 OX-2/CD200 cDNA 클론으로 일시적으로 트랜스펙션된 293-EBNA 세포에 특이적으로 결합한다는 것을 도시한다. OX-2/CD200 cDNA는 RT-PCR로 CLL 세포로부터 클론하고 포유동물 발현 벡터 pCEP4(Invitrogen)에 삽입하였다. PCEP4-CD200 플라스미드 또는 상응하는 빈 벡터 pCEP4는 Polyfect 시약(QIAGEN)을 이용하여 293-EBNA 세포에 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션 2일후, 세포는 유세포분석으로 scFv 항체에 대한 결합을 분석하였다.
도 14에서는 OX-2/CD200 트랜스펙션된 세포의 존재가 IL-2와 IFN-γ과 같은 Th1 사이토킨의 하향-조절을 유도한다는 것을 도시한다. 30 ㎍/㎖에서 항-OX 2/CD200 항체의 첨가는 Th1 반응을 완전히 복원시켰다.
도 15에서는 혼성 림프구 반응물에서 CCL 세포의 존재가 IL-2에 대한 Th1 반응의 하향-조절을 유도한다는 것을 도시한다.
도 16에서는 혼성 림프구 반응물에서 CCL 세포의 존재가 IFN-γ에 대한 Th1 반응의 하향-조절을 유도한다는 것을 도시한다.
도 17a와 b에서는 인간 PBL의 존부하에 4x106 RAJI 세포로 피하 주입된 모든 NOD/SCID 생쥐군에 대한 종양 체적의 평균 +/-SD를 도시한다.
도 18에서는 2가지 모수 검정(스튜던트 t-검정과 웰치 검정(Welch's test)) 및 1가지 비-모수 검정(윌콕스 검정(Wilcox test))을 이용하여 수행된 통계학적 분석의 결과를 도시한다.
본 발명에서는 OX-2/CD200이 개체에서 상향조절되는 지를 결정하고, 이런 경우에 OX-2/CD200에 결합하는 폴리펩티드를 상기 개체에 투여하는 방법을 제시한다. 일반적으로, 본 발명에 이용되는 폴리펩티드는 당업자에게 공지된 상이한 기술을 이용하여 작제할 수 있다. 한 구체예에서, 폴리펩티드는 화학적 합성에 의해 수득된다. 다른 구체예에서, 폴리펩티드는 항체이거나 한가지이상 항체의 단편 또는 여러 단편으로부터 작제된다.
적절하게는, 본 발명의 방법에 이용되는 폴리펩티드는 CLL 세포주로부터 수득된다. 본 명세서에서 “CLL”은 B 세포 CLL(“B-CLL”)을 포함하지만 이들에 국한되지 않는 B 세포와 T 세포의 다양한 발달 단계의 림프구를 수반하는 만성 림프성 백혈병이다. 본 명세서에서 B-CLL은 CD5+, CD23+, CD20dim+, sIgdim+이며 세포 주기의 G0/G1에서 정지되는 성숙 B 세포 표현형을 보유하는 백혈병을 나타낸다. 다른 관점에서, CLL 세포주는 OX-2/CD200이 상향조절되는 질환 상태, 바람직하게는, 암과 CLL의 진단 및/또는 치료에 유효한 폴리펩티드, 바람직하게는 항체를 산출하는데 이용된다.
본 명세서에서 “항체”는 선택된 표적에 결합할 수 있는 완전 항체 또는 항체 단편을 나타낸다. 여기에는 Fv, scFv, Fab'와 F(ab')2, 단클론과 다클론 항체, 가공된 항체(키메라 항체, CDR-융합된 항체, 인화 항체, 완전 인간 항체, 인공적으로 선택된 항체 포함), 파지 전시 또는 대체 기술을 이용하여 생산된 합성이나 반-합성 항체 등이 포함된다. 소형 단편, 예를 들면, Fv와 scFv는 작은 크기 및 이에 따른 우수한 조직 분산으로 인하여 진단과 치료 용도에 유리한 특성을 보유한다.
본 발명의 폴리펩티드 및/또는 항체는 진단과 치료 용도에 특히 적합하다. 따라서, 이들은 작동자 단백질, 예를 들면, 독소 또는 라벨로 변형될 수 있다. 특히, 생체내에서 폴리펩티드 또는 항체 분산의 영상을 가능하게 하는 라벨이 바람직하다. 이런 라벨은 환자의 체내에서 쉽게 가시화되는 방사성 라벨 또는 방사성비투과성(radioplaque) 라벨, 예를 들면, 금속 입자일 수 있다. 또한, 라벨은 환자로부터 제거되는 조직 샘플에서 가시화되는 형광 라벨 또는 다른 라벨일 수 있다.
항체는 본원에 개시된 세포를 면역원으로서 이용하고, 단클론 항체가 분리되는 동물에서 면역 반응을 유발함으로써 산출된다. 항체의 서열을 결정하고, 재조합 기술로 이들 항체 또는 이의 변이체를 산출한다. 이런 관점에서, “변이체”는 단클론 항체의 서열 및 OX-2/CD200에 결합할 수 있는 폴리펩티드에 기초한 키메라 항체, CDR-융합된 항체, 인간화 항체, 완전 인간 항체를 포괄한다.
더 나아가, 본원에 기술된 세포 또는 이로부터 유래된 폴리펩티드를 표적 특이성에 기초한 항체 또는 폴리펩티드를 분리하는 미끼로 이용하여, 재조합 라이브러리로부터 유래된 항체(“파지 항체”)를 선별할 수 있다.
또 다른 관점에서, 항체 또는 폴리펩티드는 일차 CLL 세포 또는 이로부터 유래된 항원을 이용하여 항체 라이브러리를 패닝하여 산출하고, CLL 세포주, 예를 들면, 본원에 기술된 CLL 세포주를 이용하여 더욱 선별하거나 특성화시킨다. 따라서, CLL에 특이적인 항체 또는 폴리펩티드를 특성화하는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 CLL 세포주에 대한 항체 또는 폴리펩티드의 결합을 사정하는 단계를 포함한다.
세포주의 준비
세포주는 당업자에게 공지된 확립된 방법에 따라 생산할 수 있다. 일반적으로, 세포주는 영속화된 세포가 배양액에서 자발적으로 산출될 때까지, 환자로부터 유래된 일차 세포를 배양함으로써 생산된다. 이후, 이들 세포는 분리하고 더욱 배양하여 아폽토시스에 저항성을 보이는 클론성 세포 개체군 또는 세포를 생산한다.
가령, CLL 세포는 CLL 환자로부터 채취된 말초혈로부터 분리한다. 이들 세포는 세척하고 선택적으로 면역형확인(immunotyping)하여 존재하는 세포의 유형을 결정한다. 그 다음, 이들 세포는 배지, 예를 들면, IL-4를 함유하는 배지에서 배양한다. 적절하게는, 배지 전체 또는 일부가 배양 과정동안 1회 이상 교체된다. 이후, 세포주는 분리하고 배양동안 증가된 성장으로 확인한다.
한 구체예에서, EBV를 이용한 영속화로 확립되지 않은 악성 기원의 CLL 세포주를 제시한다. “악성 기원”은 예로써 EBV로 형질전환된 비-증식성 세포와 반대로, 악성 CLL 일차 세포로부터 세포주의 편향을 의미한다. 본 발명에 유용한 세포주는 자체 표현형에서 악성이거나 악성이 아니다. “악성” 표현형을 보유하는 CLL 세포는 반복된 주기의 세포 성장으로 특성화되는 기질 매체로부터 무관하게 세포 성장을 달성하고 아폽토시스에 저항성을 보인다. 일차 CLL 세포로부터 유래된 상기 세포주는 ATCC 수탁번호 PTA-3920로 기탁된다. 바람직한 구체예에서, 세포주는 CLL-AAT이다. CLL-AAT는 B-CLL 일차 세포로부터 유래된 B-CLL 세포주이다.
한 구체예에서, CLL 세포에서 독특하게 발현되는 단백질은 CLL-AAT 세포주를 이용하여 당분야에 공지된 방법, 예를 들면, 면역침전검사 및 이후의 질량 분광분석으로 확인된다. 이들 단백질은 CLL-AAT 세포주, 또는 CLL 환자로부터 유래된 일차 세포에서 독특하게 발현된다.
세포의 성장 특성을 조절할 수 있는 작용제를 확인하는 세포-기초한 검사에서 CLL-AAT 세포주를 이용하여 소형 분자 라이브러리(대부분 상업적으로 입수가능)를 선별할 수 있다. 가령, CLL-AAT 세포주에서 아폽토시스를 조절하거나, 이의 성장 및/또는 증식을 저해하는 작용제를 확인할 수 있다. 이런 작용제는 치료 화합물의 개발을 위한 후보이다.
CLL-AAT 세포주로부터 분리된 핵산은 CLL-특이적 유전자를 확인하는 마이너스 혼성화 실험, 또는 마이크로 어레이 분석(가령, 유전자 칩 실험)에 이용될 수 있다. CLL 세포에서 전사가 조절되는 유전자를 확인할 수 있다. 이런 방식으로 확인된 폴리펩티드 또는 핵산 유전자 산물은 CLL용 항체 또는 소형 분자 치료제의 개발을 위한 선도물질로서 유용하다.
한 구체예에서, CLL-AAT 세포주는 세포 표면 성분에 결합하고, 이후 세포에 의해 내재화되는 내재 황체(internalizing antibody)를 확인하는데 이용된다. 이들 항체는 치료 용도의 후보이다. 특히, 세포질에서 안정적으로 존재하고 세포내 결합 활성을 유지하는 단일-사슬 항체가 이런 방식으로 선별될 수 있다.
단클론 항체의 준비
재조합 DNA 기술을 이용하여 본 발명에 따라 생산된 항체를 개선할 수 있다. 따라서, 진단 또는 치료 용도에서 면역원성이 감소된 키메라 항체를 작제할 수 있다. 더 나아가, CDR 융합 및 선택적으로 기본구조 변형으로 이들 항체를 인화시킴으로써 면역원성을 최소화시킬 수 있다(참조: U.S. Patent No. 5,225,539).
항체는 동물 혈청으로부터 수득하거나 단클론 항체 또는 이의 단편의 경우에 세포 배양액에서 생산할 수 있다. 재조합 DNA 기술을 이용하여 박테리아, 바람직하게는 포유동물 세포 배양액에서 확립된 절차에 따라 항체를 생산할 수 있다. 적절하게는, 선택된 세포 배양 시스템은 항체 산물을 분비한다.
한 구체예에서, 본원에 개시된 항체의 생산 공정은 하이브리드 벡터로 형질전환된 숙주, 예를 들면, 대장균(E. coli) 또는 포유동물 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 벡터는 적절한 해독 틀에서, 항체 단백질을 인코딩하는 두 번째 DNA 서열에 연결된 단일 펩티드를 인코딩하는 첫 번째 DNA 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 보유하는 하나이상의 발현 카세트를 포함한다. 이후, 항체 단백질은 수집하고 분리한다. 선택적으로, 발현 카세트는 적절한 해독 틀에서 단일 펩티드에 각각 작동가능하게 개별적으로 연결된 항체 단백질을 인코딩하는 폴리시스트론, 가령 이중시스트론 DNA 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 보유한다.
시험관내에서 하이브리도마 세포 또는 포유동물 세포의 증폭은 적절한 배양 배지에서 수행되는데, 상기 배지에는 포유동물 혈청(가령, 소 태아 혈청) 또는 미량 원소와 성장 지속 보충물질(가령, 정상 생쥐 복막 삼출액 세포, 비장 세포, 골수 대식세포, 2-아미노에탄올, 인슐린, 트랜스페린, 저밀도 지단백, 올레산 등과 같은 영양 세포)에 의해 선택적으로 보충된 통상적인 표준 배양 배지(가령, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium) 또는 RPMI 1640 배지)이다. 박테리아 세포 또는 효모 세포인 숙주 세포의 증폭은 당분야에 공지된 적절한 배양 배지에서 유사하게 수행된다. 가령, 박테리아에 적합한 배양 배지는 LE, NZCYM, NZYM, NZM, Terrific Broth, SOB, SOC, 2 x YT, 또는 M9 최소 배지이다. 효모에 적합한 배양 배지는 YPD, YEPD, 최소 배지, 또는 완전 최소 탈락 배지(Complete Minimal Dropout Medium)이다.
시험관내 생산은 상대적으로 순수한 항체 제조물을 제공하고 원하는 항체를 다량으로 제공하는 규모 확대(scale-up)가 가능하다. 박테리아 세포, 효모, 식물, 또는 포유동물 세포의 배양 기술은 당분야에 공지되어 있으며, 균질성 현탁액 배양(가령, 공기리프트 반응기 또는 연속 교반 반응기에서), 영속화되거나 포획된 세포 배양(가령, 중공 섬유, 마이크로캡슐, 아가로오스 마이크로비드 또는 세라믹 카트라이지에서) 등이 포함된다.
다량의 원하는 항체는 생체내에서 포유동물 세포를 증폭함으로써 수득할 수 있다. 이를 위하여, 원하는 항체를 생산하는 하이브리도마 세포는 조직적합성 포유동물에 주입하여 항체-생산 종양의 성장을 유도한다. 선택적으로, 동물은 주입에 앞서, 탄화수소, 바람직하게는 프리스탄(테트라메틸-펜타데칸)과 같은 미네랄 오일로 기폭한다. 1 내지 3주후, 항체는 이들 포유동물의 체액으로부터 분리한다. 가령, 적절한 골수종 세포와 Balb/c 생쥐로부터 유래된 항체-생산 비장 세포의 융합으로 수득되는 하이브리도마 세포, 또는 원하는 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주 Sp2/0으로부터 유래된 트랜스펙션된 세포를 선택적으로 프리스틴으로 미리-처리된 Balb/c 생쥐에 복강내 주입한다. 1 내지 2주후, 이들 동물로부터 복수를 채취한다.
상기한 기술은 예로써 Kohler and Milstein,(1975) Nature 256:495-497; U.S. Patent No. 4,376, 110; Harlow and Lane, Antibodies: a Laboratory Manual,(1988) Cold Spring Harbor에서 기술한다. 재조합 항체 분자의 제조 기술은 상기한 참고 문헌 및 예로써 W097/08320; U. S. Patent No. 5,427,908; U.S. Patent No. 5,508,717; Smith, 1985, Science, Vol.225, pp 1315-1317; Parmley and Smith 1988, Gene 73, pp 305-318; De La Cruz et al, 1988, Journal of Biological Chemistry, 263 pp 4318-4322; U.S. Patent No. 5,403,484; U.S. Patent No. 5223409; W088/06630; WO92/15679; U.S. Patent No. 5780279; U.S. Patent No. 5571698; U.S. Patent No. 6040136; Davis et al., Cancer Metastasis Rev.,1999;18(4):421-5; Taylor, et al., Nucleic Acids Research 20(1992): 6287-6295; Tomizuka et al.,Proc. Nat. Academy of Sciences USA 97(2)(2000): 722-727에서 기술한다. 이들 참고문헌은 순전히 참조로 한다.
세포 배양 상층액은 CLL 세포의 면역형광 염색, 면역블랏팅, 효소 면역법, 예를 들면, 샌드위치 검사 또는 다트-검사, 또는 방사선면역법으로 원하는 항체를 선별한다.
항체의 분리를 위하여, 배양 상층액 또는 복수에서 면역글로불린은 예로써, 황산암모늄을 이용한 침전, 폴리에틸렌 글리콜과 같은 흡습성 물질에 대한 투석, 선별 막을 통한 여과 등으로 농축시킨다. 필요한 경우, 항체는 통상적인 크로마토그래피 방법, 예를 들면, 겔 여과, 이온-교환 크로마토그래피, DEAE-셀룰로오스에서 크로마토그래피 및/또는 (면역-)친화성 크로마토그래피, 가령, 본원에 개시된 CLL 세포주로부터 유래된 한가지이상의 표면 폴리펩티드 또는 단백질 A 또는 G를 이용한 친화성 크로마토그래피로 정제한다.
다른 구체예에서, 적절한 포유동물, 예를 들면, 토끼를 모아진 CLL 환자 샘플로 면역하는 것으로 특성화되는 박테리아 세포주에 대항하는 항체를 분비하는 박테리아 세포주의 제조 공정을 제시한다. 면역된 토끼로부터 생산된 파지 전시 라이브러리는 당분야에 공지된 방법(가령, 다양한 참고문헌에 개시된 방법)에 따라 원하는 항체를 작제하고 패닝한다.
본 발명에 따른 단클론 항체를 분비하는 하이브리도마 세포 역시 고려된다. 바람직한 하이브리도마 세포는 유전적으로 안정하고 본원에 기술된 원하는 특이성의 단클론 항체를 분비하며 해동과 재클로닝(recloning)에 의한 심온-동결(deep-frozen) 배양액으로부터 활성화될 수 있다.
다른 구체예에서, 본원에 기술된 CLL 세포주에 대항하는 단클론 항체를 분비하는 하이브리도마 세포주의 제조 공정을 제시한다. 상기 공정에서, 적절한 포유동물, 예를 들면, Balb/c 생쥐는 본원에 기술된 세포로부터 유래된 한가지이상 폴리펩티드 또는 이의 항원성 단편, 세포주 자체, 또는 본원에 기술된 정제된 폴리펩티드를 보유하는 항원성 담체로 면역된다. 면역된 포유동물의 항체-생산 세포는 배양액에서 짧게 성장시키거나 적절한 골수종 세포주의 세포와 융합된다. 이런 융합에서 수득된 하이브리드 세포는 클론하고, 원하는 항체를 분비하는 세포 클론은 선별한다. 가령, 본 발명의 세포주로 면역된 Balb/c 생쥐의 비장 세포는 골수종 세포주 PAI 또는 골수종 세포주 Sp2/0-Ag 14의 세포와 융합시키고, 수득된 하이브리드 세포는 원하는 항체의 분비를 선별하고, 양성 세포는 클론한다.
수개월, 예를 들면, 2 내지 4개월동안 수회, 예를 들면, 4 내지 6회 본 발명에 따른 세포주의 106 내지 107개 세포를 피하 및/또는 복강내 주입하여 Balb/c 생쥐를 면역시키는 것으로 특성화되는 하이브리도마 세포주의 제조 공정이 바람직하다. 면역된 생쥐로부터 비장 세포는 최종 주입이후 2 내지 4일 시점에 채취하고 융합 프로모터, 바람직하게는 폴리에틸렌 글리콜의 존재하에 골수종 세포주 PAI의 세포와 융합시킨다. 적절하게는, 골수종 세포는 4000 분자량의 대략 30% 내지 50% 폴리에틸렌 글리콜을 함유하는 용액에서, 면역된 생쥐로부터 유래된 3- 내지 20-배 과다의 비장 세포와 융합된다. 융합이후, 세포는 본원에 기술된 적절한 배양 배지에서 확대시키고, 통상의 골수종 세포가 원하는 하이브리도마 세포보다 커지지 않도록 규칙적인 간격으로 선별 배지, 예를 들면, HAT 배지로 보충한다.
다른 구체예에서, 본원에 기술된 세포주에 지향하는 항체의 중쇄 가변 도메인 및/또는 경쇄 가변 도메인에 대한 삽입 코딩을 포함하는 재조합 DNA를 산출한다. 본 명세서에서 “DNA”는 코딩 단일 가닥 DNA, 상기 코딩 DNA와 이의 상보성 DNA로 구성되는 이중 가닥 DNA, 또는 이들의 상보성(단일 가닥) DNA 자체를 포괄한다.
더 나아가, 본원에 기술된 세포주를 지향하는 항체의 중쇄 가변 도메인 및/또는 경쇄 가변 도메인을 인코딩하는 DNA는 중쇄 가변 도메인 및/또는 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 실제 DNA 서열, 또는 이의 변이체를 보유하는 효소적으로 또는 화학적으로 합성된 DNA일 수 있다. 실제 DNA의 변이체는 하나이상의 아미노산이 결실되거나 하나이상의 다른 아미노산으로 치환된 상기한 항체의 중쇄 가변 도메인 및/또는 경쇄 가변 도메인을 인코딩하는 DNA이다. 적절하게는, 상기 변형은 인간화 및 발현 최적화에서 항체의 중쇄 가변 도메인 및/또는 경쇄 가변 도메인의 CDR 외부에 위치한다. 또한, 변이 DNA는 하나이상의 뉴클레오티드가 동일 아미노산을 코딩하는 새로운 코돈을 갖는 다른 뉴클레오티드로 치환된 침묵 변이체를 포괄한다. 또한, 변이 서열은 축퇴된 서열을 포괄한다. 축퇴된 서열은 무제한의 뉴클레오티드가 최초 인코딩된 아미노산 서열의 변화없이 다른 뉴클레오티드로 치환된다는 점에서, 유전자 코드의 효력에서 축퇴된다. 이런 축퇴된 서열은 특정 숙주, 특히, 대장균(E. coli)에 의해 선호되는 특정 코돈의 서로 다른 제한 부위 및/또는 빈도로 인하여, 중쇄 뮤린 가변 도메인 및/또는 경쇄 뮤린 가변 도메인의 최적 발현을 달성하는데 유효하다.
변이체는 당분야에 공지된 방법에 따라 실제 DNA의 시험관내 돌연변이유발에 의해 수득되는 DNA 변이체를 포괄한다.
완전 테트라머 면역글로분린 분자의 조합과 키메라 항체의 발현을 위하여, 중쇄와 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 재조합 DNA 삽입체는 경쇄와 중쇄 불변 도메인과 융합되고, 예로써 하이브리드 벡터에 통합이후 적절한 숙주 세포에 트랜스펙션된다.
또한, 인간 불변 도메인, 예를 들면, γ1, γ2, γ3 또는 γ4, 바람직하게는 γ1 또는 γ4에 융합되고 본원에 기술된 세포주를 지향하는 항체의 중쇄 뮤린 가변 도메인을 코딩하는 삽입체를 보유하는 재조합 DNA를 제시한다. 또한, 인간 불변 도메인 κ 또는 λ, 바람직하게는 κ에 융합되고 본원에 기술된 세포주를 지향하는 항체의 경쇄 뮤린 가변 도메인을 코딩하는 삽입체를 보유하는 재조합 DNA를 제시한다.
다른 구체예는 중쇄 가변 도메인과 경쇄 가변 도메인이 스페이서 그룹에 의해 연결되는 재조합 폴리펩티드를 코딩하고, 선택적으로 숙주 세포에서 항체의 가공을 용이하게 하는 신호 서열 및/또는 항체의 정제를 용이하게 하는 펩티드, 절단 부위, 펩티드 스페이서 및/또는 작동자 분자를 코딩하는 DNA를 포함하는 재조합 DNA에 관한다. 작동자 분자를 코딩하는 DNA는 진단 또는 치료 용도에 유효한 작동자 분자를 코딩하는 DNA이다. 특히, 독소 또는 효소, 예를 들면, 프로드러그의 활성화를 촉매할 수 있는 효소인 작동자 분자가 바람직하다. 이런 작동자 분자를 인코딩하는 DNA는 자연적으로 발생하는 효소 또는 독소 인코딩 DNA 서열, 또는 이의 변이체를 보유하고, 당분야에 공지된 방법으로 만들어질 수 있다.
본원에 기술된 항체와 항체 단편은 진단과 치료에 유효하다. 따라서, 본원에 개시된 항체를 포함하는 치료 또는 진단용 조성물을 제시한다.
진단 조성물의 경우에, 항체는 이런 항체를 검출하는 수단, 예를 들면, 효소 수단, 형광 수단, 방사선 수단 또는 다른 수단과 함께 제공된다. 항체와 검출 수단은 진단용 키트에 동시, 개별적 또는 순차적으로 제공된다.
상기한 상세는 항체에 관하지만, 일부 구체예에서 이런 항체로부터 유래된 폴리펩티드가 본 발명에 사용될 수 있다.
CLL 세포주의 용도
CLL 세포주는 CLL, 암, OX-2/CD200의 상향조절된 수준으로 특성화되는 다른 질병 상태, 예를 들면, 흑색종의 진단제와 치료제의 개발을 위한 중요한 도구를 제공한다는 점에서 여러 면에서 유익하다.
본 발명에 따른 세포주는 CLL 및 OX-2/CD200의 상향조절된 수준으로 특성화되는 다른 질병 상태의 병인, 질병발생, 생태에 관한 시험관내 연구에 유용하다. 이는 이들 질환의 치료에 유효한 적절한 작용제의 확인을 보조한다.
상기 세포주는 CLL, 암, OX-2/CD200의 상향조절된 수준으로 특성화되는 다른 질병 상태(가령, 흑색종)의 시험관내 생체내 진단; 다른 방법, 예를 들면, 일차 세포 및/또는 CLL 환자로부터 유래된 항원으로 항체 라이브러리를 패닝함으로써 생산된 항체의 선별 및/또는 특성화를 위한 폴리펩티드 및/또는 단클론 항체를 생산하는 데에도 이용될 수 있다.
세포주는 이렇게 이용되거나, 또는 이들로부터 항원을 유도할 수 있다. 적절하게는, 이들 항원은 CLL에 특이적인 세포-표면 항원이다. 이들은 본 발명에 따라 세포주로부터 직접 분리될 수 있다. 대안으로, 본원에 기술된 세포주로부터 만들어진 cDNA 발현 라이브러리를 이용하여 항-CLL 항체의 선별과 특성화 및 신규한 CLL-특이적 항원의 확인에 유용한 CLL-특이적 항원을 발현할 수 있다.
단클론 항체 요법을 이용한 CLL의 치료는 당분야에 이미 제안되었다. 최근에, Hainsworth(Oncologist 5(5)(2000) 376-334)는 단클론 항체로부터 유래된 현행 치료제를 기술하였다. 특히, 림프성 백혈병은 림프구 종양에서 복수 림프구-특이적 항원의 존재로 인하여 이런 치료 방식의 유력한 후보로서 간주된다.
기존의 항체 치료제(가령, B-림프구의 표면에서 발현되는 CD20-항원에 대항하는 RituximabTM)는 특정 림프성 질환에 성공적으로 이용되었다. 하지만, CLL의 경우에 CD20 항원은 B-림프구의 표면에서 낮아진 수준으로 발현된다(Almasri et al., Am. J. Hematoi., 40(4)(1992) 259-263).
따라서, 본원에 기술된 CLL 세포주는 본 발명의 CCL 세포주의 한가지이상 항원성 결정부위에 대한 특이성을 보유하는 신규한 항-CCL 항체와 폴리펩티드의 개발을 가능하게 하고 CLL, 암, OX-2/CD200의 상향조절된 수준으로 특성화되는 다른 질병 상태의 치료와 진단에 이용된다.
상기 항체 또는 폴리펩티드는 OX-2/CD200이 정상적으로 상호작용하는 수용체에 결합하여, OX-2/CD200이 상기 수용체에 결합하는 것을 예방하거나 저해한다. 다른 대안으로서, 항체는 OX-2/CD200의 발현을 조절하는 항원에 결합하여 OX-2/CD200의 정상적인 또는 증가된 발현을 예방하거나 저해할 수 있다. OX-2/CD200의 존재가 감소된 면역 반응과 연관하기 때문에, OX-2/CD200의 대사 경로를 간섭하여 환자의 면역계가 질병 상태, 예를 들면, 암 또는 CLL로부터 더욱 효과적으로 방어할 수 있도록 하는 것이 바람직하다.
특히 바람직한 구체예에서, 폴리펩티드는 OX-2/CD200에 결합된다. 한 구체예에서, 폴리펩티드는 OX-2/CD200에 결합하여 OX-2/CD200이 다른 분자 또는 수용체와 상호작용하는 것을 예방하거나 저해하는 항체일 수 있다. CLL 세포 및 OX-2/CD200을 과다-발현하는 다른 세포가 Th1 사이토킨의 생산을 현저하게 감소시키기 때문에, OX-2/CD200에 결합하는 항-CD200 항체 또는 폴리펩티드를 OX-2/CD200이 상향조절된 개체에 투여하면 Th1 사이토킨 프로필이 복원된다. 따라서, 이들 폴리펩티드 및/또는 항체는 CLL 및 OX-2/CD200을 과다-발현하는 다른 암이나 질환의 치료에 유효한 치료제이다.
따라서, 다른 구체예에서, 본 발명의 방법은 개체에서 OX-2/CD200의 존재를 검사하고 OX-2/CD200에 결합하는 폴리펩티드를 투여하는 단계를 포함한다. 특히 바람직한 구체예에서, CLL 환자는 OX-2/CD200의 과다-발현을 조사받고, OX-2/CD200에 결합하는 항체가 상기 환자에 투여된다. 아래에 상술한 바와 같이, 이런 항체중 한가지는 OX-2/CD200에 결합하는 scFv-9(도 9B)이다.
당업자가 본원에 개시된 조성물과 방법을 더욱 효과적으로 수행할 수 있도록 하기 위하여, 설명의 목적으로 아래의 실시예를 제시한다.
실시예 1
세포주 CLL-AAT의 분리
상기 세포주의 확립
CLL로 진단된 환자로부터 말초혈을 수득하였다. WBC 총수는 1.6x1O8/㎖이었다. 단핵 세포는 Histopaque-1077 밀도 구배 원심분리(Sigma Diagnostics, St. Louis, MO)로 분리하였다. 세포는 10% 열-불활화된 소 태아 혈청(FBS)으로 보충된 IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)으로 2회 세척하고, 5 ㎖의 차가운 IMDM/10% FBS에 재부유시켰다. 생존 세포는 트립탄 블루(trypan blue)로 염색하여 계산하였다. 세포는 동등 부피의 85% FBS/15% DMSO와 혼합하고 보관을 위하여 1 ㎖ 분량으로 액체 질소에서 동결시켰다.
면역표현형확인(immunophenotyping)에서 CD45+ 림프구 집단의 >90%가 IgD, 카파 경쇄(kappa light chain), CD5, CD19, CD23을 발현하는 것으로 확인되었다. 또한, 상기 집단은 IgM과 CD20을 낮은 수준으로 발현하였다. 대략 50%의 세포가 CD38을 높은 수준으로 발현하였다. 이들 세포는 람다 경쇄(lambda light chain), CD10, CD138에 대하여 음성이었다.
세포의 분량은 해동하고 세척하며 20% 열-불활화된 FBS, 2 mM L-글루타민, 100 unit/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신, 50 μM 2-멀캡토에탄올, 5 ng/㎖ 재조합 사람 IL-4(R & D Systems, Minneapolis, MN)로 보충된 IMDM에서 107/㎖의 밀도로 재부유시켰다. 세포는 37℃, 가습된 5% CO2 대기에서 배양하였다. 배지는 안정적인 성장이 관찰될 때까지 4일 간격으로 부분적으로 교체하였다. 5주후, 배양액에서 세포의 총수는 대략 4일 간격으로 2배씩 증가하였다. 상기 세포주는 CLL-AAT로 명명하였다.
상기 세포주의 특성화
유세포분석에 의한 상기 세포주의 면역표현형확인에서 IgM, 카파 경쇄, CD23, CD38, CD138의 높은 발현, CD19와 CD20의 중간 발현, IgD와 CD5의 약한 발현이 확인되었다. 상기 세포주는 람다 경쇄, CD4, CD8, CD10에 대하여 음성이었다.
상기 세포주의 면역표현형확인은 일차 B-CLL 세포에 대한 특이적인 결합으로 선별된 토끼 scFv 항체 패널을 이용한 전체 세포 ELISA로도 수행하였다. 이들 모든 CLL-특이적 scFv 항체 역시 CLL-AAT 세포주를 인식하였다. 대조적으로, 대부분의 scFv는 B 세포 림프종으로부터 유래된 2가지 세포주: Ramos, 버킷 림프종 세포주; RL, 비-호지킨 림프종 세포주에 결합하지 않았다.
실시예 2
항체 파지 전시와 세포 표면 패닝을 이용한 B-CLL-특이적 세포 표면 항원에 대한 scFv 항체의 선별
면역화 및 scFv 항체 라이브러리 작제
말초혈 단핵 세포(PBMC)는 Scripps Clinic(La Jolla, CA)에서 CLL 환자로부터 채취된 혈액으로부터 분리하였다. 2마리 토끼는 10명의 상이한 CLL 공여자로부터 모아진 2x107 PBMC로 면역하였다. 3회 면역화, 2회 피하 주입 및 후속의 1회 정맥 주입은 3주 간격으로 수행하였다. 혈청 역가는 유세포분석을 이용하여 일차 CLL 세포에 대한 혈청 IgG의 결합을 측정하여 조사하였다. 최종 면역화이후 5일 시점에, 비장, 골수, PBMC를 이들 동물로부터 수거하였다. 전체 RNA는 Tri-Reagent(Molecular Research Center, Inc)를 이용하여 이들 조직으로부터 분리하였다. 단일-사슬 Fv(scFv) 항체 파지 전시 라이브러리는 기존 문헌에 기술된 바와 같이 구성하였다(Barbas et al.,(2001) Phage Display: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York). 세포 표면 패닝을 위하여, 재증폭된 라이브러리로부터 파게미드(phagemid) 입자는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)로 침전시키고 1% 소 혈청 알부민(BSA)을 함유하는 인산염 완충액(PBS)에 재부유시키며 하룻밤동안 PBS에서 투석하였다.
세포 표면 패닝에 의한 항체 선별
이들 라이브러리는 Siegel 등(1997, J. Immunol. Methods 206:73-85)이 밝힌 바와 같이, 자성-활성화된 세포 분류기(MACS)를 이용한 양성-음성 선별로 CLL 세포 표면-특이적 항체에 대하여 농축시켰다. 간단히 말하면, scFv 항체 라이브러리로부터 파게미드 입자는 25℃에서 1시간동안 MPBS(PBS, pH 7.4에서 2% 무지방 분유, 0.02% 소디움 아자이드)에서 사전 배양하여 비특이적 결합 부위를 차단하였다. 대략 107개 일차 CLL 세포는 상자성 마이크로비드(Miltenyi Biotec, Sunnyvale, CA)에 공액된 생쥐 항-CD5 IgG와 생쥐 항-CD19 IgG로 라벨하였다. 결합되지 않은 마이크로비드는 세척으로 제거하였다. 라벨된 CLL 세포(“표적 세포”)는 과량의 “항원-음성 흡수체 세포”와 혼합하고 펠렛하며 50 ㎕(1010-1011 cfu)의 파지 입자에 재부유시켰다. 흡수체 세포는 세포 표면에 비-특이적으로 부착하는 파지 및 표적과 흡수체 세포 모두에 존재하는“공통”항원에 특이적인 파지를 흡수하는 역할을 한다. 이용된 흡수체 세포는 TF-1 세포(인간 적백혈병 세포주), 또는 면역자성 음성 선별(StemSep system, Stem세포 Technologies, Vancouver, Canada)에 의해 말초혈로부터 분리된 정상적인 인간 B 세포이었다. 표적 세포에 대한 흡수체 세포의 비율은 부피로 대략 10배이었다. 25℃에서 30분 배양이후, 세포/파지 혼합물은 MiniMACS MS+ 분리 칼럼에 이전하였다. 칼럼은 0.5 ㎖의 MPBS로 2회, 0.5 ㎖의 PBS로 1회 세척하여 결합되지 않은 파지와 흡수체 세포를 제거하였다. 표적 세포는 1 ㎖의 PBS에서 칼럼으로부터 용리시키고 마이크로원심분리기에서 15초의 최대 속도로 펠렛하였다. 포획된 파지 입자는 표적 세포를 200 ㎕의 산 용리 완충액(0.1 N HCl, 글리신으로 pH 2.2로 조정됨, + 1 ㎍/㎖ BSA)에 재부유시켜 용리하였다. 25℃에서 10분 배양이후, 완충액은 12 ㎕의 2M Tris 염기, pH 10.5로 중화시키고, 용리된 파지는 차기 패닝을 위하여 대장균(E. coli)에서 증폭시켰다. 각 라운드의 패닝에서, 입력과 출력 파지 역가를 결정하였다. 입력 역가는 표적 세포/흡수체 세포 혼합물에 첨가된 재증폭 파지 입자의 총수이고, 출력 역가는 표적 세포로부터 용리된 포획 파지의 총수이다. 농축 인자(enrichment factor)(E)는 공식 E=(Rn 출력/Rn 입력)/(R1 출력/R1 입력)을 이용하여 계산한다. 대부부의 경우에, 102-103 배의 농축 인자가 3차 또는 4차 라운드에서 달성되었다.
패닝이후 농축된 항체 풀의 분석
3-5 라운드의 패닝이후, 포획된 파지의 풀은 유세포분석 및/또는 전체 세포 ELISA로 CLL 세포에 대한 결합을 분석하였다:
1. HA-표지된 가용성 항체 형태로 전체 풀을 생산하기 위하여, 대장균(E. coli)의 2 ㎖ 비-억제자 균주(가령, TOP1OF')는 1 ㎕(109-1010 cfu)의 파게미드 입자로 감염시켰다. 패닝되지 않은 최초 라이브러리는 음성 대조로 이용하였다. 카르베니실린(carbenicillin)을 10 μM의 최종 농도로 첨가하고, 배양액은 250 rpm으로 교반하면서 37℃에서 1시간동안 배양하였다. 50 ㎕/㎖ 카르베니실린을 함유하는 8 ㎖의 SB 배지를 첨가하고, 배양액은 ~0.8의 OD 600으로 성장시켰다. IPTG를 1 mM의 최종 농도로 첨가하여 Lac 프로모터로부터 scFv 발현을 유도하고 4시간동안 37℃에서 교반하였다. 배양액은 3000xg에서 15'동안 원심분리하였다. 가용성 항체를 함유하는 상층액은 여과하고 1 ㎖ 분량으로 -20℃에 보관하였다.
2. 표적 세포 vs. 흡착제 세포에 대한 scFv 항체 풀의 결합은 고친화성 Rat Anti-HA(클론 3F10, Roche Molecular Biochemicals)를 2차 항체로 이용하고 PE-공액된 Donkey Anti-Rat을 3차 항체로 이용하는 유세포분석으로 결정하였다.
3. 표적 세포 vs. 흡착제 세포에 대한 상기 항체 풀의 결합은 아래에 기술한 바와 같이 전체 세포 ELISA로도 결정하였다.
패닝이후 개별 scFv 클론의 선별
패닝이후 개별 scFv 클론을 선별하기 위하여, TOP10F' 세포는 상기한 바와 같이 파지 풀로 감염시키고 카르베니실린과 테트라사이클린을 함유하는 LB 평판에 도말하며 37℃에서 하룻밤동안 배양하였다. 개별 콜로니는 웰당 0.6-1.0 ㎖의 SB-카르베니실린 배지를 함유하는 깊은 96-웰 평판에 접종하였다. 배양액은 520 rpm의 HiGro 교반 배양기(GeneMachines, San Carlos, CA)에서 37℃에서 6-8시간동안 성장시켰다. 이 시점에서, 각 웰로부터 90 ㎕ 분량은 10 ㎕ DMSO를 함유하는 깊은 96-웰 평판에 이전하였다. 이런 복제 평판은 -80℃에서 보관하였다. IPTG를 1 mM 최종 농도로 최초 평판에 첨가하고, 3시간동안 교반하였다. 이들 평판은 3000xg에서 15분동안 원심분리하였다. 가용성 scFv 항체를 함유하는 상층액은 다른 깊은 96-웰 평판에 이전하고 -20℃에서 보관하였다.
HA-표지된 scFv 항체를 선별하는 민감한 전체-세포 ELISA를 개발하였다:
1. ELISA 평판은 콘카나발린 A(0.1 M NaHCO3, pH8.6에서 10 ㎎/㎖, 0.1 mM CaCl2)로 코팅한다.
2. 상기 평판은 PBS로 세척한 이후, 50 ㎕의 PBS에 담긴 0.5-1x105 표적 세포 또는 흡착제 세포를 각 웰에 첨가하고, 250xg에서 10분동안 원심분리한다.
3. PBS에 녹인 50 ㎕의 0.02% 글루타르알데하이드를 첨가하고, 세포는 4℃에서 하룻밤동안 고정시킨다.
4. PBS로 세척한 이후, 비-특이적 결합 부위는 4% 무지방 분유를 함유하는 PBS로 실온에서 3시간동안 차단한다.
5. 이들 세포는 50 ㎕의 가용성 HA-표지된 scFv 또는 Fab 항체(TOP10F' 상층액)과 함께 실온에서 2시간동안 배양하고, 이후 PBS로 6회 세척하였다.
6. 결합된 항체는 Mouse Anti-HA 2차 항체(클론 12CA5) 및 알칼리성 포스파타아제(AP)-공액된 Anti-Mouse IgG 3차 항체를 이용하여 검출한다. AMDEX AP-공액된 Sheep Anti-Mouse IgG(Amersham Pharmacia Biotech)를 3차 항체로 이용하면 신호의 대략 10배 증폭이 달성된다. AMDEX 항체는 덱스트란 골격을 통하여 복수의 AP 분자에 공액된다. 색깔은 알칼리성 포스파타아제 기질 PNPP로 전개시키고, 마이크로평판 판독기를 이용하여 405nm에서 측정한다.
scFv 클론의 일차 선별은 일차 CLL 세포 vs. 정상적인 인간 PBMC에서 ELISA로 수행하였다. CLL 세포에 양성이고 정상적인 PBMC에 음성인 클론은 정상적인 인간 B 세포, 인간 B 세포주, TF-1 세포, CLL-AAT 세포주에서 ELISA로 재선별하였다. 또한, 이들 클론은 3명의 상이한 환자로부터 분리된 CLL 세포에서 ELISA로 재선별하여 환자-특이적 또는 혈액형-특이적 항원을 인식하는 클론을 제거하였다. 대표 ELISA로부터 결과는 도 2-6에 도시하고 도 9a-c에 요약한다.
수득된 독특한 scFv 항체의 총수는 DNA 핑거프린팅(fingerprinting)과 염기서열분석(sequencing)으로 결정하였다. scFv DNA 삽입체는 PCR로 플라스미드로부터 증폭하고 제한 효소 BstNI으로 절단하였다. 생성된 단편은 4% 아가로오스 겔에서 분리하고 브롬화에티듐로 염색하였다. 서로 다른 제한 단편 패턴을 갖는 클론은 상이한 아미노산 서열을 보유하게 된다. 동일한 패턴을 갖는 클론은 유사하거나 동일한 서열을 보유한다. 독특한 BstNI 핑거프린트(fingerprint)를 갖는 클론은 DNA 염기서열분석으로 더욱 분석하였다. 25개의 상이한 서열이 발견되었는데, 이들은 밀접하게 관련된 상보성 결정 영역으로 16개 항체군으로 집합시켰다(도 9a-c).
유세포분석에 의한 scFv 항체의 특성화
여러 scFv 항체의 결합 특이성은 삼색 유세포분석법으로 분석하였다(도 7). 정상 공여자로부터 분리된 PBMC는 FITC-공액된 항-CD5와 PerCP-공액된 항-CD19로 염색하였다. scFv 항체 염색은 2차 항체로서 비오틴-공액된 항-HA 및 PE-공액된 스트렙타비딘을 이용하여 수행하였다. 3가지 항체, scFv-2, scFv-3, scFv-6은 CD19+ B 림프구 집단을 특이적으로 인식하는 것으로 밝혀졌다(데이터 제시하지 않음). 4번째 항체, scFv-9는 2가지 상이한 세포 집단: CD19+ B 림프구와 CD5+ T 림프구의 아형(subset)을 인식하였다(도 7). 상기 T 세포 아형의 추가적인 특성화에서 CD4+CD8- TH 세포의 부집단이 확인되었다(데이터 제시하지 않음).
scFv 항체에 의해 인식되는 항원이 일차 CLL 세포에서 과다-발현되는 지를 결정하기 위하여, 5명의 CLL 환자 및 5명의 정상 공여자로부터 얻은 PBMC를 scFv로 염색하고 유세포분석으로 비교하였다(도 8과 표 2). 양성 세포 집단의 평균 형광 강도를 비교함으로써, CLL 세포 vs. 정상 세포에서 항원의 상대적 발현 수준을 결정할 수 있었다. scFv-2 항체는 정상 PBMC보다 CLL 세포를 낮은 강도로 염색한 반면, scFv-3과 scFv-6 모두 정상 PBMC보다 CLL 세포를 더욱 밝게 염색하였다. 4번째 항체, scFv-9는 5개의 CLL 샘플 중에서 2개 샘플을 정상 PBMC보다 훨씬 강하게 염색하긴 했지만, 다른 3개의 CLL 샘플에 대해서는 다소 밝은 염색을 제공하였다(도 8과 표 2). 이는 scFv-3과 scFv-6에 대한 항원이 상당수의 CLL 종양에서 대략 2배로 과다-발현되는 반면, scFv-9가 CLL 종양의 아형에서 3 내지 6배로 과다-발현된다는 것을 암시한다.
CLL 환자는 2개의 거의 동등한 군으로 분할될 수 있다: 예후가 불량한 군(8년의 평균 생존 기간) 및 예후가 우수한 군(26년의 평균 생존 기간). CLL에서 여러 불량한 예후적 지표가 확인되었는데, 가장 주목되는 대상은 체세포 돌연변이(somatic mutation)가 부재하는 VH 유전자의 존재 및 높은 비율의 CD38+ B 세포의 존재이다. scFv-9가 CLL 환자의 아형에서만 과다-발현되는 항원을 인식하기 때문에, scFv-9 항원 과다-발현이 10명의 CLL 환자로부터 얻은 혈액 샘플에서 CD38+ 세포의 비율과 상관하는 지를 결정하고자 하였다(도 11). 이의 결과는 scFv-9 항원 과다-발현과 CD38+ 세포 비율이 서로 완전히 독립된다는 것을 암시한다.
면역침전검사(IP)와 질량 분광분석(MS)으로 scFv 항체에 의해 인식되는 항원의 확인
이들 항체에 대한 항원을 확인하기 위하여, scFv를 이용하여 세포-표면 비오틴화된 CLL-AAT 세포의 마이크로솜 분획물로부터 준비된 용해질로부터 항원을 면역침전시켰다(도 12). 면역침전된 항원은 SDS-PAGE로 정제하고 매트릭스 지원 레이저 이탈 이온화 비행시간형 질량 분광법(matrix assisted laser desorption ionization mass spectrometry)(MALDI-MS) 또는 마이크로모세관 역상 HPLC 나노-전기분무 직열 질량 분광법(microcapillary reverse-phase HPLC nano-electrospray tandem mass spectrometry)(μLC/MS/MS)으로 확인하였다(데이터 제시하지 않음). ScFv-2는 RL과 CLL-ALT 세포 모두로부터 110 kd 항원을 면역침전시켰다(도 12). 상기 항원은 MALDI-MS에 의해, B 세포-특이적 마커 CD19로 확인되었다. ScFv-3과 scFv-6 모두 CLL-AAT 세포로부터 45 kd 항원을 면역침전시켰다. 상기 항원은 MALDI-MS에 의해, CLL과 활성화된 B 세포에 대한 공지된 마커인 CD23으로 확인되었다. ScFv-9는 CLL-AAT 세포로부터 50 kd 항원을 면역침전시켰다(도 12). 상기 항원은 μLC/MS/MS에서, B 세포, 활성화된 CD4+ T 세포, 흉선세포(thymocyte)에 대한 공지된 마커인 OX-2/CD200으로 확인되었다. OX-2/CD200은 일부 비-림프성 세포, 예를 들면, 신경과 내피 세포에서도 발현된다.
실시예 3
사이토킨 반응을 Th1 반응(IL-2, IFN-γ)에서 Th2 반응(IL-4, IL-10)으로 전환시키는 OX-2/CD200을 과다-발현하는 세포의 능력은 1명의 공여자로부터 얻은 단핵구-유래된 대식세포/수상돌기 세포 및 다른 공여자로부터 얻은 혈액-유래된 T 세포를 이용한 혼성 림프구 반응물에서 사정하였다. OX-2/CD200-발현 세포의 공급원으로서, 아래에 기술된 바와 같은 OX-2/CD200 트랜스펙션된 EBNA 세포 또는 CLL 환자 샘플을 이용하였다.
293-EBNA 세포의 트랜스펙션
293-EBNA 세포(Invitrogen)는 100 ㎜ 접시당 2.5x106개로 접종하였다. 24시간후, 이들 세포는 제조업자의 지시에 따라, Polyfect 시약(QIAGEN)을 이용하여 일시적으로 트랜스펙션시켰다. 세포는 벡터 pCEP4(Invitrogen)에 실린 7.2 ㎍의 OX-2/CD200 cDNA 및 0.8 ㎍의 pAdVAntage 벡터(Promega)로 동시 트랜스펙션시켰다. 음성 대조로서 세포는 빈 pCEP4 벡터 + pAdVAntage로 동시 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션 48시간후, 대략 90%의 세포가 scFv-9 항체를 이용한 유세포분석에서, 표면에 OX-2/CD200을 발현하였다.
혈액 단핵구로부터 수상돌기 세포/대식세포의 성숙
연막층(buffy coat)은 San Diego Blood Bank로부터 입수하고, 일차 혈액 림프구(PBL)는 Ficoll을 이용하여 분리하였다. 세포는 2% 인간 혈청을 함유하는 EMEM(Eagles Minimal Essential Medium)에서 1시간동안 부착시키고, 이후 PBS로 활발하게 세척하였다. 세포는 3일후 지질다당류(LPS)를 첨가하거나 첨가하지 않고 GM-CSF, IL-4, IFN-γ 또는 M-CSF의 존재하에 5일동안 배양하였다. 성숙된 세포는 수거하고 γ-조사기(Shepherd Mark I Model 30 조사기(Cs137))를 이용하여 2000 RAD에서 조사(irradiation)하였다.
혼성 림프구 반응물
혼성 림프구 반응물은 500,000개 수상돌기 세포/대식세포 및 1x106 반응자 세포를 이용하여 24 웰 평판에 배치하였다. 반응자 세포는 Ficoll을 이용하여 말초혈로부터 정제된 T 세포 농축된 림프구이었다. T 세포는 이들 세포를 조직 배양 플라스크에서 1시간동안 배양하고 비-부착성 세포 분획물을 채취하여 농축시켰다. 500,000개 OX-2/CD200 트랜스펙션된 EDNA 세포 또는 CLL 세포는 림프구 첨가 2-4시간 전에 30 ㎍/㎖ 항-CD200 항체(완전 IgG로 전환된 scFv-9)의 존부하에 대식세포/수상돌기 세포에 첨가하였다. 상층액은 48시간과 68시간후에 수거하고 사이토킨의 존재를 분석하였다.
scFv-9의 완전 IgG로의 전환
scFv-9의 경쇄와 중쇄 V 유전자는 각 유전자의 가변 영역을 각각 인간 람다 경쇄 불변 영역 유전자 및 인간 IgG1 중쇄 불변 영역 CH1 유전자와 연결하는 프라이머를 이용한 중복 PCR로 증폭하였다. scFv-9의 경쇄 유전자와 중쇄 유전자의 가변 영역은 특정 프라이머로 증폭하고, 인간 람다 경쇄 불변 영역 유전자와 IgG1 중쇄 불변 영역 CH1 유전자는 아래의 특정 프라이머로 개별적으로 증폭하였다:
R9VL-F1 QP: 5' GGC CTC TAG ACA GCC TGT GCT GAC TCA GTC GCC CTC 3'(SEQ ID NO 103);
R9VL/hCL2-rev: 5' CGA GGG GGC AGC CTT GGG CTG ACC TGT GAC GGT CAG CTG GGT C 3'(SEQ ID NO 104);
R9VL/hCL2-F: 5' GAC CCA GCT GAC CGT CAC AGG TCA GCC CAA GGC TGC CCC CTC G 3'(SEQ ID NO 105);
R9VH-F1: 5' TCT AAT CTC GAG CAG CAG CAG CTG ATG GAG TCC G 3'(SEQ ID NO 106);
R9VH/hCG-rev: 5' GAC CGA TGG GCC CTT GGT GGA GGC TGA GGA GAC GGT GAC CAG GGT GC 3'(SEQ ID N0 107);
R9VH/hCG-F: 5' GCA CCC TGG TCA CCG TCT CCT CAG CCT CCA CCA AGG GCC CAT CGG TC 3'(SEQ ID N0 108);
hCL2-rev: 5' CCA CTG TCA GAG CTC CCG GGT AGA ACT C 3'(SEQ ID NO 109);
hCG-rev: 5' GTC ACC GGT TCG GGG AAG TAG TC 3'(SEQ ID NO 110).
증폭 산물은 정제하고 중복 PCR을 수행하였다
최종 산물은 Xba I/Sac I(경쇄) 및 Xho I/Pin AI(중쇄)으로 절단하고 인간 Fab 발현 벡터, PAX243hGL에 클론하였다. DNA 클론은 DNA 염기서열분석으로 PCR 오류를 분석하였다. hCMV IE 프로모터 유전자를 Not I/ Xho I 부위(중쇄 앞쪽)에 삽입하였다. 상기 벡터는 Xba I/Pin AI/EcoR I/Nhe I로 절단하고, 경쇄 + hCMV IE 프로모터 및 중쇄 유전자를 보유하는 3472 bp 단편은 Xba I/Pin AI 부위에서 IgG1 발현 벡터로 이전하였다.
사이토킨 분석
혼성 림프구 반응물에서 사이토킨 프로필에 대한 완전 IgG로 전환된 scFv-9의 효과를 검사하였다.
조직 배양 상층액에서 발견된 사이토킨, 예를 들면, IL-2, IFN-γ, IL-4, IL-10, IL-6은 ELISA를 이용하여 정량하였다. 각 사이토킨에 대한 대응된 포획과 검출 항체 쌍은 R+D Systems(Minneapolis, MN)로부터 구입하고, 각 사이토킨에 대한 표준 곡선은 재조합 인간 사이토킨을 이용하여 작성하였다. 항-사이토킨 포획 항체는 최적 농도로 PBS에서 평판에 코팅하였다. 하룻밤동안 배양한 이후, 평판은 세척하고 1% BSA와 5% 자당을 함유하는 PBS로 1시간동안 차단하였다. 0.05% Tween을 함유하는 PBS로 3회 세척이후, 상층액은 1% BSA를 함유하는 PBS에 2배 또는 10배 희석하여 첨가하였다. 포획된 사이토킨은 적절한 비오틴화된 항-사이토킨 항체로 검출하고, 이후 알칼리성 포스파타아제 공액된 스트렙타비딘과 SigmaS 기질을 첨가하였다. 색깔 전개는 ELISA 평판 판독기(Molecular Devices)로 사정하였다.
도 14에 도시된 바와 같이, OX-2/CD200 트랜스펙션된 세포의 존재는 Th1 사이토킨, 예를 들면, IL-2와 IFN-γ의 하향-조절을 결과하였다. 30 ㎍/㎖로 항-CD200 항체의 첨가는 Th1 반응을 완전히 복원하였는데, 이는 상기 항체가 OX-2/CD200과 이의 수용체간의 상호작용을 차단한다는 것을 암시한다.
도 15와 16에 도시된 바와 같이, 혼성 림프구 반응물에서 CLL 세포의 존재는 Th1 반응의 하향-조절을 결과하였다(도 15에서는 IL-2에 대한 결과를 도시한다; 도 16에서는 IFN-γ에 대한 결과를 도시한다). 이는 OX-2/CD200을 과다-발현하는 세포(IB, EM, HS, BH)뿐만 아니라 OX-2/CD200을 과다-발현하지 않는 CLL 세포(JR, JG, GB)에도 적용되었다(이들 세포에 대한 발현 수준은 도 11에 도시한다). 하지만, 항-CD200 항체는 OX-2/CD200을 과다-발현하는 세포에서만 Th1 반응을 복원하였는데, 이는 OX-2/CD200을 과다-발현하는 환자에서, 대식세포에서 OX-2/CD200과 이의 수용체간 상호작용을 제거하면 Th1 반응이 충분히 복원된다는 것을 암시한다. OX-2/CD200을 과다-발현하지 않는 환자에서 Th1 반응의 하향-조절에는 다른 기전이 관여하는 것으로 생각되었다.
종양 거부반응에 대한 항-CD200의 효과를 검사하는 동물 모델
RAJI 림프종 종양 성장이 PBL의 동시 주입에 의해 예방되는 모델을 확립하였다. NOD/SCID 생쥐는 1x106, 5X106 또는 10X106개 세포로 서로 다른 공여자로부터 얻은 인간 PBL의 존부하에 4X106 RAJI 세포를 피하 주입하였다. 종양 길이와 너비 및 체량은 주 3회 측정하였다. 모든 군에 대한 종양 체적의 평균 +/-SD는 도 17a와 b에 도시한다. 통계학적 분석은 2가지 모수 검정(스튜던트 t-검정과 웰치 검정(Welch's test)) 및 1가지 비-모수 검정(윌콕스 검정(Wilcox test))을 이용하여 수행하였다. 통계학적 분석의 결과는 도 18에 도시한다. 거부 반응은 특정 공여자 및 PBL 세포 총수에 좌우된다. 1X106 PBL은 종양 성장을 예방하는데 불충분하였다. 22일부터 43일까지 5X106 PBL에서 공여자 2 및 36일부터 시작하여 5x106 또는 1x107에서 공여자 3은 종양 성장을 유의하게 감소시켰다. 공여자 4는 48일후 유의성에 매우 근접하였다.
항-CD200의 효과를 검사하기 위하여, RAJI 세포는 CD200으로 안정적으로 트랜스펙션시켰다. 동물은 상기한 바와 같이 처리하였다. CD200-트랜스펙션된 세포의 존재하에, 종양은 인간 PBL의 존재하에서도 성장하였다. 항-CD200 항체를 투여하여 상기 모델에서 종양 거부 반응을 평가하였다.
또한, 액형 종양 모델을 확립하였다. RAJI 세포는 NOD/SCID 생쥐의 복강내 주입하였다. 이들 세포는 골수, 비장, 림프절, 다른 기관으로 확산되어 마비를 유발하였다. 인간 PBL의 동시 주입은 종양 성장을 예방하거나 지연시켰다. 종양 성장은 생쥐에서 움직임 손상과 마비의 징후를 사정하여 모니터하였다. 이들 징후가 관찰되면, 생쥐는 희생시키고 골수, 비장, 림프절, 혈액을 비롯한 여러 장기에서 FACS 분석과 PCR로 종양 세포의 총수를 사정하였다.
피하 모델과 유사하게, CD200 트랜스펙션된 세포는 복강내 주입하였다. 이들은 인간 PBL의 존재하에서도 성장하였다. 항-CD200 처리는 종양 거부 반응 또는 느려진 종양 성장을 결과하였다.
참고문헌
아래의 참고문헌은 본원에 순전히 참조로 한다. 참고문헌에 기술된 내용 중에서 본원에 기술된 내용과 상충되는 부분은 본원을 우선한다.
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본원에 개시된 구체예에 대한 다양한 개변이 가능하다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 본원에 기술된 특정 서열은 OX-2/CD200 결합에 이용되는 폴리펩티드, 항체 또는 항체 단편의 기능에 부정적인 영향을 주지 않으면서 다소 변형될 수 있다. 가령, 항체 또는 항체 단편의 기능을 파괴하지 않는 항체 서열에서 단일 또는 복수 아미노산의 치환이 빈번하게 수행될 수 있다. 따라서, 본원에 기술된 특정 항체에 70% 이상의 상동성을 보유하는 폴리펩티드 또는 항체는 본 발명의 범위에 속한다. 바람직한 구체예에서, 본원에 기술된 특정 항체에 80% 이상의 상동성을 보유하는 항체를 고려한다. 다른 바람직한 구체예에서, 본원에 기술된 특정 항체에 90% 이상의 상동성을 보유하는 항체를 고려한다. 이런 이유로, 상기한 상세는 바람직한 구체예의 예시일 뿐이며 본 발명을 한정하지 않는다. 본 발명의 기술적 사상과 범위를 벗어나지 않는 다른 개변 역시 본 발명에 속한다.
SEQUENCE LISTING <110> Alexion Pharmaceuticals, Inc. Bowdish, Katherine S. McWhirter, John Kretz-Rommel, Anke <120> POLYPEPTIDES AND ANTIBODIES DERIVED FROM CHRONIC LYMPHOCYTIC LEUKEMIA CELLS AND USES THEREOF <130> 60 CIP III (1087-60 CIP III) <140> 10/894,672 <141> 2004-07-20 <150> US 10/736,188 <151> 2003-12-15 <150> US 10/379,151 <151> 2003-03-04 <150> PCT/US01/47931 <151> 2001-12-10 <150> US 60/254,113 <151> 2000-12-08 <160> 110 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 14 <212> PRT <213> rabbit <400> 1 Thr Leu Ser Thr Gly Tyr Ser Val Gly Ser Tyr Val Ile Ala 1 5 10 <210> 2 <211> 11 <212> PRT <213> rabbit <400> 2 Gln Ala Ser Glu Ser Ile Arg Asn Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> rabbit <400> 3 Gln Ala Ser Glu Ser Ile Ser Asn Trp Leu Ala 1 5 10 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> rabbit <400> 4 Gln Ala Ser Glu Ser Ile Ser Asn Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 5 <211> 11 <212> PRT <213> rabbit <400> 5 Gln Ala Ser Gln Asn Ile Tyr Ser Asn Leu Ala 1 5 10 <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> rabbit <400> 6 Gln Ala Ser Gln Ser Val Asn Asn Leu Leu Ala 1 5 10 <210> 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Ser Ser Phe His Val Val 1 5 10 <210> 38 <211> 13 <212> PRT <213> rabbit <400> 38 Ala Thr Gly His Gly Ser Gly Ser Ser Ala Gly Val Val 1 5 10 <210> 39 <211> 12 <212> PRT <213> rabbit <400> 39 Leu Gly Gly Tyr Pro Tyr Ser Ser Thr Gly Thr Ala 1 5 10 <210> 40 <211> 11 <212> PRT <213> rabbit <400> 40 Gln Ser Gly Trp Tyr Ser Ala Gly Ala Leu Thr 1 5 10 <210> 41 <211> 11 <212> PRT <213> rabbit <400> 41 Gln Ser Gly Tyr Tyr Arg Ala Gly Asp Leu Thr 1 5 10 <210> 42 <211> 11 <212> PRT <213> rabbit <400> 42 Gln Ser Gly Tyr Tyr Ser Ala Gly Ala Leu Thr 1 5 10 <210> 43 <211> 10 <212> PRT <213> rabbit <400> 43 Gln Ser Asn Ala Trp Ser Val Gly Met Thr 1 5 10 <210> 44 <211> 10 <212> PRT <213> rabbit <400> 44 Ala Ala Gln Tyr Ser Gly Asn Ile Tyr Thr 1 5 10 <210> 45 <211> 5 <212> PRT <213> rabbit <400> 45 Asn Tyr Ala Met Thr 1 5 <210> 46 <211> 5 <212> PRT <213> rabbit <400> 46 Ser Tyr Gly Leu Ser 1 5 <210> 47 <211> 5 <212> PRT <213> rabbit <400> 47 Thr Tyr Gly Val Ser 1 5 <210> 48 <211> 5 <212> PRT <213> rabbit 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6 <212> PRT <213> rabbit <400> 62 Ser Ser Tyr Trp Ile Cys 1 5 <210> 63 <211> 5 <212> PRT <213> rabbit <400> 63 Asn Tyr Gly Val Asn 1 5 <210> 64 <211> 15 <212> PRT <213> rabbit <400> 64 Ile Ile Ser Ser Asn Gly Gly Ala Asp Tyr Ala Ser Trp Ala Lys 1 5 10 15 <210> 65 <211> 16 <212> PRT <213> rabbit <400> 65 Tyr Phe Asp Pro Val Phe Gly Asn Ile Tyr Tyr Ala Thr Trp Val Asp 1 5 10 15 <210> 66 <211> 16 <212> PRT <213> rabbit <400> 66 Tyr Asn Asp Pro Ile Phe Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Thr Trp Val Asn 1 5 10 15 <210> 67 <211> 15 <212> PRT <213> rabbit <400> 67 Ile Ile Ser Ser Ser Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys 1 5 10 15 <210> 68 <211> 15 <212> PRT <213> rabbit <400> 68 Ile Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys 1 5 10 15 <210> 69 <211> 17 <212> PRT <213> rabbit <400> 69 Cys Ile Tyr Thr Gly Ser Ser Ser Ser Thr Trp Tyr Ala Ser Trp Ala 1 5 10 15 Lys <210> 70 <211> 16 <212> PRT <213> rabbit <400> 70 Tyr Ile Tyr Thr Gly Asp Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Ser Trp Val Asn 1 5 10 15 <210> 71 <211> 15 <212> PRT <213> rabbit <400> 71 Ser Ile Tyr Ala Ser Arg Ser Pro Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys 1 5 10 15 <210> 72 <211> 15 <212> PRT <213> rabbit <400> 72 Thr Ile Ile Tyr Gly Asp Asn Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys 1 5 10 15 <210> 73 <211> 17 <212> PRT <213> rabbit <400> 73 Val Val Tyr Ala Gly Thr Arg Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asn Trp Ala 1 5 10 15 Lys <210> 74 <211> 16 <212> PRT <213> rabbit <400> 74 Tyr Ile Asp Pro Asp Tyr Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Val Asn 1 5 10 15 <210> 75 <211> 15 <212> PRT <213> rabbit <400> 75 Ile Thr Tyr Pro Ser Gly Asn Val Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys 1 5 10 15 <210> 76 <211> 15 <212> PRT <213> rabbit <400> 76 Tyr Ser Ser Tyr Gly Asn Asn Ala His Tyr Thr Asn Trp Ala Lys 1 5 10 15 <210> 77 <211> 15 <212> PRT <213> rabbit <400> 77 Ile Ile Ile Gly Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asn Trp Ala Lys 1 5 10 15 <210> 78 <211> 15 <212> PRT <213> rabbit <400> 78 Ile Ile Ser Ser Ser Gly Thr Ser Tyr Tyr Ala Thr Trp Ala Lys 1 5 10 15 <210> 79 <211> 15 <212> PRT <213> rabbit <400> 79 Ile Ile Ser Ser Ser Gly Ser Ala Tyr Tyr Ala Thr Trp Ala Lys 1 5 10 15 <210> 80 <211> 15 <212> PRT <213> rabbit <400> 80 Ile Ile Val Gly Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Trp Ala Lys 1 5 10 15 <210> 81 <211> 15 <212> PRT <213> rabbit <400> 81 Thr Ile Thr Tyr Gly Thr Asn Ala Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys 1 5 10 15 <210> 82 <211> 17 <212> PRT <213> rabbit <400> 82 Cys Ile Tyr Thr Gly Ser Asn Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala 1 5 10 15 Lys <210> 83 <211> 16 <212> PRT <213> rabbit <400> 83 Tyr Ile Asp Pro Val Phe Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Val Asn 1 5 10 15 <210> 84 <211> 17 <212> PRT <213> rabbit <400> 84 Asp Asp Glu Gly Tyr Asp Asp Tyr Gly Asp Tyr Met Gly Tyr Phe Thr 1 5 10 15 Leu <210> 85 <211> 14 <212> PRT <213> rabbit <400> 85 Asp Arg Ile Tyr Val Ser Ser Val Gly Tyr Ala Phe Asn Leu 1 5 10 <210> 86 <211> 14 <212> PRT <213> rabbit <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(14) <223> Xaa = is an unknown amino acid <400> 86 Asp Arg Ala Tyr Ala Ser Ser Ser Gly Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 <210> 87 <211> 13 <212> PRT <213> rabbit <400> 87 Asp Trp Ile Ala Ala Gly Lys Ser Tyr Gly Leu Asp Leu 1 5 10 <210> 88 <211> 9 <212> PRT <213> rabbit <400> 88 Arg Tyr Thr Gly Asp Asn Gly Asn Leu 1 5 <210> 89 <211> 13 <212> PRT <213> rabbit <400> 89 Asp Ala Ala Tyr Ala Gly Tyr Gly Trp Ile Phe Asn Leu 1 5 10 <210> 90 <211> 11 <212> PRT <213> rabbit <400> 90 Gly Asp Ala Gly Ser Ile Pro Tyr Phe Lys Leu 1 5 10 <210> 91 <211> 7 <212> PRT <213> rabbit <400> 91 Gly Asn Val Phe Ser Asp Leu 1 5 <210> 92 <211> 7 <212> PRT <213> rabbit <400> 92 Gly Leu Thr Tyr Tyr Pro Leu 1 5 <210> 93 <211> 12 <212> PRT <213> rabbit <400> 93 Gly Ala Tyr Ser Gly Tyr Pro Ser Tyr Phe Asn Leu 1 5 10 <210> 94 <211> 5 <212> PRT <213> rabbit <400> 94 Gly Phe Phe Asn Leu 1 5 <210> 95 <211> 7 <212> PRT <213> rabbit <400> 95 Gly Asn Ala Tyr Ser Asp Leu 1 5 <210> 96 <211> 22 <212> PRT <213> rabbit <400> 96 Asp Gln Pro Ile Ile Tyr Gly Ala Tyr Gly Asp Tyr Gly Leu Ala Thr 1 5 10 15 Gly Thr Arg Leu Asp Leu 20 <210> 97 <211> 22 <212> PRT <213> rabbit <400> 97 Asp Gln Pro Ile Ile Asp Ala Ala Tyr Gly Asp Tyr Gly Ile Ala Thr 1 5 10 15 Gly Thr Arg Leu Asp Leu 20 <210> 98 <211> 22 <212> PRT <213> rabbit <400> 98 Asp Gln Pro Ile Ile Thr Thr Asp Tyr Gly Gly Tyr Gly Ile Ala Thr 1 5 10 15 Gly Thr Arg Leu Asp Leu 20 <210> 99 <211> 19 <212> PRT <213> rabbit <400> 99 Asp Gln Pro Ile Thr Tyr Ala Gly Tyr Gly Tyr Ala Thr Gly Thr Arg 1 5 10 15 Leu Asp Leu <210> 100 <211> 7 <212> PRT <213> rabbit <400> 100 Gly Asn Thr Tyr Ser Asp Leu 1 5 <210> 101 <211> 13 <212> PRT <213> rabbit <400> 101 Ala Tyr Ile Tyr Tyr Gly Gly Tyr Gly Phe Phe Asp Leu 1 5 10 <210> 102 <211> 10 <212> PRT <213> rabbit <400> 102 Glu Ala Ser Phe Tyr Tyr Gly Met Asp Leu 1 5 10 <210> 103 <211> 36 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 103 ggcctctaga cagcctgtgc tgactcagtc gccctc 36 <210> 104 <211> 43 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 104 cgagggggca gccttgggct gacctgtgac ggtcagctgg gtc 43 <210> 105 <211> 43 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 105 gacccagctg accgtcacag gtcagcccaa ggctgccccc tcg 43 <210> 106 <211> 34 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 106 tctaatctcg agcagcagca gctgatggag tccg 34 <210> 107 <211> 47 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 107 gaccgatggg cccttggtgg aggctgagga gacggtgacc agggtgc 47 <210> 108 <211> 47 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 108 gcaccctggt caccgtctcc tcagcctcca ccaagggccc atcggtc 47 <210> 109 <211> 28 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 109 ccactgtcag agctcccggg tagaagtc 28 <210> 110 <211> 23 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 110 gtcaccggtt cggggaagta gtc 23

Claims (51)

  1. 개체에서 OX-2/CD200이 상향조절되는 지를 결정하고,
    OX-2/CD200 또는 OX-2/CD200 수용체에 결합하는 폴리펩티드를 상기 개체에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 폴리펩티드의 투여 단계는 OX-2/CD200에 결합하는 항체를 개체에 투여하는 과정을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 폴리펩티드의 투여 단계는 OX-2/CD200에 결합하는 단클론 항체를 개체에 투여하는 과정을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 폴리펩티드의 투여 단계는 OX-2/CD200 수용체에 결합하는 항체를 개체에 투여하는 과정을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 폴리펩티드의 투여 단계는 OX-2/CD200 수용체에 결합하는 단클론 항체를 개체에 투여하는 과정을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 폴리펩티드의 투여 단계는 아래에서 선택되는 한가지이상의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 개체에 투여하는 과정을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법: SEQ. ID. NO:1, SEQ. ID. NO:2, SEQ. ID. NO:3, SEQ. ID. NO:4, SEQ. ID. NO:5, SEQ. ID. NO:6, SEQ. ID. NO:7, SEQ. ID. NO:8, SEQ. ID. NO:9, SEQ. ID. NO:10, SEQ. ID. NO:11, SEQ. ID. NO:12, SEQ. ID. NO:13, SEQ. ID. NO:14, SEQ. ID. NO:15, SEQ. ID. NO:16, SEQ. ID. NO:17, SEQ. ID. NO:18, SEQ. ID. NO:19, SEQ. ID. NO:20, SEQ. ID. NO:21, SEQ. ID. NO:22, SEQ. ID. NO:23, SEQ. ID. NO:24, SEQ. ID. NO:25.
  7. OX-2/CD200이 상향조절되는 질병 상태를 치료하는 방법에 있어서, OX-2/CD200이 상향조절되는 질병 상태로 고생하는 환자에게 OX-2/CD200 또는 OX-2/CD200 수용체에 결합하는 폴리펩티드를 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 폴리펩티드의 투여 단계는 OX-2/CD200에 결합하는 항체를 개체에 투여하는 과정을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 7 항에 있어서, 폴리펩티드의 투여 단계는 OX-2/CD200에 결합하는 단클론 항체를 개체에 투여하는 과정을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 7 항에 있어서, 폴리펩티드의 투여 단계는 OX-2/CD200 수용체에 결합하는 항체를 개체에 투여하는 과정을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 7 항에 있어서, 폴리펩티드의 투여 단계는 OX-2/CD200 수용체에 결합하는 단클론 항체를 개체에 투여하는 과정을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 7 항에 있어서, 폴리펩티드의 투여 단계는 아래에서 선택되는 한가지이상의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 개체에 투여하는 과정을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법: SEQ. ID. NO:1, SEQ. ID. NO:2, SEQ. ID. NO:3, SEQ. ID. NO:4, SEQ. ID. NO:5, SEQ. ID. NO:6, SEQ. ID. NO:7, SEQ. ID. NO:8, SEQ. ID. NO:9, SEQ. ID. NO:10, SEQ. ID. NO:11, SEQ. ID. NO:12, SEQ. ID. NO:13, SEQ. ID. NO:14, SEQ. ID. NO:15, SEQ. ID. NO:16, SEQ. ID. NO:17, SEQ. ID. NO:18, SEQ. ID. NO:19, SEQ. ID. NO:20, SEQ. ID. NO:21, SEQ. ID. NO:22, SEQ. ID. NO:23, SEQ. ID. NO:24, SEQ. ID. NO:25.
  13. 암으로 고생하는 개체에서 OX-2/CD200이 상향조절되는 지를 결정하고,
    OX-2/CD200 또는 OX-2/CD200 수용체에 결합하는 폴리펩티드를 상기 개체에 투여하는 암의 치료 방법.
  14. 제 13 항에 있어서, 폴리펩티드의 투여 단계는 OX-2/CD200에 결합하는 항체를 개체에 투여하는 과정을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 13 항에 있어서, 폴리펩티드의 투여 단계는 OX-2/CD200에 결합하는 단클론 항체를 개체에 투여하는 과정을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 13 항에 있어서, 폴리펩티드의 투여 단계는 OX-2/CD200 수용체에 결합하는 항체를 개체에 투여하는 과정을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 13 항에 있어서, 폴리펩티드의 투여 단계는 OX-2/CD200 수용체에 결합하는 단클론 항체를 개체에 투여하는 과정을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 13 항에 있어서, 폴리펩티드의 투여 단계는 아래에서 선택되는 한가지이상의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 개체에 투여하는 과정을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법: SEQ. ID. NO:1, SEQ. ID. NO:2, SEQ. ID. NO:3, SEQ. ID. NO:4, SEQ. ID. NO:5, SEQ. ID. NO:6, SEQ. ID. NO:7, SEQ. ID. NO:8, SEQ. ID. NO:9, SEQ. ID. NO:10, SEQ. ID. NO:11, SEQ. ID. NO:12, SEQ. ID. NO:13, SEQ. ID. NO:14, SEQ. ID. NO:15, SEQ. ID. NO:16, SEQ. ID. NO:17, SEQ. ID. NO:18, SEQ. ID. NO:19, SEQ. ID. NO:20, SEQ. ID. NO:21, SEQ. ID. NO:22, SEQ. ID. NO:23, SEQ. ID. NO:24, SEQ. ID. NO:25.
  19. CLL로 고생하는 개체에서 OX-2/CD200이 상향조절되는 지를 결정하고,
    OX-2/CD200 또는 OX-2/CD200 수용체에 결합하는 폴리펩티드를 상기 개체에 투여하는 CLL의 치료 방법.
  20. 제 19 항에 있어서, 폴리펩티드의 투여 단계는 OX-2/CD200에 결합하는 항체를 개체에 투여하는 과정을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 19 항에 있어서, 폴리펩티드의 투여 단계는 OX-2/CD200에 결합하는 단클론 항체를 개체에 투여하는 과정을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 19 항에 있어서, 폴리펩티드의 투여 단계는 OX-2/CD200 수용체에 결합하는 항체를 개체에 투여하는 과정을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 19 항에 있어서, 폴리펩티드의 투여 단계는 OX-2/CD200 수용체에 결합하는 단클론 항체를 개체에 투여하는 과정을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 19 항에 있어서, 폴리펩티드의 투여 단계는 아래에서 선택되는 한가지이상의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 개체에 투여하는 과정을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법: SEQ. ID. NO:1, SEQ. ID. NO:2, SEQ. ID. NO:3, SEQ. ID. NO:4, SEQ. ID. NO:5, SEQ. ID. NO:6, SEQ. ID. NO:7, SEQ. ID. NO:8, SEQ. ID. NO:9, SEQ. ID. NO:10, SEQ. ID. NO:11, SEQ. ID. NO:12, SEQ. ID. NO:13, SEQ. ID. NO:14, SEQ. ID. NO:15, SEQ. ID. NO:16, SEQ. ID. NO:17, SEQ. ID. NO:18, SEQ. ID. NO:19, SEQ. ID. NO:20, SEQ. ID. NO:21, SEQ. ID. NO:22, SEQ. ID. NO:23, SEQ. ID. NO:24, SEQ. ID. NO:25.
  25. 항체가 결합하는 항원을 확인하는 방법에 있어서,
    CLL 환자로부터 수거된 조직을 이용하여 유래된 항체 라이브러리를 준비하고;
    상기 라이브러리의 하나이상의 구성원을 ATCC 수탁 No. PTA-3920으로 기탁된 세포주 CLL-AAT의 용해질과 접촉시키고;
    상기 라이브러리의 적어도 하나의 구성원에 결합된 항원을 특성화시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 25 항에 있어서, 라이브러리의 준비 단계는 CLL 세포, 또는 이의 일부로 생물체를 면역시키는 과정을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 25 항에 있어서, 라이브러리의 준비 단계는 CLL 세포 또는 세포주로 합성 항체 라이브러리를 패닝하는 과정을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 27 항에 있어서, 라이브러리는 라이브러리의 구성원을 분리하는 파지 전시에 의해 선별되는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제 27 항에 있어서, 라이브러리는 한명이상의 CLL 환자로부터 분리된 일차 CLL 세포로 패닝되는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제 25 항에 있어서, CLL 세포에서 상향조절되는 항원에 결합하는 항체 라이브러리의 구성원을 확인하는 단계가 추가로 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제 30 항에 있어서, 항체 라이브러리의 구성원은 OX-2/CD200에 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
  32. CLL 세포에 의해 상향조절되는 항원에 결합하는 항체.
  33. 제 32 항에 있어서, OX-2/CD200인 것을 특징으로 하는 항체.
  34. 제 32 항에 있어서, 아래에서 선택되는 서열과 적어도 70% 상동성을 보유하는 아미노산 서열을 보유하는 것을 특징으로 하는 항체: SEQ. ID. NO:1, SEQ. ID. NO:2, SEQ. ID. NO:3, SEQ. ID. NO:4, SEQ. ID. NO:5, SEQ. ID. NO:6, SEQ. ID. NO:7, SEQ. ID. NO:8, SEQ. ID. NO:9, SEQ. ID. NO:10, SEQ. ID. NO:11, SEQ. ID. NO:12, SEQ. ID. NO:13, SEQ. ID. NO:14, SEQ. ID. NO:15, SEQ. ID. NO:16, SEQ. ID. NO:17, SEQ. ID. NO:18, SEQ. ID. NO:19, SEQ. ID. NO:20, SEQ. ID. NO:21, SEQ. ID. NO:22, SEQ. ID. NO:23, SEQ. ID. NO:24, SEQ. ID. NO:25.
  35. 항체가 결합하는 항원을 확인하는 방법에 있어서,
    ATCC 수탁 No. PTA-3920으로 기탁된 세포주 CCL-AAT의 세포를 이용하여 유래된 항체 라이브러리를 준비하고;
    상기 라이브러리의 하나이상의 구성원을 CLL 환자로부터 수거된 조직으로부터 얻은 세포 용해질과 접촉시키고;
    상기 라이브러리의 적어도 하나의 구성원에 결합된 항원을 특성화시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 항체가 결합하는 항원을 확인하는 방법에 있어서,
    CLL 환자로부터 수거된 조직으로부터 얻은 CLL 세포의 적어도 일부로 생물체를 면역시키고;
    면역화에 대한 생물체의 면역 반응에 기초하여 항체 라이브러리를 산출하고;
    상기 라이브러리의 하나이상의 구성원을 CLL 세포와 접촉시키고;
    상기 라이브러리의 적어도 하나의 구성원에 결합된 항원을 특성화시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 제 36 항에 있어서, 라이브러리의 하나이상의 구성원을 CLL 세포와 접촉시키는 단계는 상기 라이브러리의 하나이상의 구성원을 CLL 환자로부터 수거된 조직으로부터 얻은 세포 용해질과 접촉시키는 과정을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  38. 항체가 결합하는 항원을 확인하는 방법에 있어서,
    CLL 세포의 적어도 일부로 생물체를 면역시키고;
    면역화에 대한 생물체의 면역 반응에 기초하여 항체 라이브러리를 산출하고;
    상기 라이브러리의 하나이상의 구성원을 ATCC 수탁 No. PTA-3920으로 기탁된 세포주 CCL-AAT의 용해질과 접촉시키고, 상기 라이브러리의 하나이상의 구성원을 CLL 세포와 접촉시키고;
    상기 라이브러리의 적어도 하나의 구성원에 결합된 항원을 특성화시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  39. 악성 종양 세포에 의해 상향조절되는 폴리펩티드의 대사 경로를 간섭하는 항체를 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료 방법.
  40. 제 39 항에 있어서, 항체는 상향조절된 폴리펩티드에 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
  41. 제 39 항에 있어서, 항체는 상향조절된 폴리펩티드가 상호작용하는 수용체에 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
  42. 제 39 항에 있어서, 항체는 폴리펩티드의 발현을 조절하는 항원에 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
  43. 제 39 항에 있어서, 폴리펩티드는 OX-2/CD200인 것을 특징으로 하는 방법.
  44. 제 39 항에 있어서, 항체는 아래에서 선택되는 서열과 적어도 70% 상동성을 보유하는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법: SEQ. ID. NO:1, SEQ. ID. NO:2, SEQ. ID. NO:3, SEQ. ID. NO:4, SEQ. ID. NO:5, SEQ. ID. NO:6, SEQ. ID. NO:7, SEQ. ID. NO:8, SEQ. ID. NO:9, SEQ. ID. NO:10, SEQ. ID. NO:11, SEQ. ID. NO:12, SEQ. ID. NO:13, SEQ. ID. NO:14, SEQ. ID. NO:15, SEQ. ID. NO:16, SEQ. ID. NO:17, SEQ. ID. NO:18, SEQ. ID. NO:19, SEQ. ID. NO:20, SEQ. ID. NO:21, SEQ. ID. NO:22, SEQ. ID. NO:23, SEQ. ID. NO:24, SEQ. ID. NO:25.
  45. 폴리펩티드의 발현이 악성 종양 세포에 의해 상향조절되는 암 환자를 선별하고;
    상향조절이 확인된 이들 환자에게 상향조절된 폴리펩티드의 대사 경로를 간섭하는 항체를 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  46. 제 45 항에 있어서, 환자의 선별 단계는 CLL 환자를 선별하는 과정을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  47. 제 45 항에 있어서, 환자의 선별 단계는 OX-2/CD200의 상향 조절을 검출하는 과정을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  48. 제 45 항에 있어서, 항체의 투여 단계는 OX-2/CD200에 결합하는 항체를 투여하는 과정을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  49. 제 45 항에 있어서, 항체의 투여 단계는 OX-2/CD200가 상호작용하는 수용체에 결합하는 항체를 투여하는 과정을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  50. 제 45 항에 있어서, 항체의 투여 단계는 OX-2/CD200의 발현을 조절하는 항원에 결합하는 항체를 투여하는 과정을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  51. 제 45 항에 있어서, 항체의 투여 단계는 아래에서 선택되는 서열과 적어도 70% 상동성을 보유하는 아미노산 서열을 포함하는 항체를 투여하는 과정을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법: SEQ. ID. NO:1, SEQ. ID. NO:2, SEQ. ID. NO:3, SEQ. ID. NO:4, SEQ. ID. NO:5, SEQ. ID. NO:6, SEQ. ID. NO:7, SEQ. ID. NO:8, SEQ. ID. NO:9, SEQ. ID. NO:10, SEQ. ID. NO:11, SEQ. ID. NO:12, SEQ. ID. NO:13, SEQ. ID. NO:14, SEQ. ID. NO:15, SEQ. ID. NO:16, SEQ. ID. NO:17, SEQ. ID. NO:18, SEQ. ID. NO:19, SEQ. ID. NO:20, SEQ. ID. NO:21, SEQ. ID. NO:22, SEQ. ID. NO:23, SEQ. ID. NO:24, SEQ. ID. NO:25.
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