KR20020073279A

KR20020073279A - 포유동물에서 이종이식체의 거부를 예방하거나 지연시키기위한 ｃ1 에스테라제 억제제의 용도

Info

Publication number: KR20020073279A
Application number: KR1020020013273A
Authority: KR
Inventors: 빈클러미카엘; 뤼콜트호르스트
Original assignee: 아벤티스 베링 게엠베하
Priority date: 2001-03-14
Filing date: 2002-03-12
Publication date: 2002-09-23
Also published as: ATE465749T1; AU2324102A; US20020168352A1; JP2002322084A; EP1240904A3; CA2376716A1; DK1240904T3; DE10112617A1; AU783932B2; EP1240904A2; EP1240904B1; DE50214392D1

Abstract

본원에서는 포유동물에서 이종이식체(xenotransplant)의 초급성 및/또는 급성 거부를 예방하거나 지연시키기 위한, C1 에스테라제 억제제(C1-INH)를 포함하는 제제의 용도를 기술한다. 바람직하게는, 이종간 이식은 치료학적 유효량의 C1-INH 제제를 이식 전에 수용 유기체에게 투여하고, 이식이 수행된 후에는 당해 유기체에게 C1-INH 제제를 이식체 거부를 예방하기에 충분한 1일 투여량으로 투여하는 방식으로 수행한다.

Description

포유동물에서 이종이식체의 거부를 예방하거나 지연시키기 위한 Ｃ1 에스테라제 억제제의 용도{Use of a Ｃ1 esterase inhibitor for preventing or delaying rejection of xenotransplants in mammals}

본 발명은 이종간 이식(xenotransplantation)의 성공 가능성을 개선시키기 위한 C1 에스테라제 억제제(C1-INH)를 포함하는 제제의 용도에 관한 것이다.

장래, 적합한 공여 장기의 부족으로 인해, 이종간 이식은 부적합한 이종간 이식시 자연적인 거부 반응 및 방어 반응을 극복할 수 있게 되는 경우에 외과 기술에서 상당히 중요해질 것이다. 그러나, 현재는 여전히 이종간 이식의 초급성 거부(HAR) 및 이종간 이식의 급성 거부(AVR)는 포유동물의 상이한 종으로부터의 장기 이식의 영구적 성공의 장애가 되고 있다. 미리 형성된 항체에 의해 유발되는 급성 거부(HAR)뿐만 아니라 이식 후에만 형성되는 항체로 인해 지연되어 발생되는 거부(AVR)는 현재 이종간 이식시에는 극복할 수 없다. 사이클로스포린 A, 미코페놀레이트 모페틸 또는 스테로이드의 투여와 같은 면역억제 수단도 보체계의 활성화 및 이로부터 야기되는 세포 손상을 예방할 수 없다. 따라서, 본 발명의 목적은, 보체계의 영구 불활성화를 통해 이종-이식체와 수용 유기체의 양립성을 유지시킬 수 있도록 하는 방법을 찾는 것이다.

도 1은 C1-INH의 투여와 함께 비개질된 돼지 신장을 이식한 영장류와 연속적인 C1-INH의 투여 치료요법 없이 비개질된 돼지 신장 또는 hDAF 형질전환 돼지 신장을 이식한 영장류에서 발견된 C3a 및 sC5b-9의 전신계적 농도를 도시한 것이다.

C1 에스테라제 억제제로도 지칭되는 C1 억제제는 혈중에 존재하는 단백질이며 보체계 및 접촉계(contact system)의 고전 경로의 주요 억제제이다. C1 억제제는 인자 XII 및 칼리크레인의 활성형을 억제할 수 있다[참조 문헌: Schapira M. et al., 1985, Complement 2: 111; Dabis A.E., 1988, Ann Rev Immunol 6: 595; Sim R.B. et al., 1979, FEBS Lett 97: 111; De Agostini A. et al., 1984, J Clin Invest 73: 1542; Fixley R.A. et al., 1985, J Biol Chem 260: 1723; Schapira M. et al., 1982, J Clin Invest 69: 462; Van der Graaf F. et al., 1983, J Clin Invent 71: 149; Harpel P.C. et al., 1975, J Clin Invest 55: 593]. 따라서 C1 억제제는 생물학적 활성 펩타이드가 생성되는 2개의 혈장 다단계, 즉 보체계 및 접촉계의 활성을 조절한다. 따라서 C1 억제제는 염증계의 중요한 조절제이기도 하다. 또한, C1 억제제는 활성화 인자 XI를 억제한다[참조 문헌: Meijers J.C.M et al., 1988, Biochemistry 27; 959; Wuillemin W.A. et al., 1995, Blood 85: 1517]. 이러한 결과로서, C1 억제제는 응혈 억제제로서 간주될 수 있다. 비록 C1 억제제의 주요 기능은 아니라해도, 조직 플라스미노겐 활성인자 및 플라스민도 C1 억제제에 의해 특정 범위까지 억제된다[참조 문헌: Harpel P.C. et al., 1975, J Clin Invest 55: 149; Booth N.A. et al., 1975, Blood 69: 1600].

C1 억제제는 정제함으로써 혈장으로부터 상당 범위까지 수득되며 임상 적응용으로, 특히 유전성 혈관부종 또는 C1 억제제가 유전적으로 결핍되어 유발되는 질환의 치료에서 사용된다. 또한, 전신계적 염증의 경우[참조 문헌: 국제 특허원 제WO 92/22320(Genentech Inc.)], 중증 화상, 췌장염, 골수 이식, 사이토킨의 투여 치료요법의 경우 및 체외 혈액 순환에서 사용시[참조 문헌: DE-A-4 227 762(Aventis Behring GmbH)] C1 억제제의 투여에 의해 우수한 치료 결과가 달성된다는 것이 보고된 바 있다.

C1 억제제를 암호화하는 완전한 게놈 및 cDNA는 이미 클로닝되었다[참조 문헌: Bock S.C. et al., 1986, Biochemistry 25: 4292; Carter P.E. et al., 1988, Eur J Biochem 173: 163]. 반응 부위의 P1 및 P3 및/또는 P5 위치에 아미노산 변이를 갖는 재조합 C1 억제제의 다양한 변이체 및 유전성 혈관 부종을 앓는 환자로부터 분리한 변이체가 이미 제조되었다[참조 문헌: Eldering E. et al., 1988, J Biol Chem 263: 11776; Eldering E. et al., 1993, J Biol Chem 267: 7013;Eldering E. et al., 1993, J Clin Invest 91: 1035; 국제 특허원 제WO 91/06650(Cetus Corporation); Davis A.E. et al., 1992, Nature Genetics 1: 354; Eldering E. et al., 1995, J Biol Chem 270: 2579; Verpy et al., 1995, J Clin Invest 95: 350].

C1 억제제는 서핀(serpin)으로도 지칭되는 세린 프로테이나제 억제제의 대 그룹에 속한다[참조 문헌: Travis J. et al., 1983, Ann Rev Biochem 52; 655; Carrel R. W. et al., 1985, Trends Bioch Sci 10: 20]. SDS 폴리아크릴아미드 겔 상에서 C1 억제제는 분자량이 약 105KD인 것으로 나타난다. 이의 혈장 농도는 약 270mg/ℓ이다[참조 문헌: Schapira M. et al., 1985, Complement 2: 111; Nuijens JH et al., 1989, J Clin Invest 84: 443]. C1 억제제는 단순 감염 및 기타 염증시 혈장 농도가 2배까지 증가할 수 있는 단백질이다[참조 문헌: Kalter ES et al., 1985, J. Infect, Dis 151: 1019]. 염증시 C1 억제제의 형성 증가는 급성 반응 동안 보체계 및 접촉계의 정맥내 활성화의 유해 효과로부터 신체를 보호할 수 있다.

서핀은 억제될 프로테이나제와의 이분자 복합체의 형성을 통해 억제제로서 작용한다. 이러한 복합체에서, 프로테이나제의 활성 부위는 서핀의 활성 부위에 의해 결합됨으로써 불활성화된다[참조 문헌: Travis J. et al., 1983, Ann Rev Biochem 52: 655]. 서핀은 특정 프로테이나제와 특이적으로 반응하며, 이러한 특이성은 반응 부위의 아미노산 서열에 의해 측정한다.

본 발명은 이종간 이식의 거부가 C1 억제제의 투여에 의해 차단될 수 있는지의 관찰에 기초한다.

따라서, 본 발명은 포유동물, 특히 사람에서 이종간 이식체의 초급성 및/또는 급성 거부를 예방하거나 지연시키기 위한, C1 에스테라제 억제제(C1-INH)를 포함하는 제제의 용도에 관한 것이다.

사람 C1 에스테라제 억제제는 바람직하게는 포유동물의 장기를 영장류에게 이식하는데 사용한다. 이러한 경우에서 방법은, 치료학적 유효량의 C1-INH 제제를 이식하기 전에 수용 유기체에게 투여하고 이식을 수행한 후에는 C1-INH 제제를 이식체 거부를 예방하기에 충분한 1일 투여량으로 유기체에게 투여하는 것이다. 이식하기 전에는 일반적으로 체중 1kg당 150I.U 미만의 C1-INH를 투여할 수 있다. 이식이 수행된 후에 투여되는 C1-INH의 양은 일반적으로 80I.U./체중kg 이하이다.

돼지 장기를 영장류에게 이식하는 것이 본 발명의 이식 방법의 모델로서 조사되었다. 또한 당해 숙련가는 발견된 정보를 사용하여 사람에서 이종간 이식을 수행할 수 있다.

이미 이종간 이식의 거부를 예방하기 위한 몇가지 시도가 있어왔다. 따라서, 국제 특허원 제WO 97/16064호에는 형질전환 조직 또는 장기를 사람 수용 유기체에게 도입하여 초급성 거부 반응(HAR)의 감소를 비형질전환 조직 또는 장기를 수여받은 사람 수용 유기체와 비교함으로써 관찰하는 이종간 이식방법이 기재되어 있다. 또한, C1-INH를 함유하는, 사람 신선혈로 관류된 돼지 신장의 생존 시간이 연장될 수 있는 것으로 나타난 관류 연구도 있었다[참조 문헌: 22]. 보체를 억제함으로써 초급성 거부 반응(HAR)을 완화시킬 수 있다는 것이 예상되었다. 놀랍게도,본 발명에 이르러, 적합하게 예비처리한 후 수용 유기체에서 충분하게 높은 C1-INH 용량이 지속적으로 유지되는 경우 상기 방법을 이식된 장기에 적용할 수 있게 되었다.

다음과 같이 조사를 수행하였다:

재료 및 방법

동물: 체중이 3.3 내지 4.7kg이고 연령이 4.5 내지 5년된 5마리의 시아노몰구스 원숭이(짧은꼬리 원숭이)를 약력학 조사(n=2) 또는 신장 이종간 이식(n=3)의 일부 경우에서 사용하였다. 당해 원숭이는 괴팅겐에 소재하는 독일 영장류 센터로부터 구입하고 짧은꼬리 원숭이 헤르페스 B(서코피텍신 헤르페스 바이러스 1형), 에볼라, 마르부르크, 시미안 T-세포 백혈병 바이러스(STLV), 시미안 레트로바이러스 D(SRV) 및 시미안 면역결핍 바이러스(SIV)에 대한 음성 여부로 시험하였다.

이종간 이식 시험용으로 사용된 공여 동물은 예비처리되지 않은 3마리의 대형 백색 돼지(공급원: Schweinezuchtverband Weser-Ems, Oldenburg, Germany)이다. 상기 돼지는 8 내지 18주령이며 체중이 18 내지 23kg이다. 모든 외과적 과정 및 수술후 처리는 기관[National German Institute for Animal Care]과의 합의하에 수행하였으며 지방 동물 복지 기관에 의해 승인을 받았다.

신장 이종간 이식

공지된 방법을 사용하여, 공여 장기를 제거하고 수용체 자체의 기능할 수 없는 신장을 보유시키고 수용체의 방광에 이를 연결시킨채 이종 신장을 이식한다. 수술 동안 결찰이 결합된 천연 수뇨관의 폐쇄를 초음파 또는 NMR 및 부검 둘다에 의해 조사한다. 비장은 제거하지 않는다. 수술후 정맥내 약물 치료요법 동안, 접촉계를 모든 원숭이들의 우측 내경 정맥으로 이식한다.

HAR 및 AVR의 정의

이종간 이식체 HAR은 재관류시킨지 2시간 후에 생검 수행시 출혈하지 않은 혈관 연결을 갖는 이식체의 완전한 혈전을 의미한다. 또한, 표준 HE 절편에서의 HAR의 징후[참조 문헌: 3, 16, 17]는 해부학적 검사 및 면역화학조직 조사 둘다에서 나타난다. AVR은 임상 및 해부학적 매개변수를 기초로하여 진단한다. 조직 거부로 인한 것이 아닌 패혈증 또는 기술적 오류와 같은 이식체 기능의 악화에 대한 모든 원인을 (초음파에 의해) 배재한 후, 기준보다 20% 이상의 크레아틴 수준 증가와 연관된 모든 결과를 AVR로 추정하였다.

면역억제 치료요법

면역억제는 사이클로스포린, 미코페놀레이트 모페틸 및 프레드니솔론으로 이루어진다[참조 문헌: 9, 10, 24]. 이식 전, 먼저 사이클로스포린을 100mg/kg의 투여량으로 매일 경구 경구투여한다. 이식 후에는 CyA를 400 내지 600ng/ℓ혈액 수준에 도달하기에 충분한 양으로 경구 투여하는데, 이때 충분한 효능 및 최소 독성은 당해 영장류 종에서 달성된다. 위관에 의한 MMF의 투여를 이식 3일 전에 시작한다. MMF 투여량을 조정하여 1 내지 4㎍/㎖의 MPA 혈장 수준이 유지되도록 한다. 스테로이드를 다음과 같이 투여한다: 이식 당일에 1㎎/kg 메틸프레드니솔론을 정맥내 투여한 다음, 이식 후 첫번째 주에 1㎎/kg 프레드니솔론을 경구 투여한다. 이어서 매일 0.05㎎/kg씩 감소시켜 0.2mg/kg의 일정한 투여량이 유지되도록 한다. 유도 치료요법을 위해, 동물 제3번 및 제4번에게 -1, 0, 2 및 4일째에 사이클로포스파미드도 40㎎/kg, 10㎎/kg 및 20㎎/kg의 양으로 각각 투여한다. 사이클로포스파미드 유도 치료요법은 동물 제5번에게는 수행하지 않는다.

수술후 혈액 시험

총 혈액 수치, 요소, 크레아티닌 및 전해질을 측정하기 위해 혈액 샘플을 매일 채취한다. 또한, 24-시간 동안의 뇨를 선택된 동물에서 수집하여 전해질 농도에 대하여 분석한다. 전체 혈액 중의 사이클로스포린 수준뿐 아니라 MPA 혈장 수준을 모노클로날 항체(EMIT 2000, 공급원: Aventis Behring GmbH)를 사용하는 측정 방법에 의해 측정한다.

유량 세포계측

수술전 및 수술후 혈청은 분석용 유량 세포계측 검정법을 사용하여 이의 항돼지 항체 역가에 대하여 검정한다. 혈액을 채취한 후, 20℃에서 10분 동안 3400×g에서 원심분리하여 혈청을 제조하다. 항돼지 항체를 검출하기 위해, 각각의 대형 백색 돼지로부터 수득한 돼지 말초혈 백혈구(PPBL)의 냉동 분취액을 해동시키고, 0.5×10⁵세포를 상응하는 다양한 용액 중의 시아노몰구스 혈청 20㎕로 오염시킨다. 4℃에서 20분 동안 항온처리한 후, 세포를 1% BSA 및 0.1% 아지드화 나트륨을 함유하는 PBS로 2회 세척한다. 결합된 시아노몰구스 항체를 IgG(공급원: Dianova, Hamburg) 또는 IgM(공급원: Dianova, Hamburg)와 반응된 염소 항-사람 FITC 2차 항체를 사용하여 검출한다. 상기 항체는 시아노몰구스 면역글로불린과 교차-반응하는 것으로 공지되어 있다[참조 문헌: 7]. 항체를 돼지 혈청으로 예비흡착시켰다. 4℃에서 20분 동안 항온처리한 후, 세포를 다시 2회 세척한 다음, FACScan 세포계측기(공급원: Becton Dickinson, Mountain View, CA)에서 분석한다.

보체 수준의 분석

혈장 보체 수준을 검출하기 위해, 정맥혈을 채취하고 항응혈제로서 EDTA를 첨가한다. 혈액을 채취한 직후, 샘플을 원심분리한 다음, 혈장을 분석할때까지 -70℃에서 보관한다. 시아노몰구스 혈장 중의 C3a 및 sC5b-9의 농도를 시아노몰구스 보체 화합물과 교차-반응하는 것으로 공지된 시판중인 ELISA 시약(공급원: Quidel, San Diego, CA, USA)을 사용하여 측정한다. 이러한 조사는 제조업자의 지시에 따라서 정확하게 수행한다.

C1-INH 활성의 분석

시트르산 첨가된 혈장 중의 총 C1-INH 활성 및 C1-INH 단백질의 총량을 정량적으로 측정한다. C1-INH의 활성을 다음과 같이 측정한다: 당해 샘플중의 C1-INH는 명시된 용적의 외인성 C1 에스트라제를 억제한다. C1 에스테라제의 잔류 활성을 405nm에서 흡착의 증가를 측정함으로써 반응속도 검정(Berichrom^RC1-억제제, 공급원: Dade Behring Inc., Newark, USA)으로 측정한다. 샘플의 C1 활성을 사람 표준 혈정으로부터 생성된 참조 플롯으로부터 산정한다. 평균 수치(사람의 경우)를 공급업자에 의해 공급된 C-INH 검정의 표준치에 따라서 명시한다. C1-INH 단백질의 양을 양 및 래빗으로부터의 항-C1-INH 항체를 사용하여 NOR-Partigen(공급원: Behring)에 의해 측정한다. 제조업자의 지시에 따라서 정확하게 조사한다. 이식체를 재관류시킨 후 보체 활성화도를 비교하기 위해, 비개질된 이식체 또는 h-DAF 형질전환 이식체를 수여받았으나 추가로 C1-INH 처리하지 않은 원숭이의 2개 그룹으로부터의 병력 데이터도 이용한다[참조 문헌: 8]. 이들 동물에서 즉각적 수술후 면역억제는 마찬가지로 CyP, CyA 및 저 투여량의 스테로이드로 이루어지나, 미코페놀레이트 모페틸은 이들 동물들에게 투여하지 않는다.

결과

약력학 분석을 위해, 1회 정맥내 투여량의 C1-INH를 2마리의 건강한 시아노몰구스 원숭이(실험용 동물 제1번 및 제2번)에게 투여한다. 사람에서 C1-INH를 투여한 시험[참조 문헌: 26 및 27]을 기초로하여, 150I.U/kg의 투여량을 선택한다. 약력학 데이터는 정상 수치보다 200% 이상의 농도를 나타낸다. 산정된 반감기는 각각 72 및 90 시간이다. 따라서, 다음의 원숭이의 신장 이종간 이식에서, 재관류 1시간 후 500I.U. 투여량의 CI-INH를 투여한 다음, 1일당 80I.U/kg를 사용한다.

소생 돼지 신장 이종간 이식을 3마리의 원숭이에서 수행한다. 수술후 면역억제는 CyA, MMF 및 스테로이드를 포함한다. 이전에 다른 실험실에서 확립된 프로토콜[참조 문헌: 25]에 따라서 동물 제3번 및 제4번에서 CyP 유도를 추가로 수행한다. 동물 제5번에게는 CyP 유도를 수행하지 않는다. 3마리 모든 원숭이에게 이식한 후, C1-INH(250I.U)를 추가로 매일 투여한다. 이식 후의 전신계적 C1 수치는 정상 수치의 170 내지 210%의 범위이다. 수술 후, 특히 처음 5일 동안은 개체들 사이의 총 C1-INH 수준에서의 변화가 현저하게 작았다.

이들 3마리의 이종 이식체중 어느 것도 초급성 거부 반응을 겪지 않았다. 3개의 모든 돼지 신장은 먼저 뇨를 생성하는 것으로 나타나며, 안정한 신장 기능이 수술후 경과로서 생성되며, 각각 31, 71 및 64μmol/ℓ의 최소량의 크레아틴이 발견되었다. 모든 3마리의 동물에서, FACS에 의한 전신계적 항돼지 항체 수준의 분석은 관찰 기간 동안 역가가 현저하게 증가되지 않았음을 나타낸다.

C3a 및 sC5b-9의 혈장 수치를 ELISA를 사용하여 3마리의 원숭이에서 측정한다. 당해 데이터를, 연속적인 C1-INH의 투여 치료요법 없이 비개질된 신장(n=3) 또는 hDAF 형질전환 신장(n=10)을 이식한 후에 원숭이에서 발견된 한 세트의 조직학적 데이터와 비교한다(도 1). sC5b-9 수준은 모든 그룹에서 비슷하였으나, C3a 수준은 나머지 두 그룹과 비교하여 C1-INH 그룹에서 보다 낮은 수치를 갖는 경향이 있었다. 3마리의 모든 원숭이는 이식 후 6, 13 및 15일째에 세균성 패혈증으로 인해 사망하였으나 심장 기능은 안정하였다(뇨 생성, 혈청 크레아틴 수준). 패혈증은 항미생물 치료에 반응하지 않았다. 3마리의 모든 원숭이에서, 이. 콜라이/이.파이칼리스(동물 제3번), 스트렙토코커스 아종(동물 제4번) 및 스타필로코커스 아우레우스(동물 제5번)에 대해 양성인 혈액 배양물이 발견되었다. 안정한 심장 기능은 이식 후 3마리의 모든 원숭에에서 발견되었으나, 동물 제3번 및 제4번에서는 크레아틴 수준이 약간 상승하였다. 응혈계의 손상은 부분적인 트롬보플라스틴 시간의 증가, 피브리노겐 분해 산물의 증가 및 AT-III 농도의 감소와 함께 모든 3마리의 원숭이에 발견되었다. 1마리의 동물(동물 5번)에서, DIC의 임상 징후는 부검시 모든 장기 시스템에서 가시적이었으나, 임상적으로 명백한 응혈 장애의 징후는 피브리노겐 분해 산물이 현저하게 증가되었음에도 불구하고 나머지 2마리 동물에서 발견되지 않았다.

본 발명의 C1 에스테라제 억제제를 포함하는 제제에 의해 보체계를 불활성화시켜 이종이식체의 초급성 및/또는 급성 거부를 예방하거나 지연시킬 수 있다.

참조 문헌

Claims

포유동물에서 이종이식체(xenotransplant)의 초급성 및/또는 급성 거부반응을 예방하거나 지연시키기 위한, C1 에스테라제 억제제(C1-INH)를 포함하는 제제의 용도.
제1항에 있어서, 제제가 사람 C1 에스테라제 억제제를 포함하는 용도.
제1항 또는 제2항에 있어서, 치료학적 유효량의 C1-INH 제제를 이식 전에 수용 유기체에게 투여하고, 이식이 수행된 후에는 당해 유기체에게 C1-INH 제제를 이식체 거부를 예방하기에 충분한 1일 투여량으로 투여하는 용도.
제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 이식 전에 투여되는 C1-INH의 양이 150I.U./체중kg 이하인 용도.
제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, 이식이 수행된 후에 투여되는 C1-INH의 양이 80I.U./체중kg 이하인 용도.
제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 이종이식체가 돼지로부터 기원하며 수용체가 영장류인 용도.
제6항에 있어서, 수용체가 사람인 용도.