KR20010072357A - 세균 검출용 유전자 및 이를 이용한 세균의 검출방법 - Google Patents

세균 검출용 유전자 및 이를 이용한 세균의 검출방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 맥주 부패균으로 알려진 펙티나투스류의 펙티나투스 프리싱젠시스 또는 펙티나투스 세레비시이필러스 검출용 유전자와 이를 이용한 균의 검출방법에 관한 것이다.
본 발명은 맥주 부패와 관련된 펙티나투스류의 16S rRNA를 코딩하는 유전자와 23S rRNA를 코딩하는 유전자사이의 스페이서 부분의 유전자 서열과 상기 서열을 이용하여 균을 빠르고 확실하게 검출하는 방법을 제공한다.

Description

세균 검출용 유전자 및 이를 이용한 세균의 검출방법{Genes for detecting bacteria and detection method by using the same}
펙티나투스균은 맥주 부패균으로 알려져 있다. 펙티나투스류로는 펙티나투스 프리싱젠시스 또는 펙티나투스 세레비시이필러스 두 가지가 알려져 있다. 펙티나투스균을 검출하기 위하여 증식배양과 분리배양 후에 세균을 분리한다. 이는 적어도 7일 이상 걸린다. 그런 다음, 분리한 세균을 증식하고 균을 확인하기 위한 형태학적 관찰, 그람 염색능, 카탈라제 시험, 여러 탄소원의 이용 및 이와 유사한 여러 정성시험에 의해 검정한다.
상기 시험들은 매우 힘들며, 많은 시간과 비용이 든다. 이들 통상적인 확인 시험 외에, DNA를 분리한 세균으로부터 추출하고 이를 막상 또는 다른 지지체상에 고정하고 그 종류를 확인하기 위한 탐침(probe)으로 일반세균 DNA를 사용함으로써 하이브리다이제이션 테스트를 수행하는 방법이 있다. 그러나, 이 방법은 몇 일 걸리며, 검출의 민감도와 선별성을 확실하게 얻기엔 어렵다.
최근 펙티나투스 세레비시이필러스에 특이하게 반응하는 모노클로날 항체를 사용함으로써 펙티나투스균을 검출하는 방법을 발표하였다[ASBC Journal:51(4)158-163, 1993]. 그러나, 이 방법은 검출 민감도가 만족스럽지 못할 뿐만 아니라 펙티나투스 프리싱겐시스가 검출되지 않는 문제점이 있다.
다른 검출법으로서 리보좀 RNA의 다형성을 확인하는 리보타이핑(Ribotyping) 방법으로 펙티나투스 프리싱젠시스와 펙티나투스 세레비시이필러스를 검출하는 방법이 보고되었다[J.Am.Soc.Chem.:56(1)19-23, 1998]. 그러나, 이 방법은 적용하는데 세균 분리작업이 필요하기 때문에 검출의 민감도와 속도의 문제점이 있다.
상기 문제점을 고려하여 좀더 빠른 검출법이 연구되어 최근에는 WO97/20071에 검체로서 미생물의 DNA를 추출하는 것을 포함하며 DNA의 상보적인 올리고뉴클레오티드가 프라이머로 작용하는 PCR 방법을 사용하는 펙티나투스를 검출하는 방법이 보고되었다. 그러나, 상기 방법에서 사용되는 16S rRNA 유전자의 염기 서열은 다른 종류의 미생물의 염기서열과 유사해서 특정 미생물을 검출시에 다른 미생물을 검출하는 문제점이 있다.
16S rRNA 유전자와 23S rRAN 유전자 사이에 구성되는 스페이서(spacer) 부분의 미생물류에 특이한 유전자 서열을 가진 것이 알려지고 있다. 유전자 서열을 사용하여 미생물을 검출하는 방법이 일본에서 발표[Jozo Ronbunshu 50,22-31(1995), APPL. ENVIRON. MICROBIOL. VOL.62,NO.5, 1683-1688(1996), FEMSMICROBIOL LETT. VOL. 84, NO.3, 307-312(1991), 일본 특허 공개평 6-98800 등]되었음에도 불구하고, 펙티나투스균의 스페이서 부분의 유전자 서열은 아직 밝혀져 있지 않다.
[발명의 요약]
본 발명은 맥주 부패와 관련된 펙티나투스류에 대해 특이적인 16S rRNA 유전자와 23S rRNA 유전자 사이에 구성되어 있는 스페이서 부분의 유전자 서열과 상기 서열을 사용함으로써 상기 균을 빠르고 민감하게 검출하는 방법을 제공하는데 목적이 있다.
(1) 첫 번째 발명은 서열번호 1로 표시된 염기 서열 전체 또는 일부를 포함하는 펙티나투스 프리싱젠시스의 16S rRNA를 코딩하는 유전자와 23S rRNA를 코딩하는 유전자 사이의 스페이서 부분의 유전자 서열이다.
(2) 두 번째 발명은 서열번호 2로 표시된 염기 서열 전체 또는 일부를 포함하는 펙티나투스 프리싱젠시스의 16S rRNA를 코딩하는 유전자와 23S rRNA를 코딩하는 유전자 사이의 스페이서 부분의 유전자 서열이다.
(3) 세 번째 발명은 서열번호 3으로 표시된 염기 서열 전체 또는 일부를 포함하는 펙티나투스 세레비시이필러스의 16S rRNA를 코딩하는 유전자와 23S rRNA를 코딩하는 유전자 사이의 스페이서 부분의 유전자 서열이다.
(4) 네 번째 발명은 서열번호 4로 표시된 염기 서열 전체 또는 일부를 포함하는 펙티나투스 세레비시이필러스의 16S rRNA를 코딩하는 유전자와 23S rRNA를 코딩하는 유전자 사이의 스페이서 부분의 유전자 서열이다.
(5) 다섯 번째 발명은 펙티나투스 프리싱젠시스의 16S rRNA를 코딩하는 유전자와 23S rRNA를 코딩하는 유전자 사이의 스페이서 부분의 유전자 서열이 적어도 다음 서열 또는 이와 상보적인 서열 중 하나 이상인 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드이다:
5'-CCATCCTCTTGAAAATCTC-3' ①
5'-TCTCRTCTCACAAGTTTGGC-3' ②.
(6) 여섯 번째 발명은 펙티나투스 세레비지이필러스의 16S rRNA를 코딩하는 유전자와 23S rRNA를 코딩하는 유전자 사이의 스페이서 부분의 유전자 서열이 적어도 다음 서열 또는 이와 상보적인 서열 중 하나 이상인 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드이다:
5'-CACTCTTACAAGTATCTAC-3' ③
5'-CCACAATATTTCCGACCAGC-3' ④
5'-AGTCTTCTCTACTGCCATGC-3' ⑤.
(7) 일곱 번째 발명은 상기 (1) 또는 (2)의 유전자 서열로부터 만들어진 올리고뉴클레오티드가 핵산의 합성에 대해 프라이머로 사용하는 펙티나투스 프리싱젠시스 검출법이며, 상기 핵산을 세균을 검출하기 위한 유전자 증폭으로 처리한다.
(8) 여덟 번째 발명은 상기 (3) 또는 (4)의 유전자 서열로부터 만들어진 올리고뉴클레오티드가 핵산의 합성에 대해 프라이머로 사용하는 펙티나투스 세레비시이필러스 검출법이며, 상기 핵산을 세균을 검출하기 위한 유전자 증폭으로 처리한다.
(9) 아홉 번째 발명은 상기 (1) 또는 (2)의 유전자 서열로부터 만들어진 올리고뉴클레오티드 또는 상기 (5)의 유전자 서열로부터 만들어진 올리고뉴클레오티드, 및 펙티나투스 프리싱젠시스의 16S rRNA 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 핵산의 합성에 대해 프라이머로 사용하는 펙티나투스 프리싱젠시스 검출법이며, 상기 핵산을 세균을 검출하기 위한 유전자 증폭으로 처리한다.
(10) 열 번째 발명은 상기 (3) 또는 (4)의 유전자 서열로부터 만들어진 올리고뉴클레오티드 또는 상기 (6)의 유전자 서열로부터 만들어진 올리고뉴클레오티드, 및 펙티나투스 세레비시이필러스의 16S rRNA 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 핵산의 합성에 대해 프라이머로 사용하는 펙티나투스 세레비시이필러스 검출법이며, 상기 핵산을 세균을 검출하기 위한 유전자 증폭으로 처리한다.
(11) 열한 번째 발명은 상기 (9)와 같은 방법이며, 펙티나투스 프리싱젠시스의 16S rRNA 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 다음과 같다:
5'-CGTATCCAGAGATGGATATT-3' ⑥
(12) 열두 번째 발명은 상기 (10)와 같은 방법이며, 펙티나투스 세레비시이필러스의 16S rRNA 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 다음과 같다:
5'-CGTATGCAGAGATGCATATT-3' ⑦
본 발명은 맥주 부패균으로 알려진 펙티나투스(Pectinatus)류 중 펙티나투스 프리싱젠시스(Pectinatus frisingensis) 또는 펙티나투스 세레비시이필러스(Pectinatus cerevisiiphilus) 검출용 유전자와 이를 이용한 세균의 검출방법에 관한 것이다.
도 1은 실시예 3에서의 전기영동사진을 나타낸 것이다.
도 2는 실시예 5에서의 전기영동사진을 나타낸 것이다.
유전자 증폭 기술은 잘 알려져 있고 Saiki 등에 의해 개발된 중합효소 연쇄반응법(Polymerase Chain Reaction:PCR)을 수행한다[이하, PCR 법이라 한다;Science 230,1350,1985].
상기 방법은 특정 유전자 서열의 증폭반응에 의해 수행된다. 상기 반응은 빠르며, 고감도의 특이성 및 편의성을 보여주므로 이의 적용은 유전학적 분야뿐만 아니라 식품분야에서 유해한 세균을 빠르게 검출하거나 의약분야에서 바이러스를 빠르게 판단하는데 시도되었다. PCR 방법에 의해 비록 극소수의 뉴클레오티드 서열이 검체에 있지만, 두 프라이머 사이의 표적 뉴클레오티드 서열을 수백배 증폭되어 검출이 가능할 때까지 대량으로 그의 복제물(copies)이 생산된다. 또한, PCR 방법을 수행함에는 검체 중에서 핵산 성분을 세균으로부터 분리시킬 필요가 있지만, PCR 방법에서 몇몇 또는 그 이상의 분자들이 표적 서열에 존재할 때 증폭반응이 진행된다. 따라서, PCR 방법은 용균효소 또는 계면활성제를 이용한 간단한 전처리만으로도 충분한 시험을 제공할 수 있다. 이런 이유로 상기 균 검출방법은 종래 방법보다 많은 이용가치가 있다.
본 발명은 펙티나투스 프리싱젠시스 또는 펙티나투스 세레비시이필러스 각각의 16S rRNA를 코딩하는 유전자와 23S rRNA를 코딩하는 유전자와의 사이의 스페이서 부분의 유전자 서열을 제공한다. 16S rRNA 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드서열 또는 상기 서열로부터 선택된 올리고뉴클레오티드를 PCR 방법으로 핵산 합성을 위한 프라이머로 사용하고 유전자 증폭 처리함으로써 본 발명자들은 검체에서 펙토나투스 프리싱젠시스 또는 펙티나투스 세레비시이필러스의 존재를 판단하기 위한 빠르고 높은 민감도를 가지는 방법을 개발하였다.
검체는 맥주 또는 맥주의 중간생성물, 또는 하수등의 환경으로부터 채취된 검체도 좋다. 상기 프라이머를 이용하는 올리고뉴클레오티드는 화학적으로 합성한 것이거나 천연의 것 어느것이라도 사용이 가능하다.
[구현예의 설명]
다음에 나타내듯이, 본 발명의 방법에서는 PCR 방법으로 펙토나투스 프리싱젠시스 또는 펙티나투스 세레비시이필러스를 검출하는 방법을 나타낸다. 예를 들어, PCR 방법으로 사용한 염기 서열은 상기 (5), (6), (11) 및 (12)에 나타난 것은 하나의 예이고, 이에 한정되지는 않는다. PCR 방법으로 사용한 프라이머 길이는 상기 (5), (6), (11) 및 (12)에서 기술한 것은 19 ∼ 20의 염기 길이지만 바람직하게는 10 ∼ 50 염기 길이이다.
펙티나투스 프리싱젠시스를 PCR 방법으로 검출하는 경우, 세균의 존재는 ①과 ⑥의 결합인 경우에 프라이머로서 증폭된 DNA 단편은 약 700 염기쌍 및 약 900 염기쌍이며, ②와 ⑥의 결합인 경우에 프라이머로서 증폭된 DNA 단편은 약 700 염기쌍 및 약 900 염기쌍인 것으로 판단한다. 이들 밴드가 전기영동법에 의해 검출되면, 펙티나투스 프리싱젠시스가 존재하는 것으로 판정된다. 상기 프라이머의 결합이 어떠한 경우에도 펙티나투스 프리싱젠시스 균에 대해 특이적이므로, 그균류의 검출에 이용할 수 있지만, 상기 두 개의 결합을 평행으로 사용함으로써 더욱 정확한 동정이 가능하다. PCR 방법에 사용되는 프라이머의 염기 서열을 변경시킴으로써 증폭된 뉴클레오티드 서열의 길이는 변화한다.
다른 한편으로는, 펙티나투스 세레미시이필러스를 PCR 방법에 의해 검출하는 경우, 프라이머로서 ③과 ⑦의 결합의 경우에 증폭된 DNA 단편은 약 600 염기쌍이며, ④와 ⑦의 결합인 경우에 증폭된 DNA 단편은 약 650 염기쌍이고, ⑤와 ⑦의 결합인 경우에 증폭된 DNA 단편은 약 700 염기쌍인 것으로 판정된다. 이들 밴드이 전기영동법에 의해 검출될 때는 펙티나투스 세레미시이필러스가 존재하는 것으로 판정된다. 상기 프라이머의 결합은 어떠한 경우에도 펙티나투스 세레미시이필러스 균에 대해 특이적이므로, 그 균류의 검출에 이용되지만, 상기 둘 또는 그 이상의 결합을 평행으로 이용하면 보다 정확한 동정이 가능하다. PCR 방법에 사용되는 프라이머의 염기 서열을 변경시킴으로써 증폭된 뉴클레오티드 서열의 길이는 변화한다.
PCR 방법에서, 한 싸이클의 온도 조건은 두 가닥의 DNA가 한 가닥의 DNA로 변하는 열변성 반응에서 90 ∼ 98℃이며, DNA가 프라이머 주형 DNA로 하이브리드화되는 어닐링 반응에서는 37 ∼ 65 ℃이고, DNA 중합효소가 작용되는 사슬 신장 반응에서는 50 ∼ 75 ℃이고, 한 싸이클로서 한 것을 수십 싸이클로 행함에 따라 표적 서열을 증폭시킬 수 있다. PCR 반응 후, 반응물을 전기영동에 의해 분리하고 핵산은 에티듐 브로마이드 또는 그와 유사한 것으로 염색한다. 증폭된 뉴클레오티드 서열의 염기 길이가 표적 서열 염기 길이와 같을 때, 검체 중에 검출대상의 세균이 있음을 판정할 수 있다. 증폭된 뉴클레오티드 서열을 검출하는데는 크로마토그래피도 사용할 수 있다.
본 발명의 서열을 다음에 설명한다:
서열번호 1: 이 서열의 길이는 624, 서열의 타입은 핵산, 사슬 수는 두 가닥, 토폴로지는 직쇄상이며, 분자 타입은 게놈 DNA며, 기원은 펙티나투스 프리싱젠시스 DSM6306이다.
서열번호 2: 이 서열의 길이는 442, 서열의 타입은 핵산, 사슬 수는 두 가닥, 토폴로지는 직쇄상이며, 분자 타입은 게놈 DNA며, 기원은 펙티나투스 프리싱젠시스 DSM6306이다.
서열번호 3: 이 서열의 길이는 724, 서열의 타입은 핵산, 사슬 수는 두 가닥, 토폴로지는 직쇄상이며, 분자 타입은 게놈 DNA며, 기원은 펙티나투스 세레비시이필러스 DSM20467이다.
서열번호 4: 이 서열의 길이는 399, 서열의 타입은 핵산, 사슬 수는 두 가닥, 토폴로지는 직쇄상이며, 분자 타입은 게놈 DNA며, 기원은 펙티나투스 세레비시이필러스 DSM20467이다.
서열번호 5: 이 서열의 길이는 19, 서열의 타입은 핵산, 사슬 수는 한 가닥, 토폴로지는 직쇄상이며, 분자 타입은 게놈 DNA며, 기원은 펙티나투스 프리싱젠시스 DSM6306이다.
서열번호 6: 이 서열의 길이는 20, 서열의 타입은 핵산, 사슬 수는 한 가닥, 토폴로지는 직쇄상이며, 분자 타입은 게놈 DNA며, 기원은 펙티나투스 프리싱젠시스DSM6306이다.
서열번호 7: 이 서열의 길이는 19, 서열의 타입은 핵산, 사슬 수는 두 가닥, 토폴로지는 직쇄상이며, 분자 타입은 게놈 DNA며, 기원은 펙티나투스 세레비시이필러스 DSM20467이다.
서열번호 8: 이 서열의 길이는 20, 서열의 타입은 핵산, 사슬 수는 두 가닥, 토폴로지는 직쇄상이며, 분자 타입은 게놈 DNA며, 기원은 펙티나투스 세레비시이필러스 DSM20467이다.
서열번호 9: 이 서열의 길이는 20, 서열의 타입은 핵산, 사슬 수는 두 가닥, 토폴로지는 직쇄상이며, 분자 타입은 게놈 DNA며, 기원은 펙티나투스 세레비시이필러스 DSM20467이다.
서열번호 10: 이 서열의 길이는 20, 서열의 타입은 핵산, 사슬 수는 한 가닥, 토폴로지는 직쇄상이며, 분자 타입은 게놈 DNA며, 기원은 펙티나투스 프리싱젠시스 DSM6306이다.
서열번호 11: 이 서열의 길이는 20, 서열의 타입은 핵산, 사슬 수는 두 가닥, 토폴로지는 직쇄상이며, 분자 타입은 게놈 DNA며, 기원은 펙티나투스 세레비시이필러스 DSM20467이다.
본 발명을 다음 실시예에 따라 구체적으로 설명한다. 본 발명이 다음 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
검체의 제조
펙티나투스 프리싱젠시스 DSM6306와 펙티나투스 세레비시이필러스 DSM20467는 펙티나투스에 속하는 균주로서 사용되었다. 본 발명에서 서열 번호 5, 6, 7, 8, 9, 10 및 11로 나타낸 펙티나투스 프리싱젠시스와 펙티나투스 세레비시이필러스 프라이머의 특이성을 확인하기 위하여 다음 표 1에 표시된 다른 세균을 사용하였다. 이들 세균은 적당한 배양배지에서 배양되며 균주는 원심분리에 의해 회수하였다. 균주로부터 DNA를 문헌[신생화학실험강좌 2, 핵산 I, 분리 및 정제, p.p.20-21(일본생화학외편, 동경화학동인)]에 따라 추출하고, DNA 용액을 얻었다.
세균 번호 세균 타입 균주 이름 주의
1 펙티나투스 프리싱젠시스 DSM6306 타입 균주
2 펙티나투스 세레비시이필러스 DSM20467 타입 균주
3 셀레노모나스 락티시펙스 DSM20757 타입 균주
4 자이모필러스 라피노시보란스 DSM20765 타입 균주
5 자이모필러스 파우시보란스 DSM20756 타입 균주
6 대장균 IFO3301 K-12
7 메가스패라 세레비시애 DSM20462 타입 균주
8 락토바실러스 에시도필러스 IFO13951 타입 균주
9 락토바실러스 플란타럼 JCM1149 타입 균주
10 락토바실러스 브레비스 JCM1059 타입 균주
11 락토코커스 락티스 JCM5805 타입 균주
12 레우코노스톡 메센테로이데스 JCM6124 타입 균주
13 페디오코커스 담노서스 JCM5886 타입 균주
실시예 2
펙티나투스 프리신젠시스의 16S rRNA를 코딩하는 유전자와 23S rRNA를 코딩하는 유전자 사이 스페이서 부분의 클로닝 및 염기 서열의 결정
(1) PCR 방법에 의해 16S/23S rRNA 스페이서 부분의 증폭을 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머의 선별과 합성
펙티나투스 프리싱젠시스의 16S rRNA 유전자의 염기 서열이 명백하므로[International Journal of Systematic Bacteriology, Vol.40, p.p. 19-27(1990)], 상기 프라이머를 557에서 576번째의 염기 서열의 근거로 선택한다.
펙티나투스 프리싱젠시스의 23S rRNA 유전자의 염기 서열이 명백하므로[Systemetic Applied Microbiology, Vol.15, p.p. 487-501(1992), EMSL Accession Number x48423], 대응하는 상보적 서열을 얻기 위해 상기 프라이머를 1에서 20번째 염기 서열의 근거로 선택한다. 이 합성은 사와다이 테크놀로지 사에 위탁하였다.
(2) PCR 방법에 의해 16S/23S rRNA 스페이서 부분의 증폭
상기 실시예 1에서 제조한 펙티나투스 프리싱젠시스 DNA 용액 0.1 ㎍을 0.2 ㎖ 튜브[Perkin-Elmer에 의해 제조]에 넣고, rTaq DNA 중합효소 킷[Toyobo 사] 중의 10 배 희석한 완충용액 5 ㎕, 25 mM MgCl23㎕, 2mM dNTP 혼합용액(dATP, dGTP, dCTP 및 dTTP) 5 ㎕, rTaq 중합효소의 5 units/㎕ 0.5 ㎕ 및 상기 실시예 2-(1)에서 제조한 100 mM 프라이머를 각각 0.5 ㎕를 상기 용액에 첨가한 다음, 살균 증류수를 가하여 50 ㎕의 요액으로 하였다. 상기 튜브를 자동 유전자 증폭 장치[Perkin Elmer]의 온도 싸이클러에 놓고 증폭을 수행하였다. 상기 반응을 30 회 반복하고, 한 싸이클은 다음 조건과 같다:
94 ℃ 2.5분 동안 변성; 94 ℃ 30초 동안 변성; 55 ℃ 30초 동안 프라이머 어닐링, 그리고 72 ℃ 30초 동안 합성 반응. 상기 반응 후, 상기 반응용액 5 ㎕를 사용하여 전기영동법을 아가로스 겔(agarose gel)에 의해 수행하였고, DNA를 에티듐 브로마이드(ethidium bromide)로 염색하고 증폭된 DNA를 확인하였다. 그 결과, 약 1600 염기쌍(이하, "롱(long)"이라 칭함) DNA와 약 1400 염기쌍(이하, "숏(short)"이라 칭함) DNA가 증폭되었음을 알 수 있었다.
(3) "롱" 스페이서 부분의 클로닝(cloning) 및 시퀀싱(sequencing)
PCR 반응 후의 반응용액을 고순도의 PCR 생성물 정제 킷[Baringer Manhaim]을 사용하여 미반응 dNTPs를 제거하였다. 이와 같이 제조한 상기 증폭된 DNA 100 ng에 TA 클로닝 킷[INVITROGEN]에 포함된 플라스미드 pCR 2.1 2 ㎕, 리가제 1 ㎕ 그리고 완충용액 1 ㎕를 첨가하고, 살균수를 전량 10 ㎕가 되도록 첨가하였다. 상기 용액이 14 ℃에서 4시간 동안 반응한 후, 상기 용액 2 ㎕와 0.5 Mβ-머캅토에탄올을 대장균 INVα'F 수용성 세포에 넣고, 30분간 얼음에 방치하였다. 그런 다음, 상기 용액을 42 ℃에서 30초간 가열하고, 상기 대장균에 플라스미드 형질전환을 실시하였다. 형질전환된 대장균에 SOC 배지(2.0% 트립톤, 0.5% 효모 추출액, 10.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10.0 mM MgCl2ㆍ6H2O 및 20.0 mM 글루코오스) 250 ㎕을 첨가하고, 혼합물을 37 ℃에서 60분간 진탕한 후, 암피실린 50 ㎍/㎖와 X-Gal 40 ㎍/㎖을 포함하는 LB 평판 배지로 옮겨 37 ℃에서 하룻밤 배양하였다. 발현된 백색의 콜로니를 암피실린 50 ㎍/㎖을 포함하는 LB 액체 배지 3㎖로 접종하여 37 ℃에서 하룻밤 배양하였다.
배양 후, 플라스미드를 플라스미드 미니 킷[QIAGEN]을 사용하여 상기 대장균으로부터 추출하였다. 상기 플라스미드 일부를 취하고 제한효소EcoRI[Takara Shuzo에 의해 제조]에 의해 37 ℃에서 60분 동안 반응시키고, 아가로스 전기영동법에 의해 분리하였다. DNA를 에티듐 브로마이드로 염색하고 "롱"의 삽입을 확인하였다. 남은 플라스미드 500 ng를 30 ℃에서 60분간 제한효소SmaI[TOYOBO 사에 의해 제조]와 반응시켰다. 반응물에 3 M 소디움 아세테이트 2 ㎕와 100% 에탄올 500 ㎕을 첨가하고 그 혼합물을 얼음에 15분간 놓고 15000 rpm에서 15분간 원심분리하고, 그 상청액을 제거하였다. 침전물에 70% 에탄올 500 ㎕을 첨가하고 그 혼합물을 15000 rpm에서 15분간 원심분리하고, 상청액을 제거한 다음, 10분간 감압 하에 건조시켰다. 침전물에 살균수를 가하여 용해시키고 그 혼합물을 제한효소XbaI[Baringer Manhaim 사]와 37 ℃에서 60분간 반응시켰다. 반응액에 등량의 페놀/클로로포름(등량의 혼합액)을 첨가하고 서서히 혼합하였다. 상기 혼합액을 15000 rpm에서 15분간 원심분리하여 물층(상층)을 회수하였다.
회수된 액체에 등량의 수포화 에테르를 첨가하고 서서히 혼합하고, 상기 혼합액을 15000 rpm에서 15분간 원심분리하여 에테르 층(상층)을 제거하였다. 남아 있는 물층에 3 M 소디움 아세테이트 2 ㎕와 100% 에탄올 500 ㎕을 첨가하고 그 혼합물을 15분간 얼음에 놓고 15000 rpm에서 15분간 원심분리하여 상청액을 제거하였다. 침전물에 70% 에탄올 500 ㎕을 첨가하고 그 혼합물을 15000 rpm에서 15분간 원심분리하여 상청액을 제거한 다음, 잔여물을 10분간 감압 하에 건조시킨 후, 살균 증류수 20 ㎕를 첨가하였다. 상기 용액 5 ㎕에 블런팅 킷[Takara Shuzo 사]에 포함된 10 배 희석한 완충용액 1 ㎕와 살균 증류수 3 ㎕를 첨가하고 그 혼합물을 70 ℃에서 5분간 유지시킨 후, T4 DNA 중합효소 1 ㎕를 첨가하고 블런트 엔드를 얻기 위해 37 ℃에서 3분간 유지시켜서 말단평활화를 실시하였다. T4 DNA 중합효소를 교반하여 불활성화시킨 후, 라이게이션 용액 A 40 ㎕와 라이게이션 용액 B 10 ㎕을 첨가하고 그 혼합물을 분자내 라이게이션을 행하기 위해 16 ℃에서 30분간 유지시켰다.
상기 반응액 2 ㎕와 0.5 Mβ-머캅토에탄올 2 ㎕를 대장균 INVα'F 수용성 세포에 넣고, 그 혼합물을 30분간 얼음에 방치하였다. 그리고, 42 ℃에서 30 초간 가열하고 상기 플라스미드를 대장균에 형질전환시켰다. 형질전환된 대장균에 SOC 배지(2.0% 트립톤, 0.5% 효모 추출액, 10.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10.0 mM MgCl2ㆍ6H2O 및 20.0 mM 글루코오스) 250 ㎕을 첨가하고, 혼합물을 37 ℃에서 60분간 진탕한 후, 암피실린 50 ㎍/㎖을 포함하는 LB 평판 배지로 옮겨 37 ℃에서 하룻밤 배양하였다. 발현된 백색의 콜로니를 암피실린 50 ㎍/㎖을 포함하는 LB 액체 배지 3㎖로 접종하여 37 ℃에서 하룻밤 배양하였다. 배양 후, 플라스미드를 플라스미드 미니 킷[QIAGEN 사]을 사용하여 대장균으로부터 추출하였다.
상기에서 얻은 플라스미드를 주형으로 사용하여 시퀀스 반응을 수행하였다. 시퀀싱 프라이머로서 IRD41 적외선 염료 라벨 M13 전방향 프라이머와 IRD41 적외선 염료 라벨 M13 후방향 프라이머[Nisshinbo에 의해 제조, Aroka 사]를 사용하였다. 반응 액체로 SequiTherm(상표) Long-Read(상표) 싸이클 시퀀싱 킷-LC[EPICENTRE TECHNOLOGIES 제조]를 사용하였다. 4000L Long ReadIR(상표) DNA 시퀀싱 시스템[LI-COR 제조]을 염기 서열의 측정에 사용하였다.
얻은 펙티나투스 프리싱젠시스 DSM6303의 16S rRNA를 코딩하는 유전자와 23S rRNA를 코딩하는 유전자 사이의 "롱" 스페이서 부분의 유전자 서열을 서열번호 1로 표시하였다.
(4) "숏" 스페이서 부분의 클로닝과 시퀀싱
고순도의 PCR 생성물 정제 킷[Baringer Manhaim]을 사용하여 상기 실시예 2-(2)에서 미반응 dNTPs를 PCR 반응 후, 상기 용액으로부터 제거하였다. 이와 같이 제조한 상기 증폭된 DNA 100 ng에 TA 클로닝 킷[INVITROGEN 사]에 포함된 플라스미드 pCR 2.1 2 ㎕, 리가제 1 ㎕ 그리고 완충용액 1 ㎕를 첨가하고, 살균수를 전량이 10 ㎕되도록 첨가하였다. 상기 용액을 14 ℃에서 4시간 동안 반응시킨 후, 상기 용액 2 ㎕와 0.5 Mβ-머캅토에탄올을 대장균 INVα'F 수용성 세포에 넣고, 30분간 얼음에 방치하였다. 그런 다음, 상기 용액을 42 ℃에서 30초간 가열하고, 상기 대장균에 플라스미드 형질전환을 실시하였다. 형질전환된 대장균에 SOC 배지(2.0% 트립톤, 0.5% 효모 추출액, 10.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10.0 mM MgCl2ㆍ6H2O 및 20.0 mM 글루코오스) 250 ㎕을 첨가하고, 혼합물을 37 ℃에서 60분간 진탕한 후, 암피실린 50 ㎍/㎖와 X-Gal 40 ㎍/㎖을 포함하는 LB 평판 배지로 옮겨 37 ℃에서 하룻밤 배양하였다. 발현된 백색의 콜로니를 암피실린 50 ㎍/㎖을 포함하는 LB 액체 배지 3㎖로 접종하여 37 ℃에서 하룻밤 배양하였다. 배양 후, 플라스미드를 플라스미드 미니 킷[QIAGEN]을 사용하여 상기 대장균으로부터 추출하였다.
상기 플라스미드 일부를 취하고 제한효소EcoRI[Takara Shuzo 제조]와 37 ℃에서 60분 동안 반응하고, 아가로스 전기영동법에 의해 분리하였다. DNA를 에티듐 브로마이드로 염색하고 "숏"의 삽입을 확인하였다. 남은 플라스미드 중 500 ng를 30 ℃에서 60분간 제한효소SmaI[TOYOBO 사 제조]와 반응시켰다. 반응액에 3 M 소디움 아세테이트 2 ㎕와 100% 에탄올 500 ㎕을 첨가하고 그 혼합물을 얼음에 15분간 놓고 15000 rpm에서 15분간 원심분리하고, 그 상청액을 제거하였다. 침전물에 70% 에탄올 500 ㎕을 첨가하고 그 혼합물을 15000 rpm에서 15분간 원심분리하고, 그 상청액을 제거한 다음, 10분간 감압 하에 건조시켰다. 살균수를 침전물이 용해될때까지 첨가하고 그 혼합물을 제한효소XbaI[Baringer Manhaim]와 37 ℃에서 60분간 반응시켰다. 반응물에 등량의 페놀/클로로포름(등량의 혼합액)을 첨가하고 서서히 혼합하였다. 상기 혼합액을 15000 rpm에서 15분간 원심분리하여 물층(상층)을 회수하였다. 회수된 액체에 등량의 수포화 에테르를 첨가하고 서서히 혼합하고, 상기 혼합액을 15000 rpm에서 15분간 원심분리하여 에테르 층(상층)을 제거하였다.
남아 있는 물층에 3 M 소디움 아세테이트 2 ㎕와 100% 에탄올 500 ㎕을 첨가하고 그 혼합물을 15분간 얼음에 놓고 15000 rpm에서 15분간 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 침전물에 70% 에탄올 500 ㎕을 첨가하고 그 혼합물을 15000 rpm에서 15분간 원심분리하여 상청액을 제거한 다음, 잔여물을 10분간 감압 하에 건조시킨 후, 살균한 증류수 20 ㎕를 첨가하였다. 상기 용액 5 ㎕에 블런팅 킷[Takara Shuzo 사]에 포함된 10 배 희석한 완충용액 1 ㎕와 살균한 증류수 3 ㎕를 첨가하고 그 혼합물을 70 ℃에서 5분간 유지시키며, T4 DNA 중합효소 1 ㎕를 첨가하고 블런트 엔드를 얻기 위해 37 ℃에서 3분간 유지시켜 말단평활화를 실시하였다. T4 DNA 중합효소를 교반하여 불활성화시킨 후, 라이게이션 용액 A 40 ㎕와 라이게이션 용액 B 10 ㎕을 첨가하고 그 혼합물을 인터널 라이게이션을 행하기 위해 16 ℃에서 30분간 유지시켰다. 상기 반응물 2 ㎕와 0.5 Mβ-머캅토에탄올 2 ㎕를 대장균 INVα'F 수용성 세포에 넣고, 30분간 얼음에 방치하였다. 그 후, 42 ℃에서 30 초간 가열하고 상기 플라스미드를 대장균에 형질전환시켰다.
형질전환된 대장균에 SOC 배지(2.0% 트립톤, 0.5% 효모 추출액, 10.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10.0 mM MgCl2ㆍ6H2O 및 20.0 mM 글루코오스) 250 ㎕을 첨가하고, 혼합물을 37 ℃에서 60분간 흔들어 준 후, 암피실린 50 ㎍/㎖을 포함하는 LB 평판 배지로 옮겨 37 ℃에서 하룻밤 배양하였다. 발현된 흰 콜로니를 암피실린50 ㎍/㎖을 포함하는 LB 액체 배지 3㎖로 접종하여 37 ℃에서 하룻밤 배양하였다. 배양 후, 플라스미드를 플라스미드 미니 킷[QIAGEN 사]을 사용하여 대장균으로부터 추출하였다.
상기에서 얻은 플라스미드를 주형으로 사용하여 시퀀스 반응을 수행하였다. 시퀀싱 프라이머로서 IRD41 적외선 염료 라벨 M13 전방향 프라이머와 IRD41 적외선 염료 라벨 M13 후방향 프라이머[Nisshinbo에 의해 제조, Aroka 사]를 사용하였다. 반응 액체로 SequiTherm(상표) Long-Read(상표) 싸이클 시퀀싱 킷-LC[EPICENTRE TECHNOLOGIES 제조]를 사용하였다. 4000L Long ReadIR(상표) DNA 시퀀싱 시스템[LI-COR 제조]을 염기 서열의 측정에 사용하였다.
얻은 펙티나투스 프리싱젠시스 DSM6303의 16S rRNA를 코딩하는 유전자와 23S rRNA를 코딩하는 유전자 사이의 "숏" 스페이서 부분의 유전자 서열을 서열번호 2로 표시하였다.
실시예 3
PCR 방법에 의해 펙티나쿠스 프리싱젠시스의 검출
(1)펙티나투스 프리싱젠시스의 선별과 합성
서열번호 1과 서열번호 2를 근거로 DNASIS[Hitachi Soft Engineering 사]를 사용하여 펙티나투스 프리싱젠시스에 특이성이 있는 서열을 분석하였다. 서열번호 1의 펙티나투스 프리싱젠시스 16S rRNA를 코딩하는 유전자와 23S rRNA를 코딩하는 유전자 사이의 스페이서 부분의 유전자 서열상에 377에서 395번째의 서열과 서열번호 2의 펙티나투스 프리싱젠시스 16S rRNA를 코딩하는 유전자와 23S rRNA를 코딩하는 유전자 사이의 스페이서 부분의 유전자 서열상에 195에서 213번째의 서열을 선별하였다[서열번호 5].
추가로, 유사 분석은 서열번호 1의 펙티나투스 프리싱젠시스 16S rRNA를 코딩하는 유전자와 23S rRNA를 코딩하는 유전자 사이의 스페이서 부분의 유전자 서열상에 361에서 380번째의 서열과 서열번호 2의 펙티나투스 프리싱젠시스 16S rRNA를 코딩하는 유전자와 23S rRNA를 코딩하는 유전자 사이의 스페이서 부분의 유전자 서열상에 179에서 198번째의 서열을 선별하였다[서열번호 6].
더욱이, 서열번호 10으로 표시된 특이적인 프라이머를 펙티나투스 프리싱젠시스의 16S rRNA를 코딩하는 유전자 서열에 의해 선별하였다. 이들의 올리고뉴클레오티드를 상기 실시예 2-(1)에서와 같은 방법에 의해 화학적으로 합성하였다.
(2) 서열번호 6과 서열번호 10의 서열을 지닌 프라이머에 의한 펙티나투스 프리싱젠시스의 검출과 확인
상시 실시예 1에서 제조된 균의 DNA 용액을 PCR에 의해 상기 실시예 3(서열번호 6과 10)에서 합성된 프라이머로 처리하였다. PCR의 온도 조건은 다음과 같다:
열적 변성; 94 ℃, 30초
어닐링; 55 ℃, 30초
사슬 신장 반응; 72 ℃, 30초, 이를 한싸이클로 하여 35 회 반복하였다. PCR 종료 후, 반응물을 100 V 정전압에서 30분간 아가로스 겔로 전기영동시켰다. 또한, 분자량 마커로서 pHY 마커도 동시에 전기영동시켰다. 전기영동 후, 아가로스 겔을 에티듐 브로마이드 용액 약 0.5 ㎍/㎖ 20분간 염색시킨 후, 자외선 조사 하에서 겔을 관찰하고 겔의 사진 촬영을 하였다. 겔의 관찰 또는 사진에 나타난 증폭된 생성물의 염기 길이를 분자량 마커의 상대적인 이동정도로부터 결정하였다.
도 1에 나타내듯이, 펙티나투스 프리싱젠시스의 경우에만 약 700 bp 및 약 900 bp의 밴드가 확인되었다.
그 결과로부터 서열번호 6 및 서열번호 10의 올리고뉴클레오티드를 PCR 프라이머로 사용할 때, 목적 길이를 가지는 밴드는 펙티나투스 프리싱젠시스의 경우에만 확인하였다. 따라서, 이는 본 발명의 각각의 올리고뉴클레오티드가 펙티나투스 프리싱젠시스의 16S rRNA를 코딩하는 유전자와 23S rRNA를 코딩하는 유전자 사이의 스페이서 부분의 유전자 서열 및 16S rRNA를 코딩하는 유전자를 표적하는 염기 서열을 정확히 인지됨을 보여주었다. 더구나, 같은 부류인 펙티나투스 세레비시이필러스 및 편성 혐기성 균과 그램 양성균에서는 목적 길이를 가지는 밴드를 관찰하지 못했다. 따라서, 펙티나투스 프리싱젠시스를 특이적으로 검출할 수 있으며, 또한 본 발명에 의해 동시에 동정도 할 수 있다는 것을 나타내었다.
실시예 4
펙티나투스 세레비시이필러스의 16S rRNA를 코딩하는 유전자와 23S rRNA를 코딩하는 유전자 사이의 스페이서 부분의 염기 서열의 클로닝 및 결정
(1) PCR에 의한 16S/23S rRNA 스페이서 부분을 증폭하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머의 선별 및 합성
펙티나투스 세레비시이필러스의 16S rRNA 유전자의 염기 서열이 명백하므로[International Journal of Systematic Bacteriology, Vol.40, p.p. 19-27(1990)], 상기 프라이머는 557에서 576번째의 염기 서열을 근거로 선정하였다.
펙티나투스 세레비시이필러스의 23S rRNA 유전자의 염기 서열이 명백하므로[Systemetic Applied Microbiology, Vol.15, p.p. 487-501(1990), EMSL Accession Number x48423], 상기 프라이머는 대응하는 상보적인 서열을 얻기 위해 1에서 20번째의 염기 서열을 근거로 선정되었다. 이 합성은 사와다이 테크놀로지 사에 위탁하였다.
(2) PCR 방법에 의해 16S/23S rRNA 스페이서 부분의 증폭
상기 실시예 1에서 제조한 펙티나투스 세레비시이필러스 DNA 용액 0.1 ㎍을 0.2 ㎖ 튜브[Perkin-Elmer에 의해 제조]에 넣고, rTaq DNA 중합효소 킷[Toyobo 사] 중의 10 배 희석한 완충용액 5 ㎕, 25 mM MgCl23㎕, 2mM dNTP 혼합용액(dATP, dGTP, dCTP 및 dTTP) 5 ㎕, rTaq 중합효소의 5 units/㎕ 0.5 ㎕ 및 상기 실시예 2-(1)에서 제조한 100 mM 프라이머 0.5 ㎕를 상기 용액에 첨가한 다음, 살균 증류수를 가하여 50 ㎕ 용액으로 하였다. 상기 튜브를 자동 유전자 증폭 장치[Perkin Elmer 사]의 온도 싸이클러에 놓고 증폭반응을 수행하였다. 94 ℃ 2.5분 동안 변성, 94 ℃ 30초 동안 변성, 55 ℃ 30초 동안 프라이머 어닐링 및 72 ℃ 30초 동안 합성 반응과 같은 한 싸이클의 반응조건 하에서 30 회 수행하였다. 상기 반응 후, 상기 용액 5 ㎕를 취하여 아가로스 겔 전기영동법을 수행하였다. DNA를 에티듐 브로마이드로 염색하고 증폭된 DNA를 확인하였다. 그 결과, 약 1700 염기쌍(이하, "롱(long)"이라 칭함) DNA와 약 1400 염기쌍(이하, "숏(short)"이라 칭함) DNA가 증폭되었음을 알 수 있었다.
(3) "롱" 스페이서 부분의 클로닝과 시퀀싱
고순도의 PCR 생성물 정제 킷[Baringer Manhaim 사]을 사용하여 비반응 dNTPs를 PCR 반응 후의 반응용액을 제거하였다. 이와 같이 제조한 상기 증폭된 DNA 10 ng에 TA 클로닝 킷[INVITROGEN]에 포함된 플라스미드 pCR 2.1 2 ㎕, 리가제 1 ㎕ 및 완충용액 1 ㎕를 첨가하고, 살균수를 전량 10 ㎕가 되도록 첨가하였다. 상기 용액이 14 ℃에서 4시간 동안 반응한 후, 상기 용액 2 ㎕와 0.5 Mβ-머캅토에탄올을 대장균 INVα'F 수용성 세포에 넣고, 30분간 얼음에 방치하였다. 그런 다음, 상기 용액을 42 ℃에서 30초간 가열하고, 상기 대장균에 플라스미드 형질전환을 실시하였다. 형질전환된 균에 SOC 배지(2.0% 트립톤, 0.5% 효모 추출액, 10.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10.0 mM MgCl2ㆍ6H2O 및 20.0 mM 글루코오스) 250 ㎕을 첨가하고, 혼합물을 37 ℃에서 60분간 진탕한 후, 암피실린 50 ㎍/㎖와 X-Gal 40 ㎍/㎖을 포함하는 LB 평판 배지로 옮겨 37 ℃에서 하룻밤 배양하였다. 발현된 백색의 콜로니를 암피실린 50 ㎍/㎖을 포함하는 LB 액체 배지 3㎖로 접종하여 37 ℃에서 하룻밤 배양하였다.
배양 후, 플라스미드를 플라스미드 미니 킷[QIAGEN]을 사용하여 상기 대장균으로부터 추출하였다. 상기 플라스미드 일부를 취하고 제한효소EcoRI[Takara Shuzo에 의해 제조]에 의해 37 ℃에서 60분간 반응시키고, 아가로스 전기영동법에 의해 분리하였다. DNA를 에티듐 브로마이드로 염색하고 "롱"의 삽입을 확인하였다. 남은 플라스미드 500 ng를 30 ℃에서 60분간 제한효소SmaI[TOYOBO 사에 의해 제조]와 반응시켰다. 반응물에 3 M 소디움 아세테이트 2 ㎕와 100% 에탄올 500 ㎕을 첨가하고 그 혼합물을 얼음에 15분간 놓고 15000 rpm에서 15분간 원심분리하고, 그 상청액을 제거하였다. 침전물에 70% 에탄올 500 ㎕을 첨가하고 그 혼합물을 15000 rpm에서 15분간 원심분리하고, 그 상청액을 제거한 다음, 잔여물을 10분간 감압 하에 건조시켰다. 침전물에 살균수를 가하여 용해시키고 그 혼합물을 제한효소XbaI[Baringer Manhaim 사]와 37 ℃에서 60분간 반응하였다. 반응액에 등량의 페놀/클로로포름(등량의 혼합액)을 첨가하고 서서히 혼합하고, 혼합액을 15000 rpm에서 15분간 원심분리하여 물층(상층)을 회수하였다. 회수된 액체에 등가의 수포화 에테르를 첨가하고 서서히 혼합하고, 상기 혼합액을 15000rpm에서 15분간 원심분리하여 에테르 층(상층)을 제거하였다. 남아 있는 물층에 3 M 소디움 아세테이트 2 ㎕와 100% 에탄올 500 ㎕을 첨가하고 그 혼합물을 15분간 얼음에 놓고 15000 rpm에서 15분간 원심분리하여 상청액을 제거하였다.
침전물에 70% 에탄올 500 ㎕을 첨가하고 그 혼합물을 15000 rpm에서 15분간 원심분리하여 상청액을 제거한 다음, 잔여물을 10분간 감압 하에 건조시키고, 살균 증류수 20 ㎕를 첨가하였다. 상기 용액 5 ㎕에 블런팅 킷[Takara Shuzo 사]에 포함된 10 배 희석한 완충용액 1 ㎕와 살균한 증류수 3 ㎕를 첨가하고 그 혼합물을 70 ℃에서 5분간 유지시킨 후, T4 DNA 중합효소 1 ㎕를 첨가하고 블런트 엔드를 얻기 위해 37 ℃에서 3분간 유지시켜서 말단평활화를 실시하였다. T4 DNA 중합효소를 교반하여 불활성화시킨 후, 라이게이션 용액 A 40 ㎕와 라이게이션 용액 B 10 ㎕을 첨가하고 그 혼합물을 인터널 라이게이션을 행하기 위해 16 ℃에서 30분간 유지시켰다.
상기 반응액 2 ㎕와 0.5 Mβ-머캅토에탄올 2 ㎕를 대장균 INVα'F 수용성 세포에 넣고, 30분간 얼음에 방치하였다. 그 후, 42 ℃에서 30 초간 가열시키고 상기 플라스미드를 대장균에 형질전환시켰다.
형질전환된 대장균에 SOC 배지(2.0% 트립톤, 0.5% 효모 추출액, 10.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10.0 mM MgCl2ㆍ6H2O 및 20.0 mM 글루코오스) 250 ㎕을 첨가하고, 혼합물을 37 ℃에서 60분간 흔들어 준 후, 암피실린 50 ㎍/㎖을 포함하는 LB 평판 배지로 옮겨 37 ℃에서 하룻밤 배양하였다. 발현된 백색의 콜로니를 암피실린 50 ㎍/㎖을 포함하는 LB 액체 배지 3㎖로 접종하여 37 ℃에서 하룻밤 배양하였다. 배양 후, 플라스미드를 플라스미드 미니 킷[QIAGEN 사]을 사용하여 대장균으로부터 추출하였다.
상기에서 얻은 플라스미드를 주형으로 사용하여 시퀀스 반응을 수행하였다. 시퀀싱 프라이머로서 IRD41 적외선 염료 라벨 M13 전방향 프라이머와 IRD41 적외선 염료 라벨 M13 후방향 프라이머[Nisshinbo에 의해 제조, Aroka 사]를 사용하였다. 반응 액체로 SequiTherm(상표) Long-Read(상표) 싸이클 시퀀싱 킷-LC[EPICENTRE TECHNOLOGIES 제조]를 사용하였다. 4000L Long ReadIR(상표) DNA 시퀀싱 시스템[LI-COR 제조]을 염기 서열의 측정에 사용하였다.
얻은 펙티나투스 세레비시이필러스 DSM6303의 16S rRNA를 코딩하는 유전자와 23S rRNA를 코딩하는 유전자 사이의 "롱" 스페이서 부분의 유전자 서열을 서열번호 3으로 표시하였다.
(4) "숏" 스페이서 부분의 클로닝과 시퀀싱
고순도의 PCR 생성물 정제 킷[Baringer Manhaim]을 사용하여 실시예 2-(2)에서 미반응 dNTPs를 PCR 반응 후 상기 용액으로부터 제거하였다. 이와같이 제조한 상기 증폭된 DNA 100 ng에 TA 클로닝 킷[INVITROGEN 사]에 포함된 플라스미드 pCR 2.1 2 ㎕, 리가제 1 ㎕ 및 완충용액 1 ㎕를 첨가하고, 살균수를 전량이 10 ㎕ 되도록 첨가하였다. 상기 용액이 14 ℃에서 4시간 동안 반응한 후, 상기 용액 2 ㎕와 0.5 Mβ-머캅토에탄올을 대장균 INVα'F 수용성 세포에 넣고, 30분간 얼음에 방치하였다. 그런 다음, 상기 용액을 42 ℃에서 30초간 가열하고, 상기 균에 플라스미드 형질전환을 실시하였다. 형질전환된 대장균에 SOC 배지(2.0% 트립톤, 0.5% 효모 추출액, 10.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10.0 mM MgCl2ㆍ6H2O 및 20.0 mM 글루코오스) 250 ㎕을 첨가하고, 혼합물을 37 ℃에서 60분간 진탕한 후, 암피실린 50 ㎍/㎖와 X-Gal 40 ㎍/㎖을 포함하는 LB 평판 배지로 옮겨 37 ℃에서 하룻밤 배양하였다. 발현된 백색의 콜로니를 암피실린 50 ㎍/㎖을 포함하는 LB 액체 배지 3㎖로 접종하여 37 ℃에서 하룻밤 배양하였다. 배양 후, 플라스미드를 플라스미드 미니 킷[QIAGEN]을 사용하여 상기 대장균으로부터 추출하였다.
상기 플라스미드 일부를 취하고 제한효소EcoRI[Takara Shuzo 제조]와 37 ℃에서 60분 동안 반응하고, 아가로스 전기영동법에 의해 분리하였다. DNA를 에티듐 브로마이드로 염색하고 "숏"의 삽입을 확인하였다. 남은 플라스미드 중 500 ng를 30 ℃에서 60분간 제한효소SmaI[TOYOBO 사 제조]와 반응시켰다. 반응액에 3 M 소디움 아세테이트 2 ㎕와 100% 에탄올 500 ㎕을 첨가하고 그 혼합물을 얼음에 15분간 놓고 15000 rpm에서 15분간 원심분리하고, 그 상청액을 제거하였다. 침전물에 70% 에탄올 500 ㎕을 첨가하고 그 혼합물을 15000 rpm에서 15분간 원심분리하고, 그 상청액을 제거한 다음, 10분간 감압 하에 건조시켰다. 침전물에 살균수를 가하여 용해시키고 그 혼합물을 제한효소XbaI[Baringer Manhaim 사]와 37 ℃에서 60분간 반응시켰다. 반응액에 등량의 페놀/클로로포름(등량의 혼합액)을 첨가하고 서서히 혼합하고, 혼합액을 15000 rpm에서 15분간 원심분리하여 물층(상층)을 회수하였다. 회수된 액체에 등량의 수포화 에테르를 첨가하고 서서히 혼합하고, 상기 혼합액을 15000 rpm에서 15분간 원심분리하여 에테르 층(상층)을 제거하였다. 남아 있는 물층에 3 M 소디움 아세테이트 2 ㎕와 100% 에탄올 500 ㎕을 첨가하고 그 혼합물을 15분간 얼음에 놓고 15000 rpm에서 15분간 원심분리하여 상층액을 제거하였다.
침전물에 70% 에탄올 500 ㎕을 첨가하고 그 혼합물을 15000 rpm에서 15분간 원심분리하여 상청액을 제거한 다음, 잔여물을 10분간 감압 하에 건조시킨 후, 살균한 증류수 20 ㎕를 첨가하였다. 상기 용액 5 ㎕에 블런팅 킷[Takara Shuzo 사]에 포함된 10 배 희석한 완충용액 1 ㎕와 살균한 증류수 3 ㎕를 첨가하고 그 혼합물을 70 ℃에서 5분간 유지시키며, T4 DNA 중합효소 1 ㎕를 첨가하고 블런트 엔드를 얻기 위해 37 ℃에서 3분간 유지시켜 말단평활화를 실시하였다. T4 DNA 중합효소를 교반하여 불활성화시킨 후, 라이게이션 용액 A 40 ㎕와 라이게이션 용액 B 10 ㎕을 첨가하고 그 혼합물을 인터널 라이게이션을 행하기 위해 16 ℃에서 30분간 유지시켰다. 상기 반응물 2 ㎕와 0.5 Mβ-머캅토에탄올 2 ㎕를 대장균 INVα'F 수용성 세포에 넣고, 30분간 얼음에 방치하였다. 그 후, 42 ℃에서 30 초간 가열시키고 상기 플라스미드를 대장균에 형질전환시켰다. 형질전환된 대장균에 SOC 배지(2.0% 트립톤, 0.5% 효모 추출액, 10.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10.0 mM MgCl2ㆍ6H2O 및 20.0 mM 글루코오스) 250 ㎕을 첨가하고, 혼합물을 37 ℃에서 60분간 흔들어 준 후, 암피실린 50 ㎍/㎖을 포함하는 LB 평판 배지로 옮겨 37 ℃에서하룻밤 배양하였다. 발현된 백색의 콜로니를 암피실린 50 ㎍/㎖을 포함하는 LB 액체 배지 3㎖로 접종하여 37 ℃에서 하룻밤 배양하였다. 배양 후, 플라스미드를 플라스미드 미니 킷[QIAGEN 사]을 사용하여 대장균으로부터 추출하였다.
상기에서 얻은 플라스미드를 주형으로 사용하여 시퀀스 반응을 수행하였다. 시퀀싱 프라이머로서 IRD41 적외선 염료 라벨 M13 전방향 프라이머와 IRD41 적외선 염료 라벨 M13 후방향 프라이머[Nisshinbo에 의해 제조, Aroka 사]를 사용하였다. 반응 액체로 SequiTherm(상표) Long-Read(상표) 싸이클 시퀀싱 킷-LC[EPICENTRE TECHNOLOGIES 제조]를 사용하였다. 4000L Long ReadIR(상표) DNA 시퀀싱 시스템[LI-COR 제조]을 염기 서열의 결정에 사용하였다.
얻은 펙티나투스 세레비시이필러스의 16S rRNA를 코딩하는 유전자와 23S rRNA를 코딩하는 유전자 사이의 "숏" 스페이서 부분의 유전자 서열을 서열번호 4로 표시하였다.
실시예 5
PCR 방법에 의해 펙티나쿠스 세레비시이필러스의 검출
(1)펙티나투스 세레비시이필러스의 선별과 합성
서열번호 3을 근거로 DNASIS[Hitachi Soft Engineering 사]를 사용하여 펙티나투스 세레비시이필러스에 특이성이 있는 서열을 분석하였다. 서열번호 3의 펙티나투스 세레비시이필러스의 16S rRNA를 코딩하는 유전자와 23S rRNA를 코딩하는 유전자 사이의 스페이서 부분의 유전자 서열상에 135에서 153번째의 서열을 선별하였다[서열번호 7].
추가로, 유사 분석이 서열번호 3의 펙티나투스 세레비시이필러스 16S rRNA를 코딩하는 유전자와 23S rRNA를 코딩하는 유전자 사이의 스페이서 부분의 유전자 서열상에 172에서 191번째의 서열을 선별하였다[서열번호 8].
또한, 유사 분석이 서열번호 3의 펙티나투스 세레비시이필러스 16S rRNA를 코딩하는 유전자와 23S rRNA를 코딩하는 유전자 사이의 스페이서 부분의 유전자 서열상에 203에서 222번째의 서열을 선별하였다[서열번호 9].
더욱이, 서열번호 11로 표시된 특이적인 프라이머를 펙티나투스 세레비시이필러스의 16S rRNA를 코딩하는 유전자 서열에 의해 선별하였다. 이들의 올리고뉴클레오티드를 상시 실시예 2-(1)에서와 같은 방법에 의해 화학적으로 합성하였다.
(2) 서열번호 7과 서열번호 11의 서열을 지닌 프라이머에 의한 펙티나투스 세레비시이필러스의 검출과 확인
상시 실시예 1에서 제조된 균의 DNA 용액가 PCR에 의해 상기 실시예 5-(1)[서열번호 7과 11]에서 합성된 프라이머로 처리되었다. PCR의 온도 조건은 다음과 같다:
열적 변성; 94 ℃, 30초
어닐링; 55 ℃, 30초
사슬 신장 반응; 72 ℃, 30초를 한 싸이클로 하여 이를 35 회 반복하였다. PCR 종료 후, 반응물을 100 V 정전압 하에서 30분간 아가로스 겔로 전기영동시켰다. 또한 분자량 마커로서 pHY 마커도 동시에 전기영동시켰다. 전기영동 후, 아가로스 겔을 에티듐 브로마이드 용액 5 ㎍/㎖로 20분간 염색시킨 후, 자외선을 조사하여 겔을 관찰하고 겔의 사진 촬영을 하였다. 겔의 관찰 또는 사진에 의해 증폭된 생성물의 염기 길이를 분자량 마커의 상대적인 이동정도로부터 결정하였다.
도 2에 나타냈듯이, 펙티나투스 세레비시이필러스의 경우에 약 600 bp의 밴드가 확인되었다.
그 결과로부터 서열번호 7 및 서열번호 11의 올리고뉴클레오티드를 PCR 프라이머로 사용했을 때, 목적 길이를 가지는 밴드는 펙티나투스 세레비시이필러스의 경우에만 검출하였다. 따라서, 이는 본 발명의 각각의 올리고뉴클레오티드가 펙티나투스 세레비시이필러스의 16S rRNA를 코딩하는 유전자와 23S rRNA를 코딩하는 유전자 사이의 스페이서 부분의 유전자 서열 및 16S rRNA를 코딩하는 유전자를 표적하는 염기 서열을 정확히 인지됨을 보여주었다. 더구나, 같은 균류인 펙티나투스 프리싱젠시스 및 편성 혐기성 균과 그램 양성균에서는 목적 길이를 가지는 밴드를 관찰하지 못했다. 따라서, 펙티나투스 세레비시이필러스는 특이적으로 검출될 수 있으며, 또한 동시에 본 발명에 의해 측정될 수 있다.
본 발명에 의해 펙티나투스 프리싱젠시스 및 펙티나투스 세레비시이필러스의 16S rRNA를 코딩하는 유전자와 23S rRNA를 코딩하는 유전자 사이에 구성하고 있는 스페이서 부분의 유전자가 명확하게 되고, 유전자 서열의 일부 또는 모두를 사용함으로써 빠르고 확실한 펙티나투스 프리싱젠시스와 펙티나투스 세레비시이필러스를 검출하는 방법을 제공하게 된다.

Claims (12)

  1. 서열번호 1로 표시된 염기 서열 전체 또는 일부를 포함하는 펙티나투스 프리싱젠시스(Pectinatue frisingensis)의 16S rRNA를 코딩하는 유전자와 23S rRNA를 코딩하는 유전자와의 사이의 스페이서 부분의 유전자 서열.
  2. 서열번호 2로 표시된 염기 서열 전체 또는 일부를 포함하는 펙티나투스 프리싱젠시스의 16S rRNA를 코딩하는 유전자와 23S rRNA를 코딩하는 유전자와의 사이의 스페이서 부분의 유전자 서열.
  3. 서열번호 3으로 표시된 염기 서열 전체 또는 일부를 포함하는 펙티나투스 세레비시이필러스(Pectinatus cerevisiiphilus)의 16S rRNA를 코딩하는 유전자와 23S rRNA를 코딩하는 유전자와의 사이의 스페이서 부분의 유전자 서열.
  4. 서열번호 4로 표시된 염기 서열 전체 또는 일부를 포함하는 펙티나투스 세레비시이필러스의 16S rRNA를 코딩하는 유전자와 23S rRNA를 코딩하는 유전자와의 사이의 스페이서 부분의 유전자 서열.
  5. 펙티나투스 프리싱젠시스의 16S rRNA를 코딩하는 유전자와 23S rRNA를 코딩하는 유전자와의 사이의 스페이서 부분의 유전자 서열이 적어도 다음 서열 또는 이와 대응하는 상보적인 서열 중 하나 이상인 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드:
    5'-CCATCCTCTTGAAAATCTC-3' ①
    5'-TCTCRTCTCACAAGTTTGGC-3' ②.
  6. 펙티나투스 세레비지이필러스의 16S rRNA를 코딩하는 유전자와 23S rRNA를 코딩하는 유전자와의 사이의 스페이서 부분의 유전자 서열이 적어도 다음 서열 또는 이와 대응하는 상보적인 서열 중 하나 이상인 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드:
    5'-CACTCTTACAAGTATCTAC-3' ③
    5'-CCACAATATTTCCGACCAGC-3' ④
    5'-AGTCTTCTCTACTGCCATGC-3' ⑤.
  7. 상기 청구항 1 또는 청구항 2에 기재된 유전자 서열로부터 만들어진 올리고뉴클레오티드를 핵산 합성의 프라이머로 사용하는 펙티나투스 프리싱젠시스 검출방법과 세균을 검출하기 위해 유전자 증폭에 의한 상기 핵산의 처리방법.
  8. 상기 청구항 3 또는 청구항 4에 기재된 유전자 서열로부터 만들어진 올리고뉴클레오티드는 핵산 합성의 프라이머로 사용하는 펙티나투스 세레비시이필러스 검출법과 세균을 검출하기 위해 유전자 증폭에 의한 상기 핵산의 처리방법.
  9. 상기 청구항 1 또는 청구항 2에 기재된 유전자 서열로부터 만들어진 올리고뉴클레오티드 또는 상기 청구항 5의 유전자 서열로부터 만들어진 올리고뉴클레오티드, 와 펙티나투스 프리싱젠시스의 16S rRNA 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 핵산 합성의 프라이머로 사용하는 펙티나투스 프리싱젠시스 검출법과, 세균을 검출하기 위해 유전자 증폭에 의한 상기 핵산의 처리방법.
  10. 상기 청구항 3 또는 청구항 4에 기재된 유전자 서열로부터 만들어진 올리고뉴클레오티드 또는 상기 청구한 6에 기재된 유전자 서열로부터 만들어진 올리고뉴클레오티드와 펙티나투스 세레비시이필러스의 16S rRNA 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 핵산 합성의 프라이머로 사용하는 펙티나투스 세레비시이필러스 검출법과 세균을 검출하기 위해 유전자 증폭에 의한 상기 핵산의 처리방법.
  11. 제 9 항에 있어서, 펙티나투스 프리싱젠시스의 16S rRNA 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 다음 서열과 같은 방법:
    5'-CGTATCCAGAGATGGATATT-3' ⑥
  12. 제 10 항에 있어서, 펙티나투스 세레비시이필러스의 16S rRNA 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 다음 서열과 같은 방법:
    5'-CGTATGCAGAGATGCATATT-3' ⑦
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