KR102184743B1 - 락토바실러스 파라카제이 아종 파라카제이 판별용 마커 및 이의 용도 - Google Patents

락토바실러스 파라카제이 아종 파라카제이 판별용 마커 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 락토바실러스 파라카제이 아종 파라카제이(Lactobacillus paracasei subsp. paracasei) 특이 검출 및 선발을 위한 마커 및 이를 이용한 분석 방법에 관한 것으로, 김치, 막걸리 등의 발효식품 등에서 발견되는 유산균인 락토바실러스 파라카제이 아종 파라카제이(Lactobacillus paracasei subsp. paracasei)를 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머 세트를 통해 락토바실러스 파라카제이 아종 파라카제이(Lactobacillus paracasei subsp. paracasei)를 정량 및 정성 분석할 수 있고, 막걸리 및 김치 내 락토바실러스 파라카제이 아종 파라카제이(Lactobacillus paracasei subsp. paracasei)의 밀도 변화를 모니터링할 수 있다.

Description

락토바실러스 파라카제이 아종 파라카제이 판별용 마커 및 이의 용도{Marker for discriminating Lactobacillus paracasei subsp. paracasei and use thereof}
본 발명은 락토바실러스 파라카제이 아종 파라카제이 특이 검출 및 선발을 위한 마커 및 이를 이용한 판별 방법에 관한 것이다.
젖산균은 글루코오스 등 당류를 분해하여 젖산을 생성하는 세균으로 유산균이라고도 불리며, 젖산발효에 의해 생성되는 젖산에 의해서 병원균과 유해세균의 생육이 저지되는 성질을 유제품·김치류·양조식품 등의 식품제조에 이용하고 있다. 또한, 젖산균은 포유류의 장내에 서식하여 잡균에 의한 이상발효를 방지하여 정장제로도 이용되고 있다. 상기 유산균은 그람양성균으로, 통성혐기성 또는 혐기성을 성질을 지니며, 락토바실러스 속과 스트렙토코쿠스 속에 여러 종류가 알려져 있다.
김치는 유산균(젖산균)에 의하여 발효되는 한국 전통 식품으로, 김치에서 분류된 젖산균(유산균)으로는 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides), 류코노스톡 덱스트라니쿰(Leuconostoc dextranicum), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 페디오코코스 펜토사쿠스(Pediococcus pentosacues), 락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei)등이 있다.
일반적으로 김치가 발효되면서 발효 초기에 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides)를 포함한 류코노스톡들이 우세하게 증식하여 초기의 산 생성을 주도하여 김치 발효에 관여하며, 점차 pH가 감소함에 따라 처음에 왕성했던 류코노스톡 균주의 수도 감소하게 된다. 반면, 발효 후기에는 산에 내성적인 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) 등의 락토바실러스 균들이 활발하게 활동하여 락토바실러스 균의 수가 점차 증가하면서 김치가 시어지게 된다.
다만, 종래 유산균을 분석하기 위해 김치와 같은 발효물 내에 존재하는 유산균을 유산균에 특이적인 배양조건상에서 도말 배양함으로써 형성된 콜로니(colony)의 형태나 수를 확인해왔다. 그러나, 도말 배양은 인위적인 배양조건에서 생존할 수 있는 미생물의 개체 수만 측정할 수 있어, 실제 김치에 존재하여 발효에 중요한 역할을 하는 미생물이 시료의 준비과정이나 배양과정에서 사멸될 수 있으며, 미생물이 배양이 된다 하더라도 균주가 콜로니를 형성하기까지 다소 시간이 소요되며, 특이성(specificity)과 민감성(sensitivity)이 낮은 단점이 있었다. 또한, 유산균이 함유된 제품에서 유전적으로 비슷한 성질을 가지는 락토바실러스를 분리 및 동정하기 위해서는 많은 시간과 비용이 필요하였다.
이에 따라, 유전적 성질이 비슷한 락토바실러스 종들을 정확하고 간단하게 동정할 수 있는 새로운 기술 개발의 필요성이 존재하였다.
대한민국공개특허 제10-2015-0075994호
본 발명의 하나의 목적은 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 프라이머를 포함하는 락토바실러스 파라카제이 아종 파라카제이(Lactobacillus paracasei subsp. paracasei) 판별용 프라이머 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 락토바실러스 파라카제이 아종 파라카제이(Lactobacillus paracasei subsp. paracasei) 판별용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 락토바실러스 파라카제이 아종 파라카제이(Lactobacillus paracasei subsp. paracasei) 판별용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 시료에서 분리된 DNA를 주형으로 하고, 제1항의 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 단계로부터 얻은 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는 락토바실러스 파라카제이 아종 파라카제이(Lactobacillus paracasei subsp. paracasei)의 판별방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 프라이머를 포함하는 락토바실러스 파라카제이 아종 파라카제이(Lactobacillus paracasei subsp. paracasei) 판별용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 용어 "프라이머"란, 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.
본 발명의 용어 "프라이머 세트(a pair of primers)"란 판별 대상 유전자를 PCR을 이용하여 증폭시키기 위한 염기서열들로, 하나의 진단대상 유전자에 정방향 프라이머와 역방향 프라이머가 세트를 이루어 반응하여 PCR 산물을 합성한다. 이때, 상기 정방향과 역방향 프라이머 세트가 결정되면 이로부터 합성되는 PCR 생성물의 크기를 예측할 수 있다.
상기 프라이머들은 락토바실러스 파라카제이 아종 파라카제이(Lactobacillus paracasei subsp. paracasei)의 가설적 단백질(hypothetical protein)(등록번호: GenBank accession protein ID ABJ69457.1)을 코딩하는 유전자(GenBank accession CP000423.1, 위치 605385-605744)를 증폭할 수 있다.
구체적으로, 상기 프라이머 세트는 락토바실러스 파라카제이 아종 파라카제이(Lactobacillus paracasei subsp. paracasei)의 가설적 단백질(hypothetical protein)(등록번호: GenBank accession protein ID ABJ69457.1)을 코딩하는 유전자(GenBank accession CP000423.1)의 위치 605385번 내지 605744번 중에서 605,482번 에서 605,636번에 해당하는 155bp(서열번호 3)의 핵산 단편을 증폭시키는 프라이머 세트일 수 있다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 락토바실러스 파라카제이 아종 파라카제이(Lactobacillus paracasei subsp. paracasei) 판별용 조성물을 제공한다.
본 발명의 락토바실러스 파라카제이 아종 파라카제이(Lactobacillus paracasei subsp. paracasei) 판별용 조성물은 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함한다.
본 발명의 용어 "프라이머", "프라이머 세트(a pair of primers)" 에 대한 설명은 전술한 바와 같다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 락토바실러스 파라카제이 아종 파라카제이(Lactobacillus paracasei subsp. paracasei) 판별용 키트를 제공한다.
본 발명의 판별용 키트는 PCR 분석 또는 multiplex-PCR 분석을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. 상기 키트는, 상기 각 폴리뉴클레오티드에 대한 특이적인 각각의 프라이머 세트 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한, PCR 산물의 증폭 여부를 확인할 수 있는 전기영동 수행에 필요한 구성성분 또는 공지된 종에 대한 동정 기준표들이 본 발명의 키트에 추가로 포함될 수 있다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 시료에서 분리된 DNA를 주형으로 하고, 제1항의 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 단계로부터 얻은 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는 락토바실러스 파라카제이 아종 파라카제이(Lactobacillus paracasei subsp. paracasei)의 판별방법을 제공한다.
상기 시료는 락토바실러스 파라카제이 아종 파라카제이(Lactobacillus paracasei subsp. paracasei) 판별용 키트를 포함한 유산균 또는 유산균을 포함한 발효식품, 유제품 등 식품으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 보다 구체적으로 막걸리, 김치 또는 김치 국물을 이용할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 판별방법에 있어서, 상기 락토바실러스 파라카제이 아종 파라카제이(Lactobacillus paracasei subsp. paracasei)의 가설적 단백질(hypothetical protein)을 코딩하는 유전자의 DNA는 게놈 DNA와 클론(cloned) DNA를 포함한다. 상기 DNA는 본 발명의 기술분야에서 통상적으로 사용되는 SDS 추출법(Tai et al. Plant Mol. Biol. Reporter, 8:297-303, 1990), CTAB 분리법(Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide; Murray et al. Nuc. Res., 4321-4325, 1980) 또는 상업적으로 판매되는 DNA 추출 키트를 이용하여 분리될 수 있으며, 예를 들면, Fast DNA spin kit for soil(Mp Biomedicals)나 게놈(genomic) DNA 추출 키트(DNeasyⓡBlood & Tissue Kit, Qiagen, Hilden, Germany)를 이용할 수 있다.
상기 분리된 DNA를 주형으로 하고, 본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하여 락토바실러스 파라카제이 아종 파라카제이(Lactobacillus paracasei subsp. paracasei)의 가설적 단백질(hypothetical protein)을 코딩하는 유전자의 표적 서열을 증폭할 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "증폭 반응"은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 본 발명의 기술 분야에 보고되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(PCR)(미국 특허 제4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159호), 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H. I.(WO 89/06700) 및 Davey, C.등(EP 329,822)의 방법, 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구 연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사 중재 증폭(transcription-mediated amplification; TMA)(WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication)(20)(WO90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences)(미국 특허 제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction; CPPCR)(미국 특허 제4,437,975호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction; AP-PCR)(미국 특허 제5,413,909호 및 제5,861,245호), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA)(미국 특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호, 및 제6,063,603호), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification), 고리-중재 항온성 증폭(loop mediated isothermal amplification; LAMP), Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 반응, 또는 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system) 등을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 사용 가능한 다른 증폭방법들은 미국특허 제5,242,794호, 제5,494,810호, 제4,988,617호 및 미국 특허 출원 제09/854,317호에 기술되어 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 증폭 반응으로 실시간(Real time) PCR을 수행한다. 실시간 PCR은 PCR 증폭 산물의 증가를 실시간으로 모니터링하여 분석하는 기술로, PCR 생산물의 증가가 타겟 주형의 초기 양과 비례하는 지수기(exponential phase) 동안 각 사이클(cycle)에서 형광 방출량을 기록하여 PCR 반응을 모니터링할 수 있다. 핵산 타겟의 출발 카피 수가 높을수록, 형광 증가가 더 빨리 관찰되고 더 낮은 CT 값(threshold cycle)을 가지게 된다. 3-15 사이클 사이에서 측정된 기준값보다 높은 형광의 뚜렷한 증가는 축적된 PCR 생산물의 검출을 의미한다.
종래의 PCR 방법에 비해, 실시간 PCR은 다음과 같은 장점을 가진다: (a) 종래의 PCR은 정체 상태(plateau)에서 측정되는 반면에, 실시간 PCR은 지수성장기(exponential growth phase) 동안 데이터를 얻을 수 있다; (b) 리포터 형광 시그널의 증가는 발생된 앰플리콘(amplicons)의 수와 직접적으로 비례한다; (c) 분해된 프로브는 앰플리콘의 영구적인 기록 증폭(record amplification)을 제공한다; (d) 검출 범위의 증가; (e) 종래 PCR 방법에 비해 1,000배 이상 적은 핵산을 필요로 한다; (f) 전기영동을 통한 분리 없이 증폭된 DNA의 검출이 가능하다; (g) 작은 앰플리콘 크기를 이용하여 증가된 증폭 효율을 획득할 수 있다; 및 (h) 오염 위험성이 적다.
PCR 증폭 산물량은 형광으로 검출 가능한 양에 도달하면 증폭곡선이 일어나기 시작해 지수적으로 시그널이 상승하다가 정체 상태에 도달한다. 초기 DNA량이 많을수록 증폭 산물량이 검출 가능한 양에 달하는 사이클 수가 적어지므로 증폭곡선이 빨리 나타난다. 따라서, 단계적으로 희석한 표준시료를 사용하여 실시간 PCR 반응을 하면 초기 DNA량이 많은 순서로 같은 간격으로 늘어선 증폭 곡선이 얻어진다. 여기서 적당한 지점에 한계치(threshold)를 설정하면 한계치와 증폭 곡선이 교차하는 지점 CT 값이 산출된다.
실시간 PCR에서는 PCR 증폭 산물을 형광을 통해 검출한다. 검출 방법은 크게 인터킬레이팅(interchelating) 방법(SYBR 그린I 방법)와 형광 표지 프로브를 이용하는 방법(TaqMan 프로브 방법) 등이 있다. 인터킬레이팅 방법은 이중 가닥 DNA를 모두 검출하기 때문에 유전자별 프로브를 준비할 필요가 없어 저렴한 비용으로 반응계를 구축할 수 있다. 형광 표지 프로브를 이용하는 방법은 고비용이 드는 반면에 검출 특이성이 높아 유사 서열까지도 구별해서 검출할 수 있다.
상기 실시간 PCR에 의한 락토바실러스 파라카제이 아종 파라카제이(Lactobacillus paracasei subsp. paracasei)의 가설적 단백질(hypothetical protein)을 코딩하는 유전자의 검출을 위한 최소 DNA 양은 5 fg(femtogram) 내지 5 ng(nanogram)인 것이 바람직하고, 최소 5 fg만 있어도 검출이 가능하므로 검출감도가 매우 높은 것이다.
본 발명의 판별방법에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출 가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭 시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행 시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 프라이머 세트는 상기에 기재된 바와 같다.
본 발명의 판별방법에 있어서, 상기 증폭 산물의 검출은 젤 전기영동, 모세관 전기영동, DNA 칩, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법의 하나로서, 젤 전기영동을 수행할 수 있으며, 젤 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아크릴아미드 젤 전기영동 또는 아가로스 젤 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABi Sequencer를 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행 시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 락토바실러스 파라카제이 아종 파라카제이(Lactobacillus paracasei subsp. paracasei)의 가설적 단백질(hypothetical protein)을 코딩하는 유전자에 특이적인 서열번호 1의 프라이머 및 서열번호 2의 프라이머는 같은 속 다른 종의 균주들은 검출하지 못한 반면, 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei)의 종만을 특이적으로 검출하였다(도 2 참조). 또한, 게놈 DNA와 클론 DNA는 각각 50 fg 및 5 fg, 세포 현탁액에서는 5.92Х 104 (CFU/mL)에서도 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei)을 안정적으로 정량 검출할 수 있음을 확인할 수 있었다(표 2 참조).
또한, 본 발명의 서열번호 1의 프라이머 및 서열번호 2의 프라이머는 락토바실러스 파라카제이 아종 파라카제이(Lactobacillus paracasei subsp. paracasei)에 특이적이고 민감성이 높다. 따라서 본 발명의 프라이머 세트는 실시간 PCR 방법을 통해 락토바실러스 파라카제이 아종 파라카제이(Lactobacillus paracasei subsp. paracasei)의 정량, 정성 분석과 김치 내에서 락토바실러스 파라카제이 아종 파라카제이(Lactobacillus paracasei subsp. paracasei)의 밀도 변화를 신속, 정확하게 판단할 수 있다.
본 발명은 김치 및 발효식품 등에서 발견되는 유산균인 락토바실러스 파라카제이 아종 파라카제이(Lactobacillus paracasei subsp. paracasei)를 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머 세트를 통해 락토바실러스 파라카제이 아종 파라카제이(Lactobacillus paracasei subsp. paracasei)를 정량 및 정성 분석할 수 있고, 막걸리 또는 김치 내 락토바실러스 파라카제이 아종 파라카제이(Lactobacillus paracasei subsp. paracasei)의 밀도 변화를 모니터링할 수 있다.
도 1은 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei ATCC 334의 가설적 단백질을 코딩하는 유전자의 Blastn 검색 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 LaCa155F/R 프라이머 세트를 사용한 PCR 증폭 결과를 도시한 것이다. M은 사이즈 마커(1 kb DNA plus ladder; Gibco BRL)이고, 레인 1 내지 6은 Lactobacillus paracasei strain이며, 레인 7 내지 37은 표 1에 나열된 바와 같은 락토바실러스(Lactobacillus), 류코노스톡(Leuconostoc), 락토코커스(Lactococcus) 및 웨이셀라(Weissella) 종에 속하는 균주들을 포함한다. 레인 38은 음성대조군으로 물을 나타낸다.
도 3은 표 1에 기재된 37종의 미생물을 대상으로, 종-특이적인 LaCa155F/R 프라이머 세트를 이용한 Lactobacillus paracasei 유래의 가설적 단백질(hypothetical protein)을 코딩하는 유전자의 실시간 PCR 결과이다. 도 3에서 멜팅-피크는 약 85.0℃의 융점(Tm)에서 증폭된 산물을 나타낸다. 레인 38은 음성대조군으로 물을 나타낸다.
도 4는 표준 희석 계열에서 실시간 PCR의 민감성을 나타낸 것이다. 표준 곡선은 락토바실러스 파라카제이 아종 파라카제이(Lactobacillus paracasei subsp. paracasei) 표준 희석의 교차점으로 알려진 threshold cycles (Ct)로부터 생성된다. 모든 곡선은 R2>0.99인 것으로 입증되었다. a. 게놈 DNA, b. 클론 DNA, c. 세균 세포 현탁액.
도 5는 4 ℃에서 발효된 생 막걸리에서 분리된 총 DNA에서 락토바실러스 파라카제이 아종 파라카제이(Lactobacillus paracasei subsp. paracasei)의 정량에 대한 실시간 PCR Ct 값의 변화를 도시한 것이다.
도 6은 4 ℃에서 발효된 2 종류의 배추 김치에서 분리된 총 DNA에서 락토바실러스 파라카제이 아종 파라카제이(Lactobacillus paracasei subsp. paracasei)의 정량에 대한 실시간 PCR Ct 값의 변화를 도시한 것이다.
도 7은 15 및 25 ℃에서 발효된 2 종류의 배추 김치에서 분리된 총 DNA에서 락토바실러스 파라카제이 아종 파라카제이(Lactobacillus paracasei subsp. paracasei)의 정량에 대한 실시간 PCR Ct 값의 변화를 도시한 것이다.
이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 첨부한 도면을 참고로 하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.
<실시예 1> 락토바실러스 파라카제이 아종 파라카제이( Lactobacillus paracasei subsp. paracasei )에 특이적인 프라이머 제작
(1) Bacterial strain과 배양 조건
본 발명에서 사용된 락토바실러스 파라카제이 아종 파라카제이(Lactobacillus paracasei subsp. paracasei)를 포함한 기타 미생물은 벨기에의 the Belgian Co-ordinated Collections of Microorganisms (BCCMTM)와 Korean Agricultural Culture Collection, Republic of Korea (KACC), Korean Collection for Type Cultures (KCTC)에서 분양 받았으며, 이들의 출처는 표 1에 정리하였다. Lactobacillus species 균주들은 MRS배지(OXOID CM0361)로 28, 30, 37℃에서 각각 하루 배양하였다.
No. Bacterial strain Source Biological origin
1 Lactobacillus paracasei subsp. paracasei KCTC 3510T Milk products
2 Lactobacillus paracasei subsp. paracasei KCTC 3165 Emmetal cheese
3 Lactobacillus paracasei subsp. paracasei KCTC 3166 Pasteurized milk
4 Lactobacillus paracasei subsp. paracasei KCTC 3169 Cheese
5 Lactobacillus paracasei subsp. paracasei KCTC 13090 Corn steep ilquor
6 Lactobacillus paracasei subsp. paracasei ATCC 334 Emmetal cheese
7 Lactobacillus paracasei subsp. tolerans KCTC 3074T Pasteurized milk
8 Lactobacillus casei LMG 6904T Cheese
9 Lactobacillus zeae KCTC 3804T Corn steep ilquor
10 Lactobacillus rhamnosus KCTC 3237T N.D.
11 Lactobacillus sakei KACC 12414T Starter of sake(Moto)
12 Lactobacillus sakei subsp. carnosus LMG 18295T Raw sausage
13 Lactobacillus curvatus KACC 12415T N.D.
14 Lactobacillus bifermentans LMG 9845T Blown Dutch cheese
15 Lactobacillus gasseri LMG 9203T Human
16 Lactobacillus jensenii KACC 12437T Human vaginal discharge
17 Lactobacillus delbrueckii spp. bulgaricus LMG 6901T Bulgarian yoghurt
18 Lactobacillus kalixensis KACC 12398T Gastric biopsies, human stomach mucosa
19 Lactobacillus amylolyticus LMG 18796T Acidified beer wort
20 Lactobacillus intestinalis KACC 12368T Intestine of rat
21 Lactobacillus acetotolerans KACC 12447T Fermented vinegar broth
22 Lactobacillus amylovorus KACC 12435T Cattle waste-corn fermentation
23 Lactobacillus helveticus LMG 6413T Swiss Emmental cheese
24 Lactobacillus crispatus LMG 9479T Eye
25 Lactobacillus salivarius LMG 9477T Saliva
26 Lactobacillus pentosus LMG 10755T N.D.
27 Lactobacillus plantarum subsp. plantarum LMG 6907T Pickled cabbage
28 Lactobacillus reuteri KACC 11452T Human feces
29 Lactobacillus rossiae KACC 12391T Wheat sourdough
30 Lactobacillus brevis LMG 6906T Human, faeces
31 Lactobacillus collinoides LMG 9194T Fermenting apple juice
32 Lactobacillus buchneri LMG 6892T Tomato pulp
33 Lactobacillus hilgardii LMG 6895T Wine
34 Lactobacillus sanfranciscensis LMG 16002T San Francisco sourdough
35 Leuconostoc mesenteroides KACC 12312 T Fermenting olives
36 Lactococcus lactis KACC 13877 T N.D.
37 Weissella cibaria KACC 11862T Chili bo
ATCC, American Type Culture Collection, USA;
KCTC, Korean Collection for Type Cultures, Republic of Korea;
KACC, Korean Agricultural Culture Collection, Republic of Korea; LMG, The Belgian Co-ordinated Collections of Microorganisms (BCCMTM), Belgium
N.D., Not determined.
T Type strain.
(2) 총 DNA의 추출
배양된 균주의 총 DNA는 Qiagen (Hilden, Germany)사의 genomic DNA 추출 키트 (DNeasy￠
Figure 112019062369606-pat00001
Blood & Tissue Kit)를 이용하여 추출하였다.
(3) 특이 염기서열 정보 탐색을 위한 blastn 프로그램 이용 분석
락토바실러스 파라카제이 아종 파라카제이(Lactobacillus paracasei subsp. paracasei)를 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 세트의 제작을 위해 National Center for Biotechnology Information (NCBI)의 Genbank(www.ncbi.nlm.nih.gov/)에 등록된 락토바실러스 파라카제이 아종 파라카제이(Lactobacillus paracasei subsp. paracasei) ATCC 334의 유전체 정보 중 가설적 단백질(hypothetical protein)(GenBank accession: protein ID ABJ69457.1)을 코딩하는 유전자(GenBank accession: CP000423.1, 위치 605385-605744)를 blastn 및 blastx 프로그램을 통해 특이성을 확인하고 primer를 제작하였다(도 1 참조).
(4) 특이 프라이머 제작
락토바실러스 파라카제이 아종 파라카제이(Lactobacillus paracasei subsp. paracasei)에서 155bp 크기의 단편(서열번호 3)을 증폭하는 LaCa155F와 LaCa155R 프라이머 세트를 제작하였다. 프라이머의 서열은 다음과 같다.
Figure 112019062369606-pat00002
LaCa155F 프라이머 : 5'-CCT CCA TCG GTG AAG TCG TCG TG-3' 23mer(서열번호 1)
Figure 112019062369606-pat00003
LaCa155R 프라이머 : 5'-TTG TCC GCC TTC GCT GGT CTG T-3' 22mer(서열번호 2)
<실시예 2> PCR 증폭 반응
PCR 증폭 반응은 PTC-200TM thermo cycler (MJ research, Watertown, mass)를 사용하여 실시하였으며, 각 반응은 Tris-HCl 10mM, KCl 50mM, MgCl2 1.5mM, 젤라틴 0.01%, dNTP 각각 0.2mM, 프라이머 각각 20pM, Taq polymerase 2unit (Promega, Madison, Wis.)을 함유하는 PCR 혼합액으로 총 25㎕의 양으로 수행하였다. 상기 PCR 혼합액에 첨가한 미생물의 게놈 DNA 양은 약 25ng이었다. 반응은 95℃에서 5분간 변성하고 95℃ 60초, 65℃ 30초, 72℃ 60초로 35회 반복시킨 후 72℃에서 10분간 반응하였다. 증폭반응 후 10㎕의 PCR 산물을 LoadingStar(DYNEBIO, Republic of Korea)로 착색시켜 1.5% 농도의 아가로스 젤(agarose gel)에서 전기영동한 후 UV transilluminator에서 확인하였다.
<실시예 3> 실시간(Real-time) PCR 특이성 분석
Real-time PCR 증폭 반응은 CFX96 Real-time PCR system (Bio-Rad laboratories, Inc., USA)를 사용하여 실시하였으며, 각 반응은 TB-Green premix Ex Taq (2x) (TAKARA Bio, Inc., Japan)과 LaCa155F/R 프라이머 각각 5pM을 함유하는 Real-time PCR 혼합액으로 총 20㎕의 양으로 수행하였다. Real-time PCR 혼합액에 첨가한 미생물의 genomic DNA 양은 약 5ng이었다. 반응은 95℃에서 30초간 변성하고 95℃ 5초, 65℃ 30초로 40회 반복시킨 후 95℃에서 15초간 반응시킨 뒤, melting curve와 melting peak를 위해 65~95℃까지 5초마다 0.5℃씩 증가시켰다(도 3).
<실시예 4> 실시간(Real-time) PCR 민감도 분석
Real-time PCR 증폭 반응은 CFX96 Real-time PCR system (Bio-Rad laboratories, Inc., USA)를 사용하여 실시하였으며, 각 반응은 SYBR premix Ex Taq (2x) (TAKARA Bio, Inc., Japan)과 LaCa155F/R 프라이머 각각 10pM을 함유하는 Real-time PCR 혼합액으로 총 20㎕의 양으로 수행하였다. 락토바실러스 파라카제이 아종 파라카제이(Lactobacillus paracasei subsp. paracasei) KCTC3510 genomic DNA와 cloned DNA 양은 약 5ng에서부터 10배씩 희석하였고, 미생물 현탁액은 O.D 600에서 0.1이 되게 맞춘 후 10배씩 희석하여 Real-time PCR 혼합액에 첨가하였다. Real-time PCR 증폭반응은 95℃에서 30초간 변성하고 95℃ 5초, 67℃ 30초로 40회 반복시킨 후 95℃에서 15초간 반응시킨 뒤, melting curve와 melting peak를 위해 65~95℃까지 5초마다 0.5℃씩 증가시켰다(표 2).
표 2는 락토바실러스 파라카제이 아종 파라카제이(Lactobacillus paracasei subsp. paracasei) KCTC3510의 클론 DNA, 게놈 DNA 및 세포 현탁액을 10배씩 단계적으로 희석하여 실시간 PCR 분석을 진행한 평균 Ct end-point fluorescence을 나타내며, 도 4는 표준 희석 계열(standard dilution series)에서 실시간 PCR의 민감성을 나타낸다.
Cloned DNA Genomic DNA Cell suspension
Weight/μl reaction mix Ct ± SD
(n = 3)		 Weight/μl reaction mix Ct ± SD
(n = 3)		 CFU/ml reaction mix Ct ± SD
(n = 3)
5 ng (1.40 × 109copies) 13.73 ± 0.23 5 ng 18.14 ± 0.23 5.92 × 108 20.04 ± 0.04
500 pg (1.40 × 108copies) 17.13 ± 0.14 500 pg 21.72 ± 0.10 5.92 × 107 23.26 ± 0.05
50 pg (1.40 × 107copies) 20.44 ± 0.11 50 pg 25.12 ± 0.03 5.92 × 106 26.40 ± 0.10
5 pg (1.40 × 106copies) 23.91 ± 0.08 5 pg 28.35 ± 0.06 5.92 × 105 29.38 ± 0.25
500 fg (1.40 × 105copies) 27.20 ± 0.11 500 fg 31.61 ± 0.39 5.92 × 104 33.02 ± 0.02
50 fg (1.40 × 104copies) 30.58 ± 0.14 50 fg 34.78 ± 0.12 N.D. a N.D.
5 fg (1.40 × 103copies) 34.00 ± 0.18 N.D. a N.D. N.D. a N.D.
a N.D., Not determined.
<실시예 5> 막걸리와 김치 시료를 이용한 실시간(real-time) PCR 증폭
(1) 막걸리 시료를 이용한 실시간 PCR 증폭
막걸리 시료부터 락토바실러스 파라카제이 아종 파라카제이(Lactobacillus paracasei subsp. paracasei)의 실시간(real-time) PCR을 이용한 정량분석을 위하여 시중에 판매되고 있는 제조일로부터 하루 정도 지난 생 막걸리를 구입하여 4℃에서 발효, 보관하였다. 실험을 위해 생 막걸리를 구입한 일자에 막걸리 시료를 채취하였으며, 제조일자가 동일한 새로운 막걸리를 여러 병 준비하고 각 병에서 일주일 간격으로 4주차까지 막걸리 시료를 채취하였으며, 이후 6주 뒤 11주차에 막걸리 시료를 채취하였다. 잘 섞어준 생 막걸리 시료 1ml을 1.5ml 튜브에 담고 13,000rpm으로 10분간 원심분리 하는 과정을 총3번 반복한 다음 아래에 수집된 pellet을 이용하여 MPbio (OH, USA)사의 Fast DNA® spin kit for soil을 이용하여 total DNA를 추출한 후 real-time PCR을 실시하였다.
Real-time(real-time) PCR 증폭반응은 CFX96 real-time PCR system (Bio-Rad laboratories, Inc., USA)를 사용하여 실시하였으며, 각 반응은 TB-Green Premix Ex Taq (2x), 프라이머 각각 10pM을 함유하는 TB-Green PCR 혼합액으로 총 20㎕의 양으로 수행하였다. PCR 혼합액에 첨가한 막걸리 시료의 total DNA 양은 약 5ng이었다. 반응은 95℃에서 30초간 변성하고 95℃ 5초, 65℃ 30초로 40회 반복시킨 후 95℃에서 15초간 반응시킨 뒤, 65℃에서부터 0.5℃씩 간격으로 5초간 반응 후 증가시키면서 95℃까지 반응시키면서 melting 커브와 melting 피크를 실시하였다. 그 결과 특이 커브와 피크를 각각 확인하였고 밀도 변화를 도 5와 같이 정리하였다.
(2) 김치 시료를 이용한 실시간 PCR 증폭
김치 시료부터의 락토바실러스 파라카제이 아종 파라카제이(Lactobacillus paracasei subsp. paracasei)의 실시간(real-time) PCR을 이용한 정량분석을 위하여 시중에 판매되고 있는 제조일로부터 하루 정도 지난 포기김치와 백김치를 구입하여 밀폐된 용기에 담아 각각 4℃, 15℃ 및 25℃에서 발효, 보관하였다. 실험을 위해 김치 국물 30ml 씩 4℃의 경우 일주일간격으로, 15℃와 25℃의 경우 하루간격으로 채취하였으며 전처리로 고춧가루와 같은 큰 입자를 제거하기 위해 멸균된 거즈 (Daehan, Korea)를 네 겹으로 접어 짜낸 뒤 나온 김치 국물을 사용하였다. 거즈로 거른 김치 국물 1ml을 1.5ml 튜브에 담고 13,000rpm으로 10분간 원심분리 한 다음 아래에 수집된 pellet을 이용하여 MPbio(OH, USA)사의 Fast DNA® spin kit for soil을 이용하여 total DNA를 추출한 후 real-time PCR을 실시하였다.
Real-time PCR 증폭반응은 CFX96 real-time PCR system (Bio-Rad laboratories, Inc., USA)를 사용하여 실시하였으며, 각 반응은 SYBR Premix Ex Taq (2x), 프라이머 각각 5pM을 함유하는 SYBR-Green PCR 혼합액으로 총 20μl의 양으로 수행하였다. PCR 혼합액에 첨가한 김치 시료의 total DNA 양은 약 5ng이었다. 반응은 95℃에서 30초간 변성하고 95℃ 5초, 65℃ 30초로 40회 반복시킨 후 95℃에서 15초간 반응시킨 뒤, 65℃에서부터 0.5℃씩 간격으로 5초간 반응 후 증가시키면서 95℃까지 반응시키면서 melting 커브와 melting 피크를 실시하였다. 그 결과 특이 커브와 피크를 각각 확인하였고 밀도 변화를 도 6 및 7과 같이 정리하였다.
<실험예 1> 분석 균주별 PCR 증폭 반응
표 1의 균주들에 적용하여 서열번호 1과 2의 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행한 결과, 락토바실러스 파라카제이 아종 파라카제이(Lactobacillus paracasei subsp. paracasei)에 해당하는 레인 1-6번의 6개 균주들에서만 155bp 크기의 DNA 단편을 특이적으로 증폭하는 것을 확인하였다(도 2). 락토바실러스 파라카제이 종의 또 다른 아종에 해당하는 레인 7의 Lactobacillus paracasei subsp. tolerans 균주에서는 155bp 크기의 DNA 단편이 증폭되지 않는 것을 확인하였다.
따라서 서열번호 1과 2의 LaCa155F/R 프라이머 세트가 락토바실러스 파라카제이 아종 파라카제이(Lactobacillus paracasei subsp. paracasei)만을 특이적으로 증폭함을 검증하였다(도 2).
<실험예 2> 실시간 PCR 특이성 분석 결과
도 3에서 알 수 있는 바와 같이, 락토바실러스 파라카제이 아종 파라카제이(Lactobacillus paracasei subsp. paracasei)에서만 특정 온도 (85.0℃)에서 melting peak를 확인할 수 있었다.
<실험예 3> 실시간 PCR 민감도 분석 결과
도 4의 standard curve의 R2값과 E값이 적정범위에 있는 것으로 보아 유효한 데이터로 판명할 수 있으며 genomic DNA와 cloned DNA는 각각 50 fg와 5 fg, bacterial cell suspension에서는 5.92 × 104에서 락토바실러스 파라카제이 아종 파라카제이(Lactobacillus paracasei subsp. paracasei)를 안정적으로 정량 검출할 수 있음을 확인할 수 있었다.
<실험예 4> 생 막걸리 및 김치 총 DNA를 이용한 실시간 PCR 증폭결과
도 5는 본 발명의 프라이머 LaCa155F와 LaCa155R을 사용하여, 락토바실러스 파라카제이 아종 파라카제이(Lactobacillus paracasei subsp. paracasei)에 대하여 실시간(real-time) PCR 기법으로 4℃에서 보관된 생 막걸리에 적용하여 밀도 변화를 관찰한 결과이다. 생 막걸리의 경우, Ct 값 28.57에서 처음 검출되었고 1주차에서 4주차까지 Ct 값 28.45에서 26.69까지 밀도가 서서히 증가하였다. 11주차에 Ct 값 24.91로 처음 검출된 밀도보다 약 10배 정도 증가하였다.
도 6은 본 발명의 프라이머 LaCa155F와 LaCa155R을 사용하여, 락토바실러스 파라카제이 아종 파라카제이(Lactobacillus paracasei subsp. paracasei)에 대하여 실시간(real-time) PCR 기법으로 4℃에서 보관된 포기김치와 백김치에 적용하여 밀도 변화를 관찰한 결과이다. 포기김치의 경우, Ct 값 35.57에서 처음 검출되었고 이후에도 35.24~36.98 사이에서 밀도가 일정하게 유지되었다. 백김치의 경우, Ct 값 32.01에서 처음 검출되었고 이후에도 29.55~30.99 사이에서 밀도가 일정하게 유지되었다.
도 7은 15℃와 25℃에서 보관된 포기김치와 백김치에 적용하여 밀도 변화를 관찰한 결과로, 15℃의 포기김치의 경우, Ct 값 34.77에서 처음 검출되었고 1주차 이후부터는 Ct 값 35.39에서 31.24까지 밀도가 약 10배 정도 증가하였다. 15℃의 백김치의 경우, Ct 값 35.42에서 처음 검출되었고 1주차부터는 Ct 값 35.58에서 27.99까지 밀도가 약 100배 정도 증가하였다. 25℃의 포기김치의 경우, Ct 값 33.51에서 처음 검출되었고 2주차에 Ct 값 30.37로 밀도가 약 10배 정도 증가하였다. 2주차 이후에 Ct 값 30.25에서 23.43까지 밀도가 약 100배 정도 증가하였다. 25℃의 백김치의 경우, Ct 값 35.80에서 처음 검출되었고 4주차에 Ct 값 27.82으로 밀도가 약 100배 정도 증가하였다. 4주차 이후부터는 Ct 값 25.35~26.76에서 밀도가 일정하게 유지되었다.
결론적으로, 락토바실러스 파라카제이 아종 파라카제이(Lactobacillus paracasei subsp. paracasei)의 hypothetical protein 특이 DNA 단편으로부터 제작된 LaCa155F/R 프라이머는 락토바실러스 파라카제이 아종 파라카제이(Lactobacillus paracasei subsp. paracasei)의 특이적인 검출을 위한 PCR 프라이머로 이용이 가능하다는 것을 알 수 있으며, 생막걸리와 김치시료 내 락토바실러스 파라카제이 아종 파라카제이(Lactobacillus paracasei subsp. paracasei)의 정성, 정량분석과 밀도변화의 모니터링에 적용 가능하다는 것이 확인되었다.
<110> Republic of Korea <120> Marker for discriminating Lactobacillus paracasei subsp. paracasei and use thereof <130> DP20190145 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LaCa155F primer <400> 1 cctccatcgg tgaagtcgtc gtg 23 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LaCa155R primer <400> 2 ttgtccgcct tcgctggtct gt 22 <210> 3 <211> 155 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hypothetical protein <400> 3 cctccatcgg tgaagtcgtc gtgattgacg atcggccaaa acccgacaag gatcataatg 60 caccaggaac agaagtatca aaaccaaagg aagagccttc ggtaccgcca cgccaacagg 120 ttgatcgttt gccacagacc agcgaaggcg gacaa 155

Claims (9)

  1. 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 프라이머를 포함하는 락토바실러스 파라카제이 아종 파라카제이(Lactobacillus paracasei subsp. paracasei) 판별용 프라이머 세트.
  2. 제1항에 있어서, 상기 프라이머 세트는 락토바실러스 파라카제이 아종 파라카제이(Lactobacillus paracasei subsp. paracasei)의 가설적 단백질(hypothetical protein)을 코딩하는 유전자에 특이적인, 프라이머 세트.
  3. 제1항의 프라이머 세트를 포함하는 락토바실러스 파라카제이 아종 파라카제이(Lactobacillus paracasei subsp. paracasei) 판별용 조성물.
  4. 제3항의 조성물을 포함하는 락토바실러스 파라카제이 아종 파라카제이(Lactobacillus paracasei subsp. paracasei) 판별용 키트.
  5. 시료에서 분리된 DNA를 주형으로 하고, 제1항의 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
    상기 증폭 단계로부터 얻은 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는 락토바실러스 파라카제이 아종 파라카제이(Lactobacillus paracasei subsp. paracasei)의 판별방법.
  6. 제5항에 있어서,
    시료는 막걸리, 김치 또는 김치 국물을 포함하는, 판별방법.
  7. 제5항에 있어서,
    증폭 반응은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 반응을 포함하는, 판별방법.
  8. 제7항에 있어서, 중합효소연쇄반응(PCR)은 실시간(real-time) PCR을 포함하는 것인, 판별방법.
  9. 제5항에 있어서,
    증폭 산물의 검출은 젤 전기영동, 모세관 전기영동, DNA 칩, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 포함하는, 판별방법.
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