KR101789501B1

KR101789501B1 - 혈관의 신생 또는 성장을 억제하는 융합 단백질 및 그 용도

Info

Publication number: KR101789501B1
Application number: KR1020167017551A
Authority: KR
Inventors: 샤오 케; 샤오핑 가오
Original assignee: 쳉두 캉홍 바이오테크놀로지스 코. 리미티드
Priority date: 2014-01-25
Filing date: 2015-01-23
Publication date: 2017-10-26
Also published as: KR20160085362A; AU2015208482B2; CN104804097A; WO2015110067A1; CA2935610C; EP3098241A4; MX2016008776A; EP3098241B1; PE20170142A1; RU2634406C1; CN104804097B; BR112016015187A2; JP6071099B1; US20170002056A1; ES2648809T3; ZA201604362B; HK1212716A1; EP3098241A1; NZ721607A; US9657084B2

Abstract

본 발명은 혈관의 신생 또는 성장을 억제하는 융합 단백질, 그 코딩 서열, 당해 코딩 서열을 포함하는 벡터, 숙주 세포, 의약품 조성물 및 상기 융합 단백질의 용도를 제공한다. 본 발명의 융합 단백질은 열 안정성이 높고, 발효 과정에서의 단백질 폴리머의 형성률이 뚜렷하게 저하되며, 단백질 순도 및 생산량이 뚜렷하게 향상되고, 우월한 바이오 활성을 갖고 있다.

Description

혈관의 신생 또는 성장을 억제하는 융합 단백질 및 그 용도{FUSION PROTEIN INHIBITING ANGIOGENESIS OR GROWTH AND USE THEREOF}

본 발명은 유전자 공학 분야에 속하고, 보다 구체적으로는 혈관의 신생 또는 성장을 억제하는 융합 단백질에 관한 것이다.

정상적인 생리 조건에서, 혈관의 생성은 복수 개의 부분이 치밀하게 조절되는 과정이며, 생물체의 정상적인 기능을 복구하고 유지하는데 중요한 작용을 하고 있다. 하지만, 종양 내부혈관이 빠른 속도로 성장하는 것은 임상에서 자주 보는 현상 중의 하나이다. 대량의 동물 모델과 인체 임상시험으로부터 알다시피, 종양 내 신생 혈관의 형성을 차단하면 종양의 생성을 효과적으로 막고 종양 세포의 사망을 일으킬 수 있으며, 따라서 종양에 대한 치료 작용을 달성할 수 있다. 이리하여, 혈관의 신생을 억제하는 것은 현재 항 종양 신약 연구의 중요한 방향 중의 하나이다. Avastin과 같은 고분자 항혈관형성 의약품은 이미 미국 FDA의 시장 진출 승인을 받았고, 아울러 더욱 많은 의약품이 서로 다른 임상 전단계과 임상 연구 단계에 처해 있다. 또한, 노인성 황반변성(Age-related macular degeneration, AMD이라고 약칭함), 당뇨망막병증(Diabetic Retinopathy), 관절염 등 혈관 신생에 관계되는 각종 질병에 대하여, 혈관 신생을 억제하는 치료 신약도 광범위하고 중요한 작용을 갖고 있다.

혈관 신생은 여러 종류의 바이오 활성 인자에 의해 조절 제어하는 복잡한 과정으로써, 그 중의 중요한 일환은 내피세포 표면 수용체와 복수의 성장인자가 결합하여 활성화된 후, 세포내 티로신 인산화의 신호 전달 시스템에 의해 내피세포의 활동을 제어하여, 혈관의 신생을 촉진하는 것이다. 여러 종류의 성장인자에 있어서, 혈관 내피세포 성장인자(Vascular endothelial sell growth factor, VEGF이라고 약칭함)는 혈관 신생을 제어하는 가장 중요한 인자이고, 혈관 형성을 유도하고 촉진하는 작용이 가장 강하고, 가장 전문적인 혈관 성장 인자이며, 거의 모든 인체 종양에서 모두 과량으로 발현하며, 항암 연구의 중요한 분자 표적이다. VEGF는 혈관 내피세포 표면에 여러 종류의 수용체가 있으며, VEGFR-1( F1t-1라고도 함) 및 VEGFR-2(KDR 또는 F1k-1라고도 함)를 포함하며, 그들의 세포외 부분은 각각 VEGF와 서로 결합할 수 있는 7개의 면역 글로불린 유사 도메인(D1~D7)으로 구성되고, 세포내 부분은 각각 티로신활성효소 그룹을 포함한다. 수용체가 VEGF에 의해 활성화된 후, 세포내의 티로신활성효소 그룹은 인산화되고, 일련의 신호 전달을 초래하며, 최종적으로 혈관의 신생을 일으킨다. 혈관 신생에 대한 VEGF-신호 전달의 중요성에 의해, VEGF 또는 VEGF 수용체를 차단하여 혈관의 신생을 억제함으로써 중요한 항암 작용을 갖고 있으며, 아울러 망막 혈관 병증 등을 포함하는 기타 혈관 신생에 관계되는 질병에 대해 중요한 치료 작용을 갖고 있다.

융합 단백질 의약품의 안정성은 바이오 기술 응용에 대해 중요한 영향을 갖고 있으며, 의약품의 품질을 향상시키고 의약품의 산업화 생산 가능 여부를 결정하는 키포인트이기도 하다. 단백질은 일부 물리적 및 화학적 요소의 작용하에서 특정된 공간적 서열이 변경되고, 이에 의해 물리적 및 화학적 성질의 변화와 바이오 활성의 상실을 일으키게 되는데, 이러한 현상을 단백질 변성이라고 한다. 변성작용이란, 단백질이 물리적 또는 화학적 요소의 영향을 받아, 분자 내부의 구조 및 성질이 변화되는 작용을 가리킨다. 단백질의 열 안정성 검출에 의해 단백질의 변성을 효과적으로 확정할 수 있기에, 단백질 의약품 개발 과정에서 단백질의 안정성을 검출하는데 사용되며, 주로 자외선 여기광으로 단백질 샘플을 비추어 형광을 발광하도록 하며, 단백질에서 발광되는 형광의 파장 및 조명 강도와 그 구조의 변화는 일일이 대응하므로, 이를 토대로 단백질 샘플의 변성 온도(Tm)를 정확하게 검출할 수 있다. 또한, 자외선 여기광과 정적 광산란(Static Light Scattering)기술을 동시에 이용하여 단백질의 집결 상황을 검출한다. 단백질 샘플의 집결 및 비집결 상태에서 조명 강도가 아주 현저하게 변화하기에, 이를 토대로 단백질 샘플의 집결 온도(Tagg, aggregation onset temperature)를 정확하게 검출할 수 있다. 단백질의 변성 온도(Tm)와 집결 온도(Tagg)는 단백질 분자의 안정성을 효과적으로 반영할 수 있다.

고분자 의약품의 개발 과정에 있어서, 제약 요소는 의약품의 치료 효과, 의약품의 안정성, 의약품의 산업화 생산가능성 등을 포함한다. 치료 효과가 확실하고, 안정성이 높은 혈관의 신생 또는 성장을 억제하는 의약품을 찾아내는 것이 매우 필요하다.

본 발명의 목적은 치료 효과가 확실하고, 안정성이 높은 혈관의 신생 또는 성장을 억제하는 융합 단백질을 제공하는 것이다. 당해 융합 단백질은 VEGF 신호 전달을 차단하므로써, 혈관의 신생 또는 성장을 억제한다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 아래와 같은 기술적 해결 수단을 제공한다.

본 발명의 일 양태에 있어서, 혈관의 신생 또는 성장을 억제하는 융합 단백질을 제공하고, 당해 융합 단백질은 사람 VEGF 수용체 단편과 사람 면역 글로불린 Fc 단편에 의해 형성되고, 상기 VEGF 수용체 단편의 아미노산 서열은 예를 들어 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 또는 SEQ ID NO: 5로 표시할 수 있다.

일 실시형태에 있어서, 상기 융합 단백질의 사람 면역 글로불린 Fc 단편은, IgG1 Fc(아미노산 서열이 SEQ ID NO: 7), IgG2 Fc(아미노산 서열이 SEQ ID NO: 8), IgG3 Fc(아미노산 서열이 SEQ ID NO: 9) 및 IgG4 Fc(아미노산 서열이 SEQ ID NO: 10) 중의 적어도 하나를 포함한다.

다른 실시형태에 있어서, 본 발명의 융합 단백질은,

SEQ ID NO: 14으로 표시된 아미노산인 KH02 ,

SEQ ID NO: 16으로 표시된 아미노산인 KH03, 또는

SEQ ID NO: 18로 표시된 아미노산인 KH04이다.

다른 양태에 있어서, 본 발명은 상기 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 제공하고, 바람직하게, 상기 뉴클레오티드 서열은,

융합 단백질 KH02을 코딩하고, 뉴클레오티드가 SEQ ID NO: 13으로 표시한 바와 같은 Kh02,

융합 단백질 KH03을 코딩하고, 뉴클레오티드가 SEQ ID NO: 15로 표시한 바와 같은 Kh03, 또는

융합 단백질 KH04을 코딩하고, 뉴클레오티드가 SEQ ID NO: 17로 표시한 바와 같은 Kh04이다.

한편, 본 발명은 상기 융합 단백질을 발현하는 발현 벡터 또는 숙주 세포를 제공하고, 상기 발현 벡터는 상기 융합 단백질의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 상기 발현 벡터는 재조합된 진핵 발현 벡터일 수도 있고, 포유동물 세포의 발현 벡터인 것이 바람직하다. 또한, 재조합된 바이러스 발현 벡터일 수도 있고, 아데노에 관계되는 바이러스 또는 아데노 바이러스 벡터인 것이 바람직하다. 상기 발현 벡터는 전환된 숙주 세포에서 복제되어 발현될 수 있고, 상기 숙주 세포는 CHO 세포 또는 그 아계(subline), 또는 293 세포 또는 그 아계인 것이 바람직하다.

한편, 본 발명은 상기 융합 단백질을 제조하는 방법을 제공하고, 상술한 발현 벡터를 적합한 숙주 세포에 트랜스펙션하여, 융합 단백질을 발현시키는 단계를 포함한다.

한편, 본 발명은, 본 발명의 융합 단백질과, 약학적으로 허용가능한 벡터 또는 부형제를 포함하는 의약품 조성물을 제공한다. 상기 벡터 또는 부형제는 본 분야에서 일반적으로 사용하는 벡터 또는 부형제이다. 상기 의약품 조성물의 제제의 형태는 주사제, 주사용 동결건조분말 또는 안과용 젤(Ophthalmic Gel)인 것이 바람직하다. 본 분야에서 이미 알려진 방법으로 상기 제제를 제조할 수도 있다.

한편, 본 발명은 상술한 융합 단백질을 포함하는, 혈관 신생 또는 성장으로 인한 질병을 치료하는 의약품을 제공한다. 상기 혈관 신생 또는 성장으로 인한 질병은 종양 또는 안부 신생 혈관으로 인한 질병인 것이 바람직하다. 상기 안부 신생 혈관으로 인한 질병은 노인성 황반변성, 당뇨망막병증, 맥락망막병증(chorioretinopathy) 등인 것이 바람직하다.

한편, 본 발명은 사람 이외의 동물의 혈관 신생 또는 성장으로 인한 질병을 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 필요한 환자에게 본 발명의 융합 단백질 또는 의약품 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 상기 질병은 종양 또는 안부 신생 혈관으로 인한 질병인 것이 바람직하다. 상기 안부 신생 혈관으로 인한 질병은 노인성 황반변성, 당뇨망막병증, 맥락망막병증 등인 것이 바람직하다.

본 발명의 융합 단백질은 열 안정성이 높으므로, 발효 과정에서의 단백질 폴리머의 형성률을 현저히 저하시키고, 단백질 순도 및 생성량을 뚜렷하게 향상시키며, 아울러 본 발명의 융합 단백질은 양호한 바이오 활성을 갖고 있다.

도 1은 VEGF 수용체 융합 단백질의 열변성 경향성의 검출 결과도이다. 도면에 있어서, 그래프는 단백질 분자 내부의 형광 피크(peak)가 온도의 상승에 따라 상승하는 상황을 반영하고, 세로 좌표 BCM(nm)는 내부 형광 피크이고, 가로 좌표는 온도이다.
도 2는 VEGF 수용체 융합 단백질의 열중합 경향성의 검출 결과도이다. 도면에 있어서, 그래프는 단백질 분자의 정적 광산란 강도가 온도 상승에 따라 변화하는 상황을 반영하고, 세로좌표 SLS at 266nm는 정적 광산란 강도이고, 가로좌표는 온도이다.
도 3은 VEGF 수용체 융합 단백질에 의하여, VEGF에 의해 유발되는 HUVEC 세포 증식을 억제하는 작용을 나타내는 결과도이다. 그 중, 가로좌표는 융합 단백질의 농도이고, 세로좌표는 CCK-8 방법에 의해 검출한 세포 활력의 흡광치이다.
도 4는 VEGF 수용체 융합 단백질에 의하여, VEGF에 의해 유발되는 HUVEC 세포 이동을 억제하는 작용을 나타내는 결과도이다. 그 중, 가로좌표는 융합 단백질과 VEGF의 몰농도비이고, 세로좌표는 총 이동의 백분율(%총이동율)=(F_{fusion protein}-F_basal)/(F_total-F_basal)이며, 여기서 F_basal는 배지 그룹의 형광 평균치이고, F_total는 VEGF 그룹의 형광 평균치이며, F_{fusion protein}는 상이한 몰비의 융합 단백질과 VEGF 그룹의 형광 평균치를 가리킨다.

이하, 실시예에 의해 본 발명을 상세하게 설명한다. 이러한 실시예는 단지 본 발명을 설명하는데 사용되고, 본 발명을 제한하는 것이 아님은 이해되여야 할 것이다. 당업자가 본 명세서의 계시하에 본 발명의 실시 형태에 대해 진행한 임의의 변경은 모두 특허청구범위 내에 속한다.

서열에 대한 설명:

사람 VEGF 수용체 단편 1: 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 1이고, 뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NO: 2이다.

사람 VEGF 수용체 단편 2: 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 3이고, 뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NO: 4이다.

사람 VEGF 수용체 단편 3: 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 5이고, 뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NO: 6이다.

융합 단백질 KH01: 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 12이고, 뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NO: 11이다.

융합 단백질 KH02: 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 14이고, 뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NO: 13이다.

융합 단백질 KH03: 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 16이고, 뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NO: 15이다.

융합 단백질 KH04: 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 18이고, 뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NO: 17이다.

융합 단백질 KH05: 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 20이고, 뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NO: 19이다.

실시예 1: 융합 단백질의 제조

재료 또는 시약

PCR시약 키트(5X 완충액, dNTP 및 Phusion 효소를 포함): M0530L, NEB사

아가로오스 젤 전기영동: IQ300, GE사

완충액 4(lot: 0101201): NEB사

AvrⅡ: R0174L, NEB사

BstZ17Ⅰ: R0594L, NEB사

PCR 생성물 정화 시약 키트: QIAGEN사, CAT: 28106

10XT4 완충액: B0202S, NEB사

T4 DNA 연결 효소: M0202L, NEB사

Top10 대장균: CB104, TIANGEN사

2YT(Kan) 플레이트 배지: 상하이루이충실험실설비유한회사(上海銳聰實驗室設備有限公司)

Freedom^TMCHO-S^TMKit 시약 키트: A13696-01, LIFE TECHNOLOGIES사

Clone Pix FL: Genetix사

HiTrap 단백질 A 아가로오스 친화크로마토그래피 칼럼: HiTrap 단백질 A HP, 5X1ml; GE사

PBS 완충액(20mM 인산염, pH: 7.4): SD117-500ml, 상하이바이오공학유한회사(上海生物工程有限公司)

ForteBio 바이오 분자 상호 작용 시스템: Octet QKe, pall사

단백질 열 안정성 분석기: Optim2, Avacta사

VEGF: R&D사

NHS-LCLC-Biotin: Thermo사

1. 융합 단백질의 코딩 서열을 포함하는 플라스미드의 구축

1.1 유전자와 프라이머의 합성

베이징진워이쯔회사(北京金唯智公司)에서 합성 단편 1(SEQ ID NO: 21)과 2(SEQ ID NO: 22) 및 프라이머 P1~P10(서열은 각각 SEQ ID NO: 23~32으로 표시한 바와 같다)를 합성하고, 합성 단편 1과 2를 플라스미드 벡터 pUC19(베이징진워이쯔회사)로 재조합한다. 합성 단편 1은 사람 VEGF 수용체 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 신호 펩타이드 서열을 포함하고, 합성 단편 2는 사람 IgG1 FC의 코딩 서열을 포함한다. 합성 단편 1과 합성 단편 2는 각 융합 단백질을 구축하는 템플릿으로써, 하기의 프라이머를 사용하고 PCR 방법에 의해 본 발명의 융합 단백질의 코딩 서열을 구축한다.

1.2 융합 단백질의 코딩 서열의 획득

각종 융합 단백질의 코딩 서열은 두 개의 부분으로 나누어 증폭하는데, 제 1 부분은 사람 VEGF 수용체 단편이고, 제 2 부분은 사람 IgG1 FC 단편이다. 각 부분은 각자의 특이 프라이머에 의해 상응하는 타겟 단편을 획득하고, 또한 PCR를 오버랩(overlap)하는 방법에 의해 사람 VEGF 수용체 단편과 사람 IgG1 Fc 단편을 접합시켜(Splice), 최종적으로 전장 유전자 서열(全長遺傳子序列)을 획득한다.

제 1, 제 2 두 부분의 증폭 PCR 반응시스템은 모두 아래와 같다(총 체적 50μl). 5X 완충액이 10μl, dNTP가 2μl, 특이 포워드 및 리버스(foward and reverse) 프라이머가 각각 1μl, 템플릿(상기 합성 단편 1 또는 합성 단편 2)이 1μl, Phusion 효소(PCR 하이파이 효소)가 0.5μl이고, 마지막으로 50μl가 될 때까지 재증류수를 추가한다.

반응 조건은 이하와 같다. 98℃에서 초기 변성(Initial denaturation)을 30s 동안 진행하고, 98℃에서 10s, 68℃에서 2min을 10회 진행하고, 98℃에서 10s, 55℃에서 30s, 72℃에서 50s를 30회 진행하며, 마지막으로 72℃에서 5min 동안 진행한다.

구체적인 실시형태는 이하와 같다.

kh02에 있어서, 제 1 부분의 프라이머쌍은 P1과 P6이고, 템플릿은 합성 유전자 1이며; 제 2 부분의 프라이머쌍은 P5과 P2이고, 템플릿은 합성 유전자 2이다.

kh03에 있어서, 제 1 부분의 프라이머쌍은 P1과 P8이고, 템플릿은 합성 유전자 1이며; 제 2 부분의 프라이머쌍은 P7과 P2이고, 템플릿은 합성 유전자 2이다.

kh04에 있어서, 제 1 부분의 프라이머쌍은 P1과 P10이고, 템플릿은 합성 유전자 1이며; 제 2 부분의 프라이머쌍은 P9과 P2이고, 템플릿은 합성 유전자 2이다.

단백질 KH01의 코딩 서열(kh01)에 있어서, 제 1 부분의 프라이머쌍은 P1과 P4이고, 템플릿은 합성 유전자 1이며; 제 2 부분의 프라이머쌍은 P3과 P2이고, 템플릿은 합성 유전자 2이다.

유전자 생성물은 아가로오스 젤 전기영동에 의하여 검출되며, kh01-Q, kh01-H, kh02-Q, kh02-H, kh03-Q, kh03-H, kh04-Q 및 kh04-H 총 8종류의 관련 단편이 획득된다.

오버랩 PCR 반응 시스템은 이하와 같다(총 체적50μl). 5X 완충액이 10μl이고, dNTP가 2μl이며, 템플릿인 상술한 각각 증폭된 대응하는 제 1 과 제 2 단편이 각각 1μl이며(예를 들면, kh01의 전장을 증폭할 시, 대응하는 kh01-Q와 kh01-H의 회수된 PCR 생성물을 1μl씩 사용한다)이며, 포워드 및 리버스 프라이머가 각각 1μl(P1, P2)이고, Phusion 효소가 0.5μl이며, 마지막으로 50μl가 될 때까지 재증류수를 추가한다.

반응 조건은 이하와 같다. 98℃에서 초기 변성을 30s 동안 진행하고, 98℃에서 10s, 55℃에서 30s, 72℃에서 50s를 30회 진행하고, 마지막으로 72℃에서 5min 동안 진행한다.

유전자 생성물은 아가로오스 젤 전기영동(IQ300, GE사 제품) 에 의하여 검출되며, 각각 kh01-1(대응하는 서열은 SEQ ID NO: 11(PCR 증폭 생성물은 SEQ ID NO: 11에 비해 신호 펩타이드 코딩 서열을 더 포함한다)), kh02-1(대응하는 서열은 SEQ ID NO: 13(신호 펩타이드 코딩 서열을 더 포함한다)), kh03-1(대응하는 서열은 SEQ ID NO: 15(신호 펩타이드 코딩 서열을 더 포함한다)), kh04-1(대응하는 서열은 SEQ ID NO: 17(신호 펩타이드 코딩 서열을 더 포함한다))으로 명명된 총 4종류의 유전자 단편이 획득된다. 전기영동 검출에 의하면, 획득한 증폭 단편의 크기는 예기한 바와 일치하다.

1.3 벡터와 유전자 단편의 효소 절단（Enzyme digestion）처리

pCHO1.0 플라스미드(life technologies에서 구매, 품목 번호: A13696-01), kh01-1, kh02-1, kh03-1, kh04-1증폭 단편에 대해 각각 중복 효소 절단 처리를 진행하며, 효소 절단 시스템은 이하와 같다. 1.5ml EP 파이프에 각각 pCHO 1.0 플라스미드 또는 kh01-1, kh02-1, kh03-1, kh04-1 증폭 단편을 40μl, 10X 완충액 4(NEB)을 10μl, AvrⅡ(R0174L, NEB) 및 BstZ17Ⅰ(R0594L, NEB사 제품)를 각각 5μl, 멸균수를 45μl 투입하고, 균일하게 혼합한 후 37℃에서 5시간 동안 반응시키고, PCR 생성물 정화 시약 키트(CAT: 28106, QIAGEN)를 사용하여 회수한다.

1.4 재조합 플라스미드의 연결 전환

T4DNA 연결 효소의 작용하에서, 동일한 효소 절단을 이용하여 획득한 pCHO1.0 단편(AvrⅡ 및 BstZ17Ⅰ 효소 절단 대 단편, 약 13kb)과 kh01-1, kh02-1, kh03-1, kh04-1(AvrⅡ 및 BstZ17Ⅰ 효소 절단)단편을 연결한다. 연결 반응시스템은 이하와 같다. 1.5ml EP 파이프에 각각 pCHO 1.0 단편(AvrⅡ 및 BstZ17Ⅰ) 2μl, kh01-1, kh02-1, kh03-1, kh04-1(AvrⅡ 및 BstZ17Ⅰ 효소 제한) 단편6μl, 10XT4 완충액(B0202S, NEB) 1μl, T4DNA 연결 효소(M0202L, NEB) 1μl와 같은 성분을 투입하고, 균일하게 혼합한 후 상온(약 20℃)에서 4시간 이상 반응시키고, 연결 생성물을 Top10 대장균(CB104, TIANGEN) 감응 세포에로 전환하며, 2YT(Kan) 플레이트 배지(상하이루이충실험실설비유한회사 제품)에 도포하여 37℃에서 정지된 상태로 하룻 밤 방치하며, 플레이트 번호는 각각 kh01, kh02, kh03, kh04이다.

1.5 재조합 플라스미드의 콜로니 PCR의 선별

kh01, kh02, kh03, kh04 플레이트에서 각각 복수 개의 재조합 단일 콜로니를 선택하여 37℃에서 정지된 상태로 3~5 시간 배양한다. 배양한 후에는 PCR 템플릿으로서, 각각 PCR 선별 및 검사를 실시한다. 균액 PCR 증폭 반응시스템(총 체적 20μl)은 이하와 같다. 2XTaq HS(R013A, TAKATA)가 10μl이고, 균액 템플릿이 2μl이며, 포워드 및 리버스 프라이머(P1과 P2)가 각각 1μl(최종 농도 0.3μmol/L)이며, 마지막으로 20μl가 될 때까지 재증류수를 추가한다.

반응 조건은 이하와 같다. 94℃에서 3min 동안 진행하고, 94℃에서 60s, 53℃에서 60s, 72℃에서 120s를 30회 진행하고, 마지막으로 72℃에서 50min 동안 진행한다. 결과에 따르면, 모든 콜로니에 의해 1.6Kbp 정도의 타겟 밴드(target band)가 증폭되어 있었으며, 모두 양성 클론임을 표시한다.

1.6 재조합 플라스미드의 효소 절단 검사

콜로니 PCR 검사에 의해 정확한 콜로니를 접종한 후, 플라스미드를 추출하여 효소 절단 검사를 수행한다. 먼저 재조합 균의 플라스미드를 추출하고, 다음으로 효소 절단 분석을 진행하는데, 효소 절단 시스템은 아래와 같다. 1.5ml EP 파이프에 각각 플라스미드를 2μl, 10X 완충액 4를 1μl, AvrⅡ 및 BstZ17Ⅰ를 각각 1μl 투입한 후, 10μl가 될 때까지 멸균수를 보충하고, 균일하게 혼합한 후 37℃에서 4시간 반응시킨다. 아가로오스 젤 전기영동으로 분석한 결과, 모두 1.6Kbp 좌우의 타겟 밴드가 효소 절단되어 있었으며, 선택된 클론은 모두 양성 클론이다.

1.7 재조합 플라스미드의 서열 측정 검사

콜로니 PCR과 효소 결정 검사에 의해, 정확한 콜로니를 쑤저우진워이쯔바이오과학기술유한회사(蘇州金唯智生物科技有限公司)에 보내어 서열 측정 검사를 진행한다. 서열측정 결과는 예기한 바와 일치하다. 발현 플라스미드는 예비용으로 저장하고, 서열 측정에 성공한 클론에 대해 이하와 같이 번호를 매긴다. kh01-1을 610으로, kh02-1을 711로, kh03-1을 812로, kh04-1을 915로 번호를 매긴다.

2. 플라스미드 트랜스펙션 및 세포 선별

Freedom^TMCHO-S^TMKit시약 키트(A13696-01, LIFE TECHNOLOGIES) 중의 숙주 세포 CHO-S를 사용하여, 설명서에 따라 플라스미드 트랜스펙션을 실시한다. 본 실험은 각각 4종류의 플라스미드 610, 915, 812, 711에 대해 트랜스펙션을 진행하고, 플라스미드가 주입된 세포를 각각 진탕 플라스크에서 배양하며, 배지는 CD FortiCHO 배지(life technologies에서 구매)이고, 배양 조건은 37℃, 8% CO₂, 110rpm/min이며, 48h 배양하여, 세포 계수기로 세포 생존율과 세포수를 검출한다.

트랜스펙션을 48h 실시한 후, 10P/100M, 20P/200M(P=10μg/mL 퓨로마이신, M=nM 메토트렉세이트(MTX))단계와; 30P/500M, 50P/1000M 단계를 포함하는 두 단계의 가압 선별을 진행하며, 배지는 CD FortiCHO 배지이고, 초기 선별 세포 다시 말해서 610, 915, 812, 711(즉 각각 상술한 대응하는 플라스미드를 포함한다)가 획득된다. 계속하여 단일 클론 세포 선별을 실시하고, 접종 생세포 밀도는 500개/mL이며, 각 트랜스펙션을 48h 실시한 후 획득한 초기 선별 세포 군체에 8개의 6웰 플레이트(well plates)을 접종하고, 세포 배양기에서 일주일간 배양한다. 형광 현미경하에서 각 웰 플레이트 세포의 클론 성장 상황을 관찰하고, Clone Pix FL(Genetix)를 사용하여 단일 클론 세포를 선택하여, 단백질의 발현량 및 순도를 검출하여 클론을 선택하고 단계별로 확대하여 배양한다.

3. 단백질의 발현, 정화 및 검사

다수확 클론 세포를 선택하고 96웰 플레이트에서 24웰 플레이트으로 확장하여 성장시키고, 다음 6웰 플레이트으로 확장하여 성장시키며, 그 다음으로 50mL 진탕 플라스크로 확장하여 성장시킨다.

4-6일 배양한 세포 배양 상청액을 수집하고, 원심 분리하여 세포 조각을 제거하며, 상청액을 0.45μm 필터로 여과하고, pH를 7.4까지 조절하며, HiTrap 단백질 A 친화 크로마토그래피 칼럼(HiTrap 단백질 A HP, 5X1ml; GE)으로 융합 단백질을 정화시킨다. 칼럼 층 체적의 5배의 탈이온수로 칼럼을 세척하고, 칼럼 층 체적의 5배의 PBS 완충액(20mM 인산염, pH7.4)(SD117-500ml, 상하이바이오공학유한회사)으로 칼럼을 평형시키며, 샘플을 투입하고, 유출액을 수집하여 검출하고, 10배 체적의 PBS 완충액의 희석액(0.02mol/L 인산염, pH7.4)으로 세척하여 잡 단백질을 제거하며, 다음으로 0.1M 글리신 완충액(pH3)을 사용하여 타겟 단백질을 칼럼으로부터 제거하여, SDS-PAGE(폴리아크릴아미드 젤 전기영동)에 의해 검출된 여러 종류의 단백질의 순도가 모두 90% 이상이 되도록 한다.

실시예 2 단백질 순도 및 발현 생산량 분석

SEC-HPLC 기술을 이용하여, 발효액의 단백질 순도를 분석하고 검출하며, ForteBio 바이오 분자 상호 작용 시스템(Octet QKe, pall사)을 사용하여 실시예 1 중의 각 단백질의 발현량을 검출하며, 결과를 표 1에 표시한다. 융합 단백질 KH02-KH04의 발현량과 순도는 모두 KH01 단백질보다 우월한바, 융합 단백질 KH02는 순도 및 생산량에서 가장 우위를 차지하고, 배양하여 제 9 일이 되는 날에, 영양물질을 추가하지 않는 조건에서도, 단백질 순도는 여전히 80%이상을 유지할 수 있다.

실시예 3 VEGF 수용체 융합 단백질의 열 안정성 검출

(1) VEGF 수용체 융합 단백질의 열변성 경향성의 분석

단백질 분자가 열을 받을 때, 그 공간 서열은 풀림(unfolding)이 발생하고, 방향족 그룹의 소수성 아미노산 잔기(예를 들면, 트립토플레이트, 티로신, 페닐알라닌)는 끊임없이 외부로 노출된다. 방향족 그룹 내부의 형광 강도(IF: intensity of fluorescence)를 검출하여 단백질 분자의 풀림 정도를 반영할 수 있다. 단백질 분자의 풀림 과정에서, 그 내부 형광단의 형광 분광에 변화가 발생하고, 천연 구조(정상 폴딩) 단백질은 낮은 내부 형광 강도를 구비하고, 피크는 330nm 부근에 있으며, 변성 단백질의 내부 형광 강도는 뚜렷하게 증가되고, 피크는 350nm 부근으로 이동한다. 단백질 분자의 내부 형광 강도의 변화 및 피크의 이동 정도를 분석하여 열변성 중간 온도(Half thermal denaturation temperature)Tm 값을 계산할 수 있으며, 단백질 샘플 구조의 열변성 경향성을 간접적으로 반영한다.

단백질 열 안정성 분석기기(Optim2, Avacta사)를 사용하여 VEGF 수용체 융합 단백질의 열변성 경향성을 검출한다. 약 15μl의 검출하고자 하는 샘플(1mg/ml PBS, pH7.2, 순도는 90%를 초과)을 Optim2 샘플 반응 튜브에 투입하고, 온도 스캔 범위를 25℃~95℃로 설정하며, 각 온도 포인트에서 60s 배양한다. Optim2 분석용 소프트웨어를 이용하여 데이터를 처리하고, 그 결과는 도 1 및 표 2에 표시한 바와 같으며, 실시예 1에서 발현한 일련의 융합 단백질에서, KH02의 변성 온도가 가장 높음을 나타내고, 그 열변성 경향성이 상대적으로 가장 낮음을 설명하며, 다시 말해서, 그 단백질의 열 안정성이 상대적으로 가장 높음을 설명한다.

(2) VEGF 수용체 융합 단백질의 열중합 경향성 분석

자외선을 비출 시, 단백질 분자에서 광산란이 발생하고, 정적 광산란 강도는 일정한 범위 내에서 단백질 분자의 크기(10~600KD)와 선형관계를 갖는다. 광산란SCS(Static Light Scattering) 강도를 검출하여 단백질 분자의 크기 변화를 반영할 수 있으며, 그 단백질의 중합이 발생하는 시작 온도 Tagg를 계산하여 단백질 샘플의 중합 경향성을 간접적으로 반영할 수 있다.

단백질 열 안정성 분석기기(Optim2, Avacta사)를 사용하여 VEGF 수용체 융합 단백질의 열중합 경향성을 검출한다. 약 15μl의 검출하고자 하는 샘플(1mg/ml PBS, pH7.2, 순도는 90%를 초과)을 Optim2 샘플의 반응 튜브에 투입하고, 온도 스캔 범위를 25℃~95℃로 설정하며, 각 온도 포인트에서 60s 배양시킨다. Optim2 분석용 소프트웨어를 이용하여 데이터를 처리하며, 실험 결과는 도 2 및 표 3에 표시한 바와 같다. 온도가 높아짐에 따라, 융합 단백질 샘플의 정적 광산란 강도는 끊임없이 높아진다. KH02의 시작 중합 온도 Tagg 값은 상대적으로 가장 높은바, 이는 열중합 경향성이 상대적으로 가장 낮음을 표시한다.

실시예 4 VEGF 수용체 융합 단백질의 바이오 활성 검출

(1) HUVEC 세포 증식

성장이 양호한 사람의 제대정맥혈관내피세포(HUVEC, ScienCell사)를 96 웰 배양 플레이트에 접종하고, 3X10³세포/웰, 100μl/웰, 37℃에서, 5% CO₂에서 20h 배양하고; 2% 소태아혈청을 함유한 ECM 배지(내피세포 배지, 품목 번호 1001, Sciencell사)를 이용하여 서로 다른 몰농도(0.0023, 0.007, 0.023, 0.065, 0.19, 0.57, 1.7, 5, 15, 45, 135nM)의 VEGF 수용체 융합 단백질을 조제하고, 각각 40ng/ml의 VEGF(R&D사)와 균일하게 혼합하여, 2h 배양시킨다. 다음으로 HUVEC 세포가 접종된 96웰 플레이트에 투입하는바, 100μl/웰, 각 조의 실험은 3회 독립적으로 진행되고, 5% CO₂에서 계속하여 96h 배양하고, CCK-8 시약(Dojindo사)을 추가하고, EC₅₀으로 본 발명의 억제 작용을 표시한다. 결과는 도 3 및 표 4에 표시한 바와 같다. 본 발명의 VEGF 융합 단백질은 모두 VEGF에 의해 자극되는 HUVEC 세포 증식작용을 효과적으로 억제할 수 있고, 본 발명의 VEGF 수용체 융합 단백질이 VEGF의 바이오 활성을 양호하게 억제할 수 있음을 표시한다.

(2) HUVEC 세포 이동

개량형의 Boyden 챔버(FluoroBlok^TM Biocoat angiogenesis system: Endothelial cell migration, BD사)를 이용하여 본 발명의 융합 단백질의 HUVEC 세포에 대한 이동 작용을 검출한다. 성장 상태가 양호한 HUVEC 세포를 3X10⁵세포/ml 밀도로 Boyden 챔버의 상층 컴파트먼트에 접종시키는 바, 75μl/웰 이다. 2% 소태아혈청을 함유한 ECM 기초 배지(품목 번호 1001, Sciencell사)를 이용하여 서로 다른 몰농도(13333nM, 4444nM, 1481nM, 494nM, 164.5nM, 54.8nM, 18.3nM, 6.1nM)의 VEGF 수용체 융합 단백질을 조제하고, 각각 500pM의 VEGF(R&D사)와 균일하게 혼합하여, 2h 배양한 후 Boyden 챔버의 하층 컴파트먼트에 투입하는 바, 225μl/웰이다. 전체 챔버가 37℃, 5% CO₂인 상태에서 계속하여 20~24h 배양시킨다. 하층 컴파트먼트 내의 배지를 제거하고, HBSS완충액(항크스 평형염)으로 조제한 최종 농도가 5μg/ml인 형광 염료Calcein AM(Anaspec사)를 투입하고, 37℃, 5% CO₂에서 90min 광선을 피하여 배양시킨 후, 다기능 마이크로플레이트리더에서 형광값을 검출하는 바, 여기 파장은 494nm이고, 검출 파장은 517nm이다. 세포의 상대적 이동율을 계산한다. 실험 결과는 도 4에 도시한 바와 같이, 본 발명에서 서술한 VEGF 수용체 융합 단백질에 의하여, VEGF에 의해 유발되는 HUVEC 세포 이동을 억제하는 작용은 기본적으로 동일하며, 본 발명의 융합 단백질 KH02가 비교적 높은 VEGF를 억제하는 바이오 활성을 구비함을 다시한번 증명한다.

실시예 5 VEGF 수용체 융합 단백질과 VEGF 결합의 친화력 검출

바이오층 간섭기술(biolayer interferometry, BLI)을 이용하여, ForteBio 바이오분자 상호작용 시스템(OctetQK^e, Pall사)에 의해 사람 VEGF 수용체 융합단백질과 사람 VEGF 결합 친화력을 검출한다. 사람 VEGF(품목 번호 293-VE-010, R&D사)와 NHS-LCLC-비오틴(품목 번호: 21338, Thermo사)을 1:3의 몰비로 균일하게 혼합하고, 실내 온도에서 1h 방치한 후 나머지 NHS-LCLC-비오틴을 제거하여 최종적으로 표기 생성물인 50μg/ml 비오틴-hVEGF를 획득하고, 샘플을 투입하여 50μg/ml 비오틴-hVEGF를 스트렙타비딘(Streptavidin) 센서에 결합시키며, 샘플 희석 완충액(PBS, 0.1% BSA, 0.02% 트윈-20, 0.003% NaN₃)을 이용하여 농도가 서로 다른(농도는 각각 600nM, 200nM, 66.7nm, 22.2nM, 7.4nm, 2.46nM, 0.82nM) 검출하고자 하는 샘플을 조제하여, 샘플 희석 완충액을 블랭크 컨트롤(blank control)로 한다. 동역학적 분석모드 하에서 hVEGF와 수용체 융합단백질의 결합 동역학적 파라미터를 검출한다. 실험 결과는 표 5에 표시한 바와 같고, 실시예 1 중의 VEGF 수용체 융합단백질과 사람 VEGF는 모두 현저한 결합이 있음을 나타내고, KH02의 KD값은 약 0.33nM이며, 특히 VEGF 결합 복합물과의 동적 해리 속도는 기타 융합단백질보다 느리고 그 결합 친화력이 상대적으로 제일 높음을 표시한다.

실시예 6 융합 단백질의 친화력 실험

1.1 실험용 시약

1.2 실험 방법

1) 시약의 조제

ⅰ. 10×PBS 완충액: NaCl 80.1g, KCl 2.0g, KH₂PO₄ 2.0g, Na₂HPO₄·12H₂O 29.0g, 순수를 넣어 용해시켜 1000ml으로 되도록 한다.

ⅱ. 1×PBS 완충액: 10×PBS 완충액 100ml를 취하고 순수 850ml를 넣어 용해시키고, pH 7.2~7.4로 조절하며, 최종적으로1000ml으로 되도록 한다.

ⅲ. 탄산염 완충액: Na₂CO₃ 1.59g, NaHCO₃ 2.93g을 1000ml의 초순수에 pH가 9.6-9.8이 되도록 용해시키고, 실온에 보존한다. 사용하기 전에는 반드시 0.22μm 구경의 필터로 여과해야 한다.

ⅳ. BSA(소혈청알부민): 4℃에 보존한다.

V. 세척액: 0.05%(v/v) 폴리소르베이트 20을 포함한 1×PBS.

ⅵ. 블로킹(blocking) 용액과 샘플 희석액: l%(w/v) BSA를 포함하는 1×PBS.

ⅶ. 정지액(2NH₂SO₄): 농축황산 27.8ml를 천천히 472.2ml의 순수에 추가하는 바, 농축황산은 강한 부식성 액체이고, 추가시 유리 막대로 끊임없이 뒤섞어야 하며 사용할 때에는 보호에 주의해야 한다.

ⅷ. rhVEGF₁₆₅(R&D, 293-VE, 50μg/대 규격) 저장액: 3ml 1×PBS를 취하여 0.22 μm 구경의 필터로 여과시킨다. 미 개봉의 rhVEGF₁₆₅ 하나를 취하고, 먼저 800μl의 이미 여과한 PBS를 추가하며, 육안으로 병 내에서 고체 물질의 용해를 관찰한 후, 200μl의 이미 여과한 PBS를 추가한다. rhVEGF₁₆₅가 충분히 용해되도록 실내 온도에 10분간 방치한다. 용해 후 rhVEGF₁₆₅ 저장액의 농도는 50μl/ml이다. 저장액을 25μl/개 로 나누어 포장하고, -20℃에 방치하여 6개월간 보존할 수 있다.

ix. 사람 IgG-Fc 항체 HRP 검출 항체(BETHYLA80-104P): 농도가 1mg/ml이고, 4℃에서 보존한다.

2) 피복

20μl의 rhVEGF₁₆₅ 저장액을 7980μl의 탄산염 완충액에 넣고 균일하게 혼합한 후 농도가 125ng/ml인 피복 용액 A를 획득하고, 또 2500μl의 피복 용액 A를 취하여 2500μl의 탄산염 완충액에 추가하여 균일하게 혼합한 후 피복 용액 B를 획득한다. 먼저 피복 용액 A에 의해 엘리자 플레이트(ELISA Plate)의 1-6열을 피복하고, 또한 피복 용액 B에 의해 동일한 엘리자 플레이트의 7-12열을 피복하는 바, 피복량은 100μl/웰 이고, 플레이트 블로킹 접착제로 블로킹하여 실온에서 하룻 밤 배양시킨다.

3) 플레이트 세척

플레이트를 250μl 세척액/웰, 120초/회 담그는 것에 의해 세척하며, 이를 3회 세척한다. 세척한 후 깨끗한 흡수지에 뚜렷한 물의 흔적이 없을 때까지 웰 내의 액체를 배출시킨다.

4) 플레이트 블로킹

8채널 피펫(pipette)을 이용하여 블로킹 용액 300μl/웰을 추가하고, 플레이트 블로킹 접착제로 블로킹하며 37℃에서 2h 배양시킨다.

5) 샘플의 준비

샘플(융합 단백질 KH02, KH05)의 초기 단백질 농도에 따라 각각 1600ng/ml으로 희석하고, 1600ng/ml의 샘플이 적어도 800μl 있도록 하며, 또한 200μl 샘플에 600μl의 희석액을 추가하여 4배 희석하는 방식에 의해 8개 부동한 농도의 용액(1600ng/ml를 포함)을 획득할 수 있다.

6) 샘플의 투입

위와 같이 플레이트를 세척한다. 샘플을 각각 차례로 엘리자 플레이트에 투입하는 바, 100μl/웰 이며, 플레이트 블로킹 접착제로 블로킹한다. 샘플의 투입은 높은 농도에서 낮은 농도의 순서로 차례로 진행되며, 각 샘플의 실험은 2회 독립적으로 진행된다. 샘플을 투입한 후, 37℃에서 1h 배양시킨다.

7) 검출용 항체 투입

위와 같이 플레이트를 세척한다. 사람 IgG-Fc 항체 HRP 0.5μl를 10ml의 블로킹 희석액에 투입하여 균일하게 혼합시키고, 희석한 후의 검출용 항체를 웰에 투입하는 바, 100μl/웰 이며, 37℃에서 1h 배양시킨다.

8) 착색

위와 같이 플레이트를 세척한다. TMB 착색액을 100μl/웰 로 투입하고, 실온에서 광선을 피하여 5min 착색시킨다.

9) 정지와 읽기

정지액을 50μl/웰으로 투입하고 반응을 정지시키며, 엘리자 플레이트를 마이크로플레이트리더에 놓고 450nm 파장의 조건에서 수치를 읽는다.

1.3 친화력 검출 결과

표 8의 친화력 검출 결과에서 알 수 있다 싶이, KH02는 고온 10일이 지난 후에도 친화력이 여전히 허용 가능 범위(22~84pM) 내이지만, KH05는 고온 10일이 지난 후 친화력이 허용 가능한 범위를 크게 초과하고 있다. 따라서, 활성 면에서 KH02의 안정성은 KH05보다 우월하다.

실시예 7 고온 순도 검출 실험

1.1 실험용 시약과 설비

1.2 실험 방법

1) 시약의 조제

i. PBS 이동상: 7.16g의 Na₂HPO₄·12H₂O, 8.77g의 NaCl과 42.2g의 Arg를 취하여 800ml의 초순수에 용해시키고, HCl를 이용하여 pH7.2로 조절하고, 용적이 1000ml로 되도록 하며, Φ0.22μm의 필터를 이용하여 여과시킨다.

ii. 크로마토그래피칼럼 보호액(0.05% NaN₃): NaN₃ 0.5g을 취하여 1000 ml의 초순수에 용해시킨다. Φ0.22μm의 필터를 이용하여 여과시킨다.

iii. 초순수: Φ0.22μm의 필터를 이용하여 여과시킨다.

2) 샘플 제조

각종 샘플(KH02, KH05)의 농도가 모두 1mg/ml이므로 각 샘플을 취하여 직접 샘플을 투입한다.

3) 크로마토그래피 분석 조건

이동상: PBS 이동상

크로마토그래피 칼럼: TSK G3000 SW_XL(5μm, 7.8*300mm).

칼럼 온도: 25℃, 이동 속도: 0.5ml/min, 검출 파장: 280nm, 분사량: 50μl.

1.3 실험 결과

표 11을 통하여, KH05는 고온 5일 때 그 순도가 54% 좌우로 하강하고, 10일 때 샘플의 순도는 25% 뿐이며, KH02는 고온 5일 때 내려감이 뚜렷하지 않고, 고온 10일 때에도 그 샘플의 순도는 여전히 65%에 도달한다는 것을 알 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> CHENGDU KANGHONG BIOTECHNOLOGIES CO., LTD. <120> FUSION PROTEIN INHIBITING ANGIOGENESIS OR GROWTH AND USE THEREOF <130> DP1P150042ZX <150> CN201410035738.1 <151> 2014-01-25 <160> 32 <170> KopatentIn 3.0 <210> 1 <211> 296 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His 1 5 10 15 Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro 20 25 30 Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro 35 40 45 Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser 50 55 60 Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val 65 70 75 80 Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr Asn 85 90 95 Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser 100 105 110 Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn 115 120 125 Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His 130 135 140 Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser 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tgacctgtga agcaacagtc 240 aatgggcatt tgtataagac aaactatctc acacatcgac aaaccaatac aatcatagat 300 gtggttctga gtccgtctca tggaattgaa ctatctgttg gagaaaagct tgtcttaaat 360 tgtacagcaa gaactgaact aaatgtgggg attgacttca actgggaata cccttcttcg 420 aagcatcagc ataagaaact tgtaaaccga gacctaaaaa cccagtctgg gagtgagatg 480 aagaaatttt tgagcacctt aactatagat ggtgtaaccc ggagtgacca aggattgtac 540 acctgtgcag catccagtgg gctgatgacc aagaagaaca gcacatttgt cagggtccat 600 gaaaaacctt ttgttgcttt tggaagtggc atggaatctc tggtggaagc cacggtgggg 660 gagcgtgtca gaatccctgc gaagtacctt ggttacccac ccccagaaat aaaatggtat 720 aaaaatggaa taccccttga gtccaatcac acaattaaag cggggcatgt actgacgatt 780 atggaagtga gtgaaagaga cacaggaaat tacactgtca tccttaccaa tcccatttca 840 aaggagaagc agagccatgt ggtctctctg cgtgtgtatg tcccaccg 888 <210> 3 <211> 296 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His 1 5 10 15 Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro 20 25 30 Asn Ile Thr Val 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acactttgat ccctgatgga aaacgcataa tctgggacag tagaaagggc 180 ttcatcatat caaatgcaac gtacaaagaa atagggcttc tgacctgtga agcaacagtc 240 aatgggcatt tgtataagac aaactatctc acacatcgac aaaccaatac aatcatagat 300 gtggttctga gtccgtctca tggaattgaa ctatctgttg gagaaaagct tgtcttaaat 360 tgtacagcaa gaactgaact aaatgtgggg attgacttca actgggaata cccttcttcg 420 aagcatcagc ataagaaact tgtaaaccga gacctaaaaa cccagtctgg gagtgagatg 480 aagaaatttt tgagcacctt aactatagat ggtgtaaccc ggagtgacca aggattgtac 540 acctgtgcag catccagtgg gctgatgacc aagaagaaca gcacatttgt cagggtccat 600 gaaaaacctt ttgttgcttt tggaagtggc atggaatctc tggtggaagc cacggtgggg 660 gagcgtgtca gaatccctgc gaagtacctt ggttacccac ccccagaaat aaaatggtat 720 aaaaatggaa taccccttga gtccaatcac acaattaaag cggggcatgt actgacgatt 780 atggaagtga gtgaaagaga cacaggaaat tacactgtca tccttaccaa tcccatttca 840 aaggagaagc agagccatgt ggtctctcgt cctgtgtatg tcccaccg 888 <210> 7 <211> 227 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 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tttccacttg acactttgat ccctgatgga aaacgcataa tctgggacag tagaaagggc 180 ttcatcatat caaatgcaac gtacaaagaa atagggcttc tgacctgtga agcaacagtc 240 aatgggcatt tgtataagac aaactatctc acacatcgac aaaccaatac aatcatagat 300 gtggttctga gtccgtctca tggaattgaa ctatctgttg gagaaaagct tgtcttaaat 360 tgtacagcaa gaactgaact aaatgtgggg attgacttca actgggaata cccttcttcg 420 aagcatcagc ataagaaact tgtaaaccga gacctaaaaa cccagtctgg gagtgagatg 480 aagaaatttt tgagcacctt aactatagat ggtgtaaccc ggagtgacca aggattgtac 540 acctgtgcag catccagtgg gctgatgacc aagaagaaca gcacatttgt cagggtccat 600 gaaaaacctt ttgttgcttt tggaagtggc atggaatctc tggtggaagc cacggtgggg 660 gagcgtgtca gaatccctgc gaagtacctt ggttacccac ccccagaaat aaaatggtat 720 aaaaatggaa taccccttga gtccaatcac acaattaaag cggggcatgt actgacgatt 780 atggaagtga gtgaaagaga cacaggaaat tacactgtca tccttaccaa tcccatttca 840 aaggagaagc agagccatgt ggtctctctg cctgtgtatg tcccaccggg cccgggcgac 900 aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc 960 ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 1020 gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 1080 gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt 1140 gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 1200 aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg 1260 cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggatgagct gaccaagaac 1320 caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1380 gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 1440 ggctccttct tcctctatag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 1500 gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 1560 tccctgtctc cgggtaaa 1578 <210> 16 <211> 526 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> fusion protein KH03 <400> 16 Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His 1 5 10 15 Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro 20 25 30 Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys 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480 aagaaatttt tgagcacctt aactatagat ggtgtaaccc ggagtgacca aggattgtac 540 acctgtgcag catccagtgg gctgatgacc aagaagaaca gcacatttgt cagggtccat 600 gaaaaacctt ttgttgcttt tggaagtggc atggaatctc tggtggaagc cacggtgggg 660 gagcgtgtca gaatccctgc gaagtacctt ggttacccac ccccagaaat aaaatggtat 720 aaaaatggaa taccccttga gtccaatcac acaattaaag cggggcatgt actgacgatt 780 atggaagtga gtgaaagaga cacaggaaat tacactgtca tccttaccaa tcccatttca 840 aaggagaagc agagccatgt ggtctctcgt cctgtgtatg tcccaccggg cccgggcgac 900 aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc 960 ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 1020 gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 1080 gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt 1140 gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 1200 aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg 1260 cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggatgagct gaccaagaac 1320 caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1380 gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 1440 ggctccttct tcctctatag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 1500 gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 1560 tccctgtctc cgggtaaa 1578 <210> 18 <211> 526 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> fusion protein KH04 <400> 18 Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His 1 5 10 15 Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro 20 25 30 Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro 35 40 45 Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser 50 55 60 Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val 65 70 75 80 Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr Asn 85 90 95 Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser 100 105 110 Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn 115 120 125 Val Gly Ile 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protein KH05 <400> 19 ggtagacctt tcgtagagat gtacagtgaa atccccgaaa ttatacacat gactgaagga 60 agggagctcg tcattccctg ccgggttacg tcacctaaca tcactgttac tttaaaaaag 120 tttccacttg acactttgat ccctgatgga aaacgcataa tctgggacag tagaaagggc 180 ttcatcatat caaatgcaac gtacaaagaa atagggcttc tgacctgtga agcaacagtc 240 aatgggcatt tgtataagac aaactatctc acacatcgac aaaccaatac aatcatagat 300 gtggttctga gtccgtctca tggaattgaa ctatctgttg gagaaaagct tgtcttaaat 360 tgtacagcaa gaactgaact aaatgtgggg attgacttca actgggaata cccttcttcg 420 aagcatcagc ataagaaact tgtaaaccga gacctaaaaa cccagtctgg gagtgagatg 480 aagaaatttt tgagcacctt aactatagat ggtgtaaccc ggagtgacca aggattgtac 540 acctgtgcag catccagtgg gctgatgacc aagaagaaca gcacatttgt cagggtccat 600 gaaaaccttt ctgttgcttt tggaagtggc atggaatctc tggtggaagc cacggtgggg 660 gagcgtgtca gaatccctgc gaagtacctt ggttacccac ccccagaaat aaaatggtat 720 aaaaatggaa taccccttga gtccaatcac acaattaaag cggggcatgt actgacgatt 780 atggaagtga gtgaaagaga cacaggaaat tacactgtca tccttaccaa tcccatttca 840 aaggagaagc agagccatgt ggtctctctg gttgtgtatg tcccaccggg cccgggcgac 900 aaaactcaca catgcccact gtgcccagca cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc 960 ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 1020 gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 1080 gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt 1140 gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 1200 aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg 1260 cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggatgagct gaccaagaac 1320 caggtcagcc tgacctgcct agtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1380 gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aaggccacgc ctcccgtgct ggactccgac 1440 ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 1500 gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 1560 tccctgtctc cgggtaaa 1578 <210> 20 <211> 526 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> fusion protein KH05 <400> 20 Gly Arg Pro Phe Val Glu Met 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cgacaaacca atacaatcat agatgtggtt ctgagtccgt ctcatggaat tgaactatct 420 gttggagaaa agcttgtctt aaattgtaca gcaagaactg aactaaatgt ggggattgac 480 ttcaactggg aatacccttc ttcgaagcat cagcataaga aacttgtaaa ccgagaccta 540 aaaacccagt ctgggagtga gatgaagaaa tttttgagca ccttaactat agatggtgta 600 acccggagtg accaaggatt gtacacctgt gcagcatcca gtgggctgat gaccaagaag 660 aacagcacat ttgtcagggt ccatgaaaaa ccttttgttg cttttggaag tggcatggaa 720 tctctggtgg aagccacggt gggggagcgt gtcagaatcc ctgcgaagta ccttggttac 780 ccacccccag aaataaaatg gtataaaaat ggaatacccc ttgagtccaa tcacacaatt 840 aaagcggggc atgtactgac gattatggaa gtgagtgaaa gagacacagg aaattacact 900 gtcatcctta ccaatcccat ttcaaaggag aagcagagcc atgtggtctc tctg 954 <210> 22 <211> 708 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic fragment 2 <400> 22 gtgtatgtcc caccgggccc gggcgacaaa actcacacat gcccaccgtg cccagcacct 60 gaactcctgg ggggaccgtc agtcttcctc ttccccccaa aacccaagga caccctcatg 120 atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg gtggtggacg tgagccacga agaccctgag 180 gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg 240 gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac 300 tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag gtctccaaca aagccctccc agcccccatc 360 gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc 420 ccatcccggg atgagctgac caagaaccag gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc 480 tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag agcaatgggc agccggagaa caactacaag 540 accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc tccttcttcc tctatagcaa gctcaccgtg 600 gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg 660 cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc ctgtctccgg gtaaatga 708 <210> 23 <211> 29 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> full length upstream primer ，P1 <400> 23 atacctaggg ccaccatggt cagctactg 29 <210> 24 <211> 31 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> full length downstream primer，P2 <400> 24 actgtatact catttacccg gagacaggga g 31 <210> 25 <211> 48 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> non-mutant upstream primer，P3 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<220> <223> upstream primer for producing SEQ ID NO: 6，P9 <400> 31 cagagccatg tggtctctcg tcctgtgtat gtcccaccgg gcccgggc 48 <210> 32 <211> 46 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> downstream primer for producing SEQ ID NO: 6，P10 <400> 32 gcccgggccc ggtgggacat acacaggacg agagaccaca tggctc 46

Claims

혈관의 신생 또는 성장을 억제하는 융합 단백질에 있어서,
상기 융합 단백질은 사람 VEGF 수용체 단편과 사람 면역 글로불린 Fc 단편에 의해 형성되고,
상기 융합 단백질은 SEQ ID NO: 14로 표시된 아미노산인 KH02인 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
삭제
삭제
삭제
제 1 항의 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산.
제 5 항에 있어서,
상기 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 13으로 표시한 서열인 것을 특징으로 하는 핵산.
제 1 항의 융합 단백질을 발현하는 발현 벡터로서, 제 1 항의 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
제 7 항에 있어서,
상기 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 13으로 표시한 서열인 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
제 7 항에 있어서,
상기 발현 벡터는 진핵 발현 벡터 또는 바이러스 발현 벡터인 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
제 9 항에 있어서,
상기 진핵 발현 벡터는 포유동물 세포의 발현 벡터이며, 상기 바이러스 발현 벡터는 아데노 관련 바이러스 또는 아데노 바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
제 1 항의 융합 단백질을 발현하는 숙주 세포로서, 제 1 항의 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
제 11 항에 있어서,
상기 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 13으로 표시한 서열인 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
제 11 항에 있어서,
상기 숙주 세포는 CHO 세포 또는 그 아계, 또는 293 세포 또는 그 아계인 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
제 1 항의 융합 단백질을 제조하는 방법에 있어서, 제 7 항의 발현 벡터를 적합한 숙주 세포에 트랜스펙션하여 융합 단백질을 발현시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 제 1 항의 융합 단백질을 제조하는 방법.
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제 1 항의 융합 단백질을 포함하는, 혈관의 신생 또는 성장으로 인한 종양, 노인성 황반변성, 당뇨망막병증, 또는 맥락망막병증을 치료하는 것을 특징으로 하는 의약품.
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