KR101636318B1

KR101636318B1 - Wounding stress-inducible expression promoter

Info

Publication number: KR101636318B1
Application number: KR1020140013028A
Authority: KR
Inventors: 신정섭; 최준영; 정희정; 신현영; 배정명
Original assignee: 고려대학교 산학협력단
Priority date: 2014-02-05
Filing date: 2014-02-05
Publication date: 2016-07-05
Also published as: KR20150092540A

Abstract

본 발명은 식물에서 상처 스트레스 유도성 프로모터, 상기 프로모터를 포함하는 벡터, 그리고 상기 벡터를 포함하는 형질전환체 및 형질전환 방법에 관한 것으로, 상기한 본 발명에 의한 프로모터는 식물체에서 스트레스에 의하여 유전자의 발현을 유도하여, 스트레스 내성 식물 생산을 가능하게 하여, 우수한 품질 또는 수확량 증가 효과를 갖는 고부가 가치의 신품종 육성에 유용하게 이용될 수 있다.The present invention relates to a wound stress inducible promoter in a plant, a vector comprising the promoter, a transformant containing the vector, and a transformation method. The promoter according to the present invention as described above, Inducing expression, allowing stress tolerant plants to be produced, and thus being useful for cultivating new varieties of high added value having excellent quality or yield increasing effect.

Description

상처 스트레스 유도성 발현 프로모터{WOUNDING STRESS-INDUCIBLE EXPRESSION PROMOTER}{WOUNDING STRESS-INDUCIBLE EXPRESSION PROMOTER}

본 발명은 식물에서 상처(wounding) 스트레스 유도성 발현 프로모터, 상기 프로모터를 포함하는 벡터, 그리고 상기 벡터를 포함하는 형질전환체에 관한 것이다.The present invention relates to a wounding stress inducible expression promoter in plants, a vector comprising said promoter, and a transformant comprising said vector.

작물분자육종은 모든 종(種)의 유전자를 재료로 사용할 수 있으며 기존의 게놈 단위로만 가능하던 육종기술을 유전자 단위로 끌어내려 무한대의 육종 효과를 미세하게 조절할 수 있다는 측면에서 차세대 농업을 이끌어 갈 핵심적인 기술이다. 이러한 작물분자육종 기술을 이용한 유전자변형 작물의 재배면적과 재배량이 전 세계적으로 지속적으로 증가하고 있으며, 상업화된 유전자변형 신종자의 세계 시장 규모는 2002년 40억 달러에서 2010년 100억 달러(종자와 기술료 포함)로 전체 세계 종자 시장규모 300억 달러 대비 15% 수준이며, 종류로는 대두, 옥수수, 면화, 유채가 주 시장을 형성하고 있다. 유전자변형 작물의 효과를 극대화하기 위해서는 외부에서 삽입된 유전자의 발현을 식물의 발달 시기별, 조직 별로 미세하게 조절할 수 있어야 하며 이를 위해 다양한 프로모터의 개발이 이루어져야 한다.Crop molecular breeding can use all kinds of genes as a material and it is possible to control the effect of breeding infinitely by dragging the breeding technique which was possible only by the existing genome unit as a gene unit, Technology. The cultivation area and the cultivation amount of genetically modified crops using the above-mentioned crop molecular breeding technique are continuously increasing worldwide, and the global market size of the commercialized genetically modified new person is from $ 4 billion in 2002 to $ 10 billion in 2010 , Which is about 15% of the global seed market of 30 billion dollars. Soybean, corn, cotton, and rapeseed are the major markets. In order to maximize the effect of genetically modified crops, the expression of exogenously inserted genes must be finely regulated by the developmental stage and tissue of the plant, and various promoters should be developed for this purpose.

이에 1980년대 초반부터 식물 유전자의 발현을 조절하는 프로모터에 대한 연구가 진행되어 왔다. 꽃양배추 모자이크 바이러스(Cauliflower mosaic virus)의 프로모터가 식물 전 조직에서 강한 발현을 유도할 것이라고는 가능성이 제시되고, 상기 프로모터의 염기서열이 밝혀지고, 식물체내에서 강한 발현이 증명되었다. 그 후 CaMV 35S(특허번호: JP1993192172-A1) 프로모터는 식물에서 가장 많이 쓰이는 보편적인(universal) 프로모터가 되었다.Since the early 1980s, research has been conducted on promoters that regulate the expression of plant genes. It has been suggested that the promoter of cauliflower mosaic virus will induce strong expression in whole plant tissues, the nucleotide sequence of the promoter is revealed, and strong expression has been demonstrated in the plant body. The CaMV 35S (patent number: JP1993192172-A1) promoter has since become the universal promoter most commonly used in plants.

한편, 식물은 과습, 고염, 가뭄, 저온, 고온, 활성산소 등의 비생물학적 스트레스와 병충해 같은 생물학적 스트레스와 같은 다양한 유형의 스트레스에 대응하기 위한 내성 메카니즘을 보유하고 있다. 최근, 이러한 스트레스 내성 메카니즘이 분자 수준에서 규명됨에 따라서, 생명공학적 기법을 이용하여 스트레스 내성 식물이 제조되게 되었다. 이러한 식물 스트레스 내성 연구에서, 유전자는 대부분이 꽃양배추 모자이크 바이러스의 35S 프로모터에 결합되어 식물에 도입된다. 그러나 재조합 식물의 스트레스 내성 수준은 불안정하며 도입된 유전자의 발현 수준은 낮게 나타나 이들 중 어떤 것도 실제로 이용되기 쉽지 않아 스트레스 조직 특이적으로 발현을 유도하는 조직 특이 프로모터의 발현에 대한 연구가 꾸준히 진행되어서 가뭄 스트레스 조직 특이 프로모터 (Boyce et al., 2003, Plant Journal 34:395-406), 저온 스트레스 조직 특이 프로모터 (Yamaguchi-shinozaki and shinozaki, 2005, 10:88-94), 활성산소 스트레스 조직 특이 프로모터 (Kim et al., 2003, Plant Mol. Bio. 51:831-838) 등 과 병균 스트레스, 해충 스트레스, 바이러스 스트레스 등의 연구가 이루어졌다. 식물의 스트레스는 식물의 성장을 방해하여 수확량을 감소 문제를 일으키며 더 나아가 식물을 고사시키는 문제가 있다. 따라서 스트레스 반응을 유발하여 발현을 조절할 수 있는 기술에 대한 연구가 요구되어 왔으며, 이를 위해서 상처(wounding) 스트레스로 발현을 유도하는 프로모터의 개발에 대한 요구가 지속적으로 있어 왔다.On the other hand, plants have resistance mechanisms to cope with various types of stresses such as abiotic stresses such as hyperhidrosis, high salt, drought, low temperature, high temperature, active oxygen, and biological stress such as insect pests. Recently, as these stress tolerance mechanisms have been identified at the molecular level, stress tolerant plants have been produced using biotechnological techniques. In these plant stress tolerance studies, most of the genes are introduced into plants by binding to the 35S promoter of the cauliflower mosaic virus. However, the level of stress tolerance of recombinant plants is unstable and the expression level of the introduced gene is low, and none of them is actually used. Therefore, studies on the expression of tissue-specific promoters that induce stress-specific expression have been steadily conducted, (Kim et al., 2003, Plant Journal 34: 395-406), cold stress tissue specific promoters (Yamaguchi-shinozaki and shinozaki, 2005, 10: 88-94), active oxygen stress tissue- specific promoters et al., 2003, Plant Mol. Bio. 51: 831-838), and the like. The stress of the plant interferes with the growth of the plant, causing a problem of decreasing the yield, and furthermore, there is a problem of ending the plant. Therefore, there has been a demand for a technique for regulating expression by inducing a stress response, and there has been a continuous demand for the development of a promoter that induces expression by wounding stress.

KR 10-2007-0115325AKR 10-2007-0115325A

본 발명은 상기 요구를 해결하기 위한 것으로, 본 발명의 목적은 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어지는 상처(wounding) 스트레스 유도성 프로모터를 제공하는 것이다.An object of the present invention is to provide a wounding stress inducible promoter comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1.

본 발명의 다른 목적은 상기 프로모터를 포함하는 발현 벡터 및 상기 벡터를 포함하는 형질전환체와 형질전환용 조성물을 제공하는 것이다. Another object of the present invention is to provide an expression vector comprising the promoter, a transformant comprising the vector, and a composition for transformation.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 프로모터를 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 제공하는 것이다. It is still another object of the present invention to provide a primer set capable of amplifying the promoter.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명가들은 애기장대 TAIR/ATTED DB를 이용하여 종자 특이적 발현을 보이는 At5g55750 유전자의 프로모터 부위를 클로닝하여 식물체에서 상처(wounding) 스트레스 유도성 발현 프로모터를 제작하였고, 애기장대를 이용한 형질전환체에서 상기 프로모터의 활성을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.In order to achieve the above object, the present inventors produced a wounding stress inducible promoter in a plant by cloning a promoter region of At5g55750 gene showing seed-specific expression using Arabidopsis thaliana TAIR / ATTED DB, The present inventors completed the present invention by confirming the activity of the promoter in the transformant.

구체적으로, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어지고, 상처(wounding) 스트레스 유도성 프로모터를 제공한다. Specifically, the present invention consists of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 and provides a wounding stress inducible promoter.

또한, 본 발명은 상기 프로모터를 포함하는 발현 벡터를 제공한다. The present invention also provides an expression vector comprising the promoter.

또한, 본 발명은 상기 프로모터 및 이와 작동 가능하게 연결된 유전자를 포함하는 발현 벡터를 제공한다. The invention also provides an expression vector comprising the promoter and a gene operably linked thereto.

또한, 본 발명은 상기 프로보터 또는 벡터를 포함하는 형질전환체를 제공한다. The present invention also provides a transformant comprising the promoter or the vector.

또한, 본 발명은 상기 프로모터 및 벡터 중에서 어느 하나를 포함하는 식물의 형질전환용 조성물을 제공한다. In addition, the present invention provides a composition for transforming a plant comprising any one of the promoter and the vector.

또한 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함하는 DNA 단편을 증폭하기 위한 서열번호 2로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 3으로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 제공한다.
The present invention also provides a primer set comprising a forward primer of SEQ ID NO: 2 for amplifying a DNA fragment comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and a reverse primer of SEQ ID NO:

이하, 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명한다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail.

서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어지고, 상처(wounding) 스트레스 유도성 프로모터에 관한 것이다. The present invention is directed to a wounding stress inducible promoter comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1.

상기 프로모터는 전사를 개시할 수 있는 프로모터로, 비생물학적 및/또는 기계적 스트레스에 반응하여 발현된다. 또한, 상기 프로모터 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함될 수 있다. 변이체는 염기서열은 변화되지만, 서열번호 1의 염기서열과 유사한 기능적 특성을 갖는 염기서열을 모두 포함한다. 구체적으로, 상기 프로모터는 서열번호 염기서열과 각각 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상 또는 95% 이상의 상동성을 갖는 염기서열을 포함할 수 있다. The promoter is a promoter capable of initiating transcription and is expressed in response to abiotic and / or mechanical stress. In addition, variants of the promoter sequence may be included within the scope of the present invention. The mutant includes all the nucleotide sequences having a functional characteristic similar to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 although the nucleotide sequence is changed. Specifically, the promoter may include a nucleotide sequence having 70% or more, 80% or more, 90% or more, or 95% or more homology with the nucleotide sequence of SEQ ID NO:

상기 폴리뉴클레오티드에 대한 서열 상동성의 %는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)과 달리 추가 또는 삭제(갭, gap)를 포함할 수 있다.The percent of sequence homology to the polynucleotide is determined by comparing the comparison region with the two optimally aligned sequences, and some of the polynucleotide sequences in the comparison region are referenced (addition or deletion) to the optimal alignment of the two sequences , But may include additions or deletions (gaps).

상기 프로모터의 발현 부위는 식물체 전체에서 나타날 수 있으며, 일 예로 꽃, 잎 및 줄기에서 발현 된다. The expression site of the promoter may appear throughout the plant, for example, in flowers, leaves and stems.

비생물학적 및/또는 기계적 스트레스는 바람직하게는 상처 또는 상해(wounding)에 의한 스트레스 일 수 있다. The abiotic and / or mechanical stress may preferably be stress due to wound or wounding.

상기 프로모터는 서열번호 1의 염기서열을 갖고, 상기 염기서열은 애기장대 At5g55750 유전자의 코딩 시퀀스의 번역개시 부위로부터 -1 내지 -1200에서 유래된 것을 특징으로 한다. 상기 프로모터는 식물체의 상처 조직에서 목적 유전자의 발현을 유도할 수 있다.
The promoter has the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, and the nucleotide sequence is derived from -1 to -1200 from the translation initiation site of the coding sequence of the Arabidopsis At5g55750 gene. The promoter may induce the expression of the target gene in the wound tissue of the plant.

또한, 본 발명은 상기 프로모터를 포함하는 발현 벡터, 그리고 상기 프로모터 및 이와 작동 가능하게 연결된 유전자를 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다. The present invention also relates to an expression vector comprising said promoter and an expression vector comprising said promoter and a gene operably linked thereto.

상기 벡터는 바람직하게는 식물 발현 벡터일 수 있고, 식물 발현 벡터로 통상적으로 사용되는 벡터의 종류를 모두 포함할 수 있다. The vector may preferably be a plant expression vector, and may include all kinds of vectors conventionally used as a plant expression vector.

상기 발현 벡터에서 프로모터는 작동 가능하게 연결된 유전자의 앞에 위치할 수 있다. 작동 가능하게 연결된 이란, 유전자가 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA를 포함하는 것으로, 일 예로 이종 단백질을 발현하기 위한 단위로서 기능하는 발현 카세트 성분 일 수 있다. The promoter in the expression vector may be located in front of the operably linked gene. Operably linked means that the recombinant DNA comprises a recombinant DNA comprising a suitable nucleic acid sequence necessary for the expression of the coding sequence by the gene and may for example be an expression cassette component functioning as a unit for expressing the heterologous protein.

상기 유전자는 상처 스트레스 조직에서 발현을 원하는 어떤 유전자도 될 수 있으며, 그 종류에 한정되지 않고, 외래 유전자(exotic gene)도 포함될 수 있다. 일 예로 의학적 활용성이 있는 단백질, 사람을 포함하는 동물의 건강을 증진시킬 수 있는 단백질, 세포 조절 단백질, 식물병 저항성 단백질, 고기능성 단백질, 생장 조절 단백질 및 성숙 조절 단백질 등의 유용한 목적을 달성할 수 있는 단백질을 코딩하는 유전자 일 수 있다. The gene may be any gene that is desired to be expressed in a wound stress tissue, and is not limited to the type, but may also include an exotic gene. For example, a protein having a medically utilizable property, a protein capable of promoting health of an animal including a human, a cell regulatory protein, a plant disease resistance protein, a high function protein, a growth regulatory protein and a maturation regulatory protein Lt; RTI ID = 0.0 > a < / RTI > protein.

상기 유전자는 스트레스 유도성 발현 벡터에서 상기 프로모터 부위의 뒤에 위치하며 필요에 따라 리포터 유전자와 융합되어 발현될 수도 있다.The gene is located after the promoter region in a stress inducible expression vector and may be expressed by fusion with a reporter gene as necessary.

본 발명의 일 실시예에 있어서, GUS 리포터 유전자가 함유된 바이너리 벡터(pBI101)에 본 발명의 프로모터를 삽입한 At5g55750:GUS를 제조하였고, 상기 GUS 리포터 유전자는 다른 유용한 목적의 외래 유전자로 치환될 수 있다.
In one embodiment of the present invention, At5g55750: GUS in which the promoter of the present invention is inserted into a binary vector (pBI101) containing the GUS reporter gene was prepared, and the GUS reporter gene could be replaced with a foreign gene of another useful purpose have.

또한, 본 발명은 상기 프로모터 또는 벡터를 포함하는 형질전환체 및 상기 프로모터 또는 벡터를 포함하는 식물의 형질전환용 조성물에 관한 것이다. The present invention also relates to a transformant comprising the promoter or the vector and a composition for transforming the plant comprising the promoter or the vector.

상기 형질전환체는 본 발명의 발현 벡터를 이용하여 형질전환된 형질전환 식물체 일 수 있다. 상기 식물체는 스트레스 유도성 프로모터가 포함된 유전자 발현 카세트 또는 스트레스 유도성 프로모터를 포함하는 발현 벡터가 삽입되어 형질전환이 가능한 식물체라면 그 종류에 제한되지 않는다. 상기 식물체는 상기 식물 자체, 조직, 세포 및 종자로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 일 수 있다. The transformant may be a transformed plant transformed with the expression vector of the present invention. The plant is not limited to a plant which can be transformed by insertion of an expression vector containing a gene expression cassette or a stress inducible promoter containing a stress inducible promoter. The plant may be any one selected from the group consisting of the plant itself, the tissue, the cell, and the seed.

상기 식물 세포는 어떤 식물 세포도 가능하며 배양세포, 배양조직, 배양기관 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 것은 모두 이용할 수 있다. The plant cell may be any plant cell, and may be any of those selected from the group consisting of cultured cells, cultured tissues, culture media, and combinations thereof.

상기 식물 조직은 미분화된 또는 분화된 식물의 조직일 수 있고, 일 예로 뿌리, 줄기, 잎, 꽃가루, 종자, 암 조직 및 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들로 단일세포, 원형질체(protoplast), 싹 및 캘러스을 모두 포함한다. 또한, 상기 식물조직은 인 플란타(in planta)이거나, 기관 배양, 조직배양 또는 세포 배양 상태인 것도 모두 포함한다.The plant tissue may be an undifferentiated or differentiated plant tissue. Examples of the plant tissue include roots, stems, leaves, pollen, seeds, cancer tissues, and various types of cells used for culturing. Examples thereof include single cells, protoplasts, And callus. In addition, the plant tissue may be in planta, or may be an organ culture, a tissue culture, or a cell culture.

상기 식물은 일 예로, 식량작물류, 채소작물류, 특용 작물류, 과수류, 화훼류, 사료작물류 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 일 수 있다. 상기 식물은 바람직하게는 쌍자엽 식물 일 수 있다. The plant may be any one selected from the group consisting of food crops, vegetable crops, special crops, fruit trees, flowers, feed crops, and combinations thereof. The plant may preferably be a dicotyledonous plant.

상기 형질 전환용 조성물은 바람직하게는 본 발명의 발현 벡터를 포함하는 미생물의 배양물을 포함할 수 있다. 상기 배양물은 본 발명의 벡터를 포함하는 미생물을 배양배지 또는 배양액에서 배양한 배양산물로, 상기 배양물의 상층액, 농축물, 건조물 및 이들의 조합으로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나를 포함할 수 있다. 또한 그 제형에 한정되지 않고, 액체 또는 고체일 수 있다. The transfection composition may preferably comprise a culture of a microorganism comprising the expression vector of the present invention. The culture is a culture product obtained by culturing a microorganism comprising the vector of the present invention in a culture medium or a culture medium, and may include any one selected from the group consisting of an upper layer, a concentrate, a dried product and a combination thereof of the culture . And is not limited to the formulation, but may be liquid or solid.

상기 형질 전환용 조성물은 본 발명의 프로모터 또는 발현 벡터 이외에 식물체의 형질 전환을 위해 사용되는 부가적인 성분을 더 포함할 수 있고, 일 예로, 아쥬반트, 부형제, 담체 등을 포함하여 형질 전환 효율을 향상시킬 수 있다. In addition to the promoter or expression vector of the present invention, the transforming composition may further include additional components used for transforming plants. For example, the composition may include adjuvants, excipients, carriers, etc. to improve transformation efficiency .

상기 본 발명의 프로모터 또는 이를 포함하는 발현 벡터를 식물체 내로 삽입하는 방법은 본 발명의 기술분야에서 통상적으로 사용되는 방법을 사용할 수 있고, 일 예로 아그로박테리움 방법, 삼투압법, 전기천공법, 유전자총 방법 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 방법을 이용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는 아그로박테리움 방법을 이용할 수 있다. The method of inserting the promoter of the present invention or an expression vector containing the promoter of the present invention into a plant may be a method commonly used in the technical field of the present invention. For example, the method of Agrobacterium method, osmotic pressure method, electroporation method, Methods, and combinations thereof, but the present invention is not limited thereto. Preferably, the Agrobacterium method can be used.

본 발명의 형질전환 방법에 의하여 형질 전환 된 형질전환체는 스트레스에 의하여 발현을 유도하는 본 발명의 프로모터에 의하여 스트레스 조직에서 특이적으로 유전자를 발현 시킬 수 있고, 이를 이용하여 식물의 스트레스를 이용하여 식물의 수확, 목적 유전자의 발현을 통한 유용한 단백질의 생산 등이 가능하다. The transformant transformed by the transforming method of the present invention expresses the gene specifically in the stress tissue by the promoter of the present invention which induces expression by stress, and by utilizing the stress of the plant, Harvesting of plants, production of useful proteins through the expression of target genes, and the like.

또한, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함하는 DNA 단편을 증폭하기 위한 서열번호 2로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 3으로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트 및 상기 프라이머 세트를 포함하는 식물체 선별용 키트에 관한 것이다. The present invention also provides a primer set comprising a forward primer consisting of SEQ ID NO: 2 and a reverse primer consisting of SEQ ID NO: 3 for amplifying a DNA fragment comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 and a plant set comprising the primer set To a screening kit.

상기 DNA 단편은 서열번호 1로 표시되는 것 일 수 있고, 상기 서열번호 1의 염기서열은 애기장대 At5g55750 유전자로부터 유래된 것이다. The DNA fragment may be represented by SEQ ID NO: 1, and the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 is derived from the Arabidopsis At5g55750 gene.

상기 서열번호 2 및 3을 포함하는 프라이머 세트는 본 발명의 스트레스 유도성 프로모터를 증폭할 수 있다. The primer set comprising SEQ ID NOS: 2 and 3 can amplify the stress inducible promoter of the present invention.

또한 본 발명은 상기 식물 형질전환체를 이용하여 식물체 스트레스 조직 내에서 목적 단백질이 생산되도록 하는 것을 특징으로 하는 식물체 내에서 목적 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다.The present invention also relates to a method for producing a target protein in a plant, wherein the target protein is produced in a plant stress tissue using the plant transformant.

본 발명의 애기장대 유래 스트레스 유도성 프로모터는 식물체에서 스트레스에 의하여 유전자의 발현을 유도하여, 스트레스 내성 식물 생산을 가능하게 하여, 우수한 품질 또는 수확량 증가 효과를 갖는 고부가 가치의 신품종 육성에 유용하게 이용될 수 있다.The stress-inducible promoter derived from Arabidopsis thaliana of the present invention induces expression of a gene by stress in a plant, thereby enabling production of a stress tolerant plant and is useful for cultivating a new variety of high added value having an excellent quality or yield increasing effect .

도 1은 본 발명의 프로모터에 의해 발현이 조절될 것으로 예상되는 At5g55750 유전자의 RT-PCR을 통한 조직별 발현 양상의 결과를 나타내는 도이다.
도 2는 본 발명을 위한 프로모터 클로닝을 위한 PCR 결과를 나타내는 도이다.
도 3은 본 발명에 의한 프로모터 클로닝에 이용한 발현벡터인 pBI101 벡터의 모식도이다.
도 4a는 본 발명에 의한 상처 스트레스 유도성 At5g55750 프로모터의 상처 부위별 발현양상을 확인한 도이다.
도 4b는 본 발명에 의한 상처 스트레스 유도성 At5g55750 프로모터의 조절로 GUS의 발현양상을 분석한 결과를 나타내는 도로, 왼쪽 도는 잎의 가운데 부분을 핀셋으로 집은 후 GUS 발현을 확인한 도이며, 가운데 도는 잎의 전면을 압정으로 상처를 낸 후 GUS 발현을 확인한 도이고, 오른쪽 도는 가운데 도를 확대한 도이다.
도 4c는 본 발명에 의한 상처 유도성 At5g55750 프로모터의 조절로, real-time PCR을 통해서, 상처(wounding)스트레스 유발 후 시간에 따른 유전자의 발현 양상을 확인한 그래프 이다. FIG. 1 is a diagram showing the results of tissue expression expression by RT-PCR of the At5g55750 gene, whose expression is expected to be regulated by the promoter of the present invention.
2 is a diagram showing a PCR result for promoter cloning for the present invention.
3 is a schematic diagram of a vector pBI101 used as an expression vector for promoter cloning according to the present invention.
FIG. 4A is a graph showing the expression pattern of the wound-stress inducible At5g55750 promoter according to the present invention at each wound site.
FIG. 4B is a graph showing the results of analysis of the expression pattern of GUS by the regulation of the wound stress inducible At5g55750 promoter according to the present invention, And the GUS expression was confirmed after scarring with the pushpin on the front surface.
FIG. 4C is a graph showing the expression patterns of genes according to time after induction of wounding stress through real-time PCR by controlling the wound inducible At5g55750 promoter according to the present invention.

이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the following examples. However, the scope of the present invention is not limited by these examples in accordance with the gist of the present invention.

실시예 1: 종자에서 특이적으로 발현하는 유전자 (At5g55750) 선발 및 확인Example 1: Selection and confirmation of gene (At5g55750) specifically expressed in seeds

TAIR/ATTED DB에 공개된 affymetrix 25k(ATHI) array 결과를 토대로 종자에서만 발현하는 유전자들을 선발한 후, 기존에 발표된 논문에서 종자에 특이적으로 발현하는 패턴을 확인할 수가 없는 유전자들을 선발하였다. 그 중 At5g55750에 위치한 유전자를 선발하였다.Based on the results of the affymetrix 25k (ATHI) array published in the TAIR / ATTED DB, genes selected only in seeds were selected, and genes that could not be identified in seeds were identified. Among them, genes located at At5g55750 were selected.

At5g55750 유전자의 발현 양상을 알아보기 위해 RT-PCR을 수행하였다. RT-PCR에 이용할 표준 cDNA를 합성하기 위해 TRI REAGENT^®(TRI REAGENT^®- RNA/DNA/PROTEIN ISOLATION REAGENT, MOLECULAR RESEARCH CENTER, INC.)을 이용하여, 5주된 애기장대(Arabidopsis thalina ecotype Columbia)의 각 조직, 즉 꽃(flower), 줄기(inflorescence), 잎(leaf), 뿌리(root), 미성숙 종자(immature seed)와 7주된 애기장대의 성숙 종자(mature seed)의 전체 RNA(total RNA)를 추출하였다.RT-PCR was performed to examine the expression pattern of At5g55750 gene. For the synthesis of standard cDNAs for RT-PCR, TRI REAGENT ^® (TRI REAGENT ^® - RNA / DNA / PROTEIN ISOLATION REAGENT, MOLECULAR RESEARCH CENTER, INC. Extraction of total RNA (total RNA) from tissues, flowers, inflorescence, leaves, roots, immature seeds and mature seeds of 7 major Arabidopsis thaliana Respectively.

정량한 전체 RNA(total RNA) 5 μg과 2.5 μM anchored-oligo(dT)₁₈ primer, 1x(8 mM MgCl₂) 전사인자 역전사효소 반응 완충액(transcriptor reverse transcriptase reaction buffer), 20U 프로텍터 리보뉴클레아제 억제제(protector RNase inhibitor), 1mM 데옥시뉴클레오타이드 믹스(deoxynucleotide mix), 10U 전사인자 역전사효소(transcriptor reverse transcriptase)를 전체 20 ㎕가 되도록 잘 섞은 다음 55℃에서 70분간 처리하였다. 이후 전사인자 역전사 효소의 불활성화를 위해서 85℃에서 5분간 처리하였다. 위와 같은 방법으로 조직별 cDNA pool을 만들었으며, 이 cDNA pool을 RT-PCR의 주형(template)으로 사용하였다.5 μg of the total RNA (total RNA), 2.5 μM anchored-oligo (dT) ₁₈ primer, 1 × (8 mM MgCl ₂ ) transcriptor reverse transcriptase reaction buffer, 20 U protector ribonuclease inhibitor (protector RNase inhibitor), 1 mM deoxynucleotide mix, and 10 U transcriptor reverse transcriptase were mixed to a total volume of 20 μl, followed by treatment at 55 ° C for 70 minutes. And then treated at 85 ° C for 5 minutes to inactivate the transcription factor reverse transcriptase. A cDNA pool for each tissue was constructed as described above, and this cDNA pool was used as a template for RT-PCR.

Tair 부위(Tair site)의 염기서열을 바탕으로 단백질 코딩 부위(protein coding region)에서 프라이머 1, 2(표 1의 서열번호4, 5)를 합성하였고, Gene Amp^®PCR System 2700 (Perkin Elmer, USA)을 사용하여, 95℃에서 5분간 초기 변성 후, 95℃ 20초, 60℃ 20초, 72℃ 30초 30회 실시하였다.Primers 1 and 2 (SEQ ID NOS: 4 and 5 in Table 1) were synthesized in the protein coding region based on the nucleotide sequence of the Tair site. Gene Amp ^® PCR System 2700 (Perkin Elmer, USA ) For 30 minutes at 95 ° C for 20 seconds, 60 ° C for 20 seconds, and 72 ° C for 30 seconds after the initial denaturation at 95 ° C for 5 minutes.

RT-PCR용 프라이머Primers for RT-PCR 5'-GTAAACCCCGTCTTCAACG-3'5'-GTAAACCCCGTCTTCAACG-3 ' 서열번호 4SEQ ID NO: 4 5'-CGCCAATAGTACCGTAAGGATAA-3'5'-CGCCAATAGTACCGTAAGGATAA-3 ' 서열번호 5SEQ ID NO: 5

내적대조군(internal control)으로는 EF1a를 사용하였으며, 조직별 cDNA pool에서 EF1a의 전사 양이 거의 동일함을 확인하였다. 상기 At5g55750 유전자 특이 프라이머를 이용한 RT-PCR의 결과는 도 1과 같다. 도 1에 나타난 바와 같이 At5g55750 유전자가 꽃, 잎, 줄기, 뿌리에서는 발현하지 않고, 미성숙 종자에서는 약하게 성숙 종자에서는 강하게 발현하는 것을 확인할 수 있었다.
EF1a was used as an internal control and the transcription amount of EF1a in the tissue pool was almost the same. The results of RT-PCR using the At5g55750 gene specific primer are shown in FIG. As shown in Fig. 1, it was confirmed that At5g55750 gene is not expressed in flowers, leaves, stems, and roots, and is weakly expressed in immature seeds and strongly expressed in mature seeds.

실시예 2 : 애기장대 At5g55750 유전자의 프로모터 클로닝 Example 2: Promoter cloning of the Arabidopsis At5g55750 gene

상기 유전자의 프로모터로 추정되는 부위는 1200 염기쌍(base pair)으로 추정하였다. 먼저 야생 애기장대의 게놈 DNA(gDNA)를 추출하고, 5' 말단에는 HindIII을 3' 말단에는 BamHI을 포함하고 있는 서열번호 3 및 서열번호 3으로 표시되는 프라이머를 합성하였다(표 2 참조).The region deduced as the promoter of the gene was estimated as a base pair of 1200 bases. First extracting genomic DNA (gDNA) of Arabidopsis thaliana wild, and the 5 'end is the HindIII 3' end has included a BamHI and a synthetic primer represented by SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 3 in (Table 2).

프로모터 클로닝용
프라이머For promoter cloning
primer 5' - GGCGAAGCTTAAAAAAGCAGAGACTTGGACAG - 3'5 '- GGCGAAGCTTAAAAAAGCAGAGACTTGGACAG-3' 서열번호 2SEQ ID NO: 2 5' - ATTTGGATCCTCATGGTGCTGGGTGAGT - 3'5 '- ATTTGGATCCTCATGGTGCTGGGTGAGT-3' 서열번호 3SEQ ID NO: 3

상기 gDNA를 주형으로 하여 서열번호2, 3 프라이머와 교정(proofreading) 기능을 갖는 DNA 중합효소인 Phusion High-Fidelity DNA Polymerase(Phusion^®DNA Polymerase, Thermo Scientific)를 이용하여 프로모터 부위를 증폭하였다. 그리고 이때 PCR 반응은 Gene Amp^®PCR System 2700(Perkin Elmer, USA)을 사용하여, 98℃에서 1분간 초기 변성 후, 98℃에서 10초, 58℃에서 30초 72℃에서 40초로 30회 PCR을 수행하였다. As a template, the promoter region was amplified using primers of SEQ ID NOS: 2 and 3 and a DNA polymerase, Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Phusion ^® DNA Polymerase, Thermo Scientific) having a proofreading function. The PCR reaction was carried out using Gene Amp ^® PCR System 2700 (Perkin Elmer, USA) for 30 min at 98 ° C for 1 min, 98 ° C for 10 sec, 58 ° C for 30 sec and 72 ° C for 40 sec. Respectively.

PCR로 얻은 산물이 1220 (제한효소 서열 포함) 염기쌍 인지를 아가로스 젤 상에서 확인하고, 이 PCR 산물을 HindIII과 BamHI 제한효소로 말단을 자른 다음 GUS 리포터 유전자를 가지고 있는 pBI101 벡터(vector)의 HindIII과 BamHI 제한효소 인식 부위에 클로닝하였다. 이후 대장균(E.coli) colony-PCR을 수행하여 PCR 산물이 삽입된 것을 확인하고, 그 중 하나의 클론을 시퀀싱(sequencing)한 결과 정확한 염기서열이 클로닝되었음을 확인하였다 (서열번호 1 참조).
The result of PCR was confirmed on the agarose gel with 1220 (including the restriction enzyme sequence) base pair. The PCR product was terminated with HindIII and BamHI restriction enzymes, and HindIII of the pBI101 vector having the GUS reporter gene BamHI restriction enzyme recognition site. Thereafter, E. coli colony-PCR was performed to confirm that the PCR product was inserted, and one of the clones was sequenced to confirm that the correct nucleotide sequence was cloned (see SEQ ID NO: 1).

실시예 3 : At5g55750 프로모터의 애기장대 형질전환 Example 3: Arabidopsis transformation of the At5g55750 promoter

At5g55750 프로모터 클로닝에 이용한 pBI101 벡터는 레프트 보드(left board)와 라이트 보드(right board) 사이에 GUS(β-glucuronidase) 리포터 유전자를 가지고 있으며 식물에 형질전환시킬 수 있는 바이너리 벡터(binary vector)이다(도 3 참조).The pBI101 vector used for the At5g55750 promoter cloning is a binary vector having a GUS (β-glucuronidase) reporter gene between the left board and the right board and capable of transforming into plants 3).

이 벡터를 아그로박테리움(Agrobacterium, GV3101)에 형질전환을 한 후 꽃침지(flower dipping, Clough er al., Plant J., 16(6): 735-743, 1998) 방법으로 애기장대에 형질전환을 하였다. 형질전환 애기장대를 항생제 카나마이신이 함유된 배지에서 선별하였다.
This vector was transformed into Agrobacterium (GV3101) and transformed into Arabidopsis by the method of flower dipping (Clougher al., Plant J., 16 (6): 735-743, 1998) Respectively. Transgenic Arabidopsis thaliana was selected on a medium containing the antibiotic kanamycin.

실시예 4 : 형질전환 애기장대의 조직 화학적 염색 분석Example 4: Histochemical staining analysis of transgenic Arabidopsis thaliana

선별된 형질전환 식물체의 각 조직으로부터 GUS 활성을 조직 화학적 염색 방법을 이용하며 조사하였다. 식물체의 각 조직은 1 mM X-Gluc(5-bromo-4-chloro-3-indoly- β-glucuronidase), 100 mM 인산나트륨(sodium phosphate)(pH 7.0), 10 mM EDTA, 0.5 mM 페리시안화 칼륨(potassium ferricyanide), 0.5 mM 페로시안화 칼륨(potassium ferrocyanide), 그리고 0.1% Triton X-100을 함유하는 용액에 담가 37℃에서 24시간 동안 반응시킨 다음, 용액을 제거한 후 70% 에탄올을 첨가하여 2시간동안 클로로필을 제거하는 과정을 3회 반복한 후, 100% 에탄올에 보관하면서 관찰하였다. 그 결과, 도 4a와 같이 꽃, 잎, 줄기 절단면에서 GUS 염색이 관찰 되었다. 또한 상처(wounding) 스트레스 조직 특이적으로 발현할 것으로 추정되는 At5g55750 유전자의 발현이 실제로 상처(wounding) 스트레스 조직에서만 발현이 되는지 알아보기 위해 상처(wounding) 스트레스 후 조직 화학적 염색 분석을 수행하였다. 상기 결과를 도 4에 나타내었다. GUS activity was examined from each tissue of selected transgenic plants using histochemical staining method. Each tissue of the plant was treated with 1 mM X-Gluc (5-bromo-4-chloro-3-indoly- beta -glucuronidase), 100 mM sodium phosphate (pH 7.0), 10 mM EDTA, 0.5 mM potassium ferricyanide , potassium ferricyanide, 0.5 mM potassium ferrocyanide, and 0.1% Triton X-100 at 37 ° C. for 24 hours. After removing the solution, 70% ethanol was added to the reaction solution for 2 hours The procedure for removing chlorophyll was repeated three times, followed by storage in 100% ethanol. As a result, GUS staining was observed on flower, leaf and stem sections as shown in Fig. 4A. In addition, histochemical staining analysis was performed after wounding stress to determine whether the expression of At5g55750 gene, which is presumed to be expressed specifically in wounding stress tissue, is actually expressed only in wounding stress tissue. The results are shown in Fig.

이 결과 도 4a 및4b와 같이 핀셋이나 압정으로 상처(wounding) 스트레스를 처리한 부위에서 GUS 염색이 관찰되었다. 도 4a에 나타낸 바와 같이, 꽃, 잎 및 줄기 모두에서 삽입된 유전자의 발현이 가능함을 확인 하였고, 도 4b에 나타낸 바와 같이, 상처에 의하여 발현이 유도되는 것임을 확실하게 확인 하였다. 따라서 본 발명의 프로모터가 상처(wounding) 스트레스 받은 줄기, 잎, 꽃 등의 조직에서 프로모터 활성을 보임을 모두 확인 하였다.
As a result, GUS staining was observed at the site where wounding stress was treated with tweezers or pushpins as shown in FIGS. 4A and 4B. As shown in FIG. 4A, it was confirmed that the inserted gene could be expressed in both flowers, leaves and stems, and it was confirmed that the expression was induced by a wound, as shown in FIG. 4B. Therefore, it was confirmed that the promoter of the present invention showed promoter activity in tissues such as wounding stressed stems, leaves, flowers and the like.

실시예 5 : 애기장대 잎 조직에 상처(wounding) 처리 후 시간대별 At5g55750 유전자의 발현 양상Example 5 Expression Pattern of At5g55750 Gene by Time Zone after Wounding Treatment of Arabidopsis leaf tissues

상처(wounding) 스트레스 유도성 At5g55750 유전자 프로모터의 발현이 상처(wounding) 스트레스 조직에서의 시간대별 발현양상을 알아보기 위해 real-time PCR을 실시하였다. 4주된 애기장대의 잎에 압정으로 30번씩 상처을 낸 후 TRI REAGENT^®(TRI REAGENT^®- RNA/DNA/PROTEIN ISOLATION REAGENT, MOLECULAR RESEARCH CENTER, INC.)을 이용하여 0, 1, 3, 6, 9 시간대별로 RNA를 추출하였다. Real-time PCR은 Light cycler^®480 SYBR Green I Master Kit (Roche, Germany)에서 제공하는 방법에 따라 3반복 처리하였으며, Light Cycler^®480II (Roche, Germany)을 이용하여 PCR 반응을 수행하였다. 유전자를 인식하는 real-time PCR용 프라이머 1, 2는 표 1의 서열번호4, 5 와 같으며, 대조 유전자로는 PDF1.2를 이용하여 비교 분석하였다. 그 결과를 도 4c에 나타내었다. Real-time PCR was performed to examine the temporal expression pattern of the wounding stress-inducible At5g55750 gene promoter in wounding stress tissue. 3, 6, and 9 hours using TRI REAGENT ^® (TRI REAGENT ^® - RNA / DNA / PROTEIN ISOLATION REAGENT, MOLECULAR RESEARCH CENTER, INC.) After scarring 30 times with a pushpin on the leaves of 4 weeks old Arabidopsis thaliana RNA was extracted. Real-time PCR was performed by repeating 3 times by the method provided by Light cycler ^® 480 SYBR Green I Master Kit (Roche, Germany) and PCR was performed using Light Cycler ^® 480II (Roche, Germany). Primers 1 and 2 for real-time PCR, which recognize genes, are shown in SEQ ID NOS: 4 and 5 in Table 1, and comparative analysis was performed using PDF1.2 as a control gene. The results are shown in Fig. 4C.

도 4c에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 상처 스트레스 유도성 프로모터는 상처 처리 3시간 후부터 활성이 증가하기 시작하여 6시간 후에는 매우 강하게 활성이 증가하였으며, 이 후 9시간 후에는 활성이 상처 처리 전의 수준으로 감소하였다 (도4c). 따라서, 상처 처리 후 3시간부터 9시간 까지 프로모터의 발현 유도가 가장 강한 것으로 확인 하였다.As shown in FIG. 4C, the wound stress inducible promoter of the present invention started to increase in activity from 3 hours after wounding, and increased strongly after 6 hours. After 9 hours, the activity of wound stress inducible promoter (Fig. 4C). Therefore, it was confirmed that the induction of the expression of the promoter from 3 hours to 9 hours after the wound treatment was the strongest.

<110> Korea University Research and Business Foundation <120> WOUNDING STRESS-INDUCIBLE EXPRESSION PROMOTER <130> KU1-2P <160> 5 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1200 <212> DNA <213> artificial sequence <400> 1 aaaaaagcag agacttggac agtgacttct atttatgaag tatcaatata ttttaattct 60 ttttattatg attttattat tatatgcaat ctggaatatt ttttttgaca tttctcagaa 120 tatcagagat tttagatttt aaaagtgttg ctaaattttt atataacatt tctttattat 180 gtttccctga taaacctaaa gtttgtgata tttaaatgaa aatccaaatt agggtattaa 240 ttggattcat ataaaactta ttttatggca tgttattata tttctcaaat ttgtttagtt 300 tggctaaaca aaaatttgat ataagaaaaa cattaattac attaacctaa aatatcatag 360 ctaaattaag tgggtgatat cattgcaact tttaatacat ttcaccaatt tttatctata 420 tatcatttat ttatttttac tttttttatg taatcatgaa attatgaata tgtgatccat 480 aatctcttta gtcccagaat tagactgata atatttgtgt caagctcacg gttgtagatc 540 atcttataac aaaacttgaa ctcggtttcg gtatccttga atcattgtaa acaacattca 600 tctaattggt taaaccaata caatgagtta ttaaataagt aaatttatcg tcttgttatt 660 atttaaaata tataggtaaa tgtcaacaca ttgaatattg aaaccatttg ataaagtggg 720 ttgtaatttg taaaatacta aaccatatga cagggtttac tatggattta aattgattct 780 atgtgacgtt ctggtgcatg ctcaaccatg agcttatatt agattaaaat cttgttctat 840 cgaaccggtt tgaaactcat cactcaaagc cattttgaat tcagtttggt gaataaactt 900 ataacatatc taagtttcat aaataagtat tgttatatat catcaattta tttatcaaga 960 ttaacatacc tcacacagtt ttttaataaa aaacatgcag catgcagact taaatatggg 1020 ttatgttagt cctcattcca ctctcgacaa gaccacaacc cacaccatca gaattaatat 1080 ttcctcggat acaatactgt ccgaaagtgt agtcacacct caacactagc ttgtgcatca 1140 tttgaaaagt agttgaatcc tacaacagac tagtcaaaac aaactcaccc agcaccatga 1200 1200 <210> 2 <211> 32 <212> DNA <213> artificial sequence <400> 2 ggcgaagctt aaaaaagcag agacttggac ag 32 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> artificial sequence <400> 3 atttggatcc tcatggtgct gggtgagt 28 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> artificial sequence <400> 4 gtaaaccccg tcttcaacg 19 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> artificial sequence <400> 5 cgccaatagt accgtaagga taa 23 <110> Korea University Research and Business Foundation <120> WOUNDING STRESS-INDUCIBLE EXPRESSION PROMOTER <130> KU1-2P <160> 5 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 1200 <212> DNA Artificial sequence <400> 1 aaaaaagcag agacttggac agtgacttct atttatgaag tatcaatata ttttaattct 60 ttttattatg attttattat tatatgcaat ctggaatatt ttttttgaca tttctcagaa 120 tatcagagat tttagatttt aaaagtgttg ctaaattttt atataacatt tctttattat 180 gtttccctga taaacctaaa gtttgtgata tttaaatgaa aatccaaatt agggtattaa 240 ttggattcat ataaaactta ttttatggca tgttattata tttctcaaat ttgtttagtt 300 tggctaaaca aaaatttgat ataagaaaaa cattaattac attaacctaa aatatcatag 360 ctaaattaag tgggtgatat cattgcaact tttaatacat ttcaccaatt tttatctata 420 tatcatttat ttatttttac tttttttatg taatcatgaa attatgaata tgtgatccat 480 aatctcttta gtcccagaat tagactgata atatttgtgt caagctcacg gttgtagatc 540 atcttataac aaaacttgaa ctcggtttcg gtatccttga atcattgtaa acaacattca 600 tctaattggt taaaccaata caatgagtta ttaaataagt aaatttatcg tcttgttatt 660 atttaaaata tataggtaaa tgtcaacaca ttgaatattg aaaccatttg ataaagtggg 720 ttgtaatttg taaaatacta aaccatatga cagggtttac tatggattta aattgattct 780 atgtgacgtt ctggtgcatg ctcaaccatg agcttatatt agattaaaat cttgttctat 840 cgaaccggtt tgaaactcat cactcaaagc cattttgaat tcagtttggt gaataaactt 900 ataacatatc taagtttcat aaataagtat tgttatatat catcaattta tttatcaaga 960 ttaacatacc tcacacagtt ttttaataaa aaacatgcag catgcagact taaatatggg 1020 ttatgttagt cctcattcca ctctcgacaa gaccacaacc cacaccatca gaattaatat 1080 ttcctcggat acaatactgt ccgaaagtgt agtcacacct caacactagc ttgtgcatca 1140 tttgaaaagt agttgaatcc tacaacagac tagtcaaaac aaactcaccc agcaccatga 1200 1200 <210> 2 <211> 32 <212> DNA Artificial sequence <400> 2 ggcgaagctt aaaaaagcag agacttggac ag 32 <210> 3 <211> 28 <212> DNA Artificial sequence <400> 3 atttggatcc tcatggtgct gggtgagt 28 <210> 4 <211> 19 <212> DNA Artificial sequence <400> 4 gtaaaccccg tcttcaacg 19 <210> 5 <211> 23 <212> DNA Artificial sequence <400> 5 cgccaatagt accgtaagga taa 23

Claims

서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 프로모터를 포함하는 상처 스트레스 유도에 의한 유전자 발현 유도용 조성물.1. A composition for inducing gene expression by inducing wound stress comprising a promoter consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1.

제1항에 있어서, 상기 프로모터는 발현 벡터에 포함되는 것을 특징으로 하는, 상처 스트레스 유도에 의한 유전자 발현 유도용 조성물.The composition for inducing gene expression according to claim 1, wherein the promoter is contained in an expression vector.

제2항에 있어서, 상기 발현 벡터는 상기 프로모터에 작동 가능하게 연결된 유전자를 더 포함하는, 상처 스트레스 유도에 의한 유전자 발현 유도용 조성물.3. The composition according to claim 2, wherein the expression vector further comprises a gene operably linked to the promoter.

(a) 제1항의 프로모터에 유전자를 작동 가능하게 연결하는 단계;
(b) 상기 프로모터를 포함하는 발현 벡터를 식물체에 형질전환시키는 단계; 및
(c) 상기 형질전환 식물체에서 상처 스트레스 유도에 의한 상기 유전자의 발현을 확인하는 단계;를 포함하는, 식물체에서 유전자를 상처 스트레스 유도에 의해 발현시키는 방법.(a) operably linking a gene to the promoter of claim 1;
(b) transforming an expression vector comprising the promoter into a plant; And
(c) confirming the expression of the gene by inducing wound stress in the transgenic plant, and expressing the gene by inducing wound stress in the plant.

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서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함하는 DNA 단편을 증폭하기 위한 서열번호 2로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 3으로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 상처 스트레스 유도성 발현 프로모터 증폭용 조성물.A reverse primer consisting of a forward primer consisting of SEQ ID NO: 2 and a reverse primer consisting of SEQ ID NO: 3 for amplifying a DNA fragment comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1; and a primer for amplifying a wound stress inducible expression promoter.