KR101429112B1 - 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스에 대한 항바이러스 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스에 대한 항바이러스 조성물에 관한 것으로, 커큐민(Curcumin)을 유효성분으로 포함하는 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(Viral Hemorrhagic Septisemia Virus; VHSV)에 대한 항바이러스 조성물이다. 본 발명에 따르면, 본 발명의 항바이러스 조성물은 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스에 대하여 약 5배의 세포생존율을 제공할 수 있으며, 어류의 감염기작 및 방어기작을 이해함으로써 향후 인수공통병원체로서의 가능성에 대한 문제점을 해결할 수 있는 기초연구를 제공한다.
Description
본 발명은 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스에 대한 항바이러스 조성물에 대한 것이다.
넙치는 우리나라의 주요 약식어종으로서 양식넙치 생산량은 2008년 기준 약 4만 7,000톤이며 생산금액은 4,083억원으로 전체 양식생산 금액의 26.8%를 차지하는 중요한 양식품목이다. 그러나 양식기간 중에 발생하는 바이러스, 세균 또는 기생충 등에 의한 각종 감염성 질병이 발생하여 입식량의 약 40%가 폐사하여 심각한 경제적 손실을 초래하고 있으며, 특히, 바이러스성 출혈성 패혈증(Viral hemorrhagic septisemia; VHS)과 같은 바이러스성 질병은 치어 뿐만 아니라 상품가치가 높은 성어에 있어서 대량폐사를 유발하며, 해양오염 및 양식수산물의 질병으로 인한 양식어가의 경제적 손실이 약 3000억원에 이른다고 보고된다.
어류병원 바이러스가 육상동물(인간 포함)에 영향을 일으킬 가능성이 제시되고 있으며, 국제동물보건기구(OIE) 및 유럽연합(EU)의 농림수산정책국을 중심으로 어류병원바이러스의 인수공통병원체로서의 가능성에 대한 검토 필요성이 제기되어지고 있다. 따라서, 양식어류의 바이러스 감염성 질병에 관한 문제는 단순히 안전한 수산식품을 생산을 위해 필요할 뿐만 아니라 어류에 대한 감염기작과 방어기작을 이해함으로써 향후 인수공통병원체로서의 가능성에 대한 문제점을 해결할 수 있는 기초연구에 대한 필요성이 증가되는 추세이다.
숙주어류세포내 당대사 및 에너지대사와 연관하여 바이러스가 어떻게 복제시점을 인지하고 세포사멸을 유도하는지에 대한 연구와 바이러스 복제를 증가시키는 인자를 제어함으로서 항바이러스 효과를 증진하고자 하는 연구 등이 진행되고 있는 추세이다.
울금(Curcuma longa L., tumeric)은 생강과(Zingiberaceae)에 속하는 다년생 식물이며, 그 동안 카레, 차류 및 식품첨가물 등 식용으로 널리 사용되어 왔고 울금의 주성분인 커큐민(Curcumin)은 강한 항산화작용, 항암, 항염증, 항바이러스, 혈중지질강하 작용과 소염 작용 및 콜레스테롤의 억제작용 등이 보고되어 있다. 그러나 어류질병 유발 바이러스 중 VHSV에 대한 커큐민의 항바이러스성 효과 및 연구에 대한 보고는 전무하다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 양식어류의 바이러스 감염성 질병에 대해 감염기작과 방어기작을 조사하여 항 바이러스 조성물을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 울금(Curcuma longa L., tumeric)의 주성분인 커큐민(Curcumin)의 항바이러스 효과를 규명함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 항바이러스 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 어류 감염성 바이러스에 의한 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 어류 사료 첨가용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 커큐민(Curcumin)을 유효성분으로 포함하는 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(Viral Hemorrhagic Septisemia Virus; VHSV)에 대한 항바이러스 조성물을 제공한다.
본 발명자들은 양식어류의 바이러스 감염성 질병인 바이러스성 출혈성 패혈증에 대해 감염기작과 방어기작을 조사하여 항바이러스 조성물을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 울금(Curcuma longa L., tumeric)의 주성분인 커큐민(Curcumin)의 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스에 대한 항바이러스 효과를 규명하였다.
본 발명에서 유효성분으로 이용되는 커큐민은 하기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물이다:
화학식 1
본 발명의 유효성분 커큐민은 단리된(isolated) 또는 합성된(synthesized)뿐만 아니라, 커큐민을 포함하는 천연 추출물, 바람직하게는 울금 추출물 또는 울금 분획물을 포함한다.
본 발명의 조성물이 적용될 수 있는 양식어류에는 넙치(Paralichthys olivaceus), 방어(Seriola quinqueradiata), 참돔(Pagrus major), 자주복(Takifugu rubripes), 부시리(Seriola aureovittata), 송어(예컨대, Oncorhyncus nykiss), 잿방어(Seriola dumerili), 전갱이 (Pseudocaranx dentex), 능성어(Epinephelus septemfasciatus), 참다랑어(Thunnus thynnus), 잉어(예컨대, Cyprinus carpio), 제브라피쉬(Danino rerio), 메기(예컨대, Clarias gariepinus), 틸라피아(Oreochronis niloticus), 연어(Salmo Salar) 및 송사리(Oryzias latipes)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나의 어류이고 이에 한정되지 않는다. 가장 바람직하게는 넙치이다.
본 명세서에서 용어 ‘유효성분으로 포함하는’이란 커큐민의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 포함하는 것을 의미한다. 본 발명은 울금(curcuma longa L.)의 주성분인 커큐민(curcumin)을 포함하는 조성물로서 과량 투여하여도 동물에 부작용이 없으므로 본 발명의 조성물에 포함된 양적 상한은 당업자가 적절한 범위 내에서 선택하여 실시할 수 있다.
바람직하게는, 상기 커큐민은 PGC-1α(Peroxisome proliferator-activated receptor Gamma Coactivator-1α)의 발현을 억제한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 VHSV 전사 증식 인자인 PGC-1α의 단백질 발현을 억제 및 바이러스와 결합하여 숙주세포에 부착력을 감소시켜 감염력 저하를 유도하여 세포 생존율을 증가시킨다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 커큐민(Curcumin)을 유효성분으로 포함하는 바이러스성 출혈성 패혈증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 상기 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있으며, 바람직하게는 경구 투여이다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 동물의 수령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.001-10000 ㎎/㎏이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 커큐민(Curcumin)을 유효성분으로 포함하는 어류 감염성 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(Viral Hemorrhagic Septisemia Virus; VHSV)에 의한 질환의 예방 또는 개선용 어류 사료 첨가용 조성물을 제공한다.
본 발명의 어류 사료 첨가용 조성물은 통상적으로 이용되는 어떠한 조성물도 포함한다. 예를 들어, 상기 어류 사료 첨가용 조성물은 해양 단백질(예컨대, 어분 또는 크릴밀), 식물성 단백질(예컨대, 콩분말, 밀 글루텐, 옥수수 글루텐, 루핀 분말, 완두콩 분말 또는 해바라기씨 분말), 혈분 및 골분을 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질원, 어류 기름(예컨대, 오징어간유) 또는 식물성 기름(예컨대, 평지씨 기름, 콩기름, 대두유)를 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 에너지원, 비타민혼합물 및 무기질혼합물을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스에 대한 항바이러스 조성물을 제공한다.
(b) 본 발명의 항바이러스 조성물은 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스에 대하여 약 5배의 세포생존율을 제공할 수 있다.
(c) 본 발명은 어류의 감염기작 및 방어기작을 이해함으로써 향후 인수공통병원체로서의 가능성에 대한 문제점을 해결할 수 있는 기초연구를 제공한다.
도 1은 PGC-1α 억제를 통한 바이러스 감염된 세포의 생존율에 미치는 커큐민의 활성을 나타낸 그래프이다.
도 2은 커큐민에 의한 PGC-1α 발현 억제를 웨스턴블럿을 통해 확인한 결과이다.
도 3은 커큐민 처리에 의한 바이러스 감염된 세포의 생존율의 증가 효과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 커큐민 처리에 의한 바이러스 증식 억제 효과를 나타내는 그래프이다.
도 5는 커큐민으로 VHSV의 중화처리 후 바이러스 감염 시 세포 생존율 증가 효과를 나타내는 그래프이다.
도 2은 커큐민에 의한 PGC-1α 발현 억제를 웨스턴블럿을 통해 확인한 결과이다.
도 3은 커큐민 처리에 의한 바이러스 감염된 세포의 생존율의 증가 효과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 커큐민 처리에 의한 바이러스 증식 억제 효과를 나타내는 그래프이다.
도 5는 커큐민으로 VHSV의 중화처리 후 바이러스 감염 시 세포 생존율 증가 효과를 나타내는 그래프이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1: VHSV의 전사 증식억제를 위한 세포내 타겟 물질로서의 PGC-1α 단백질의 역할 규명
본 발명은 어류 세포주인 팻헤드 미노우(Fathead Minnow; FHM) 세포(전남대학교 수산생명의학과 어병진단학 실험실에서 제작한 주화세포 제공)에 퍼옥시좀 증식-활성 수용체(Peroxisome Proliferator-activated receptor; PPAR) γ 공활성화인자-1α(PGC-1α)를 과발현 하였다. FHM 세포에서 PGC-1α의 과발현은 세포에 DNA를 직접 도입하여 세포의 유전형질을 변이 시키는 형질주입(Transfection)기법을 이용하였다. 트랜스펙선 시약인 FuGENE 6(Roche, Cat. No. 1814 433) 매뉴얼을 참조하여 시약과 재조합 PGC-1αDNA 플라스미드를 2:1 비율로 FHM 세포에 형질주입을 하여 48시간 동안 과발현 하였다. PGC-1α 과발현 FHM 세포에 VHSV(Viral Hemorrhagic Septicemia Virus)를 접종하여 살아있는 세포내 존재하는 미토콘드리아의 탈수소 효소작용에 의해 생성된 포르마잔(formazan) 결정을 분광학적인 방법을 통하여 세포생존율을 확인한 결과 PGC-1α를 과발현 하지 않은 음성 대조군에 비하여 낮은 세포 생존율을 확인 하였다. 이 결과는 VHSV에 의한 세포 감염 후 세포사멸과정이 PGC-1α 의존적 경로를 통하여 유도된 첫 증거 자료이며, VHSV의 효과적인 전사 증식억제를 위한 세포내 타겟이 PGC-1α 단백질임을 규명하였다(도 1).
실시예 2: 커큐민의 VHSV 전사 증식 인자인 PGC-1α의 단백질 발현 억제제로서의 효과
PGC-1α 의존적 VHSV 전사 증식을 억제할 후보물질로서 커큐민(Sigma, 미국)의 항바이러스 효과를 알아보고자, 바이러스 증식인자(PGC-1α)를 과발현한 세포에 커큐민을 처리하고 VHSV를 접종 한 후, 세포생존율의 변화를 측정하였다. 동일한 세포에 커큐민을 처리하지 않은 대조구에 비하여 커큐민 처리 시, VHSV 전사 증식 인자인 PGC-1α의 발현 억제 효과를 웨스턴블럿을 통하여 확인하였으며, 세포생존율 또한 8.7배 증가하는 것을 확인하였다(도 1 및 도 2). 이러한 결과로 PGC-1α가 VHSV 전사 증식 인자임을 재확인하였고 커큐민을 통한 VHSV 전사 증식 인자인 PGC-1α의 발현을 억제할 수 있는 강력한 화합물임을 입증하였다.
실시예
3:
커큐민
처리에 의한 바이러스 감염 시 세포 생존율 증가 효과
커큐민의 농도의존적 항바이러스 활성을 조사하고자, 어류 주화세포인 FHM 세포(전남대학교 수산생명의학과 어병진단학 실험실에서 제작한 주화세포 제공)에 커큐민을 0, 5, 10 및 50 μM을 각각 처리 한 후 바이러스를 접종하여 세포생존율을 확인하였다. 그 결과, 양성대조군(커큐민 미처리군)에 비하여 커큐민 처리 실험군에서는 농도 의존적으로 VHSV 감염에 대한 4.3배의 세포생존율이 증가됨을 확인하였다(도 3).
실시예
4:
커큐민
처리에 의한 바이러스 전사 억제 효과
커큐민의 항바이러스 활성기작이 직접적인 바이러스 전사 억제기능이 있는지를 알아보고자, 어류 주화세포인 FHM 세포에 커큐민을 처리하지 않은 양성대조군 대비, 50 μM을 처리한 실험군에서 VHSV를 접종하여 VHSV 전사정도를 실시간 PCR을 통하여 분석하였다. 실시간 PCR에 사용된 프라이머는 QVHSV_3192F (5'-ACA AAC AAG GGC TTG GTC TC-3') 및 QVHSV_3261R(5'-CTG AGA CGC TGG TGA CTG AT-3')를 사용하여 정량분석 하였다.
그 결과, 커큐민을 처리한 실험구가 양성대조군에 비하여 12.6배 복제 개수(copy number)의 감소 효과를 확인하였다(도 4). 이 결과는 커큐민이 VHSV 전사를 억제하여 양성대조군에 비해 높은 세포생존율을 보이는 효과를 확인 할 수 있었으며, VHSV에 대한 강력한 항바이러스제 임을 입증하는 결과이다.
실시예
5:
커큐민과
중화처리에 의한 바이러스 감염 시 세포 생존율 증가 효과
커큐민이 바이러스를 중화하여 숙주세포에 부착력을 감소시킴으로서 감염력 저하로 인한 세포생존율을 증가시키는지를 알아보고자, 먼저 160 μM 수준까지 커큐민을 처리 후 세포독성실험을 한 결과, 세포독성이 현저히 낮음을 확인하였다(도5). 또한 커큐민을 0, 10, 20, 40, 80 및 160 μM의 농도의존적 조건으로 VHSV와 중화처리한 후 세포생존율이 증가하는지를 조사하고자, 바이러스와 커큐민을 각각 농도별로 2시간 동안 혼합반응 시킨 후 커큐민과 중화된 바이러스를 어류 주화세포인 FHM 세포(전남대학교 수산생명의학과 어병진단학 실험실에서 제작한 주화세포 제공)에 접종하여 감염 후 세포생존율을 확인하였다. 그 결과, 양성대조군(커큐민 미처리군)에 비하여 커큐민 처리 실험군에서는 농도 의존적으로 VHSV 감염에 대한 최대 11배의 세포생존율이 증가함을 확인하였다(도 5).
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Claims (8)
- 커큐민(Curcumin)을 유효성분으로 포함하는 어류 감염성 바이러스인 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(Viral Hemorrhagic Septisemia Virus; VHSV)에 대한 항바이러스 조성물.
- 삭제
- 제 1 항에 있어서, 상기 어류는 넙치, 방어, 참돔, 자주복, 부시리, 송어, 잿방어, 전갱이, 능성어, 참다랑어, 잉어, 지브라피쉬, 메기, 틸라피아, 연어 및 송사리로 구성된 군으로부터 선택되는 하나의 어류인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 3 항에 있어서, 상기 어류는 넙치(Paralichthys olivaceus)인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 PGC-1α(Peroxisome proliferator-activated receptor Gamma Coactivator-1α)의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 커큐민은 울금 추출물에 포함된 것을 특징으로 하는 조성물.
- 삭제
- 삭제
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