KR100576344B1 - A nucleic acid encoding glutamyl kinase variant released from feedback inhibition by proline a vector and a host cell containing the same and a method of producing L-threonine using the host cell - Google Patents
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Abstract
본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 그를 포함하는 벡터 및 숙주세포 및 상기 숙주세포를 배양하는 단계를 포함하는 L-트레오닌을 생산하는 방법을 제공한다.The present invention provides a polynucleotide encoding a polypeptide having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, a vector comprising the same and a host cell, and a method for producing L-threonine comprising culturing the host cell.
트레오닌, 프롤린, 글루타밀 키나제 변이체Threonine, Proline, Glutamil Kinase Variants
Description
본 발명은 프롤린에 의한 길항조절이 해제된 글루타밀 키나제 변이체를 코딩하는 핵산, 그를 포함하는 벡터 및 숙주세포 및 상기 숙주세포를 이용한 L-트레오닌의 생산방법에 관한 것이다. The present invention relates to a nucleic acid encoding glutamyl kinase variants deregulated by proline, vectors and host cells comprising the same, and a method for producing L-threonine using the host cells.
L-트레오닌은 필수 아미노산의 일종으로 사료 및 식품 첨가제로서 널리 사용되며 의약용으로 수액제 및 의약품의 합성 원료로도 사용되고 있다. L-threonine is an essential amino acid, widely used as a feed and food additive, and also used as a synthetic raw material for infusion and medicine for medicine.
L-트레오닌은 발효법으로 제조하는데, 사용되는 균주로는 예를 들면, 대장균, 코리네박테리움, 세라티아 속 또는 프로비덴시아 속 균주의 야생주로부터 유도된 인공변이주가 사용되고 있다. 이러한 변이 균주들로는 예를 들면, 아미노산 유사체 및 약제 변이 내성주, 이들 내성주에 디아미노피메릭산, 메티오닌, 라이신 또는 이소루이신 영양요구성을 부여한 인공변이주가 공지되어 있다 (일본국 공개 특 허출원 평제2-219582호; Appl. Microbiol. Biotechnol., 29. 550-553(1988); 한국특허공고 제92-8365호 참조). L-threonine is produced by the fermentation method, for example, artificial strains derived from wild strains of the genus E. coli, Corynebacterium, Serratia or Providencia genus are used. Such mutant strains are known, for example, amino acid analogs and drug mutation resistant strains, and artificial strains which have been assigned to these resistant strains diaminopimeric acid, methionine, lysine or isoleucine nutritional components (JP-A-JP). 2-219582; Appl. Microbiol. Biotechnol. , 29. 550-553 (1988); see Korean Patent Publication No. 92-8365).
유전자 재조합 균주를 이용한 발효법으로는, 예를 들면 세라티아 속 L-트레오닌 생산균으로부터 유래한 아스파토키나제, 호모세린 키나제, 호모세린 디히드로게나제 및 트레오닌 신타제를 코팅하는 DNA 절편를 포함하는, 재조합 균주를 이용하여 다량의 트레오닌을 생산하는 방법 (일본특허공보 평제5-10076호) 및 프로비덴시아 속에 속하고 메티오닌 대사 길항물질에 내성을 가지는 균주로부터 유래한 유전자를 재조합하여 생산성을 증가시킨 방법 (일본특허공보 평1-289493호)이 있다. Fermentation methods using genetically modified strains include, for example, recombinant DNA fragments coating aspartokinase, homoserine kinase, homoserine dehydrogenase and threonine synthase derived from L-threonine producing bacteria of the genus Serratia. A method of producing a large amount of threonine using a strain (Japanese Patent Publication No. 5-10076) and a method of increasing productivity by recombining a gene derived from a strain belonging to Providencia and resistant to methionine metabolic antagonists ( Japanese Patent Application Laid-open No. Hei 1-289493).
대장균에 있어서, 삼투압에 대한 내성은 일차적으로 K+ 양이온에 의해 조절되며, 이차적으로 프롤린에 위해 조절되며, 다음으로 글루탐산, 트레할로오스 및 베타인 등에 위해 최종적으로 조절되는 것으로 알려져 있다. 즉, 배지 내에 삼투압이 증가할 경우 세포 내에 칼륨 이온 (K+)이 축적되기 시작하며, 그 뒤를 이어서 세포 내 프롤린 농도가 증가하기 시작한다. 프롤린 생합성 관련 유전자들은 proBA 및 proC 유전자로 구성된다. proA, proB 및 proC 유전자는 각각 글루타메이트-세미알데히드 디히드로게나제, 글루타밀 키나제 및 피롤린-5-카르복실레이트 리덕타제를 코딩한다. In E. coli, the resistance to osmotic pressure is known to be primarily regulated by K + cations, secondly to proline, and finally to glutamic acid, trehalose and betaine. That is, as the osmotic pressure in the medium increases, potassium ions (K +) begin to accumulate in the cell, followed by an increase in intracellular proline concentration. Proline biosynthesis related genes consist of the proBA and proC genes. gene proA, proB and proC are each glutamate-codes the semi-aldehyde dehydrogenase claim, glutamyl kinase and pyrroline-5-carboxylate reductase.
프롤린은 글루탐산으로부터 생합성된다. 먼저, 글루타밀 키나제 (ProB)에 의하여 글루타메이트가 감마-글루타밀 포스페이트로 전환되고, 감마-글루타밀 포스페이트는 글루타메이트-세미알데히드 디히드로게나제 (ProA)에 의하여 L-글루타메이트-감마-세미알데히드로 전환되고, L-글루타메이트-감마-세미알데히드는 자발적으 로 피롤린-5-카르복실레이트로 전환되고, 상기 피롤린-5-카르복실레이트는 피롤린-5-카르복실레이트 리덕타제 (ProC)에 의하여 피롤린으로 전환된다. Proline is biosynthesized from glutamic acid. First, glutamate is converted to gamma-glutamyl phosphate by glutamyl kinase (ProB), and gamma-glutamyl phosphate is converted to L-glutamate-gamma-semialdehyde by glutamate-semialdehyde dehydrogenase (ProA). L-glutamate-gamma-semialdehyde spontaneously converts to pyrroline-5-carboxylate and the pyrroline-5-carboxylate is converted to pyrroline-5-carboxylate reductase (ProC) To pyrroline.
상기와 같은 프롤린 생합성 과정에서 있어서, 프롤린 생합성은 첫 번째 단계에 관여하는 글루타밀 키나제, ProB 효소의 활성이 세포 내 프롤린 농도에 의해 길항작용에 의해 조절된다고 보고된 바 있다. 즉, 세포 내 프롤린 농도가 증가하면 프롤린이 ProB 효소의 조절부위에 결합하여 본 효소의 활성을 저해시킨다. 한편, 상기의 proB 유전자의 길항작용에 관여하는 조절 부위에 돌연변이가 일어날 경우에는 프롤린에 의한 길항억제가 해제된다는 보고도 있다 (J. Bacteriology, (1985) 1088-1093, Gene (1985), 109-112). 그러나, 상기 ProB 변이체를 코딩하는 DNA를 이용하여 L-쓰레오닌을 고농도로 생산하는 데에 이용한 예는 보고된 바 없다. In such a proline biosynthesis process, the proline biosynthesis has been reported that the activity of glutamyl kinase, ProB enzyme involved in the first step is regulated by antagonism by intracellular proline concentration. In other words, when the concentration of proline in the cell increases, proline binds to the regulatory region of ProB enzyme and inhibits the activity of the enzyme. On the other hand, when mutation occurs in the regulatory site involved in the antagonism of the proB gene, antagonism inhibition by proline has been reported ( J. Bacteriology , (1985) 1088-1093, Gene (1985), 109-). 112). However, no examples have been reported of high concentrations of L-threonine using the DNA encoding the ProB variant.
따라서, 종래 기술에 의하더라도 높은 삼투압 조건에서도 생육할 수 있고, L-트레오닌을 생산하는데 이용될 수 있는 ProB 변이체를 코딩하는 DNA 및 그를 포함하는 숙주세포에 대한 요구는 여전히 남아 있다. Thus, there is still a need for DNA encoding ProB variants and host cells comprising them, which can be grown even under high osmotic conditions and can be used to produce L-threonine, according to the prior art.
이에 본 발명자들은 프롤린에 의한 길항억제 조절이 해제되어 높은 삼투압 조건에서도 생장 및 발효가 가능한 L-트레오닌 생산용 균주를 선별하기 위하여 연구를 수행한 결과, 길항작용 관련 부위가 변화된 글루타밀 키나제 변이체를 코딩하는 proB 유전자를 발견하고, 본 발명을 완성하게 되었다.Therefore, the present inventors conducted a study to select L-threonine production strains that can be grown and fermented under high osmotic conditions due to the release of proline antagonism suppression control, coding for glutamyl kinase variants with altered antagonism-related sites The proB gene was discovered and the present invention was completed.
본 발명의 목적은 프롤린에 의한 길항조절 기작이 해제된 글루타밀 키나제 변이체를 코딩하는 핵산을 제공하는 것이다. It is an object of the present invention to provide a nucleic acid encoding a glutamyl kinase variant in which antagonism regulation by proline has been released.
본 발명의 또다른 목적은 상기 핵산을 포함하는 벡터를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a vector comprising the nucleic acid.
본 발명의 또다른 목적은 프롤린에 의한 길항조절 기작이 해제된 글루타밀 키나제 변이체를 코딩하는 핵산을 포함하는 숙주세포를 제공하는 것이다.It is another object of the present invention to provide a host cell comprising a nucleic acid encoding a glutamyl kinase variant in which antagonism regulation by proline has been released.
본 발명의 또다른 목적은 프롤린에 의한 길항조절 기작이 해제된 글루타밀 키나제 변이체를 코딩하는 핵산을 포함하는 숙주세포를 이용하여 L-트레오닌을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.It is another object of the present invention to provide a method for producing L-threonine using a host cell comprising a nucleic acid encoding a glutamyl kinase variant in which antagonism regulation by proline has been released.
본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.The present invention provides a polynucleotide encoding a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드는 대장균의 프롤린 오페론 proBA으로부터 발현되고 글루타밀 키나제 활성을 갖는 ProB 단백질의 변이체이다. 즉, 본 발명의 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드는 ProB 단백질의 309 번 아르기닌 (R)이 히스티딘 (H)으로 치환된 ProB 단백질 변이체이다. 상기 ProB 단백질 변이체는 고농도의 프롤린에 의하여도 그 활성이 저해되지 않는다. 따라서, 본 발명의 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 발현하는 미생물은 높은 삼투압 조건에서도 생육할 수 있다. The polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is a variant of ProB protein expressed from E. coli proline operon proBA and having glutamyl kinase activity. That is, the polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 of the present invention is a ProB protein variant in which arginine (R) 309 of ProB protein is substituted with histidine (H). The ProB protein variant is not inhibited by high concentrations of proline. Therefore, the microorganism expressing the polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 of the present invention can grow even under high osmotic conditions.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 것이면 어느 것이나 포함된다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 서열번호 2의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드는 대장균의 proBA 오페론의 염기서열 (GeneBank accession number X00786) 중 926 번 구아닌이 아데닌으로 치환된 proBA 오페론의 변이체이다. 상기 proBA 오페론의 변이체는 309 번 아르기닌이 히스티딘으로 치환된 ProB 단백질을 코딩한다.The polynucleotide of the present invention includes any of those encoding the polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. For example, the polynucleotide may be a polynucleotide having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2. The polynucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 is a variant of the proBA operon in which guanine No. 926 is replaced with adenine in the E. coli proBA operon sequence (GeneBank accession number X00786). The variant of the proBA operon encodes a ProB protein in which arginine 309 is substituted with histidine.
본 발명은 또한, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. The invention also provides a recombinant vector comprising the polynucleotide of the invention.
본 발명의 재조합 벡터는 통상의 방법 즉, 적절한 벡터에 제한효소 예를 들면, BamHI을 사용하여 상기 대장균의 프롤린 오페론 변이체를 라이게이션시킴으로써 제조할 수 있다. 본 발명의 재조합 벡터 제조시 사용가능한 벡터로는 박테리아, 바람직하기로는 에세리키아 (Escherichia) 속의 박테리아에서 자율적으로 증식할 수 있는 벡터로부터 유래한 것일 수 있다. 예를 들면, 파지벡터 또는 플라스미드 벡터로부터 유래한 것일 수 있다. 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서는, 예를 들면 pWE15, M13, λEMBL3, λEMBL4, λFIXII, λDASHII, λZAPII, λgt10, λgt11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 들 수 있고, 플라스미드 벡터로서는, 예를 들면 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계 및 pET계 등을 들 수 있다. 본 발명의 특정한 구체예에서는 카피 수가 작은 pCL1920 플라미스미드 벡터를 사용하였다.The recombinant vector of the present invention can be prepared by conventional methods, ie, by ligating the proline operon variant of the E. coli using a restriction enzyme such as BamHI in a suitable vector. The vector usable in the production of the recombinant vector of the present invention may be derived from a vector capable of autonomous propagation in bacteria, preferably bacteria of the genus Escherichia . For example, it may be derived from a phage vector or plasmid vector. As a phage vector or a cosmid vector, pWE15, M13, (lambda) EMBL3, (lambda) EMBL4, (lambda) FIXII, (lambda) DASHII, (lambda) ZAPII, (lambda) gt10, (lambda) gt11, Charon4A, and Charon21A, etc. are mentioned, for example, pBR system, pUC, And pBluescriptII, pGEM, pTZ and pET systems. In certain embodiments of the invention, pCL1920 plasmid vectors with small copy numbers are used.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 상기 숙주세포에는 상기 폴리뉴클레오티드 자체 또는 그를 포함하는 DNA 구조체를 숙주세포에 도입하여 얻어지는 것 뿐만 아니라, 야생형 숙주세포를 돌연변이 처리하여 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 갖는 숙주세포도 포함된 다. 상기 숙주세포는 예를 들면, 본 발명의 상기 재조합 벡터로 숙주 세포를 형질전환시킴으로서 얻어질 수 있다. 본 발명의 형질전환 세포는 상기 재조합 벡터를 사용하여 숙주세포를 통상의 방법으로 형질전환시켜 제조할 수 있다. The present invention also provides a host cell comprising a polynucleotide encoding a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. The host cell has a host cell having a polynucleotide encoding the polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 as well as obtained by introducing the polynucleotide itself or a DNA construct comprising the same into the host cell, and by mutating the wild type host cell. Also included. The host cell can be obtained, for example, by transforming the host cell with the recombinant vector of the present invention. The transformed cell of the present invention can be prepared by transforming a host cell by a conventional method using the recombinant vector.
본 발명에서 사용 가능한 숙주세포로는 그람음성 박테리아에 속하는 미생물을 사용할 수 있으며, 에세리키아 (Escherichia) 속에 속하는 미생물을 사용하는 것이 바람직하다. 특히, 본 실시예에서 사용한 에세리키아 콜라이 (Escherichia coli) KCCM 10236 (대한민국 특허출원 제2001-6976호)는 메티오닌 요구성, 쓰레오닌 유사체 (AHV: α-아미노-β-하이드록시 발레릭산)에 대한 내성, 라이신 유사체 (AEC: S-(2-아미노에틸)-L-시스테인)에 대한 내성, 이소루이신 유사체 (α-아미노부티르산)에 대한 내성 및 메티오닌의 유사체 (에티오닌)에 대한 내성 등의 특성을 지니며, 염색체 DNA 중에 포스포에놀 파이루베이트 카르복실레이즈 유전자 (phosphoenol pyruvate carboxylase gene, ppc)가 삽입되어 L-트레오닌의 생산성이 향상된 균주로서, thrA, thrB 및 thrC 중 어느 하나 이상의 유전자가 증폭된 균주이다. 따라서, 본 발명의 특정한 구체예에서 숙주세포로서 에세리키아 콜라이 (Escherichia coli) KCCM 10236를 사용하여 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다. 본 발명의 특정한 구체예에서, 본 발명이 제공하는 형질전환된 숙주세포는 대장균 (Escherichia coli) W3110 (ATCC27325)을 상기의 재조합 벡터로 형질전환시켜 얻은 대장균 (E. coli FTR4808) W3110/pCL-proBA(*) (수탁번호: KCCM-10587)이다. As the host cell usable in the present invention, microorganisms belonging to Gram-negative bacteria can be used, and microorganisms belonging to the genus Escherichia are preferably used. In particular, Escherichia coli KCCM 10236 (Korean Patent Application No. 2001-6976) used in this example is a methionine-required, threonine analogue (AHV: α-amino-β-hydroxy valeric acid) Resistance to lysine analogues (AEC: S- (2-aminoethyl) -L-cysteine), resistance to isoleucine analogues (α-aminobutyric acid) and methionine analogues (ethionine) Phosphoenol pyruvate carboxylase gene ( ppc ) is inserted into the chromosomal DNA and has improved productivity of L-threonine, which has characteristics such as resistance, and any of thrA, thrB and thrC . One or more genes are amplified strains. Accordingly, in certain embodiments of the present invention, a host cell transformed with the recombinant vector is provided using Escherichia coli KCCM 10236 as the host cell. In a specific embodiment of the present invention, the transformed host cell provided by the present invention is E. coli FTR4808 W3110 / pCL-proBA obtained by transforming Escherichia coli W3110 (ATCC27325) with the recombinant vector (*) (Accession number: KCCM-10587).
본 발명은 또한, 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주세포를 배양하는 단계를 포함하는 L-트레오닌의 생산방법을 제공한다. 상기 폴리뉴클레오티드에는 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드가 포함된다. The present invention also provides a method for producing L-threonine comprising culturing a host cell comprising a polynucleotide encoding a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. The polynucleotide includes a polynucleotide of SEQ ID NO.
본 발명의 L-쓰레오닌을 생산하는 방법에서, 상기 미생물의 배양 과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양과정은 당업자라면 선택되는 균주에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 상기 배양 방법의 예에는, 회분식, 연속식 및 유가식 배양이 포함되나, 여기에 한정되는 것은 아니다. 이러한 다양한 배양 방법은 예를 들면, "Biochemical Engineering" by James M. Lee, Prentice-Hall International Editions, pp 138-176에 개시되어 있다.In the method for producing L-threonine of the present invention, the culturing process of the microorganism may be made according to a suitable medium and culture conditions known in the art. This culture process can be used by those skilled in the art can be easily adjusted according to the strain selected. Examples of the culture method include, but are not limited to, batch, continuous and fed-batch cultures. Such various culture methods are described, for example, in "Biochemical Engineering" by James M. Lee, Prentice-Hall International Editions, pp 138-176.
배양에 사용되는 배지는 특정한 균주의 요구조건을 적절하게 만족시켜야 하다. 상기 배지는 다양한 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함한다. 사용될 수 있는 탄소원의 예에는, 포도당, 자당, 유당, 과당, 말토즈, 전분 및 셀룰로즈와 같은 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유와 같은 지방, 팔미트산, 스테아린산 및 리놀레산과 같은 지방산, 글리셀롤 및 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 탄소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원의 예에는, 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액 (CSL) 및 대두밀과 같은 유기 질소원 및 요소, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄과 같은 무기 질소원이 포함된다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에는 인원으로서, 인산이수소칼 륨, 인산수소이칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있다. 또한, 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 포함할 수 있다. 그외에, 아미노산, 비타민, 및 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다. 이들 배지 또는 전구체는 배양물에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다. The medium used for culturing must adequately meet the requirements of the particular strain. The medium contains various carbon sources, nitrogen sources and trace element components. Examples of carbon sources that can be used include glucose, sucrose, lactose, fructose, maltose, carbohydrates such as starch and cellulose, fats such as soybean oil, sunflower oil, castor oil, coconut oil, fatty acids such as palmitic acid, stearic acid and linoleic acid Alcohols such as glycerolol and ethanol, and organic acids such as acetic acid. These carbon sources may be used alone or in combination. Examples of nitrogen sources that can be used include organic nitrogen sources and urea such as peptone, yeast extract, gravy, malt extract, corn steep liquor (CSL) and soybean wheat, inorganics such as ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium carbonate and ammonium nitrate Nitrogen sources are included. These nitrogen sources may be used alone or in combination. The medium may include, as a person, calcium dihydrogen phosphate, dipotassium hydrogen phosphate and corresponding sodium-containing salts. It may also include metal salts such as magnesium sulfate or iron sulfate. In addition, amino acids, vitamins, appropriate precursors, and the like can be included. These media or precursors may be added batchwise or continuously to the culture.
배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 배양물에 적절한 방식으로 첨가하여, 배양물의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 배양물의 호기상태를 유지하기 위하여, 배양물내로 산소 또는 산소-함유 기체 (예, 공기)를 주입한다. 배양물의 온도는 보통 20 ℃ 내지 45 ℃, 바람직하게는 25 ℃ 내지 40 ℃이다. 배양 기간은 원하는 L-쓰레오닌의 생성량이 얻어질 때까지 계속할 수 있으며, 바람직하게는 10 내지 160 시간이다. During the culture, compounds such as ammonium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia, phosphoric acid and sulfuric acid can be added to the culture in an appropriate manner to adjust the pH of the culture. In addition, during the culture, antifoaming agents such as fatty acid polyglycol esters can be used to suppress bubble generation. In addition, to maintain the aerobic state of the culture, oxygen or an oxygen-containing gas (eg, air) is injected into the culture. The temperature of the culture is usually 20 ° C to 45 ° C, preferably 25 ° C to 40 ° C. The incubation period can continue until the desired amount of L-threonine is obtained, preferably 10 to 160 hours.
배양물로부터의 L-쓰레오닌의 분리는 당업계에 알려진 통상적인 방법에 의하여 분리될 수 있다. 이러한 분리 방법에는, 원심분리, 여과, 이온교환크로마토그래피 및 결정화 등의 방법이 이용될 수 있다. 예를 들면, 배양물을 저속 원심분리하여 바이오매스를 제거하고 얻어진 상등액을, 이온교환크로마토그래피를 통하여 분리할 수 있다. Isolation of L-threonine from the culture can be separated by conventional methods known in the art. In such a separation method, methods such as centrifugation, filtration, ion exchange chromatography, and crystallization may be used. For example, the supernatant obtained by removing the biomass by centrifugation of the culture at low speed can be separated by ion exchange chromatography.
본 발명에 따른 L-트레오닌의 생산방법은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주세포를 사용하기 때문에, 배지 내에 트레오닌의 농도가 높거나, 삼투압이 높은 조건에서도 L-트레오닌의 생산이 저해되지 않아 L-트레오닌의 생산성을 높일 수 있다.Since the production method of L-threonine according to the present invention uses a host cell containing a polynucleotide encoding a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, even in conditions with high concentration of threonine or high osmotic pressure in the medium, -The production of threonine is not inhibited, thus increasing the productivity of L-threonine.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. However, these examples are for illustrative purposes only and the scope of the present invention is not limited to these examples.
실시예 Example
이하의 실시예에서는, 종래의 L-트레오닌 발효에 사용되는 균주 (KCCM10236)의 프롤린 유사체 및 디히드로프롤린에 대한 내성을 확인하였다 (실시예 1). 다음으로, 상기 균주로부터 변이된 프롤린 오페론 폴리뉴클레오티드를 분리 및 클로닝하고 (실시예 2), 상기에서 클로닝된 변이된 프롤린 오페론 폴리뉴클레오티드의 서열을 확인하였으며 (실시예 3), 상기의 변이된 프롤린 오페론 폴리뉴클레오티드를 야생주, W3110에 도입하여 디히드로프롤린 내성을 확인하였다 (실시예 4). 마지막으로, 상기 변이된 프롤린 오페론 폴리뉴클레오티드를 L-트레오닌 생산 균주에 도입하여 삼투압과 L-트레오닌의 생산성과의 관계를 확인하였다 (실시예 5). In the following examples, the resistance to proline analogs and dihydroproline of the strain (KCCM10236) used for conventional L-threonine fermentation was confirmed (Example 1). Next, the mutated proline operon polynucleotide was isolated and cloned from the strain (Example 2), and the sequence of the mutated proline operon polynucleotide cloned above was confirmed (Example 3), and the mutated proline operon was Polynucleotides were introduced into wild strain, W3110 to confirm dihydroproline resistance (Example 4). Finally, the mutated proline operon polynucleotides were introduced into L-threonine producing strains to confirm the relationship between osmotic pressure and L-threonine productivity (Example 5).
실시예 1 : 야생주와 L-트레오닌 생산균주의 프롤린 유사체 내성 비교Example 1 Comparison of Proline Analogue Resistance of Wild and L-Threonine Producing Strains
대장균 (E.coli) KCCM10236 균주를 LB 배지에서 32 ℃, 200 rpm 및 16 시간 동안 배양한 다음, 표 1과 같은 프롤린 유사체 내성 테스트 배지에 희석하여 도말하고, 32 ℃에서 콜로니가 형성될 때까지 배양하였다. 그 결과 야생주 W3110 균주는 0.1 g/L까지 내성을 보인 반면, L-트레오닌 생산균주, KCCM10236 균주는 디히드로프롤린에 대해 1 g/L까지 내성을 갖는 것을 확인하였다. 그 결과는 표 2에 나타내었다.E. coli KCCM10236 strains were incubated in LB medium for 32 ° C., 200 rpm and 16 hours, then diluted in proline analog resistance test medium as shown in Table 1 and plated, and cultured at 32 ° C. until colonies were formed. It was. As a result, the wild strain W3110 strain showed resistance up to 0.1 g / L, whereas the L-threonine producing strain, KCCM10236 strain was confirmed to have resistance to dihydroproline up to 1 g / L. The results are shown in Table 2.
표 1. 디히드로프롤린 내성 테스트 배지 조성 Table 1. Dihydroproline Resistance Test Media Composition
표 2. 야생주와 L-트레오닌 생산 균주 (KCCM10236)의 디히드로프롤린 내성 비교Table 2. Comparison of dihydroproline resistance between wild strains and L-threonine producing strains (KCCM10236)
실시예 2 : 야생주와 L-트레오닌 생산균주 유래의 프롤린 오페론, Example 2 Proline operon derived from wild and L-threonine producing strains, proBAproBA 의of 클로닝Cloning
본 실시예에서는 L-트레오닌 생산균주, KCCM10236의 염색체 DNA를 주형으로 하고 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 사용한 PCR을 통하여 프롤린 오페론을 증폭하였다. 사용된 프라이머는 NCBI GenBank 데이터 베이스에 공개된 proBA 오페론 서열을 이용하여 제작하였다. 다음으로, 얻어진 PCR 산물을 클로닝하였다. In this example, proline operon was amplified by PCR using chromosomal DNA of L-threonine producing strain, KCCM10236 as a template, and oligonucleotides of SEQ ID NOs: 3 and 4 as primers. Primers used were constructed using proBA operon sequences published in NCBI GenBank database. Next, the obtained PCR product was cloned.
PCR은 ExpandTM High Fidelity PCR System (Boehringer Mannheim 사)을 이용하여 수행하였으며, 그 결과 프로모터를 포함한 2652 bp의 프롤린 오페론, proBA를 증폭하였다. 이때 사용된 반응액은, 200μM dATP, 200μM dCTP, 200μM dTTP, 200μM dGTP, pro-F 프라이머 (서열번호 3) 100 nM, pro-R 프라이머 (서열번호 4)100 nM, W3110 또는 KCCM10236 게놈 DNA 0.1μg, 15 mM MgCl2를 포함한 Expand HF 완충용액 1x 및 ExpandTM High Fidelity PCR System 효소 믹스 2.6 U를 포함하였다. PCR 반응 조건은 다음과 같다. 95 ℃에서 2 분 동안 반응 후 95 ℃ 15 초, 58 ℃ 15 초, 72 ℃ 2 분 30 초 조건의 반응을 30 회 반복하였다. 72 ℃에서 10 분 동안 반응을 수행한 후 4 ℃에서 반응을 종료하여 프롤린 오페론을 증폭하였다. 그 결과 야생 균주와 L-트레오닌 생산균주, KCCM10236로부터 얻어진 프롤린 오페론 DNA를 각각 proBA 및 proBA(*)로 명명하였다. 다음으로, 상기 DNA 절편을 클로닝 벡터 pGEM-T (Promega 사, 미국)에 라이게이션시킨 후 얻어진 재조합 벡터 pGEM-proBA 및 pGEM-proBA(*)를 각각 대장균 DH5α에 형질전환시켰다.PCR was performed using an Expand TM High Fidelity PCR System (Boehringer Mannheim), and as a result amplified 2652 bp of proline operon, proB A including a promoter. The reaction solution used at this time, 200μM dATP, 200μM dCTP, 200μM dTTP, 200μM dGTP, pro-F primer (SEQ ID NO: 3) 100 nM, pro-R primer (SEQ ID NO: 4) 100 nM, W3110 or KCCM10236 genomic DNA 0.1μg , Expand HF buffer 1 × with 15 mM MgCl 2 and Expand ™ High Fidelity PCR System enzyme mix 2.6 U. PCR reaction conditions are as follows. After the reaction at 95 ° C. for 2 minutes, the reaction under the conditions of 95 ° C. 15 seconds, 58 ° C. 15 seconds, and 72 ° C. 2 minutes 30 seconds was repeated 30 times. After the reaction was performed at 72 ° C. for 10 minutes, the reaction was terminated at 4 ° C. to amplify proline operon. As a result, proline operon DNA obtained from wild strain, L-threonine producing strain and KCCM10236 were named proBA and proBA (*) , respectively. Next, the DNA fragments were ligated to the cloning vector pGEM-T (Promega, USA), and the recombinant vectors pGEM-proBA and pGEM-proBA (*) obtained were transformed into E. coli DH5α, respectively.
다음으로, 상기 대장균 DH5α로부터 pGEM-proBA 및 pGEM-proBA(*)를 회수하고 제한 효소 BamHI로 절단한 다음, BamHI로 절단된 pCL1920 벡터와 통상의 방법으로 라이게이션하고, 대장균 DH5a에 형질전환시켜 벡터 pCL-proBA 및 pCL-proBA(*)를 얻었다.Next, pGEM-proBA and pGEM-proBA (*) were recovered from the E. coli DH5α, digested with a restriction enzyme BamHI, ligated with a pCL1920 vector digested with BamHI in a conventional manner, and transformed into E. coli DH5a. pCL-proBA and pCL-proBA (*) were obtained.
실시예 3 : 프롤린 오페론, Example 3: Proline operon, proBAproBA 의 염기서열 분석Sequence Analysis of
본 실시예에서는 프롤린에 의한 프롤린 오페론, proBA의 길항억제 기작이 해제된 돌연변이 부위를 확인하기 위하여, proBA(*)의 염기서열을 분석하였다. proBA(*) 0.1 mg을 주형으로 하고, 서열번호 3 및 4의 프라이머 2 mM과 BigDyeTM Terminator Cycle Sequencing v2.0 Ready Reaction (PE Biosystems 사) 1 ㎕를 이용하여 PCR을 수행한 후 (변성 : 95 ℃ 30 초, 어닐링 : 56 ℃ 30 초, 중합 : 72 ℃ 2분 30초를 30 회 반복 후 4 ℃로 반응 종료), 2.6 kb 크기의 DNA 절편을 분리하였다. 이 DNA절편과 서열번호 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 및 13의 프라이머를 이용하여 ABI PRISM 3100 Genetic AnalyzerTM (Applied Biosystems사)로 염기서열을 결정하였다. 염기서열을 분석한 결과, 프롤린 오페론의 구조 유전자, proB의 926 번째 염기 구아닌이 아데닌으로 치환된 것을 확인하였다. 그에 따라 ProB 단백질의 309 번째 아미노산 아르기닌 (R)이 히스티딘 (H)으로 치환되었음을 확인하였다. 얻어진 변이된 프롤린 오페론의 염기서열은 서열번호 2에 나타내었다. In this example, the nucleotide sequence of proBA (*) was analyzed to identify the site of mutation of the proline operon and proBA antagonist inhibition mechanism by proline. ProBA (*) 0.1 mg was used as a template, PCR was performed using 2 mM primers of SEQ ID NOs: 3 and 4 and 1 μl of BigDye ™ Terminator Cycle Sequencing v2.0 Ready Reaction (PE Biosystems). 30 sec at 30 ° C., annealing at 56 ° C. for 30 sec, and polymerization: 72 ° C. for 2 minutes 30 sec. Using the DNA fragment and the primers of SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 and 13, the base sequence was determined by ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer ™ (Applied Biosystems). As a result of analyzing the nucleotide sequence, it was confirmed that the structural gene of proline operon, the 926th base guanine of proB was substituted with adenine. This confirmed that the 309th amino acid arginine (R) of the ProB protein was substituted with histidine (H). The base sequence of the obtained mutated proline operon is shown in SEQ ID NO: 2.
실시예 4 : 돌연변이 프롤린 Example 4: Mutant Proline proBAproBA (*)가 디히드로프롤린 내성에 미치는 영향Effect of (*) on Dihydroproline Resistance
실시예 2에서 얻은 두 종류의 재조합 균주로부터 재조합 플라스미드, pCL-proBA, pCL-proBA(*)와 플라스미드 pCL1920를 플라스미드 정제 키트 (BIONEER 사, 한국)를 사용하여 회수한 다음, 이를 대장균 야균주인 대장균 W3110에 형질전환시켰다. 얻어진 형질전환된 대장균 W3110을 스펙티노마이신 100 mg/l가 함유된 LB 평판배지에 도말하여 콜로니를 각각 얻었다. 각 형질전환 균주의 콜로니를 표 1과 같은 최소 배지에 표 3과 같이 디히드로프롤린 농도를 첨가한 LB 평판배지에 스트리킹 (streaking)하였다. 이들 평판배지를 33 ℃ 배양기에서 24 시간 동안 배양한 후 생장 상태를 확인하였다. 그 결과를 표 3에 나타내었다. 표 3에 나타낸 바와 같이, 돌연변이 프롤린 오페론으로 형질전환된 균주는 야생 프롤린 오페론으로 형질전환 된 균주에 비하여 디히드로프롤린에 대하여 약 70 배의 내성을 갖는 것으로 밝혀졌다. Recombinant plasmids, pCL-proBA, pCL-proBA (*) and plasmid pCL1920 were recovered from the two kinds of recombinant strains obtained in Example 2 using a plasmid purification kit (BIONEER, South Korea), and then E. coli, which is an E. coli strain. W3110 was transformed. The resulting transformed E. coli W3110 was plated on LB plate medium containing 100 mg / l spectinomycin to obtain colonies, respectively. Colonies of each transformed strain were streaked in LB plate medium to which dihydroproline concentration was added as shown in Table 3 to the minimum medium as shown in Table 1. These plates were incubated for 24 hours in a 33 ℃ incubator and confirmed the growth state. The results are shown in Table 3. As shown in Table 3, the strain transformed with the mutant proline operon was found to have about 70-fold resistance to dihydroproline as compared to the strain transformed with the wild proline operon.
표 3. 돌연변이 또는 야생 프롤린 오페론으로 형질전환된 대장균의 디히드로프롤린에 대한 내성Table 3. Resistance to dihydroproline of Escherichia coli transformed with a mutant or wild proline operon
실시예 5 : 돌연변이 프롤린 오페론 Example 5 Mutant Proline Operon proBAproBA (*)가 L-트레오닌 발효에 미치는 영향Effect of (*) on L-Threonine Fermentation
실시예 4에서 얻은 2 종류의 재조합 벡터 pCL-proBA, pCL-proBA(*)과 플라스미드 pCL1920을 L-트레오닌 생산균주, FTR2533에 형질전환시켰다. 다음으로, 얻어진 형질전환된 대장균 FTR2533을 각각 5 주씩 총 15 주를 표 1의 고체 역가배지에서 밤새 배양하였다. 얻어진 배양물 중 한 루프 (loop)를 쓰레오닌 20 g/L 및 0.4 M NaCl가 첨가된 표 4의 플라스크 발효배지에 접종하고, 48 시간 동안 플라스크에서 배양한 다음 L-트레오닌의 축적량을 분석하였다. Two recombinant vectors pCL-proBA, pCL-proBA (*) and plasmid pCL1920 obtained in Example 4 were transformed into L-threonine producing strain, FTR2533. Next, the obtained transformed E. coli FTR2533 was cultured overnight in a solid titer medium of Table 1, each of 5 weeks for a total of 5 weeks. One loop of the obtained culture was inoculated into the flask fermentation broth of Table 4 to which 20 g / L of threonine and 0.4 M NaCl were added, incubated in the flask for 48 hours, and the accumulation of L-threonine was analyzed. .
그 결과 얻어진 L-트레오닌 축적량에 대한 데이터는 표 5에 나타내었다. 표 5에 나타낸 바와 같이, 변이된 프롤린 오페론, pCL-proBA (*)를 포함하는 대장균 균주가 플라스미드 pCL1920 또는 야생형 프롤린 오페론, pCL-proBA를 포함하는 균주보다 5 %의 트레오닌을 더 배양액에 축적시키는 것을 확인하였다. 또한, pCL-proBA (*)를 포함하는 대장균 균주가 pCL1920 또는 pCL-proBA를 포함하는 균주에 비하여 당소모 속도가 증가하는 것을 확인하였다.The data for the resulting L-threonine accumulation is shown in Table 5. As shown in Table 5, E. coli strains comprising a mutated proline operon, pCL-proBA (*) accumulate 5% more threonine in the culture than strains comprising plasmid pCL1920 or wild type proline operon, pCL-proBA. Confirmed. In addition, it was confirmed that the E. coli strain containing pCL-proBA (*) increased the sugar consumption rate compared to the strain containing pCL1920 or pCL-proBA.
본 실시예에서 얻어진 pCL-proBA(*)를 대장균 W3110 (ATCC27325)에 형질전환하여 이를 대장균 W3110/pCL-proBA(*) (기탁명 : FTR4808)로 명명하고, 2004년 8월 10일자로 국제기탁기관인 한국미생물보존센터에 기탁하였다 (수탁번호 KCCM-10587).PCL-proBA (*) obtained in this Example was transformed into Escherichia coli W3110 (ATCC27325) and named as Escherichia coli W3110 / pCL-proBA (*) (Accession Name: FTR4808), and was deposited on August 10, 2004. It was deposited with the Korea Microorganism Conservation Center (accession number KCCM-10587).
표 4. 플라스크 역가 배지Table 4. Flask Titer Medium
표 5. 높은 삼투압 조건에서 L-트레오닌 생산성 비교Table 5.L-Threonine Productivity Comparison at High Osmotic Conditions
표 5에서 알 수 있는 바와 같이, 높은 삼투압 조건에서 발효를 진행할 경우 변이된 프롤린 오페론, pCL-proBA(*)/FTR4360를 포함한 쓰레오닌 생산균주의 경우 향상된 L-트레오닌의 생산성을 보였다.As can be seen in Table 5, the fermentation under high osmotic conditions showed improved L-threonine productivity for threonine producing strains including mutated proline operon, pCL-proBA (*) / FTR4360.
본 발명의 폴리뉴클레오티드에 따르면, 프롤린에 의한 길항조절 기작이 해제된 글루타밀 키나제 변이체를 발현할 수 있어, 높은 삼투압 조건에서도 생육할 수 있는 균주를 제조하는데 사용될 수 있다. According to the polynucleotide of the present invention, it is possible to express a glutamyl kinase variant in which antagonism regulation by proline has been released, and thus can be used to prepare a strain capable of growing under high osmotic conditions.
본 발명의 재조합 벡터에 따르면, 프롤린에 의한 길항조절 기작이 해제된 글루타밀 키나제 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고 있어, 높은 삼투압 조건에서도 생육할 수 있는 균주를 제조하는데 사용될 수 있다.According to the recombinant vector of the present invention, a polynucleotide encoding a glutamyl kinase variant in which the antagonism regulation by proline has been released can be used to prepare a strain capable of growing under high osmotic conditions.
본 발명의 형질전환된 숙주 세포에 의하면, 높은 삼투압 조건에서도 생육할 수 있다.According to the transformed host cell of the present invention, it can grow even under high osmotic conditions.
본 발명의 L-트레오닌의 생산방법에 의하면, 높은 삼투압 조건 하에서도 L-트레오닌을 고농도로 생산할 수 있다.According to the production method of L-threonine of the present invention, it is possible to produce L-threonine at high concentration even under high osmotic conditions.
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Patent Citations (1)
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