JPS63119697A - コレステロ−ル分析要素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［利用分野］ 血液等の生物体液その他の液体試料中に含まれるコレス
テロールを定量する分析要素に関する。

［解決しようとする技術課題］ コレステロールを定量分析する有用な方法として、例え
ばコレステロールオキシダーゼの存在下にコレステロー
ルを酸化し生ずる過酸化水素又はコレステノンを定量す
る方法が特公昭５４−８３１８号（出願人：ナショナル
リサーチアンドディベロプメント　コーボレイション）
で知られている。

また結合コレステロールを含めた総コレステロールの定
量に適用するために、この方法をコレステロールエステ
ラーゼによるコレステロールの遊離と組みあわせること
も、米国特許３，９２５，１６４号（ベーリンガー・マ
ンハイム社）によって知られている。上記方法はコレス
テロールから生じるコレステノンと１−１２０２のいず
れかを公知の方法で定量するものである。Ｈ２０２を定
量するにはトラインダー試薬が有用であるが、共存する
ビリルビンが分析結果に誤差を与える。このとリルビン
の干渉を防ぐ方法として、フェロシアン塩を共存させる
ことが、米国特許４，２９１，１２１号（マイルズ。

ラボラトリーズ社）で知られているが、コレステロール
エステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ペルオキ
シダーゼ及びトラインダー試薬（または類似の過酸化水
素検出試薬系）を含む乾式分析要素にフェロシアン塩を
含有させると、分析要素の保存安定性は著しく損なわれ
ることが判明した。

本発明の目的は、コレステロールエステラーゼ、コレス
テロールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ及びトライン
ダー試薬を含む乾式分析要素に比べて実用的に劣らない
コレステロール分析怒度を有し、かつ保存安定性の良好
なコレステロール分析要素を提供することである。

本発明の上記目的は、少なくとも一つの液体透過性かつ
液体保持性の層から成る乾式液体分析要素であって、コ
レステロールエステラーゼまたはリパーゼと、デオキシ
コール酸またはその塩と、コレステロールデヒドロゲナ
ーゼとをそれぞれ該層の少なくとも一つに含み、該層の
少なくとも一つは多孔性液体展開層である、液体中のコ
レステロールを定量するための分析要素（コレステロー
ルエステラーゼまたはリパーゼを含む層、デオキシコー
ル酸又はその塩を含む層、コレステロールデヒドロゲナ
ーゼを含む層は同じ層でも互いに異なる層でもよい）に
よって達成された。

本発明の前記目的は、また多孔性液体展開層にリパーゼ
、デオキシコール酸又はその塩、コレステロールデヒド
ロゲナーゼのいずれか少なくとも一つを含むことを特徴
とする前記（少なくとも一つの液体透過性かつ液体保持
性の層にリパーゼ、デオキシコール酸又はその塩、コレ
ステロールデヒドロゲナーゼを含む）コレステロール定
量用分析要素によって、より好ましく達成された。

本発明に用いられるコレステロールエステラーゼは、種
々の起源のものを用いることができる。

すなわち、動物臓器から得られたものでもよいし、微生
物（例えば米国特許３，９２５，１６４号に記載された
カンジダルゴサ、アクチノミセス属、ストレプトミセス
属、ペニシリウム属等）から得られたものでもよい。

本発明に用いられるリパーゼは、種々の起源のものを用
いることができるが、特にＣｂｒｏｍｏｂａｃ　ｔｅ−
ｒｉｕｍ　ｖｉｓｃｏｓｕｍから得られたものが有用で
ある。

本発明においてはデオキシコール酸デ又はデオキシコー
ル酸の塩が用いられる。デオキシコール酸の塩としては
ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩等を用いること
ができる。デオキシコール酸のかわりにコール酸、リト
コール酸、ケノデオキシコール酸、タウロコール酸、グ
リコール酸、タウロデオキシコール酸、グリコデオキシ
コール酸及びこれらのナトリウム塩、カリウム塩、リチ
ウム塩等を用いることができる。

本発明に用いられるコレステロールデヒドロゲナーゼは
、種々の起源のものを用いることができるが、Ｎｏｃａ
ｒｄｉａ属のバクテリアから得られたものなどが有用で
ある。

本発明の分析要素においては、コレステロールエステラ
ーゼまたはリパーゼおよびデオキシコール酸またはその
塩の作用下に遊離のコレステロールが生成し、コレステ
ロールデヒドロゲナーゼの作用下にコレステロールから
コレステノンが生成する。この際、ＮＡＤまたはＮＡＤ
Ｐを共存させると、Ｎ　Ａ　Ｄ　ＩＩまたはＮＡＤＰＨ
が生成するので、生成したＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを
定量することにより、コレステロールを定量することが
できる。

Ｎ　Ａ　Ｄ　ＨまたはＮＡＤＰＨを定量する方法として
は、電子伝達剤の存在下に電子受容性の色素前駆体から
可視域に吸収スペクトルを有するフォルマザン染料を形
成させる比色分析法が、特開昭４９−１１３９５号等で
知られている。この反応系を用いれば、可視域の分光測
光によりＮＡＤＨまたはＮＡ　Ｄ　Ｐ　Ｈの定量ができ
る。

電子伝達剤としては、ヂアホラーゼ、Ｎ−＋５ｅｔｌ＋
ｙｌｐｈｅｎａｚｏｎｉｕ＋＋　ｍｅｔｈｏｓｕｌｆａ
ｔｅ等を用いることができる。

フォルマザン染ｉｌｌ前駆体としては、ＩＮＴすなわち
２−（ｐ−ｉｏｄｏｐｌ＋ｅｎｙｌ）−３−（ｐ−ｎｉ
ｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）−５−ｐｈｅｎｙｌｔｅＬｒａｚ
ｏｌｉｕｍ　ｃｈｌｏｒｉｄｅ、　Ｉ３Ｔすなわち３゜
３’　−（３，３’　−ｄｉｍｅＬｂｏｘｙ−４，４’
　−ｂｉｐｈｅｎｙｌｅｎｅ）−ｂｉｓ［２゜５−ｄｉ
ｐｈｅｎｙｌｔｅＬｒａｚｏｌｉｕｍ　ｃｌ＋Ｉｏｒｉ
ｄｅ］、３．３’−（４，４゜−ｂｉｐｈｅｎｙｌｅｎ
ｅ）−ｂｉｓ［２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚ
ｏｌｉｕｍｃｂｌｏｒｉｄｅ］等を用いることもできる
が、ニトロテトラゾリウムブルー（ＮＴＢｔたはＮＢＴ
）すなわち３．３’　−（３，３’　−ｄｉｍｅｔ！＋
ｏｘｙ−４，４′−ｂｉｐｂｅｎｙｌｅｎｅ）−ｂ　ｉ
ｓ［２−（ｐ−ｎ　ｉ　Ｌｒｏｐｂｅｎｙ　ｌ　）　−
５−ｐｈｅｎｙ　Ｉ　ｔｅｔｒａｚｏ　Ｉ　ｉｕｍｅｈ
ｌｏｒｉｄｅｌ　　が好ましい。

本発明の要素に用いられる試薬組成物の各成分の要素中
の含有量（要素１１２当たり被覆Ｊｉ）は次の通りであ
る。

コレステロールエステラーゼ；約５００〜５００００　
Ｉ　Ｕ、好ましくは　約１０００〜３００００　Ｉ　Ｉ
Ｊリパーゼ；約５０００〜３０００００　Ｉ　Ｕ好まし
くは１００００〜２０００００　Ｉ　Ｕデオキシコール
酸又はその塩；約０．２〜１０ｇ好ましくは０．５〜５
ｇ （デオキシコール酸のかわりに用いられる酸又は塩の場
合も同量） コレステロールデヒドロゲナーゼ；２００〜３００００
ｒｕ、好ましくは３００〜２００００　Ｉ　ＵＮＡＤま
たはＮＡＤＰ　、約１１０ｌ１１〜５０ｇ、好ましくは
３０繭ｇ〜２０ｇ 電子伝達剤；１〜１１０００ＩＩ１、好ましくは５〜５
００　ｍ　ｇジアホラーゼの場合５００〜２００００　
Ｉ　Ｕ、好ましくは７００〜１００００　Ｉ　Ｕフォル
マザン染料前駆体；約５Ｂ〜Ｌｏｇ、好ましくは　２５
輸ｇ〜５ｇ 本発明は公知の多種の乾式分析要素に適用することが出
来る。特に検出試薬系と被検液がいずれも透過し得る固
体担体を含む、要素に適用することが出来る。要素は光
透過性・液不透過性の支持体上に、多孔性液体展１７Ｆ
ＩＭのほかに下塗り層、吸水層、接着層、反応試薬層、
光遮蔽層、濾過層、および公知のその他の層を有する多
層ｔｌｌＩ造であってもよい。このような分析要素は例
えば、米国持許第礼９９２，１５８号および特開昭５５
−１６４３５６号に記載されている。

支持体を用いる場合、本発明の分析要素の実用的に採り
うる構成は （１）支持体上に液体展開層を有するもの。支持体と液
体展開層の間に吸水層を有してもよい。

（２）支持体上に試薬層、液体展開層をこの順（こ有す
るもの。支持体と試薬層の間に吸水層を有してもよい。

この場合、コレステロールエステラーゼまたはリパーゼ
は液体展開層または試薬層に含まれるが、液体展開層に
含まれるのが好ましい。

（３）支持体上に第二試薬層、第一試薬層、液体展開層
をこの順に有するもの。支持体と第二試薬層の間に吸水
層を有してもよい。この場合、コレステロールエステラ
ーゼまたはリパーゼは液体展開層、第二試薬層または第
一試薬層に含まれるが、第一試薬層または液体展開層に
含まれるのが好ましい。

（４）支持体上に試薬層、光道へい層、液体展開層をこ
の順に有するもの。支持体と試薬層の間に吸水層を有し
てもよい。この場合、コレステロールエステラーゼまた
はリパーゼは液体展開層または試薬層に含まれるが、液
体展開層に含まれるのが好ましい。

（５）支持体上に第二試薬層、光遮蔽層、第一試薬層、
液体展開層をこの順に有するもの、支持体と第二試薬層
の間に吸水層を有してもよい。

この場合、コレステロールエステラーゼまたはリパーゼ
は液体展開層、第二試薬層または第一試薬層に含まれる
が、第一試薬層または液体展開層に含まれるのが好まし
い。

上記（１）ないしく５）の態様において吸水層と試薬層
または液体展開層の間、試薬層と液体展開層の間、第二
試薬層と第一試薬層の間、または光遮蔽層と試薬層もし
くは液体展開層の間に、濾過層を設けてもよい。

本発明の乾式分析要素に用いることができる光透過性・
水不透過性支持体の例としては、ポリエチレンテレフタ
レート、ビスフェノールＡのポリカルボネート、ポリス
チレン、セルロースエステル（例、セルローストリアセ
テート、セルロースアセテートプロピオネート等）等の
ポリマーからなる厚さ約５０μ肩から約１ｚｚ、好まし
くは約８０μ肩から約３００μｍの範囲のフィルムもし
くはシート状の透明支持体をあげることができる。

これら支持体の表面には必要により下塗層を設けて、支
持体の上に設けられる検出層あるいはその他の層と支持
体との接着を強固なものにすることができる。また、下
塗層の代りに、支持体の表面に物理的（たとえばグロー
放電、コロナ放電）あるいは化学的な活性化処理を施し
て接着力の向上を図ってもよい。

本発明の分析要素には、光透過性・水不透過性支持体の
上に（場合によっては下塗層等の他の層を介して）吸水
層を設けることができる。吸水層は一般に、被検成分の
存在下で生成する色素が実質的に拡散しない層で、水を
吸収して膨潤する親水性ポリマーから成る。吸水層に用
いられる親水性ポリマーは、一般には水吸収時の膨潤率
が３０℃で約１．５から約２０、好ましくは約２．５か
ら１５の範囲の天然または合成親水性ポリマーである０
例として、ゼラチン（例、アルカリ処理ゼラチン、酸処
理ゼラチン、脱イオンゼラチン等）、ゼラチン誘導体く
例、フタル化ゼラチン等）、アガロース、ポリアクリル
アミド、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン
等をあげることができる。

吸水層の乾燥時の厚さは通常約１μ屑から約１００μ屑
の範囲、好ましくは約３μ屑から３０μｌの範囲である
。吸水層には、必要に応じて界面活性剤（カチオン性、
アニオン性、両性、又は非イオン性）やｔＨＴｒ剤を含
有させることもできる。

本発明の分析要素には、光透過性・水不透過性支持体の
上に（場合によっては下塗層等の他の層を介して）検出
層を設けることができる。検出層は一般に、被検成分の
存在下で生成する色素が拡散し、光透過性支持体を通し
て光学的に検出され得る層である。検出層は、吸水層と
同種の親木性ポリマーにより構成することができる。検
出層には、硬膜剤、界面活性剤（カチオン性、アニオン
性、両性、又は非イオン性）、桜街剤、光遮蔽性（反射
性または吸収性）微粒子を必要に応じて含有させること
ができる。

吸水層、光遮蔽層、濾過層、試薬層等の層の上には、展
開層を接着し積層するための接着層を設けてもよい。接
着層は水で湿潤しているとき、または水を含んで膨潤し
たときに展開層を接着することができるような親水性ポ
リマーからなることが好ましい。接着層に用いることが
できる親水性ポリマーの例としては、吸水層に用いられ
ると同様な親水性ポリマーがあげられる。これらのうち
ゼラチン、ゼラチン誘導体、ポリアクリルアミド等が好
ましい。接着層の乾燥膜厚は一般に約０．５μ屑から約
２０μｌ、好ましくは約１μｌから約１０μｓの範囲で
ある。接着層は親水性ポリマーと、必要によって加えら
れる界面活性剤等を含む水溶液を公知の方法で、試薬層
等の上に塗布する方法により設けることができる。

本発明の分析要素の試薬層その他の層に含有させること
ができる桜街剤の例としては、炭酸塩、ホウ酸塩、燐酸
塩や［ｌｉｏｃｈｅｍｉｓＬｒｙ誌　第５巻（第２号）
、４６７ページより４７７ページ（１９６６年）に記載
されているグツド（Ｇｏｏｄ　）の緩衝剤などがある。

これらの緩衝剤はｒ蛋白質・酵素の基礎実験法１〈堀尾
武−１他著、南江堂、１９８１年）等の公知文献を参考
にして選択し、使用することができる。

光遮蔽層は、親水性ポリマーをバインダーとして、光反
射性微粒子が分散されている水浸透性の層であることが
好ましい、光反射性微粒子は、試薬層（または吸水層）
に生じた検出可能な変化（色変化、発色等）を光透過性
を有する支持体側から反射測光する際に、展開層に点着
供給された水性液体の色、特に試料が全血である場合の
ヘモグロビンの赤色等を遮蔽するとともに光反射層また
は背景層としても機能する。光反射性を有する微粒子の
例としては、顔料微粒子たとえば二酸化チタン微粒子（
ルチル型、アナターゼ型またはブルツカイト型の、粒子
径が約０．１μｌから約１．２μｌの微結晶粒子等）、
硫酸バリウム微粒子等を挙げることができる。好ましい
のはルチル型二酸化チタン微粒子である。

親水性ポリマーバインダーの例としては、前述の吸水層
に用いられる種類の親水性ポリマーのほか、弱親水性の
再生セルロース等を挙げることができる。これらのうち
ゼラチン、ポリアクリルアミド等が好ましい。なおゼラ
チン、ゼラチン誘導体には公知の硬膜剤を添加すること
ができる。

光遮蔽層は、光遮蔽性微粒子と親水性ポリマーとの水性
分散液を公知の方法により吸水層、試薬層等の上に塗布
し乾燥することにより設けることができる。本発明の分
析要素には、必要に応じ展開層中にも上記のごとき光遮
蔽性微粒子を含有させてもよい。

展開層は、液体計量作用を有する展開層であることが好
ましい。液体計量作用を有するとは、その表面に点着供
給された液体試料を、その中に含有している部分を実質
的に偏在させることなく、層の面方向に単位面積当りほ
ぼ一定量の割合で広げる作用を有することである。

展開層のマトリックスを構成する材料としては、濾紙、
不織布、織物生地（例えばブロード等の平織等）、編物
生地（例、トリコット編、ダブルトリコット編等）、プ
ラッシュポリマーより形成されるメンブランフィルタ−
１あるいはポリマーミクロビーズ等からなる三次元格子
状構造物等を用いることができる。これらのうちでは、
織物生地および編物生地に代表される繊維質層が好まし
い。

これらの詳細については特開昭５５−１６４３５６号、
同５７−６６３５９号および同６０−２２２７６９号を
参照すればよい。

本発明の分析要素に用いる織物生地または編物生地は水
洗等の脱脂処理により糸、織物あるいは編物の製造時等
に付着した油脂類が実質的に除去されていることが好ま
しい。

本発明で製造される一体型多層分析要素は、−通約１５
ｚｖから約３０Ｊ１１の正方形またはほぼ同サイズ円形
等の小片に裁断し、特開昭５７−６３４５２号、特開昭
５４−１５６０７９号、実開昭５６−１２５４２４号、
実開昭５５−３２３５０号および特表昭５８−５０１１
４４等辺公報等に開示のスライド枠等に納めて分析スラ
イドとして用いるのが製造、包装、輸送、保存および測
定操作等の全ての観点で好ましい。

本発明で製造される乾式分析要素は、約５μｌから約３
０μれ好ましくは約８ノ１１から約１５μｒの水性液体
試料を展開層に点着供給し、必要に応じて約２０℃から
約４５℃、好ましくは３５℃から４０°Ｃの範囲の実質
的に一定の温度でインキュベーションする。

その後、一方の側から（−木型多層分析要素においては
光透過性支持体側から）乾式分析要素内の色変化、発色
等の検出可能な変化を反射測光し比色法の原理により液
体試料中の測定対象成分を分析する。

以下に、実施例により本発明をさらに具体的に説明する
。

（以下余白） ［実施例１］ 下塗りされている厚さ１８０μｍのポリエチレンテレフ
タレート無色透明平滑フィルム上に下記の組成（ａｏ）
の水溶液を、乾燥膜厚が１５μｍになるよう塗布し、乾
燥した（発色層）。

（ａ、） アルカリ処理ゼラチン　　　　１２　ｇ界面活性剤　　
　　　　　　　　０．１ｇ（オリン社５ｕｒｆａｃＬａ
ｎｔ　ＩＯＧ　）ＮＡＤ　　　　　　　　　　　　　０
．８ｇジアホラーゼ　　　　　　　　　２８００１ＯＮ
ＴＢ　（＊　）　　　　　　　　　　０．２ｇ水　　　
　　　　　　　　　　　　　　　９５ａ＋ｌ＊３，３′
−（３，３′−ｄｉｍｃＬｌ＋ｏｘｙ−４，４’　−ｂ
ｉｐｂｅｎｙｌｅｎｅ）−１３ｉｓ［２−（ｐ−ｎ　ｉ
　Ｌｒｏｐｈｅｎｙ　Ｉ　）−５−ｐｈｅｎｙ　ｌ　−
２１１ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕａ＋　ｃｌ＋Ｉｏｒｉｄｅ
］次に上記発色層上に、下記の組成（’ｂ　ｏ　）の水
溶液を乾燥膜厚が７μｍになるよう塗布し、乾燥した（
光道へい層） （ｂｏ） アルカリ処理ゼラチン　　　　　１４ｇルチルを酸化チ
タン　　　　　　７０　ｇ水　　　　　　　　　　　　
　　　　　　１００　ｍｌ上記光光遮い層上に、ゼラチ
ン水溶液を乾ｒｊ４膜厚が２μｍになるよう塗布し、乾
燥した９上記ゼラチン層上に約３０　ｇ／ｖｎ２の割合
で水を全面に供給して湿潤させた後、グロー放電により
親水化したポリエステル製トリコット編み物（厚さ０．
２５　ｎ１ｍ）を、軽く圧力をかけながらラミネー１−
　Ｌ、乾燥して接着させた（展開層）。

次にこの布（展開層）上に、下記の組成（ｄｏ）の懸濁
液を２００　ｃｃ／　ｍ　２の割合でほぼ均一に塗布し
、乾燥させ、コレステロール定量用一体型多層分析要素
を作製した。

（ｄｏ＞ エタノール　　　　　　　　　　５００　ｍｌポリビニ
ルピロリドン　　　　　１８ｇ（１０％エタノール溶液
） ポリオキシエヂレンノニル フェニルエーテル（１１・４０）　　　　　６　ｇ２−
アミノ−２−エチル− １，３−プロパンジオール　　　ｌ１ｇポリオギシエヂ
レンオクチル フェニルエーテル（ｎ；１０）　　　　３　ｇデオキシ
コール酸ナトリウム　　　７ｇ上記エタノール溶液に下
記酵素液を添加し、懸濁させた。

リパーゼ（＊）　　　　　　　　　１５０００　Ｕコレ
ステロール デヒドロゲナーゼ　　　　　５０００　Ｕ水　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　５ｍｌ＊　Ｃｈｒｏｔ
ｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｎ　ｖｉｓｃｏｓｕ＋ｎから産生
こうして完成した分析用フィルムを１５Ｘ１５ｍｍの正
方形に切断し、プラスチック製マウントに収めて、コレ
ステロール定置用分析スライドを完成した。

コレステロール濃度の異なる人血漿１０μｐを分析スラ
イドに点着し、３７°Ｃで６分間保った後、波長６００
　ｎ　ｍで、支持体側から反射光学濃度を測定した。そ
の結果を第１表に示す。

第１表

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. （１）少なくとも一つの液体透過性かつ液体保持性の層
   から成る乾式液体分析要素であって、コレステロールエ
   ステラーゼまたはリパーゼと、デオキシコール酸または
   その塩と、コレステロールデヒドロゲナーゼとをそれぞ
   れ該層の少なくとも一つに含み、該層の少なくとも一つ
   は多孔性液体展開層である、液体中のコレステロールを
   定量するための分析要素（コレステロールエステラーゼ
   またはリパーゼを含む層、デオキシコール酸又はその塩
   を含む層、コレステロールデヒドロゲナーゼを含む層は
   同じ層でも互いに異なる層でもよい）。
2. （２）多孔性液体展開層にコレステロールエステラーゼ
   を含むことを特徴とする特許請求の範囲１に記載の分析
   要素。
3. （３）多孔性液体展開層にリパーゼを含むことを特徴と
   する特許請求の範囲１に記載の分析要素。
4. （４）多孔性液体展開層にＣｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉ
   ｕｍｖｉｓｃｏｓｕｍから得られたリパーゼを含むこと
   を特徴とする特許請求の範囲１に記載の分析要素。
5. （５）多孔性液体展開層にコレステロールデヒドロゲナ
   ーゼを含むことを特徴とする特許請求の範囲１に記載の
   分析要素。
6. （６）多孔性液体展開層にデオキシコール酸又はその塩
   を含むことを特徴とする特許請求の範囲１に記載の分析
   要素。
7. （７）多孔性液体展開層にリパーゼ及びデオキシコール
   酸又はその塩を含むことを特徴とする特許請求の範囲１
   に記載の分析要素。
8. （８）多孔性液体展開層にリパーゼ、デオキシコール酸
   又はその塩およびコレステロールデヒドロゲナーゼを含
   むことを特徴とする特許請求の範囲１に記載の分析要素
   。
9. （９）多孔性液体展開層にＣｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉ
   ｕｍｖｉｓｃｏｓｕｍから得られたリパーゼを含むこと
   を特徴とする特許請求の範囲７又は８に記載の分析要素
   。