JPS61204197A - ステロ−ル脂肪酸エステルの製造方法 - Google Patents
ステロ−ル脂肪酸エステルの製造方法Info
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- JPS61204197A JPS61204197A JP4512885A JP4512885A JPS61204197A JP S61204197 A JPS61204197 A JP S61204197A JP 4512885 A JP4512885 A JP 4512885A JP 4512885 A JP4512885 A JP 4512885A JP S61204197 A JPS61204197 A JP S61204197A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
星11kO目Ll且I一
本発明は、ステロール類と脂肪酸とのエステルの新しい
製造方法に関する。
製造方法に関する。
従 来 の 技 i
ステロールと脂肪酸とのエステルは、従来より、例えば
コレステリック液晶(特開昭52−24992号公報参
照)や医薬化粧用親水性基材(特開昭52−41215
号公報、特開昭52−79030号公報参照)等として
、各種分野で広く用いられている。
コレステリック液晶(特開昭52−24992号公報参
照)や医薬化粧用親水性基材(特開昭52−41215
号公報、特開昭52−79030号公報参照)等として
、各種分野で広く用いられている。
従来かかるステロール脂肪酸エステルは、専ら有機合成
法により製造されてきている。しかしながら一般に有機
合成法では苛酷な反応条件が採用され、しかも副反応等
が惹起する弊害は避けられず、反応及び引続く目的物の
単離精製に繁雑な操作、工程等を特徴とする特にステ0
−ル類の水酸基はセカンダリ−であり、しかもこれはス
テロイド骨格に近接しているために、通常の脂肪族セカ
ンダリ−アルコールと比較しても反応性が低下しており
、そのためにこれに脂肪酸を反応させ、脂肪酸エステル
を製造する場合、酸触媒を用いて高温で長時間反応させ
るか、脂肪酸を一旦酸無水物、酸ハライド等に変換させ
た後、エステル化反応を行なう必要がある。またステロ
イド骨格の4位に2個のメチル基を持ち、3位に水酸基
を持つトリメチルステロール等を原料とする場合、該化
合物はその4位の2個のメチル基の立体障害のために更
に反応性は低く、酸ハライドとしなければ脂肪酸とのエ
ステル化反応は困難である。しかるに各種用途に有用な
ものとして所望されるステロ−ルエステルは、一般に長
鎖脂肪酸のエステルであり、かかるエステル合成のため
に原料とする長鎖脂肪酸のハライドは、その入手が一般
に困難であり1、通常繁雑な工程を要して別途合成せね
ばならず、非常に高価なものとなる不利がある。加えて
かかる脂肪酸のハライドは、概して湿気により分解し易
く不安定であり、しかも反応時に刺激性、腐蝕性の生成
物を副生ずるおそれがあり、特殊な反応装置等を要する
不利もある。
法により製造されてきている。しかしながら一般に有機
合成法では苛酷な反応条件が採用され、しかも副反応等
が惹起する弊害は避けられず、反応及び引続く目的物の
単離精製に繁雑な操作、工程等を特徴とする特にステ0
−ル類の水酸基はセカンダリ−であり、しかもこれはス
テロイド骨格に近接しているために、通常の脂肪族セカ
ンダリ−アルコールと比較しても反応性が低下しており
、そのためにこれに脂肪酸を反応させ、脂肪酸エステル
を製造する場合、酸触媒を用いて高温で長時間反応させ
るか、脂肪酸を一旦酸無水物、酸ハライド等に変換させ
た後、エステル化反応を行なう必要がある。またステロ
イド骨格の4位に2個のメチル基を持ち、3位に水酸基
を持つトリメチルステロール等を原料とする場合、該化
合物はその4位の2個のメチル基の立体障害のために更
に反応性は低く、酸ハライドとしなければ脂肪酸とのエ
ステル化反応は困難である。しかるに各種用途に有用な
ものとして所望されるステロ−ルエステルは、一般に長
鎖脂肪酸のエステルであり、かかるエステル合成のため
に原料とする長鎖脂肪酸のハライドは、その入手が一般
に困難であり1、通常繁雑な工程を要して別途合成せね
ばならず、非常に高価なものとなる不利がある。加えて
かかる脂肪酸のハライドは、概して湿気により分解し易
く不安定であり、しかも反応時に刺激性、腐蝕性の生成
物を副生ずるおそれがあり、特殊な反応装置等を要する
不利もある。
発明が解決しようとする問題点
本発明者らは上記苛酷な反応条件を要し、高価で且つ不
安定な反応試薬等を必要とする有機合成によることなく
、所望のステロール脂肪酸エステルをより温和な条件下
に有利に収率よく製造できる方法を提供することを目的
として鋭意研究を重ねてきた。その結果、特定の酵素を
利用して上記目的に合致する新しいステロールエステル
類の製造技術を開発するに成功し、ここに本発明を完成
するに至った。
安定な反応試薬等を必要とする有機合成によることなく
、所望のステロール脂肪酸エステルをより温和な条件下
に有利に収率よく製造できる方法を提供することを目的
として鋭意研究を重ねてきた。その結果、特定の酵素を
利用して上記目的に合致する新しいステロールエステル
類の製造技術を開発するに成功し、ここに本発明を完成
するに至った。
を解決するための 段
即ち本発明はリパーゼもしくはコレステロールエステラ
ーゼを用いて、分子内にステロイド骨格及び水酸基を有
する化合物と脂肪酸とを接触反応させることを特徴とす
るステロール脂肪酸エステルの製造方法に係わる。
ーゼを用いて、分子内にステロイド骨格及び水酸基を有
する化合物と脂肪酸とを接触反応させることを特徴とす
るステロール脂肪酸エステルの製造方法に係わる。
本発明方法によれば、酵素作用を利用することによって
、従来の有機合成法に見られるごとき苛酷な反応条件を
採用したり、繁雑な操作等を要して原料を別途合成した
り、特殊な反応装置等を必要とすることなく、非常に温
和な条件下、通常常温常圧下に、容易にしかも収率よく
目的とするステロール脂肪酸エステルを製造でき、その
反応系からの分離精製等も容易に行ない得る。更に本発
明方法では、従来反応性に劣っており収率よく製造する
ことが困難であったエステルも容易に高収率で製造可能
である。
、従来の有機合成法に見られるごとき苛酷な反応条件を
採用したり、繁雑な操作等を要して原料を別途合成した
り、特殊な反応装置等を必要とすることなく、非常に温
和な条件下、通常常温常圧下に、容易にしかも収率よく
目的とするステロール脂肪酸エステルを製造でき、その
反応系からの分離精製等も容易に行ない得る。更に本発
明方法では、従来反応性に劣っており収率よく製造する
ことが困難であったエステルも容易に高収率で製造可能
である。
本発明方法においては、酵素としてリパーゼもしくはコ
レステロールエステラーゼを用いることが重要である。
レステロールエステラーゼを用いることが重要である。
ここでリパーゼとは、トリグリセライドを段階的にグリ
セリンと脂肪酸に加水分解する反応を触媒する酵素であ
り、コレステロールエステラーゼとは、コレステリンと
脂肪酸とのエステル結合を加水分解する酵素である。本
発明者らは、上記リパーゼ及びコレステロールエステラ
ーゼが各種ステロール類と脂肪酸とのエステル合成反応
を触媒することを始めて見出し、この反応を利用してス
テロール脂肪酸エステルを、容易に収率よく且つ工業的
規模で合成するに成功したものである。
セリンと脂肪酸に加水分解する反応を触媒する酵素であ
り、コレステロールエステラーゼとは、コレステリンと
脂肪酸とのエステル結合を加水分解する酵素である。本
発明者らは、上記リパーゼ及びコレステロールエステラ
ーゼが各種ステロール類と脂肪酸とのエステル合成反応
を触媒することを始めて見出し、この反応を利用してス
テロール脂肪酸エステルを、容易に収率よく且つ工業的
規模で合成するに成功したものである。
本発明に用いられる上記リパーゼ及びコレステロールエ
ステラーゼは、その起源に特に制限はなく、各種微生物
、動物、植物起源のいずれでもよい。リパーゼの起源微
生物としては、例えばアクロモバクタ−イオファーガス
(A chromobacter+orurgus)
、アクロモバクタ−リボリテイカム(Achromob
acter Iipolyticum ) 、クロモ
バクテリウム ビスコサム(Chromobacter
iumviscosus) 、コリネバクテリウム ア
クネス(Corynebacterium acne
s ) 、シュードモナスエアルギノーサ(p 5eu
do鳳onas aeruginosa)、シュード
モナス フルオレスセンス (Pseudomonas fluorescens
) 、シュードモナス フライ(Pseudos+o
nas fraai ) 、スタフイOD’/カス
アウレウス(S taphy+ococcusaure
us) 、アスペルギルス ニガー(Aspergil
lus n1aer ) 、キャンディダ シリント
ラシア(Candida cylindracea
) 、7ミコーラ ランギノーサ(Humicora
Ianuainosa)、ペニシリウム 力セイコラ
ム(penicilliumcaseicolul)
、ペニシリウム クルストサム(penicilliu
m crustosum ) 、ベニシリウムシクロ
ビウム(penicilliua+ cyclopi
um ) 、ペニシリウム ロキュフオーテイ(pen
icilliulrOQtleforti) 、t’ル
ロプシス エノビ(Torulopsis erno
bii ) 、バシラス ズブチルレス(Bacill
us 5ubtills) 、アルカリゲネス5D(
AICaliOeneS Sp) 、サーモマイセス
イバダネンシス(Thermouces Ibad
anensis )等を例示できる。
ステラーゼは、その起源に特に制限はなく、各種微生物
、動物、植物起源のいずれでもよい。リパーゼの起源微
生物としては、例えばアクロモバクタ−イオファーガス
(A chromobacter+orurgus)
、アクロモバクタ−リボリテイカム(Achromob
acter Iipolyticum ) 、クロモ
バクテリウム ビスコサム(Chromobacter
iumviscosus) 、コリネバクテリウム ア
クネス(Corynebacterium acne
s ) 、シュードモナスエアルギノーサ(p 5eu
do鳳onas aeruginosa)、シュード
モナス フルオレスセンス (Pseudomonas fluorescens
) 、シュードモナス フライ(Pseudos+o
nas fraai ) 、スタフイOD’/カス
アウレウス(S taphy+ococcusaure
us) 、アスペルギルス ニガー(Aspergil
lus n1aer ) 、キャンディダ シリント
ラシア(Candida cylindracea
) 、7ミコーラ ランギノーサ(Humicora
Ianuainosa)、ペニシリウム 力セイコラ
ム(penicilliumcaseicolul)
、ペニシリウム クルストサム(penicilliu
m crustosum ) 、ベニシリウムシクロ
ビウム(penicilliua+ cyclopi
um ) 、ペニシリウム ロキュフオーテイ(pen
icilliulrOQtleforti) 、t’ル
ロプシス エノビ(Torulopsis erno
bii ) 、バシラス ズブチルレス(Bacill
us 5ubtills) 、アルカリゲネス5D(
AICaliOeneS Sp) 、サーモマイセス
イバダネンシス(Thermouces Ibad
anensis )等を例示できる。
またコレステロールエステラーゼの起源微生物としでは
シュードモナス属、例えばシュードモナス エアルギノ
サ(P seudomonas aeruginos
a)、シュードモナス フルオレスセンス (PSeudOmOnaS fluorescens
) 、シュードモナス ノブエスピー、シュードモナ
ス ディスモリティ力等、アクロモバクタ−属、例えば
アクロモバクタ−デリカチュラス(A chromob
acterdelicatulus )等、フザリウム
属、ノカルジア属、プサイトモナス属、ストレプトミセ
ス戊、キャンデイダ属、例えばキャンディダ リボリテ
イ力、キャンディダ トOとカリス、キャンデイダ イ
ンターメディア、キャンディダ シリントラシア等をそ
れぞれ例示できる。
シュードモナス属、例えばシュードモナス エアルギノ
サ(P seudomonas aeruginos
a)、シュードモナス フルオレスセンス (PSeudOmOnaS fluorescens
) 、シュードモナス ノブエスピー、シュードモナ
ス ディスモリティ力等、アクロモバクタ−属、例えば
アクロモバクタ−デリカチュラス(A chromob
acterdelicatulus )等、フザリウム
属、ノカルジア属、プサイトモナス属、ストレプトミセ
ス戊、キャンデイダ属、例えばキャンディダ リボリテ
イ力、キャンディダ トOとカリス、キャンデイダ イ
ンターメディア、キャンディダ シリントラシア等をそ
れぞれ例示できる。
上記各酵素の大部分は、精製された酵素として市販され
ており、本発明ではこれらの市販品をそのまま用いるこ
とができるが、特にII製された市販品を用いる必要は
なく、例えば目的とする酵素の生産能を有する微生物菌
体そのもの、その培養液、該培養液を処理して得られる
粗酵素液や酵素を含む組成物等を利用することもでき、
また上記各酵素を常法に従い適当な担体等に固定化した
固定化酵素を用いることもできる。
ており、本発明ではこれらの市販品をそのまま用いるこ
とができるが、特にII製された市販品を用いる必要は
なく、例えば目的とする酵素の生産能を有する微生物菌
体そのもの、その培養液、該培養液を処理して得られる
粗酵素液や酵素を含む組成物等を利用することもでき、
また上記各酵素を常法に従い適当な担体等に固定化した
固定化酵素を用いることもできる。
本発明において上記リパーゼ又はコレステロールエステ
ラーゼを用いて合成反応される一方の原料としてのステ
ロール類とは、分子内にステロイド骨格と水酸基とを有
する化合物をいう。ここでステロイド骨格とは、式 で表わされる骨格であり、水酸基は上記骨格に直接結合
しているのが一般的である。本発明に用いられる上記ス
テ0−ル類の具体例としては、例えばコレステロール、
7−デハイドロコレステロール、β−コレスタノール、
コレステロール、ラドステロール、チモステロール、チ
モステノール、デスモスチロール、ブラシカステロール
、エルゴステロール、カンペステロール、β−シトステ
ロール、γ−シトステロール、α−スピナステO−ル、
スティグマステロール、ラノステO−ル、ジヒドaラノ
ステロール、アグノステロール、ジヒドOアグノステロ
ール及び之等の混合物としての羊毛ロウより分離m製し
て得られるイソコレステロール等を例示できる。
ラーゼを用いて合成反応される一方の原料としてのステ
ロール類とは、分子内にステロイド骨格と水酸基とを有
する化合物をいう。ここでステロイド骨格とは、式 で表わされる骨格であり、水酸基は上記骨格に直接結合
しているのが一般的である。本発明に用いられる上記ス
テ0−ル類の具体例としては、例えばコレステロール、
7−デハイドロコレステロール、β−コレスタノール、
コレステロール、ラドステロール、チモステロール、チ
モステノール、デスモスチロール、ブラシカステロール
、エルゴステロール、カンペステロール、β−シトステ
ロール、γ−シトステロール、α−スピナステO−ル、
スティグマステロール、ラノステO−ル、ジヒドaラノ
ステロール、アグノステロール、ジヒドOアグノステロ
ール及び之等の混合物としての羊毛ロウより分離m製し
て得られるイソコレステロール等を例示できる。
本発明において他方の原料とする脂肪酸は、炭素数が2
〜32の飽和もしくは不飽和の脂肪酸のいずれでもよく
、之等は直鎖でも分岐鎖でもよい。
〜32の飽和もしくは不飽和の脂肪酸のいずれでもよく
、之等は直鎖でも分岐鎖でもよい。
飽和の直談脂肪酸としては、例えば酢酸、酪酸、カプロ
ン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチ
ン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキン酸、ベヘ
ン酸、リグノセリン酸、セロチン酸、モンタン酸、メリ
シン酸、n−トドリアコンタン酸等の炭素数が偶数であ
る飽和直鎖脂肪酸、及び例えばプロピオン酸、n−吉草
酸、エナント酸、ペラルゴン酸、ヘンデカン酸、トリデ
カン酸、ペンタデカン酸、ヘプタデカン酸、ノナデカン
酸、ヘンエイコサン酸、トリコサン酸、ベンタフサン酸
、ヘプタコサン酸等の炭素数が奇数である飽和直鎖脂肪
酸を例示できる。
ン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチ
ン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキン酸、ベヘ
ン酸、リグノセリン酸、セロチン酸、モンタン酸、メリ
シン酸、n−トドリアコンタン酸等の炭素数が偶数であ
る飽和直鎖脂肪酸、及び例えばプロピオン酸、n−吉草
酸、エナント酸、ペラルゴン酸、ヘンデカン酸、トリデ
カン酸、ペンタデカン酸、ヘプタデカン酸、ノナデカン
酸、ヘンエイコサン酸、トリコサン酸、ベンタフサン酸
、ヘプタコサン酸等の炭素数が奇数である飽和直鎖脂肪
酸を例示できる。
飽和の分岐鎖脂肪酸としては、例えばイソ酪酸、イソカ
プロン酸、イソカプリル酸、イソカプリン酸、インラウ
リン酸、11−メチル−ドデカン酸、イソミリスチン酸
、13−メチル−テトラデカン酸、イソパルミチン酸、
15−メチル−ヘキサデカン酸、イソステアリン酸、1
7−メチル−オクタデカン酸、イソアラキン酸、19−
メチル−エイコサン酸、α−エチル−ヘキサン酸、α−
ヘキシルデカン酸、α−ヘプチルウンデカン酸、2−デ
シルテトラデカン酸、2−ウンデシルテトラデカン酸、
2−デシルペンタデカン酸、2−ウンデシルペンタデカ
ン酸、式 %式% で表わされるファインオキソコール1801(日産化学
社製〕等を例示できる。また上記飽和の奇数分枝鎖脂肪
酸には、例えば6−メチル−オクタン酸、8−メチル−
デカン酸、10−メチル−ドデカン酸、12−メチル−
テトラデカン酸、14−メチル−ヘキサデカン酸、16
−メチル−オクタデカン酸、18−メチル−エイコサン
酸、20−メチル−トコサン酸、22−メチル−テトラ
コサン酸、24−メチル−ヘキサコサン酸、26−メチ
ル−オクタコサン酸等の末端がイソブチル基であるアン
チイソ系の脂肪酸が包含される。
プロン酸、イソカプリル酸、イソカプリン酸、インラウ
リン酸、11−メチル−ドデカン酸、イソミリスチン酸
、13−メチル−テトラデカン酸、イソパルミチン酸、
15−メチル−ヘキサデカン酸、イソステアリン酸、1
7−メチル−オクタデカン酸、イソアラキン酸、19−
メチル−エイコサン酸、α−エチル−ヘキサン酸、α−
ヘキシルデカン酸、α−ヘプチルウンデカン酸、2−デ
シルテトラデカン酸、2−ウンデシルテトラデカン酸、
2−デシルペンタデカン酸、2−ウンデシルペンタデカ
ン酸、式 %式% で表わされるファインオキソコール1801(日産化学
社製〕等を例示できる。また上記飽和の奇数分枝鎖脂肪
酸には、例えば6−メチル−オクタン酸、8−メチル−
デカン酸、10−メチル−ドデカン酸、12−メチル−
テトラデカン酸、14−メチル−ヘキサデカン酸、16
−メチル−オクタデカン酸、18−メチル−エイコサン
酸、20−メチル−トコサン酸、22−メチル−テトラ
コサン酸、24−メチル−ヘキサコサン酸、26−メチ
ル−オクタコサン酸等の末端がイソブチル基であるアン
チイソ系の脂肪酸が包含される。
不飽和の脂肪酸としては、例えばトウハク酸、カプロレ
イン酸、リンデル酸、ラウロレイン酸、ツヅ酸、フイセ
トレイン酸、ミリストレイン酸、パルミトオレイン酸、
ペトロセリン酸、オレイン酸、エライジン酸、バクセン
酸、カドレイン酸、シス−11−エイコセン酸、セトレ
イン酸、エルカ酸、セラコレイン酸、17−へキサコセ
ン酸、6.9.12.15−へキサデカテトラエン酸、
リノール酸、リルン酸、α−エレオステアリン酸、β−
エレオステアリン酸、ブニカ酸、6,9゜12.15−
オクタデカテトラエン酸、パリナリン酸、アラキドン酸
、5.8.11.14.17−ニイコサペンクエン酸、
7,10.13,16゜19−ドコサペンタエン酸、4
,7.10,13゜16.19−ドコサヘキサエン酸等
を例示できる。
イン酸、リンデル酸、ラウロレイン酸、ツヅ酸、フイセ
トレイン酸、ミリストレイン酸、パルミトオレイン酸、
ペトロセリン酸、オレイン酸、エライジン酸、バクセン
酸、カドレイン酸、シス−11−エイコセン酸、セトレ
イン酸、エルカ酸、セラコレイン酸、17−へキサコセ
ン酸、6.9.12.15−へキサデカテトラエン酸、
リノール酸、リルン酸、α−エレオステアリン酸、β−
エレオステアリン酸、ブニカ酸、6,9゜12.15−
オクタデカテトラエン酸、パリナリン酸、アラキドン酸
、5.8.11.14.17−ニイコサペンクエン酸、
7,10.13,16゜19−ドコサペンタエン酸、4
,7.10,13゜16.19−ドコサヘキサエン酸等
を例示できる。
また本発明に用いられる脂肪酸は、分子内に水酸基を有
するオキシ脂肪酸であってもよい。このオキシ脂肪酸と
しては、例えばα−ヒドロキシラウリル酸、α−ヒドロ
キシミリスチン酸、α−ヒドロキシパルミチン酸、α−
ヒドロキシステアリン酸、ω−とドロキシラウリル酸、
α−ヒドロキシアラキン酸、9−ヒドロキシ−12−オ
クタデセン酸、リシノール酸、α−ヒドロキシベヘニン
酸、9−ヒドロキシ−トランス−10,12−オクタデ
カジエン酸、カモレン酸、イブロリル酸、9.10−ジ
ヒドロキシステアリン酸、12−ヒドロキシステアリン
酸等を例示できる。
するオキシ脂肪酸であってもよい。このオキシ脂肪酸と
しては、例えばα−ヒドロキシラウリル酸、α−ヒドロ
キシミリスチン酸、α−ヒドロキシパルミチン酸、α−
ヒドロキシステアリン酸、ω−とドロキシラウリル酸、
α−ヒドロキシアラキン酸、9−ヒドロキシ−12−オ
クタデセン酸、リシノール酸、α−ヒドロキシベヘニン
酸、9−ヒドロキシ−トランス−10,12−オクタデ
カジエン酸、カモレン酸、イブロリル酸、9.10−ジ
ヒドロキシステアリン酸、12−ヒドロキシステアリン
酸等を例示できる。
更に上記脂肪酸は、例えばシュウ酸、マロン酸、コハク
酸、ゲルタール酸、アジピン酸、ピメリン酸、セベリン
酸、アゼライン酸、セバシン酸、D。
酸、ゲルタール酸、アジピン酸、ピメリン酸、セベリン
酸、アゼライン酸、セバシン酸、D。
し−リンゴ酸等のポリカルボン酸であってもよい。
上記脂肪酸は、その一種を単独で本発明の反応に利用し
てもよく、上記例示の同一群又は異なる群に属する二種
以上を混合して本発明に用いることもできる。二種以上
を併用する場合には、脂肪酸原料として、例えば飽和の
直鎖及び分岐脂肪酸並びにオキシ脂肪酸の混合物である
ラノリン脂肪酸等を有利に用いることができる。
てもよく、上記例示の同一群又は異なる群に属する二種
以上を混合して本発明に用いることもできる。二種以上
を併用する場合には、脂肪酸原料として、例えば飽和の
直鎖及び分岐脂肪酸並びにオキシ脂肪酸の混合物である
ラノリン脂肪酸等を有利に用いることができる。
本発明反応は、上記ステロール類と脂肪酸とを基質とし
て、之等をリパーゼ又はコレステロールエステラーゼの
存在下に接触させることにより進行する。上記接触は、
両基質と酵素の水溶液とを単に混合するのみで行なうこ
とができ、従って反応系は通常水系であるが、他の適当
な有機溶媒、例えばn−ヘキサン、ローへブタン、n−
オクタン、イソオクタン、シクロヘキサン、n−デカン
、n−トリデカン、n−テトラデカン、n−ヘキサデカ
ン、ポリブテン、ジイソブチレン、流動パラフィン、ス
クワラン、スクワレン、プリスタ等の炭化水素系溶媒を
用いた有機溶媒系とすることもできる。かかる有機溶媒
の利用によれば、反応系の物理的性状が改善され、上記
接触がより良好となる場合があり、また得られるエステ
ル類や用いた酵素の反応系からの分離回収がより効率よ
く行える場合がある。また上記混合は反応系をより均一
なものとするため通常撹拌により行なわれるのが望まし
い。反応条件は、用いられる酵素の失活がないかこれが
最小限に抑制される条件であればよく、通常酵素の最適
11H及び最適温度条件が採用される。一般に上記温度
としては、約10〜60℃の範囲が好適である。pHは
、用いる酵素に応じてアルカリ性、中性及び酸性のいず
れかが採用され、このpHを調節するために適当な酸や
アルカリ、例えば塩酸、硫酸等や水酸化ナトリウム、水
酸化カリウム等及び例えばリン酸am液等の適当な緩衝
液を、必要に応じて、反応系内に添加することもできる
。
て、之等をリパーゼ又はコレステロールエステラーゼの
存在下に接触させることにより進行する。上記接触は、
両基質と酵素の水溶液とを単に混合するのみで行なうこ
とができ、従って反応系は通常水系であるが、他の適当
な有機溶媒、例えばn−ヘキサン、ローへブタン、n−
オクタン、イソオクタン、シクロヘキサン、n−デカン
、n−トリデカン、n−テトラデカン、n−ヘキサデカ
ン、ポリブテン、ジイソブチレン、流動パラフィン、ス
クワラン、スクワレン、プリスタ等の炭化水素系溶媒を
用いた有機溶媒系とすることもできる。かかる有機溶媒
の利用によれば、反応系の物理的性状が改善され、上記
接触がより良好となる場合があり、また得られるエステ
ル類や用いた酵素の反応系からの分離回収がより効率よ
く行える場合がある。また上記混合は反応系をより均一
なものとするため通常撹拌により行なわれるのが望まし
い。反応条件は、用いられる酵素の失活がないかこれが
最小限に抑制される条件であればよく、通常酵素の最適
11H及び最適温度条件が採用される。一般に上記温度
としては、約10〜60℃の範囲が好適である。pHは
、用いる酵素に応じてアルカリ性、中性及び酸性のいず
れかが採用され、このpHを調節するために適当な酸や
アルカリ、例えば塩酸、硫酸等や水酸化ナトリウム、水
酸化カリウム等及び例えばリン酸am液等の適当な緩衝
液を、必要に応じて、反応系内に添加することもできる
。
また上記反応系内には、両基質と酵素との接触性を高め
るために、例えば「ツイーン80」 (正正アトラス社
製)、[トリトンX−1004(ローム アンド ハー
ス社製)等の酵素阻害のない適当な界面活性剤等を加え
ることもできる。更に用いる酵素の賦活因子として知ら
れている例えばカゼイン、アルブミン、カルシウムイオ
ン、胆汁酸及びその塩等を添加することもできる。
るために、例えば「ツイーン80」 (正正アトラス社
製)、[トリトンX−1004(ローム アンド ハー
ス社製)等の酵素阻害のない適当な界面活性剤等を加え
ることもできる。更に用いる酵素の賦活因子として知ら
れている例えばカゼイン、アルブミン、カルシウムイオ
ン、胆汁酸及びその塩等を添加することもできる。
反応系内に存在させる酵素及び両基質の比率は、それら
の種類、反応条件等に応じて適宜選択され特に制限はな
いが、通常酵素は原料ステロール10当り、リパーゼに
ついては、約1〜10万単位、好ましくは5000〜5
万単位程度、コレステロールエステラーゼについては約
1〜10万単位、好ましくは500〜5万単位程度とす
るのがよい。
の種類、反応条件等に応じて適宜選択され特に制限はな
いが、通常酵素は原料ステロール10当り、リパーゼに
ついては、約1〜10万単位、好ましくは5000〜5
万単位程度、コレステロールエステラーゼについては約
1〜10万単位、好ましくは500〜5万単位程度とす
るのがよい。
両基質の使用比率も任意に決定でき、特に制限はないが
、通常ステロールに対して脂肪酸を約1〜20倍モル量
、好ましくは約3〜6倍モル農用いるのがよい。反応は
水媒系でも有機溶媒系でも行なうことができるが、反応
系内には、原料ステロール1gに対して少なくとも約0
.1112、通常的1−以上の水が存在することが好ま
しい。一般に水媒系ではステロールに対して水を約5〜
500倍重量用いるのがよく、これにより反応は有利に
進行する。また有機溶媒系を採用する場合、溶媒の使用
量は、該溶媒の種類によっても若干異なるが、例えばイ
ソオクタンでは、通常イソオクタン/水が約o、ooi
〜100重量比、好ましくは0.01〜10重量比とな
る範囲で使用され、この場合も全溶媒(有様溶媒+水)
の使用量はステロールに対して約5〜500倍重量とす
るのが望ましい。他の有機溶媒も上記イソオクタンと略
々同様の範囲で用いることができる。
、通常ステロールに対して脂肪酸を約1〜20倍モル量
、好ましくは約3〜6倍モル農用いるのがよい。反応は
水媒系でも有機溶媒系でも行なうことができるが、反応
系内には、原料ステロール1gに対して少なくとも約0
.1112、通常的1−以上の水が存在することが好ま
しい。一般に水媒系ではステロールに対して水を約5〜
500倍重量用いるのがよく、これにより反応は有利に
進行する。また有機溶媒系を採用する場合、溶媒の使用
量は、該溶媒の種類によっても若干異なるが、例えばイ
ソオクタンでは、通常イソオクタン/水が約o、ooi
〜100重量比、好ましくは0.01〜10重量比とな
る範囲で使用され、この場合も全溶媒(有様溶媒+水)
の使用量はステロールに対して約5〜500倍重量とす
るのが望ましい。他の有機溶媒も上記イソオクタンと略
々同様の範囲で用いることができる。
本発明反応は、反応条件、用いられる酵素の種類、使用
量、基質の種類、使用比率等により異なるが、通常約3
0分〜120時間で終了する。
量、基質の種類、使用比率等により異なるが、通常約3
0分〜120時間で終了する。
本発明では上記反応終了後、目的物を常法に従い反応系
より分離し、必要により精製する。反応系からの目的物
の単離精製操作としては、例えば反応液をエーテル等の
適当な溶剤を用いて抽出し、未反応の脂肪WI原料をア
ルカリ脱酸により除去し、溶剤層を脱水乾燥した後、溶
剤を除去する方法を例示できる。かくして得られる粗ス
テロール脂肪酸エステルのm製は、常法に従い例えばカ
ラムクロマトグラフィー等により行ない得る。
より分離し、必要により精製する。反応系からの目的物
の単離精製操作としては、例えば反応液をエーテル等の
適当な溶剤を用いて抽出し、未反応の脂肪WI原料をア
ルカリ脱酸により除去し、溶剤層を脱水乾燥した後、溶
剤を除去する方法を例示できる。かくして得られる粗ス
テロール脂肪酸エステルのm製は、常法に従い例えばカ
ラムクロマトグラフィー等により行ない得る。
かくして得られるステロール脂肪酸エステル、は、この
種ステロール脂肪酸エステルが従来利用されている各種
の広範な用途に利用できる。
種ステロール脂肪酸エステルが従来利用されている各種
の広範な用途に利用できる。
衷−mmよ
以下、本発明を更に詳しく説明するため実験例及び実施
例を挙げる。
例を挙げる。
尚、各側において酵素量の表示は、以下に示す方法によ
り求められた国際単位を用いた。
り求められた国際単位を用いた。
くリパーゼの活性測定〉
ポリビニルアルコールの溶液(「ポバール#117J(
倉敷レーヨン社製)18gと[ポバール#205J (
同上社製)2gとを水80〇−に懸濁し、75〜80℃
に加温撹拌して完全に溶かした後、冷即し、これに水を
加えて1000mとしたもの)75−に、オリーブ油2
2.9りをホモジナイザーにて乳化して!!製したオリ
ーブ油乳化液5舗とO,IMリンWI榎衝液4−との混
液に、試料酵素液1鵬を加え、マグネチツクスタラーで
500 rpmで撹拌しつつ37℃で20分間反応させ
、次いでこれにエチルアルコール40−を注加して、0
.05M水酸化カリウム溶液で遊離脂肪酸を滴定する。
倉敷レーヨン社製)18gと[ポバール#205J (
同上社製)2gとを水80〇−に懸濁し、75〜80℃
に加温撹拌して完全に溶かした後、冷即し、これに水を
加えて1000mとしたもの)75−に、オリーブ油2
2.9りをホモジナイザーにて乳化して!!製したオリ
ーブ油乳化液5舗とO,IMリンWI榎衝液4−との混
液に、試料酵素液1鵬を加え、マグネチツクスタラーで
500 rpmで撹拌しつつ37℃で20分間反応させ
、次いでこれにエチルアルコール40−を注加して、0
.05M水酸化カリウム溶液で遊離脂肪酸を滴定する。
この条件で1分間に1μモル当量の脂肪酸を遊離する酵
素量を1rB際単位(tJ)とする。
素量を1rB際単位(tJ)とする。
くコレステロールエステラーゼの活性測定〉コレステロ
ールエステラーゼの1単位(1U)とは、子牛血清を基
質として37℃で1分間に1μモルのコレステロールを
遊離させる活性であり、以下の反応液、酵素溶液を用い
て遊離コレステロールをコレステロールオキシダーゼで
酸化し、生成する過酸化水素をパーオキシダーゼで比色
定lすることにより求められる。
ールエステラーゼの1単位(1U)とは、子牛血清を基
質として37℃で1分間に1μモルのコレステロールを
遊離させる活性であり、以下の反応液、酵素溶液を用い
て遊離コレステロールをコレステロールオキシダーゼで
酸化し、生成する過酸化水素をパーオキシダーゼで比色
定lすることにより求められる。
反応液組成
00.2Mリン酸緩衝液(1) 86.5) 0.6
+++GOパーオキシダーゼ〔シグマケミカル 社製、タイプI[NO,P−8250:l 0.
3II1200.35%4−アミノアンチピリン 水溶液 0.311Go0
.2w/w%フェノール水溶液 0.311120コ
レステロールオキシダーゼ水溶液 〔東洋醸造社製、プロダクトN O,T −04を0.
1Mリン酸緩衝液(pH7,0,0,05w/v%のト
リトンX−100を含む)で10U/−とする〕
0.6鵬0子牛血清〔グランド アイランド バイオロシカ/L、(USA)社製) 0.3m1
20蒸−留 水
0.3−試料酵素溶液としては、酵素をIOIMリン酸
!l衝液(pH7,5,0,1%アルブミンを含む)に
溶かして約1U/−に調製して用いる。上記反応液31
!Illを比色用セルに入れ、37℃で10分間インキ
ュベートし、0.05−の試料酵素溶液を加え、静かに
転lI混合し、493 rvで経時測定を行ない、吸収
の増加率(ΔAS/分)を測定する。
+++GOパーオキシダーゼ〔シグマケミカル 社製、タイプI[NO,P−8250:l 0.
3II1200.35%4−アミノアンチピリン 水溶液 0.311Go0
.2w/w%フェノール水溶液 0.311120コ
レステロールオキシダーゼ水溶液 〔東洋醸造社製、プロダクトN O,T −04を0.
1Mリン酸緩衝液(pH7,0,0,05w/v%のト
リトンX−100を含む)で10U/−とする〕
0.6鵬0子牛血清〔グランド アイランド バイオロシカ/L、(USA)社製) 0.3m1
20蒸−留 水
0.3−試料酵素溶液としては、酵素をIOIMリン酸
!l衝液(pH7,5,0,1%アルブミンを含む)に
溶かして約1U/−に調製して用いる。上記反応液31
!Illを比色用セルに入れ、37℃で10分間インキ
ュベートし、0.05−の試料酵素溶液を加え、静かに
転lI混合し、493 rvで経時測定を行ない、吸収
の増加率(ΔAS/分)を測定する。
同じことを試料酵素溶液の代りに、希釈用緩衝液を用い
て行ない増加率(ΔAb/分)を求める。
て行ない増加率(ΔAb/分)を求める。
上記吸収増加率の差(ΔA/分−ΔAs−ΔAb>が0
.05以下の時は、これが0.05以上になるまで試料
酵素溶液の濃度を高くして操作を繰返す。酵素活性(U
/l1l(If)は、次式により算出される。
.05以下の時は、これが0.05以上になるまで試料
酵素溶液の濃度を高くして操作を繰返す。酵素活性(U
/l1l(If)は、次式により算出される。
酵素活性(U/Il+(1)−
また目的エステルの合成率は、次の方法により算出した
。即ち、反応終了後、反応液を酸性とし、ジエチルエー
テルにて4回抽出し、水洗後、脱水乾燥してジエチルエ
ーテルを留去し、全脂買弁を得、これに既知量の内部標
準物質(n−トドリアコンタン)を加えて定l用試料と
する。この試料をクロマロッド(石英ロッドにシリカゲ
ルを溶着したもの、ヤトロン社製、クロマロッドSn)
にチャージし、展開して、イアトロスキャンTH−10
(ヤトロン社製)及びFID(水素炎イオン化方式)検
出器にかけて、合成されたエステルの量を求め、これを
反応液の仕込み量より算出されるステロール基準の理論
合成エステル量で除して合成率とする。
。即ち、反応終了後、反応液を酸性とし、ジエチルエー
テルにて4回抽出し、水洗後、脱水乾燥してジエチルエ
ーテルを留去し、全脂買弁を得、これに既知量の内部標
準物質(n−トドリアコンタン)を加えて定l用試料と
する。この試料をクロマロッド(石英ロッドにシリカゲ
ルを溶着したもの、ヤトロン社製、クロマロッドSn)
にチャージし、展開して、イアトロスキャンTH−10
(ヤトロン社製)及びFID(水素炎イオン化方式)検
出器にかけて、合成されたエステルの量を求め、これを
反応液の仕込み量より算出されるステロール基準の理論
合成エステル量で除して合成率とする。
各実験例では、特に断わらない限り、反応液の撹拌混合
は、20 wax 300 C1)lの試験管振盪培!
l1l(いわしや生物科学社製、RMR−3−20)に
て行なった。また実験例1〜8では、酵素としてキャン
ディダ シリントラシア(Candidacylind
racea )由来のリパーゼ(「リパーゼMYJ名糖
産業社製)を用いた。他の例では各個毎に示す。
は、20 wax 300 C1)lの試験管振盪培!
l1l(いわしや生物科学社製、RMR−3−20)に
て行なった。また実験例1〜8では、酵素としてキャン
ディダ シリントラシア(Candidacylind
racea )由来のリパーゼ(「リパーゼMYJ名糖
産業社製)を用いた。他の例では各個毎に示す。
実験例1
この例は、エステル合成率と基質量の関係を明らかにす
るものであり、ステロール類としてコレステロールを用
い、その一定量(0,1+11 )に対して脂肪酸とし
てのオレイン酸を種々変化させさせた量で用い、一定濃
度のリパーゼ0.5mQ(500U)の存在下に、両者
を、37℃で18時間撹拌混合して反応させた。結果を
下記第1表に示す。
るものであり、ステロール類としてコレステロールを用
い、その一定量(0,1+11 )に対して脂肪酸とし
てのオレイン酸を種々変化させさせた量で用い、一定濃
度のリパーゼ0.5mQ(500U)の存在下に、両者
を、37℃で18時間撹拌混合して反応させた。結果を
下記第1表に示す。
第 1 表
試験例 オレイン酸量 エステル合成率No、
(g) (%)1 0.07
58.5 2 0.1 77.9 3 0.15 83.0 4 0.22 87.7 5 0.29 88.6 6 0.37 89.7 7 0.44 91.8 8 0.66 92.0 上記第1表より、コレステロール1重量に対してオレイ
ン酸を約1〜6倍重量用いることにより、はぼ80%以
上の合成率をもって目的とするコレステロールのオレイ
ン酸エステルを合成できることが判る。またオレイン酸
を2〜6倍重!(3〜9倍モル)を用いる場合に速やか
に、最も高い合成率をもって目的エステルが合成できる
ことが判る。
(g) (%)1 0.07
58.5 2 0.1 77.9 3 0.15 83.0 4 0.22 87.7 5 0.29 88.6 6 0.37 89.7 7 0.44 91.8 8 0.66 92.0 上記第1表より、コレステロール1重量に対してオレイ
ン酸を約1〜6倍重量用いることにより、はぼ80%以
上の合成率をもって目的とするコレステロールのオレイ
ン酸エステルを合成できることが判る。またオレイン酸
を2〜6倍重!(3〜9倍モル)を用いる場合に速やか
に、最も高い合成率をもって目的エステルが合成できる
ことが判る。
実験例2
この例は、反応系の水量が目的エステルの合成率にいか
なる影響を与えるかを調べるために行なったものである
。実験は、コレステロール0.1Ω及びオレイン酸0.
22gを用いて、これにリパーゼ0.5鵬(500U)
を作用させる時、水0.5−11.0nIi2.2.0
IQ、4.Qml及び6.0−を添加してそれぞれ反応
させることにより行なった。各反応による合成率を求め
た結果を下記第2表に示す。
なる影響を与えるかを調べるために行なったものである
。実験は、コレステロール0.1Ω及びオレイン酸0.
22gを用いて、これにリパーゼ0.5鵬(500U)
を作用させる時、水0.5−11.0nIi2.2.0
IQ、4.Qml及び6.0−を添加してそれぞれ反応
させることにより行なった。各反応による合成率を求め
た結果を下記第2表に示す。
第 2 表
試験例 水 量 エステル合成率NO9(絨)
(%) 1 0 87.5 2 0.5 97.6 3 1.0 97.4 4 2.0 98.2 5 4.0 97.4 6 6.0 96.9 上記第2表より、水の添加lは約1〜3mQ(コレステ
ロールに対して約10〜3ome倍)とするのが好まし
いことが判る。
(%) 1 0 87.5 2 0.5 97.6 3 1.0 97.4 4 2.0 98.2 5 4.0 97.4 6 6.0 96.9 上記第2表より、水の添加lは約1〜3mQ(コレステ
ロールに対して約10〜3ome倍)とするのが好まし
いことが判る。
実験例3
この例は、反応系を有ti溶媒系とした場合のエステル
合成率を求めたものである。実験は、実験例2において
水の代りに、水で飽和させたイソオクタン、n−オクタ
ン又はn−ヘキサンのそれぞれ所定量を用いて、同様に
した。結果を下記第3表に示す。
合成率を求めたものである。実験は、実験例2において
水の代りに、水で飽和させたイソオクタン、n−オクタ
ン又はn−ヘキサンのそれぞれ所定量を用いて、同様に
した。結果を下記第3表に示す。
第 3 表
2 インオクタン (1) 96.23
(2> 96.74 〃
(4) 91.45 (6
) 83.46 (8)
78.87 #(1067,6゛ 延11NO= 媒 Wl12
金」1mニー8 0−オクタン (1) 8
3.59 <2)
78.110 (4)
29.811
(6) 13.912
(8) 8.513
(10) 7.714 n−
ヘキサン (1) 76.415
(2) 68.816
(4) 29.617
(6) 11
.018 (8)
9.519 〃 (106
,6第3表より、上記系ではイソオクタンが最も酵素の
失活が少ないことが判る。該イソオクタンは、0.5〜
3WfJの添加により目的とするエステルの合成率を顕
著に向上できた。
(2> 96.74 〃
(4) 91.45 (6
) 83.46 (8)
78.87 #(1067,6゛ 延11NO= 媒 Wl12
金」1mニー8 0−オクタン (1) 8
3.59 <2)
78.110 (4)
29.811
(6) 13.912
(8) 8.513
(10) 7.714 n−
ヘキサン (1) 76.415
(2) 68.816
(4) 29.617
(6) 11
.018 (8)
9.519 〃 (106
,6第3表より、上記系ではイソオクタンが最も酵素の
失活が少ないことが判る。該イソオクタンは、0.5〜
3WfJの添加により目的とするエステルの合成率を顕
著に向上できた。
実験例4
この例は、水とイソオクタンとの系での目的エステルの
合成率を調べたものであり、実験例2に示した反応系に
イソオクタン2.0IQを加え、これに更に水の所定温
を添加して、同条件下に反応を繰返した。結果を下記第
4表に示す。
合成率を調べたものであり、実験例2に示した反応系に
イソオクタン2.0IQを加え、これに更に水の所定温
を添加して、同条件下に反応を繰返した。結果を下記第
4表に示す。
第 4 表
試験No、 水の添加量 金」&」L」!翫」−1
0(無添加’) 73.0 2 1 92、7 3 2 94、6 4 4 96、6 5 6 96、8 6 7 96、5 7 8 97.5 8 9 94、9 9 10 95、5 実験例5 この例は実験例4と同様に水とインオクタンとの混合溶
媒系での反応において水の量を2.0IQに固定し、イ
ソオクタンの添加量を変化させたときの目的エステルの
合成率の変化を調べたものである。条件は実験例4に同
じである。結果を下記第5表に示す。
0(無添加’) 73.0 2 1 92、7 3 2 94、6 4 4 96、6 5 6 96、8 6 7 96、5 7 8 97.5 8 9 94、9 9 10 95、5 実験例5 この例は実験例4と同様に水とインオクタンとの混合溶
媒系での反応において水の量を2.0IQに固定し、イ
ソオクタンの添加量を変化させたときの目的エステルの
合成率の変化を調べたものである。条件は実験例4に同
じである。結果を下記第5表に示す。
第 5 表
11又L イソオクタン添加量 合成率(%)1 0
(無添加) 87.92 0、5
94.93 1.0 95.1
4 1、5 96.45 3、
0 94.06 4、0
90.47 6、0 83.48
8、0 71.5第5表より、水2IQ
とイソオクタン0.5〜3.0m(ステロールの5〜3
0倍)との併用が合成率を顕著に向上させることが判る
。
(無添加) 87.92 0、5
94.93 1.0 95.1
4 1、5 96.45 3、
0 94.06 4、0
90.47 6、0 83.48
8、0 71.5第5表より、水2IQ
とイソオクタン0.5〜3.0m(ステロールの5〜3
0倍)との併用が合成率を顕著に向上させることが判る
。
実験例に
の例は、脂肪酸が固体の場合に有機溶媒を用いた系での
反応と水系での反応とを対比したちのである。条件は実
験例1と同様とした。但し有機溶媒系の反応の場合は、
反応液に更にn−オクタン2.0112及び水7.51
11Gを加え、水系の反応の場合は水2.01112を
加えた。固体の脂肪酸としてはバルミチン酸及びステア
リン酸を用いた。結果を第6表に示す。第6表には参考
のため常温液状のオレイン酸を用いた場合の結果を併記
する。
反応と水系での反応とを対比したちのである。条件は実
験例1と同様とした。但し有機溶媒系の反応の場合は、
反応液に更にn−オクタン2.0112及び水7.51
11Gを加え、水系の反応の場合は水2.01112を
加えた。固体の脂肪酸としてはバルミチン酸及びステア
リン酸を用いた。結果を第6表に示す。第6表には参考
のため常温液状のオレイン酸を用いた場合の結果を併記
する。
第 6 表
1 パルミチン酸 99.0 91.62 ステア
リン酸 98.5 51.63 オレイン?m
96.5 91.6上記第6表より、特にステアリン酸
の場合には、有機溶媒の使用が合成率向上に顕著な効果
を発揮することが判る。
リン酸 98.5 51.63 オレイン?m
96.5 91.6上記第6表より、特にステアリン酸
の場合には、有機溶媒の使用が合成率向上に顕著な効果
を発揮することが判る。
実験例7
この例は、コレステロール0.1g、オレイン酸0.2
2a、n−オクタン2.0−及び水8.0−の反応液系
内に、種々の濃度のリパーゼ溶液0.5!112を加え
、酵素の濃度とエステル合成率との関係を求めたもので
ある。反応条件は実験例1と同じく37℃、20ux3
00cpm 、18時間)である。結果を第1図に示す
。第1図は、縦軸にエステル合成率(%)を、横軸に酵
素単位(国際単位、U)をとり、各酵素単位で酵素を利
用した時の合成率をプロットしたものである。
2a、n−オクタン2.0−及び水8.0−の反応液系
内に、種々の濃度のリパーゼ溶液0.5!112を加え
、酵素の濃度とエステル合成率との関係を求めたもので
ある。反応条件は実験例1と同じく37℃、20ux3
00cpm 、18時間)である。結果を第1図に示す
。第1図は、縦軸にエステル合成率(%)を、横軸に酵
素単位(国際単位、U)をとり、各酵素単位で酵素を利
用した時の合成率をプロットしたものである。
第1図より、コレステロール1gに対して、約5000
Uの酵素があれば、反応は速やかに進行し、高収率で目
的エステルの合成が行ない得ることが判る。
Uの酵素があれば、反応は速やかに進行し、高収率で目
的エステルの合成が行ない得ることが判る。
実験例8
この例は、実験例7において、18時間の反応で約30
〜40%の合成率を示す醇素量(約100LJ)のリパ
ーゼを用いた場合、作用時間を更に延長してその反応時
間とエステル合成率との関連を求めたものである。
〜40%の合成率を示す醇素量(約100LJ)のリパ
ーゼを用いた場合、作用時間を更に延長してその反応時
間とエステル合成率との関連を求めたものである。
結果を下記第7表に示す。
第 7 表
実JIINo0反応時間(hr、) 合成率(%)1
16 45.6 2 24 57、7 3 40 65、8 4 48 70、0 5 64 74、4 6 72 74、9 7 96 78、0 8 120 79.8 第7表より、酵素を100U用いる場合でも、反応時間
を120時間に延長すると、目的エステルの合成率を約
80%にできることが判る。
16 45.6 2 24 57、7 3 40 65、8 4 48 70、0 5 64 74、4 6 72 74、9 7 96 78、0 8 120 79.8 第7表より、酵素を100U用いる場合でも、反応時間
を120時間に延長すると、目的エステルの合成率を約
80%にできることが判る。
実験例9
第8表に示すステロール類(使用10.io )、脂肪
酸及び酵素のそれぞれ所定量を用い、同表に示す反応系
(水及び有機溶媒)を採用して、実験例1と同様にして
目的エステルを合成し、その合成率を調べた。結果を第
8表に併記する。
酸及び酵素のそれぞれ所定量を用い、同表に示す反応系
(水及び有機溶媒)を採用して、実験例1と同様にして
目的エステルを合成し、その合成率を調べた。結果を第
8表に併記する。
但し、第8表中ステロール類、脂肪酸、酵素及び有機溶
媒における記号は次のものを示す。
媒における記号は次のものを示す。
くステロール類〉
A−1・・・・・・コレステロール
A−2・・・・・・β−シトステロールA−3・・・・
・・スティグマステロールA−4・・・・・・β−コレ
スタノールA−5・・・・・・エルゴステロール A−6・・・・・・イソコレステロール〈脂 肪
酸〉 B−1・・・・・・オレイン酸 8−2・・・・・・バルミチン酸 B−3・・・・・・ステアリン酸 B−4・・・・・・リノール酸 B−5・・・・・・α−ヒトOキシバルミチン酸8−6
・・・・・・ラノリン脂肪酸 く醇 素〉 E−1・・・・・・リパーゼMY(名糖産業社製、キャ
ンディダ シリントラシア由来) E−2・・・・・・リパーゼT−01(東洋醸造社製、
クロモバクテリウム ビスコサム由来) E−3・・・・・・リパーゼ「アマノJA(大野製薬社
製、アスベリギルス属由来) E−4・・・・・・リパーゼ[アマノJP(同上社製、
シュードモナス属由来) E−5・・・・・・コレステロールエステラーゼT−1
8(東洋醸造社製) E−6・・・・・・コレステロールエステラーゼ(キャ
ンディダ シリントラシア由来) く有機宕媒〉 S−1・・・・・・n−オクタン S−2・・・・・・イソオクタン 第 8 表 試験 ステ 脂 肪 酸 水 有機
溶媒 合成率No、酵 素(U)O−(対ステロ
(舗) (1110) (%)ル −
ル、モル) 1 E−1(5(X)) A−I B−1(3)
8 S−1(2> 96.52 E−1(5
00) A−2B−1(3) 8 S−1(2)
95.53 E−1(500) A−3B−1
(3) 8 8−1 (2) 69.04 E
−1(500) A−4B−1(3) 8 S−
1(2) 92.85 E−1(500) A
−5B−1(3) 8 S−1(2) 55
.06 E−1(500) A−6B−1(1,4
) OS−2(4,3> 70.47 E−1(
500) A−I B−1(3) 8 3−1
(2) 96.58 E−1(500) A−
I B−2(3) 8 S−1(2) 99.
09 E−1(500) A−I B−3(3)
8 S−1(2) 98.510 6−1(5
00) A−I B−4(3) 8 S−1(
2) 96.511 2−1(500) A−I
B−5(3) 8 S−1(2) 35.01
2 2−2(1000) A−I B−6(3)
2 − (0) 55.013 E−2(10
00) A−I B−1(3) 8 S−2(
2) 85.314 E−3(1000) A−
I B−1(3) 2 8−2(0,5) 55
.215 6−4(1000) A−I B−1(
3) 8 8−2 (2) 52.416 E
−5(500) A−I B−1(3) 8
S−1(2) 97.717 6−5(500)
A−2B−1(3) 8 S−1(2) 88.
318 6−6(500) A−I B−1(3)
8 S−2(2) 95.0実施例1 コレステロール10Q、オレイン!122g、イソオク
タン50mG、リパーゼMY(名糖産業社製)5011
111 (50000LJ)を含む反応液を、20Or
pmの速度で撹拌しながら、37℃で18時間反応させ
た。この反応液にエーテルを加え、重曹水で洗浄しなが
ら水層を除去し、この処理を数回繰返した後、エーテル
層を無水1a酸ナトリウムで脱水乾燥した。次いでエー
テルを留去し、白色半透明の粗コレステロールオレイン
酸エステルを得た。
・・スティグマステロールA−4・・・・・・β−コレ
スタノールA−5・・・・・・エルゴステロール A−6・・・・・・イソコレステロール〈脂 肪
酸〉 B−1・・・・・・オレイン酸 8−2・・・・・・バルミチン酸 B−3・・・・・・ステアリン酸 B−4・・・・・・リノール酸 B−5・・・・・・α−ヒトOキシバルミチン酸8−6
・・・・・・ラノリン脂肪酸 く醇 素〉 E−1・・・・・・リパーゼMY(名糖産業社製、キャ
ンディダ シリントラシア由来) E−2・・・・・・リパーゼT−01(東洋醸造社製、
クロモバクテリウム ビスコサム由来) E−3・・・・・・リパーゼ「アマノJA(大野製薬社
製、アスベリギルス属由来) E−4・・・・・・リパーゼ[アマノJP(同上社製、
シュードモナス属由来) E−5・・・・・・コレステロールエステラーゼT−1
8(東洋醸造社製) E−6・・・・・・コレステロールエステラーゼ(キャ
ンディダ シリントラシア由来) く有機宕媒〉 S−1・・・・・・n−オクタン S−2・・・・・・イソオクタン 第 8 表 試験 ステ 脂 肪 酸 水 有機
溶媒 合成率No、酵 素(U)O−(対ステロ
(舗) (1110) (%)ル −
ル、モル) 1 E−1(5(X)) A−I B−1(3)
8 S−1(2> 96.52 E−1(5
00) A−2B−1(3) 8 S−1(2)
95.53 E−1(500) A−3B−1
(3) 8 8−1 (2) 69.04 E
−1(500) A−4B−1(3) 8 S−
1(2) 92.85 E−1(500) A
−5B−1(3) 8 S−1(2) 55
.06 E−1(500) A−6B−1(1,4
) OS−2(4,3> 70.47 E−1(
500) A−I B−1(3) 8 3−1
(2) 96.58 E−1(500) A−
I B−2(3) 8 S−1(2) 99.
09 E−1(500) A−I B−3(3)
8 S−1(2) 98.510 6−1(5
00) A−I B−4(3) 8 S−1(
2) 96.511 2−1(500) A−I
B−5(3) 8 S−1(2) 35.01
2 2−2(1000) A−I B−6(3)
2 − (0) 55.013 E−2(10
00) A−I B−1(3) 8 S−2(
2) 85.314 E−3(1000) A−
I B−1(3) 2 8−2(0,5) 55
.215 6−4(1000) A−I B−1(
3) 8 8−2 (2) 52.416 E
−5(500) A−I B−1(3) 8
S−1(2) 97.717 6−5(500)
A−2B−1(3) 8 S−1(2) 88.
318 6−6(500) A−I B−1(3)
8 S−2(2) 95.0実施例1 コレステロール10Q、オレイン!122g、イソオク
タン50mG、リパーゼMY(名糖産業社製)5011
111 (50000LJ)を含む反応液を、20Or
pmの速度で撹拌しながら、37℃で18時間反応させ
た。この反応液にエーテルを加え、重曹水で洗浄しなが
ら水層を除去し、この処理を数回繰返した後、エーテル
層を無水1a酸ナトリウムで脱水乾燥した。次いでエー
テルを留去し、白色半透明の粗コレステロールオレイン
酸エステルを得た。
この粗コレステロールオレイン酸エステルの純度は96
.3%であり、収量は16.0(J(収率95.0%)
であった。
.3%であり、収量は16.0(J(収率95.0%)
であった。
上記で得た粗生成物6gをシリカゲルカラムクロマトグ
ラフィー(ワコーゲルC200、和光純薬社製、160
(1)にチャージし、ベンゼン2000m12で溶出し
て、コレステロールオレイン酸エステル5.3gを得た
。このものの赤外線吸収スペクトル(IRE、融点、薄
層クロマトグラフィー(TLC)上での発色、Rf値は
、標準品のコレステロールオレイン酸エステルのそれと
完全に一致した。
ラフィー(ワコーゲルC200、和光純薬社製、160
(1)にチャージし、ベンゼン2000m12で溶出し
て、コレステロールオレイン酸エステル5.3gを得た
。このものの赤外線吸収スペクトル(IRE、融点、薄
層クロマトグラフィー(TLC)上での発色、Rf値は
、標準品のコレステロールオレイン酸エステルのそれと
完全に一致した。
第1図は、酵素の使用量と目的エステルの合成率との関
係を示すグラフである。 (以 上) 代理人 弁理士 三 枝 英 二 ・i、、::H1
′ −1・ 手続補正書(自制 昭和60年8月9日 1 事件の表示 昭和60年特許願第45128号 2 発明の名称 ステロール脂肪酸エステルの製造方法 3 補正をする者 事件との関係 特許出願人 古川製油株式会社 4代理人 大阪市東区平野町2の10 沢の鶴ビル(6521)弁
理士 三枝英二 5 補正命令の日付 自発 6 補正の対象 明細書中「発明の詳細な説明」の項 7 補正の内容 別紙添付の通り 補正の内容 ]) 明細書第6真下から第3行に「等を」とあるを次
の通り訂正する。 「等のアクロモバクタ−属、クロ七バクテリウム属、コ
リネバクテリウム属、シュード−しナス属、スタフィロ
コッカス属、アスペルギルス属、キャンデイダ属、フミ
]−ラ属、ペニシリウム居、トルロプシス属、パシラス
屈、アルカリ土類金属、サーモマイセス属等に属する各
種微生物」 2) 明細書第8頁第4行に「合成反応」とあるを「合
成」と訂正する。 3) 明細書第9頁第2行に「スティグマステロール、
」とあるを「スティグマステロール等、トリメチルステ
ロールとして」と訂正する。 4) 明細書第9頁第6行に「ロール等」とあるを「ロ
ール、シクロアルテノール等」と訂正する。 5) 明細円筒13真下から第3行に「プリスタ」とあ
るを「プリスタン」と訂正する。 6〉 明細書第14頁第10行に「好適である。」とあ
るを次の通り訂正する。 [好適であるが、耐熱性リパーゼ等を用いる場合には、
該酵素に応じてより高温を採用することもできる。] 7) 明細書第14真下から第1行に「等の」とあるを
1等の非イオン系界面活性剤等の」と訂正する。 8) 明細書第15頁第12行に「決定でき、」とある
を「決定でき、いずれを過剰としてもよく」と訂正する
。 9) 明細書第20頁下から第5行に「社製)及びFI
D(水素」とあるを「社製、FID水素」と訂正する。 10) 明細書第20頁下から第2行に「ステロール
基準の」とあるを削除する。 11) 明細書第21真下から第4行に「リパーゼ」と
あるを1リパーゼ水溶液」と訂正する。 12) 明細書第23頁第8行に「反応」とあるを「反
応(条件は実施例1に同じ。)」と訂正する。 13) 明到書第33頁に記載の第8表中、「試験NO
,18Jの項の後に下記「試験No、19」及び[試験
NO,20jを追加補充する。 r19 E−3(1000) A−6B−1(3)
8 S−2(2) 63.020 E−1(1
000) A−4B−3(3) 8 S−2(2)
99.2J14) 明細書第34頁第1行に「実施
例1」と必るを次の通り訂正する。 「実験例10 コレステロール0.1c+に対して、37°Cにて、第
9表に示す脂肪酸(対ステロール3モル)及び酵素(1
000U)をそれぞれ用い、イソオクタン10.05M
リン酸バッファD)H7)=3m12/7mf2の反応
系を採用して同表に示す反不時間での目的エステルの合
成率を調べた。その結果を第9表に併記する。但し、第
9表中の酵素にお(プる記号は、第8表と同じでおり、
脂肪酸におりる記号は第8表と同じであるか又は次のも
のを示す。 〈脂肪酸〉 B−7・・・プロピオン酸 B−8・・・カプリン酸 B −9・・・リグノセリン酸 B−10・・・コハク酸 B−11・・・セバシン酸 第 9 表 実験例11 コレステロール0.1q、オレイン酸 0.22にl、’)パーtMY1000U、 イ’#ク
タン10.05Mリン酸バッファ(pH7)=2+nQ
/8m12よりなる反応系を採用し、37℃にて反応を
行ない合成率の経時変化を調べた。 その結果を第10表にイガ記する。 第10表 実験例12 この例は、コレステロール0.1C]、オレイン酸0.
22Ω、リパーゼMY500tJ及び有機溶W10.0
5Mリン酸バッファ(pH7、0> = 2m(?/8
mGからなる反応系を用イテ37°Cで6時間反応させ
て有機溶媒の種類によるコレステロールオレイン酸エス
テル合成率の変化を調べたものである。 有機溶媒としては、以下のものを用いた。 S−2・・・イソオクタン S−3・・・シクロヘキサン S−4・・・n−ヘキサデカン S−5・・・[アイビーソルベント1016J(出光石
油化学■社製、Ca:63 %、C9:30%を主成分とするイ ソパラフィン系有機溶媒混合物 S−6・・・[アイソパーEl (エクソン化学社製
、Ca:25〜35%、C9ニ ア5〜60%を主成分とするイソパ ラフィン系有機溶媒混合物 結果を下記第11表に示す。 試験NO,有機溶媒 合成率(%) 1 S−297,0 23−396,8 33−496,7 43−596,0 53−696,0 実施例1」 15) 明細書第34頁第3〜4行に「リパーゼ・・・
(50000tJ)Jとあるを「リパーゼMY(8糖産
業社製)水溶液200mQ(50000U)Jと訂正す
る。 16) 明細書第35頁第2行に「・・・一致した。」
とあるを次の通り訂正する。 [・・・・・・一致した。 実施例2 コレステロール1q、イソステアリン酸(エメリーイン
ダストリイー社製>2.2cx、リパーゼMY0.33
3g(10000LI)、イソオクタン30mG及び0
.05Mリン酸バッファ80m(1を含む反応液を、2
0 Orpmの速度で撹拌しながら、37℃で45時間
に亘って、反応させた。この反応液を反応途中で逐次サ
ンプリングして、目的エステルの合成率を調べたところ
、3時間で28.5%、23時間で85.9%及び45
時間で 91.0%であった。 反応開始45時間で、反応を停止させ、メタノール水溶
液抽出を行ない、抽出液よりイソオクタン層を留去して
、未反応コレステロール0.09Q、未反応イソステア
リン酸1.53CI及び目的とするイソステアリン酸エ
ステル1.54CIを得た。 得られたイソステアリン酸エステルは、TLCにて単一
スポットを与え、イアトロスキャン分析では純度100
%でめった。」(以 上) 手 続 補 正 書 (自発)昭和61年6月
2日 1 事件の表示 昭和60年特許願第45128号 2 発明の名称 ステロール脂肪酸エステルの製造方法 3 補正をづる者 、パ 事件との関係 特許出願人 (。 ゝ・、−二 古川製油株式会社 4 代 理 人 大阪市東区平野町2の10 沢の鶴ビル6 補正の対象 明細書中f発明の詳細な説明」の項 7 補正の内容 2フベ 5111組添付の通り 補 正 の 内 容 1 明細書第4頁第19〜20行に[トリグリセライド
を段階的に」とあるを「グリセライドを」と訂正する。 2 明細書6頁最下行に「起源微生物」とあるを「起源
としては、哺乳動物の各種組織、例えば膵臓、肝臓、脳
、副腎、翠丸、卵巣等の他、微生物」と訂正する。 3 明am第7頁第9行に[プサイトモナス属、]とあ
るを削除する。 4 明細書第20頁最下行に「とする。」とあるを次の
通り訂正する。 「とする。但し実験例10〜13及び実施例2及び3に
おける合成率は、以下の方法により求めた。即ち、反応
終了後、反応液を水−有機溶媒2相系とし、有機溶媒相
を分m後、その濃度を適当に調整し、り0マロツドに脂
買弁として20〜40μ9程度チャージし、目的エステ
ルと未反応基質が分離する適当な条件(例えばヘキサン
/エーテル/蟻酸=56/1410.3)で展開し、そ
の後数分間乾燥し、展開溶媒を除去したクロマロッドを
イア1−ロスキャンT I−1−10検出器にかけて、
反応液中の脂質成分のビーク面積を求め、該面積をもと
にして、目的エステルの合成率(%)を次式により算出
した。 但し第1成分とは、反応基質として仕込んだ両基質の内
の小モル数の成分を意味する。」5 明細書第31頁第
19行に「由来)」とあるを[由来、30U/mg)J
と訂正する。 6 明細用第32頁第1行に「由来)」とあるを[由来
、2801J/mg)Jと訂正する。 7 明細書第32頁第3行に「由来)」とあるを「由来
、4U/l11(+)Jと訂正する。 8 明lII書第32頁第5行に「由来)」とあるを「
由来、30tJ/m(1)Jと訂正する。 9 明細書第32頁第7行に「社製)」とあるを「社製
、105 Ll/+no) Jと訂正する。 10 明細書第32頁第9行に「由来)」とあるを「由
来、20LJ/mg蛋白、生化学工業社製)Jと訂正す
る。 11 明細書第35頁第3行に「図面の」とあるを次の
通り訂正する。 [実験例13 第12表に示す酵素、ステロール類及び脂肪酸の所定量
を用い、イソオクタン1 0.05Mリン酸バッファ(DI−17)=3mQ/8
−の系で所定時間反応を行なった。結果を反応時間と共
に第12表に併記する。 尚、第12表における略号は、前記したものであるか又
は次のものを示す。 〈酵 素〉 E−7・・・コレスプロールエステラーゼ(シュードモ
ナス属由来、100U/III(]、フナコシ薬品社製
) E−8・・・リパーゼOF(キャンディダ シリントラ
シア由来、360U/ma、8糖産業社製) 〈脂 肪 酸〉 B−12・・・イソステアリン酸(エメリーインダスト
リーズ社製) B−13・・・リルンM(東京化成工業社製)第 1
2 表 I E−7(66,7) A−1(100) B−1(
147) 396.62 E−6(6,7) A−1(
100) B−12(147) 2486.73 E−
7(66,7) A−1(100) B−12(147
) 590.84 E−1(1000) A−1(10
0) B−13(216> 1.593.25 E−6
(6,7> A−1(100) B−6(159) 4
872,86 E−6(6,7) A−6(100)
B−1(146) 12292.17 E−8(100
0) A−1(100) B−1(147) 1896
.5実施例3 ジヒドロコレステロール10g、オレイン酸11g、リ
パーゼMY333w+。 (10000U)及びシクロヘキサン5−の混合物を2
00 cpmで64時間撹拌して反応させた。反応開始
後40時間後の合成率は73.1%であり、64時間後
のそれは83.1%であった。 上記反応後、反応混合物をメタノール水溶液で抽出して
未反応のジヒドロコレステロール及びオレイン酸を除去
し、シクロヘキサン層からシクロヘキサンを留去して目
的とするジヒドロコレステロールオレイン酸エステルの
12.40gを得た。 図面の」 (以 上)
係を示すグラフである。 (以 上) 代理人 弁理士 三 枝 英 二 ・i、、::H1
′ −1・ 手続補正書(自制 昭和60年8月9日 1 事件の表示 昭和60年特許願第45128号 2 発明の名称 ステロール脂肪酸エステルの製造方法 3 補正をする者 事件との関係 特許出願人 古川製油株式会社 4代理人 大阪市東区平野町2の10 沢の鶴ビル(6521)弁
理士 三枝英二 5 補正命令の日付 自発 6 補正の対象 明細書中「発明の詳細な説明」の項 7 補正の内容 別紙添付の通り 補正の内容 ]) 明細書第6真下から第3行に「等を」とあるを次
の通り訂正する。 「等のアクロモバクタ−属、クロ七バクテリウム属、コ
リネバクテリウム属、シュード−しナス属、スタフィロ
コッカス属、アスペルギルス属、キャンデイダ属、フミ
]−ラ属、ペニシリウム居、トルロプシス属、パシラス
屈、アルカリ土類金属、サーモマイセス属等に属する各
種微生物」 2) 明細書第8頁第4行に「合成反応」とあるを「合
成」と訂正する。 3) 明細書第9頁第2行に「スティグマステロール、
」とあるを「スティグマステロール等、トリメチルステ
ロールとして」と訂正する。 4) 明細書第9頁第6行に「ロール等」とあるを「ロ
ール、シクロアルテノール等」と訂正する。 5) 明細円筒13真下から第3行に「プリスタ」とあ
るを「プリスタン」と訂正する。 6〉 明細書第14頁第10行に「好適である。」とあ
るを次の通り訂正する。 [好適であるが、耐熱性リパーゼ等を用いる場合には、
該酵素に応じてより高温を採用することもできる。] 7) 明細書第14真下から第1行に「等の」とあるを
1等の非イオン系界面活性剤等の」と訂正する。 8) 明細書第15頁第12行に「決定でき、」とある
を「決定でき、いずれを過剰としてもよく」と訂正する
。 9) 明細書第20頁下から第5行に「社製)及びFI
D(水素」とあるを「社製、FID水素」と訂正する。 10) 明細書第20頁下から第2行に「ステロール
基準の」とあるを削除する。 11) 明細書第21真下から第4行に「リパーゼ」と
あるを1リパーゼ水溶液」と訂正する。 12) 明細書第23頁第8行に「反応」とあるを「反
応(条件は実施例1に同じ。)」と訂正する。 13) 明到書第33頁に記載の第8表中、「試験NO
,18Jの項の後に下記「試験No、19」及び[試験
NO,20jを追加補充する。 r19 E−3(1000) A−6B−1(3)
8 S−2(2) 63.020 E−1(1
000) A−4B−3(3) 8 S−2(2)
99.2J14) 明細書第34頁第1行に「実施
例1」と必るを次の通り訂正する。 「実験例10 コレステロール0.1c+に対して、37°Cにて、第
9表に示す脂肪酸(対ステロール3モル)及び酵素(1
000U)をそれぞれ用い、イソオクタン10.05M
リン酸バッファD)H7)=3m12/7mf2の反応
系を採用して同表に示す反不時間での目的エステルの合
成率を調べた。その結果を第9表に併記する。但し、第
9表中の酵素にお(プる記号は、第8表と同じでおり、
脂肪酸におりる記号は第8表と同じであるか又は次のも
のを示す。 〈脂肪酸〉 B−7・・・プロピオン酸 B−8・・・カプリン酸 B −9・・・リグノセリン酸 B−10・・・コハク酸 B−11・・・セバシン酸 第 9 表 実験例11 コレステロール0.1q、オレイン酸 0.22にl、’)パーtMY1000U、 イ’#ク
タン10.05Mリン酸バッファ(pH7)=2+nQ
/8m12よりなる反応系を採用し、37℃にて反応を
行ない合成率の経時変化を調べた。 その結果を第10表にイガ記する。 第10表 実験例12 この例は、コレステロール0.1C]、オレイン酸0.
22Ω、リパーゼMY500tJ及び有機溶W10.0
5Mリン酸バッファ(pH7、0> = 2m(?/8
mGからなる反応系を用イテ37°Cで6時間反応させ
て有機溶媒の種類によるコレステロールオレイン酸エス
テル合成率の変化を調べたものである。 有機溶媒としては、以下のものを用いた。 S−2・・・イソオクタン S−3・・・シクロヘキサン S−4・・・n−ヘキサデカン S−5・・・[アイビーソルベント1016J(出光石
油化学■社製、Ca:63 %、C9:30%を主成分とするイ ソパラフィン系有機溶媒混合物 S−6・・・[アイソパーEl (エクソン化学社製
、Ca:25〜35%、C9ニ ア5〜60%を主成分とするイソパ ラフィン系有機溶媒混合物 結果を下記第11表に示す。 試験NO,有機溶媒 合成率(%) 1 S−297,0 23−396,8 33−496,7 43−596,0 53−696,0 実施例1」 15) 明細書第34頁第3〜4行に「リパーゼ・・・
(50000tJ)Jとあるを「リパーゼMY(8糖産
業社製)水溶液200mQ(50000U)Jと訂正す
る。 16) 明細書第35頁第2行に「・・・一致した。」
とあるを次の通り訂正する。 [・・・・・・一致した。 実施例2 コレステロール1q、イソステアリン酸(エメリーイン
ダストリイー社製>2.2cx、リパーゼMY0.33
3g(10000LI)、イソオクタン30mG及び0
.05Mリン酸バッファ80m(1を含む反応液を、2
0 Orpmの速度で撹拌しながら、37℃で45時間
に亘って、反応させた。この反応液を反応途中で逐次サ
ンプリングして、目的エステルの合成率を調べたところ
、3時間で28.5%、23時間で85.9%及び45
時間で 91.0%であった。 反応開始45時間で、反応を停止させ、メタノール水溶
液抽出を行ない、抽出液よりイソオクタン層を留去して
、未反応コレステロール0.09Q、未反応イソステア
リン酸1.53CI及び目的とするイソステアリン酸エ
ステル1.54CIを得た。 得られたイソステアリン酸エステルは、TLCにて単一
スポットを与え、イアトロスキャン分析では純度100
%でめった。」(以 上) 手 続 補 正 書 (自発)昭和61年6月
2日 1 事件の表示 昭和60年特許願第45128号 2 発明の名称 ステロール脂肪酸エステルの製造方法 3 補正をづる者 、パ 事件との関係 特許出願人 (。 ゝ・、−二 古川製油株式会社 4 代 理 人 大阪市東区平野町2の10 沢の鶴ビル6 補正の対象 明細書中f発明の詳細な説明」の項 7 補正の内容 2フベ 5111組添付の通り 補 正 の 内 容 1 明細書第4頁第19〜20行に[トリグリセライド
を段階的に」とあるを「グリセライドを」と訂正する。 2 明細書6頁最下行に「起源微生物」とあるを「起源
としては、哺乳動物の各種組織、例えば膵臓、肝臓、脳
、副腎、翠丸、卵巣等の他、微生物」と訂正する。 3 明am第7頁第9行に[プサイトモナス属、]とあ
るを削除する。 4 明細書第20頁最下行に「とする。」とあるを次の
通り訂正する。 「とする。但し実験例10〜13及び実施例2及び3に
おける合成率は、以下の方法により求めた。即ち、反応
終了後、反応液を水−有機溶媒2相系とし、有機溶媒相
を分m後、その濃度を適当に調整し、り0マロツドに脂
買弁として20〜40μ9程度チャージし、目的エステ
ルと未反応基質が分離する適当な条件(例えばヘキサン
/エーテル/蟻酸=56/1410.3)で展開し、そ
の後数分間乾燥し、展開溶媒を除去したクロマロッドを
イア1−ロスキャンT I−1−10検出器にかけて、
反応液中の脂質成分のビーク面積を求め、該面積をもと
にして、目的エステルの合成率(%)を次式により算出
した。 但し第1成分とは、反応基質として仕込んだ両基質の内
の小モル数の成分を意味する。」5 明細書第31頁第
19行に「由来)」とあるを[由来、30U/mg)J
と訂正する。 6 明細用第32頁第1行に「由来)」とあるを[由来
、2801J/mg)Jと訂正する。 7 明細書第32頁第3行に「由来)」とあるを「由来
、4U/l11(+)Jと訂正する。 8 明lII書第32頁第5行に「由来)」とあるを「
由来、30tJ/m(1)Jと訂正する。 9 明細書第32頁第7行に「社製)」とあるを「社製
、105 Ll/+no) Jと訂正する。 10 明細書第32頁第9行に「由来)」とあるを「由
来、20LJ/mg蛋白、生化学工業社製)Jと訂正す
る。 11 明細書第35頁第3行に「図面の」とあるを次の
通り訂正する。 [実験例13 第12表に示す酵素、ステロール類及び脂肪酸の所定量
を用い、イソオクタン1 0.05Mリン酸バッファ(DI−17)=3mQ/8
−の系で所定時間反応を行なった。結果を反応時間と共
に第12表に併記する。 尚、第12表における略号は、前記したものであるか又
は次のものを示す。 〈酵 素〉 E−7・・・コレスプロールエステラーゼ(シュードモ
ナス属由来、100U/III(]、フナコシ薬品社製
) E−8・・・リパーゼOF(キャンディダ シリントラ
シア由来、360U/ma、8糖産業社製) 〈脂 肪 酸〉 B−12・・・イソステアリン酸(エメリーインダスト
リーズ社製) B−13・・・リルンM(東京化成工業社製)第 1
2 表 I E−7(66,7) A−1(100) B−1(
147) 396.62 E−6(6,7) A−1(
100) B−12(147) 2486.73 E−
7(66,7) A−1(100) B−12(147
) 590.84 E−1(1000) A−1(10
0) B−13(216> 1.593.25 E−6
(6,7> A−1(100) B−6(159) 4
872,86 E−6(6,7) A−6(100)
B−1(146) 12292.17 E−8(100
0) A−1(100) B−1(147) 1896
.5実施例3 ジヒドロコレステロール10g、オレイン酸11g、リ
パーゼMY333w+。 (10000U)及びシクロヘキサン5−の混合物を2
00 cpmで64時間撹拌して反応させた。反応開始
後40時間後の合成率は73.1%であり、64時間後
のそれは83.1%であった。 上記反応後、反応混合物をメタノール水溶液で抽出して
未反応のジヒドロコレステロール及びオレイン酸を除去
し、シクロヘキサン層からシクロヘキサンを留去して目
的とするジヒドロコレステロールオレイン酸エステルの
12.40gを得た。 図面の」 (以 上)
Claims (1)
- (1)リパーゼもしくはコレステロールエステラーゼを
用いて、分子内にステロイド骨格及び水酸基を有する化
合物と脂肪酸とを接触反応させることを特徴とするスチ
ロール脂肪酸エステルの製造方法。
Priority Applications (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP4512885A JPS61204197A (ja) | 1985-03-06 | 1985-03-06 | ステロ−ル脂肪酸エステルの製造方法 |
EP86102861A EP0195311B2 (en) | 1985-03-06 | 1986-03-05 | Process for preparing fatty acid esters |
DE8686102861T DE3672270D1 (de) | 1985-03-06 | 1986-03-05 | Verfahren zur herstellung von fettsaeureestern. |
US07/563,895 US5219733A (en) | 1985-03-06 | 1990-08-07 | Process for preparing fatty acid esters |
SG340/93A SG34093G (en) | 1985-03-06 | 1993-03-27 | Process for preparing fatty acid esters |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS61204197A true JPS61204197A (ja) | 1986-09-10 |
JPH0533712B2 JPH0533712B2 (ja) | 1993-05-20 |
Family
ID=12710629
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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JP (1) | JPS61204197A (ja) |
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- 1985-03-06 JP JP4512885A patent/JPS61204197A/ja active Granted
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JPH0533712B2 (ja) | 1993-05-20 |
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