JPS5931695A

JPS5931695A - 免疫分析ユニツト

Info

Publication number: JPS5931695A
Application number: JP14019682A
Authority: JP
Inventors: Yoshiaki Shimizu; 慶昭清水; Kyuji Mutsukawa; 六川　玖治; Fumio Watanabe; 文夫渡辺
Original assignee: Toshiba Corp; Tokyo Shibaura Electric Co Ltd
Current assignee: Toshiba Corp
Priority date: 1982-08-12
Filing date: 1982-08-12
Publication date: 1984-02-20
Also published as: JPH0376424B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔発明の技術分野〕この発明は、生体よシ採取した試料中の各種の成分を測
定する臨床検査装置の技術分野に＾する。

〔発明の技術的背景とその問題点〕

臨床化学分析の一手法にドライケミストリー法がある。

ドライケミストリー法は、試薬を１〜み込ませたＦ紙あ
るいは試薬を塗布した乾燥状態のフイルムに試料を滴下
し、試薬と試料との反応後、試料を滴下したフィルム部
分またはＦ紙部分に発色試薬を作用させて呈色し、その
吸光度を測定することｒＣよ多試料中の成分を分析する
ものである。

しかしながら、このドライケミストり一法は、試薬と試
料との反応援に、反応部分を発色させるだめの発色機構
が必要であり、また、呈色部分におりる特定の波長を検
出するだめにバックグラウンドを抑制しなければならな
いし、吸光度測定のために光学系を必要とするから装置
が複雑化するという問題点がある。

また、臨床化学分析において、酵素を応用した分析法と
して、酵素を溶液状態で用いる溶液法と酵素を不溶性相
体に結合してこれを反復利用する固定化酵素法とがある
。

しかしながら、前記溶液法には酵素の寿命が短いという
欠点があυ、前記固定化酵素法は経済的メリットがない
上に、酵素寿命が前記溶液法の場合よシも長いがそれで
も不充分であるという欠点がある。

（３）さらに、臨床化学分析において、免疫分析方法として、
ラジオイムノアッセイ法やエソザイムイムノアツセイ法
があるが、いずれも十分な検出が可能となるまでに数時
間から数１０時間もの長時間を要する。

〔発明の目的〕

この発明は前記事情に鑑みなされたものであり、液状試
料中の抗原または抗体を簡易かつ迅速に定量することの
できる簡単な構成の免疫分析ユニットを提供することを
目的とするものである。

〔発明の概要〕

前記目的を達成するだめのこの発明の概要は、基質また
は酵素を担持すると共に酵素反応生成物を検出する検出
手段を有する酵素反応層と、補体活性によシ溶解作用を
受けるマイクロカプセル表面に抗原または抗体を結合す
ると共に内部に前記酵素反応層に担持された基質または
酵素と反応する酵素または基質を収容したマイクロカプ
セルを有する試薬を保持し、かつ前記酵素反応層上に重
畳可能な試薬層と、前記試薬層上に重畳すると共（４）に滴下試料を展開する展開層とを有することを特徴とす
るものである。

〔発明の実施例〕

この発明の一実施例について図面を参照しながら説明す
る。第１図はこの発明の一実施例を示す説明図である。

第１図において、３で示すのは、試薬を担体に仰持して
なる試薬層であシ、不良導体よシなる第１の反応ユニッ
ト基板４Ａ上に形成されている。

反応ユニット基板４Ａには、所定の位置に開口部４Ｃが
設けられておシ、開口部４Ｃに後述する酵素反応層５を
装着することによシ、試薬層３と酵素反応層５とが接触
することができるようになっている。一方、第１の反応
ユニット基板４Ａの下方には第２の反応ユニット基板４
Ｂが配置されている。第２の反応ユニット基板４Ｂの上
面（第１の反応ユニツ）４Ａに対向する面）には、前記
開口部４Ｃに装着可能な枠体４Ｄが設けられ、その枠体
４Ｄ内に、基質または酵素を保持する酵素反応層５が固
化、形成されておシ、また、第２の反応ユニット基板４
Ｂの所定の位置に電極装入孔４Ｅが開口しており、この
電極挿入孔４Ｅに検出手段たとえば電極部６を装着する
ことができるようになっている。そして、第１の反応ユ
ニット基板４Ａと第２の反応ユニット基板４Ｂとは、適
宜のリンク機構４Ｆによって結合されると共に、リンク
機構４Ｆを駆動する適宜の駆動手段４Ｇによシ、リンク
機構４Ｆを介して、第２の反応ユニット基板４Ｂ上に形
成する酵素反応層５と第１の反応ユニット基板４Ａ上に
形成する試薬層３との接触が可能となるように構成され
る。電極部６は、これを電極挿入孔４Ｅに装着すると電
極部６よ如突出する電極が前記酵素反応層５に挿入され
ることとな夛、前記酵素反応層５で進行する酵素反応の
生成物を電気化学的に検出することができるようになっ
ている。電極部６よシ引き出されたリード線７はアンプ
８に接続されていて、電極部６よシ出力される検出１１
１．流を増幅するように構成されている。

検出電流ｔ；ｊ：　、さらに＠号ケーブルを介して演算
部１（）に出力され、演算部１０において試料中の特定
成分の濃度が舞出されるようになっている。

前記免疫分析ユニットについてさらに詳述する。

試薬層３中の相体は、後述の試薬を包括し、あるいｔ」
固定化するととができればどのようであってもよく、た
とえば、ポリアクリルアミド、ポリウレタン、＆ｌＪビ
ニルアルコール、ポリビニルピロリドン尋のような極性
基を有する合成高分子のグル、アガロース尋の多糖類の
グル、コラーダン、ゼラチン婢の蛋白質のグル、水酸化
アルミニウム、水酸化チタン尋の金属水酸化物のグル、
イオン交換樹脂、表面処理によ如表面にアミド基尋の極
性：ｊＡ：を有し、または有さカい多孔性ガラスピーズ
、プラスチック膜、ゼオライトモンモリロナイト等のよ
うなりレイ等の結合支持体が挙げられる。

試薬層３における試薬としては、補体活性によシ溶解作
用を受けるマイクロカプセル表面に抗体（−）、たけ抗
原）結合すると共に内部に酵素（または基質）を収容す
るマイクロカプセルを含有すると共に、生理的濃度の塩
を含有する緩衝液を使用することができる。

抗体（または抗原）を結合し、酵素（または基質）を収
容することのできるマイクロカプセルとしては、動物た
とえばヒツジの赤血球を好適に使用することができる。

々お、他の動物の赤血球あるいは赤血球以外の動物細胞
であっても、細胞膜に抗体（または抗原）を結合し、ま
た、細胞内に酵素（または基質）を収容することができ
れば、この発明における細胞として使用することができ
る。

また、さらに、人工膜としてリポソームも使用すること
ができる。

細胞膜に結合する抗体（または抗原）は、試料中の抗原
（または抗体）と特異的な抗原抗体反応を惹起するもの
が適宜に選ばれる。たとえば、試料中の抗原がα−フェ
トプロティンであるときは、α−フェトプロティン抗体
が挙げられる。

また、細胞内に収容する酵素は、たとえに酸化還元酵素
たとえばしゆう酸オキシダーゼ、ピルビン酸オキシダー
ゼ、乳酸オキシダーゼ、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、Ｌ
−アミノ酸オキシダーゼ。

モノアｉンオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、キ
ザンチンオキシダーゼ、ジアミンオキシ〆−ゼ、アルコ
ールオキシダーゼ、ウリカーゼ、ガラクトースオキシダ
ーゼ、アシルコエンザイムＡオキシダーゼ、コレステロ
ールオキシダーゼ、ザルコシンオキシターゼ、パーオキ
シダーゼ、カタラーゼ、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）　、
グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、３−ヒド
ロキシ酪酸デヒドロｒナーゼ、３αステロイドデヒドロ
ゲナーゼ、グルコース−６−リン酸ゾヒドロダナーゼ、
グルコースデヒドロゲナーゼ、マレートデヒドロｒナー
ゼ、インクエン酸デヒドロｒナーゼ。

加水分解酵素たとえば、グルタミン酸デカルがキシラー
ゼ、アスパルターゼ、アデノシンデアミナーゼ、ヌクレ
オシタ−ゼオシトシンデアミナーゼ。

クレアチンΦアミジノヒドラーゼ、ウレアーゼ。

アセト酢酸デカルボキシラーゼ、アルカリホスファター
ゼ、酸性ホスファターゼ、ピルビン酸テカルポキシラー
ゼ、ウロキナーゼ、ホスホリパーゼＣ，リパーゼ、カル
がキシペプチダーゼ、ロイシンアミノペプチダーゼ、ア
ミラーゼ、コリンエステラーゼ、アルドラーゼ、ゾラス
ミン、トリノシン、リゲヌクレアーゼ、デオキシリがヌ
クレアーゼ、グロテアーゼ、グルコアミラーゼ、転移酵
素たとえば、ピリビン酸キナーゼ、ミオキナーゼ。

アシルコエンザイムＡシンセターゼ、オルニチンカルバ
ミルトランスフェラーゼ、クレアチンギナーゼ、アスノ
母うギン酸アミノトランスフェラーゼ。

アラニンアミノトランスフェラーゼ、異性化９！たとえ
ば、グルタミン酸ラセマーゼ、アラニンラセマーゼ、ト
リオースリン酸イソメラーゼ、等が挙げられる。ｔた、
試薬層３中の試薬として、試料中の酵素成分を分析する
場合、前述の酵素と特異的に酵素反応をする基質たとえ
ばＬ−アスパラギン酸、Ｌ−アラニン、α−ケトゲルタ
ール酸。

ピルビン酸、Ｌ−乳酸、Ｌ−ロイシンアミド、グル：ｒ
　−ｘ　−６−！Ｊン酸、　澱粉、アセチルコリン。

クレアチン、グルタチオン、エタトルアミン、β−ヒド
ロキシ酪酸、オルニチン、フラクトースビスホスフェー
ト、トリグリセリド、ホスフォエノールピルビン酸、イ
ソクエン酸、りんご酸、プラスεノーｒン、ドーパミン
、アスコルビン酸、蛋白質、ポリヌクレオチド尋が挙け
られる。ただし、細胞内に収容する基質は、細胞膜を透
過しにくい物質でおるのが好ま１〜く、たとえば細胞が
赤血球、リポソーム等であるときには塩素イオン、グリ
セロール、疎水性物質たとえはリン脂質、赤血球膜の能
動輸送で透過可能な物質たとえばグルコースアミノ酸が
挙げられる。しかしながら、本明細書の場合抗原抗体反
応と酵素反応とは分割されているので基質としては十分
に利用可能である。

マイクロカプセル内に収容する酵素（又は基質）の１ｉ
Ｊ１マイクロ力プセル調整時に自由に調整可能でおる（
吉沢満；生化学５３（９）、　１０６６（１９８１））
。

従って測定対象の抗原（又は抗体）の濃度範囲に応じて
、マイクロカプセル内に収容する酵素又は基質の濃度を
適宜に調整する事が出来る。通常、抗体（または抗原）
量に対して細胞内の酵素（または基質）量が大過剰であ
るので、この発明の免疫分析ユニットを用いた免疫分析
測定を短時間のうちに行なうことができる。

細胞たとえば羊の赤血球の細胞膜に抗体たとえばα−フ
ェトプロティン抗体を結合し、赤血球内に酵素たとえば
グルコースオキシターゼを収納シた細胞の調整は、たと
えば次のようにして行なうことができる。

先ず、動物たとえばウサギ、ヤギ、マウス、ラット等に
α−フェトプロティンを常法に従って注射すると、これ
ら動物は感作されて動物体内でα−フェトプロティン抗
体が産生される。注射後適当な期間の経過後、その動物
よシ所定１゛の血液を採取し、得られた血液の上澄み液
を分離することによシ、抗α−フェトプロティン抗体を
有する抗血清を得る。なお、抗原抗体反応の特異性を向
上させるために、前記抗血清をさらに精製してもよい。

一方、他の動物たとえばヒツジから所定ｌの血液を採取
してこれを精製し、等供液たとえば０．１５Ｍの濃度の
塩を含有するバッファ液（ｐＨ７）と混合することによ
υ赤血球をサスペンドした等供液を得る。この勢張液中
にサスペンドした赤血球中にり一細胞液、ミトコンドリ
ア等が含まれているので、常法である透析法によって赤
血球内から細胞液咎をυ１出して赤血球内に酵素である
グルコアミラーゼを収容する。収容するグルコアミラー
ゼの１″ハ、伊達する免疫分析測定法の必要に応じて適
宜に法定することができる。次いで、ヒツジの赤血球を
サスペンドした尋供液と前記のα−フェトプロティン抗
体を有する抗血清とを混合すると、ヒツジの赤血球の細
胞膜上にα−フェトプロティン抗体が吸着され、α−フ
ェトプロティン抗体を細ｌ１ｉ３１膜に結合する赤血球
を有する等供液が得られる。この場合、赤血球膜が抗体
を吸着しにくい時は、グルタルアルデヒドや無水コノ蔦
り酸の様ガ２価性試薬、ウッドワード試薬の様なペプチ
ド試薬層と共に処理する事によシ膜表面に抗原（又は抗
体）を結合させる事ができる。

試薬層３の調製として、たとえば免疫測定法で通常行な
われる、寒天グルを使用する方法でマイクロカプセルを
包括することができる。前記方法は、免疫化学実験入門
（松橋直ら著、学会出版センター（１９８１）　）、臨
床とウィルス（９巻４７９頁（１９８１）、佐藤征也ら
）に詳細に記軟されている。

展開層１は、展開層１の上面に滴下した試料を試薬層３
に均一な濃度で移送することができるように試料を拡散
させるためのものであって、たとえは前記試薬層３の形
成に用いた各種のダルを使用することができる。

なお、細胞膜を溶解する補体は、動物の血液中に含まれ
ているものを使用することができ、たとえにモルモット
の血清を補体含有液としてそのまま使用することができ
る。また、補体は、あらかじめ前記試薬層３や展開層１
のいずれかに添加しておいてもよく、二次試薬として後
に添加してもよい。

電極部６としては、電気化学的手段を採用することがで
き、たとえば酵素反応層５中での反応生成物がイオンで
ある時にはイオン電極を、反応生放物が過酸化水素であ
るときには過酸化水素電極を用いることができる。

以」二構成の免疫分析ユニットを使用すると次のように
して試別中の抗原（または抗体）を分析することができ
る。

先ず、ｖｌル１状態として試薬層３と酵素反応層５とは
分離した状態になっている。そこで、展開層１の表面に
試料だとえ一血液試料を滴下すると、匍液試別は展開層
１中で拡散して均一な濃度となって試薬層３に到達する
。なお、血液試料としては、血清、血漿その他全血であ
ってもよい。到達後、血液試別中の抗原（または抗体）
と試薬層３中に包括または固定化されている細胞の膜表
面に結合されている抗体（または抵Ｍ）とが、特異的な
抗原抗体反応を惹起する。そうすると、展開層１よ如血
液試利と共に移送されてきた、あるいは試薬層３中に加
えられていた補体が前記抗原抗体反応Ｆよシ活性化され
、補体活性による細胞溶解作用により細胞膜が溶解して
細胞内に収容されていた酵素（または基質）が細胞外に
放出される。

次いで、駆動手段４Ｇの駆動によシリンク機構４Ｆを操
作して第２の反応ユニット基板４Ｂを上昇させ、酵素反
応層５の上面と試薬層３の下面とを接触させ、酵素反応
層５上に試薬層３を重畳させる。

なお、第１の反応ユニット基板４Ｂ上に、開口部４Ｃか
ら試薬層３が漏出し力いように半透膜の隔膜を配置し、
この隔膜上に試薬層３が形成されているときは、この隔
膜を介して酵素反応層５と試薬層３とを接触させ、重畳
する。そうすると、試薬層３中に放出された酵素（まだ
は基質）が酵素反応層５に移動し、酵素反応層５中に保
持した基質（または酵素）と移動してきた酵素（または
基質）と酵素反応し、反応生成物が得られる。次いで、
この反応生成物を、電極挿入孔４Ｅに挿入した電極部６
によシミ気化学的に定ｌ°することができるＯ前記構成の免疫分析ユニットでは、内部に酵素（または
基質）を収容する細胞を有する試薬を保持した試薬層３
と基質（または酵素）を保持する酵素反応層６とをあら
かじめ分離しておき、細胞外に酵素（または基質）を放
出してから試薬層３と酵素反応層６とを接触させて酵素
反応を行なっているので、酵３ｋ（または基’ｊｌ）を
収容する細胞と基質（または酵素）とを併存させると細
胞内に細胞外の基質（または酵素）が侵入し細胞内で酵
素反応を生ずるような酵素と基質との組合わせであって
も、この免疫分析ユニットで適切に酵素反応を行ガうこ
とができる。

り上、この発明の一実施例について詳述した力（この発
明は前記実施例に限定されるものではなく、この発明の
要旨の範囲内で適宜に変形して実施することができるの
はいうまでもない。

この発明においては、試薬層３中で抗原抗体反応を起し
、次いで試薬層３中に放出された酵素（または基質）を
移動して酵素反応層５中で酵素反応を起こす必要があシ
、かかる必要を満足するために、第２の実施例として、
第２図に示すように、酵素反応層５上に試薬層３を重畳
し、酵素（ｔたは基質）を透過するが基質（！たけ酵素
）を透過させないような半透膜性の隔膜１１を眉間に介
在させてもよい。このような隔膜１１で両層を分離して
おくと、基質（または酵素）が細胞膜を透過可能である
とき、基質（または酵素）が試薬層３に拡散し、抗原抗
体反応前に細胞内で酵素反応が進行するのを防止するこ
とができ、常に、抗原抗体反応後に酵素反応を進行させ
ることができる。

また、前記必要を満足するために、第３の実施例として
、第３図に示すように、酵素反応層５上に試薬層３を重
畳し、酵素およ゛・び基質を透過させない不透過性の隔
膜ないし遮蔽板１３を層間に介在させると共に、この遮
蔽板１３を、駆動手段４Ｈによル駆動する引き抜きアー
ム４Ｉによ多層間から引き抜きあるいは層間に挿入可能
としてもよい。

このようにすると、試薬層３で抗原抗体反応を進行させ
るときには両層間に遮蔽板１３を介在させておき、試薬
層３中に酵素（または基質戸放出された後に、遮蔽板１
３を両層間よシ引き抜くことによシ試薬層３に拡散した
酵素（また１基質）を酵素反応層５に移動させ、抗原抗
体反応後に確実に酵素反応を行なって前記実施例と同様
の効果を奏することかできる。

この発明においては、試料中の抗原（または抗体）を定
量にするために、酵素反応層５で進行した酵素反応の生
成物を分析する必要がある。この必要を満足するために
、前記第１の実施例におけるよう寿、電極挿入孔４Ｅに
装着された電極部６を用いるかわシに、第３図および第
４図（Ａ）’（Ｂ）に示すように、反応ユニット基板４
上に一対の電極６Ａを配置すると共に、電極４と反応ユ
ニット基板４の端部に設けた接続部６Ｂとをプリントし
たリードＩｔｉ！６Ｃで一′１気的に接続し、前記反応
ユニット基板４上に試薬層３を形成することによシミ極
６Ａが試薬層３中に埋設されるようにしてもよい。

さらに、抄出手段として、前記のような電気化学的手段
によらず、第４の実施例におけるように、光学的検出手
段を採用してもよい。すなわち、第５図に示すように、
透明な材質で形成された反応ユニット基板４の下方（酵
素反応層５の形成面とは反別（１１１Ｉ）に光電検出器
６Ｄを配置しておくと共に、酵素反応層５内に、酵素反
応の生成物たとえばＨ２Ｏ２と反応して発光する物質た
とえばルはノールを含浸捷たは担持しておく。このよう
にすると、ルミノール発光量を光電検出器６Ｄで定量す
ることにより試料中の抗原（または抗素）を定量するこ
とができる。

〔発明の効果〕この発明によると、簡単な構成でありながら、従来長時
間の分析時間を要した免疫分析をわずか数分から数１０
分の間に行なうことができる。特に、内部に酵素（また
は基質）を収容した細胞を有する試薬を担持する試薬層
と酵素反応層とを抗原抗体反応時に分離しているので、
細胞膜を透過可能な基質（または酵素）であってもこの
免疫分析ユニットを用いて試料中の抗原（または抗体）
を定量することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図はこの発明の一実施例を示す説明図並びに第２図
、第３図、第４図（４）（Ｂ）および第５図はこの発明
の他の実施例を示す説明図である。１・・・展開層、３・・・試薬層、５・・・酵素反応層
、６・・・を極部、１１・・・隔膜、１３・・・不透過
性隔膜。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）基質または酵素を担持すると共に酵素反応生成物
を検出する検出手段を有する酵素反応層と、補体活性に
よシ溶解作用を受けるマイクロカプセル表面に抗原また
は抗体を結合すると共に内部に前記酵素反応層に担持さ
れた基質または酵素と反応する酵素または基質を収容し
たマイクロカプセルを有する試薬を保持し、かつ前記酵
素反応層上に重畳可能な試薬層と、前記試薬層上に重畳
すると共に滴下試料を展開する展開層とを有することを
特徴とする免疫分析ユニット。
（２）前記マイクロカプセルが、動物の感作赤血球であ
ることを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の免疫
分析ユニット。
（３）前記マイクロカプセルが、リポツームチすること
を特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の免疫分析ユ
ニット。
（４）　　前記酵素反応層と試薬層とがあらかじめ非接
触状態にあり、試薬層での反応稜に前記酵素反応層と試
薬層とが接触することを特徴とする特許請求の範囲第１
項ないし第３項のいずれかに記載の免疫分析ユニット。
（５）　　前記酵素反応層と試薬層との非接触状態が、
酵素反応層と試薬層との間に介装された不ｌ性隔膜によ
シなされることを特徴とする特許請求の範囲第４項に記
載の免疫分析ユニット。
（６）前記不透過性隔膜が、前記酵素反応層と試１薬層との間に挿藤自在であることを特徴とする特許請求
の範囲第５項に記載の免疫分析ユニット。