JPH11183372A - Ｓｐｒセンサ装置および分析システムとこれを用いた検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 小型で検出精度が高く複数物質の検出が可能
な表面プラズモンセンサ装置を提供する。 【解決手段】 プリズム３の検出表面２に対して、流体
の供給管１が直立して配置される。供給管１は直線的
で、内部を流体が層流となって流れるよう十分に長い。
供給管１の出口は検出表面２に対し僅かな隙間を開けて
正対し、喇叭状に広がって流体の層流を乱さずに検出表
面２に導きそして外方へ逃がす。流体の排出管４は大径
の円管であって、その中心軸位置に供給管１が位置する
ように配置され、プリズム３の表面にボルト・ナット６
で強固に圧着される。排出管４とプリズム３表面とのつ
なぎ目は、流体の流れを乱さないように滑らかに湾曲し
ている。供給管１と排出管４には電気化学センサとして
のリング状電極９が取り付けられている。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は表面プラズモン共鳴
（ＳＰＲ）を利用したセンサ装置（本明細書では「ＳＰ
Ｒセンサ装置」という）、ＳＰＲ検出方法及び分析シス
テムに関する。

【０００２】

【従来の技術】ＳＰＲセンサ装置は、その検出表面に接
触した液体や気体の屈折率又は屈折率変化を検出できる
もので、その原理を応用して例えば抗原抗体反応の測定
などに利用される。その測定方法の例を示すと、被検体
がバッファ液に溶質として存在する抗原で、センサの検
出表面に抗体が固定化されている場合、まず抗原を含ま
ないバッファ液をセンサセル（バッファ液や被検液など
の流体を検出表面に接触させて流すための部屋）に流
し、そのときの表面プラズモンの共振角を測定する。次
に、被検体の抗原を含むバッファ液をセンサセルに流し
抗原抗体反応を起こさせた後、抗原を含まないバッファ
液でセンサセルを洗浄して再度表面プラズモンの共振角
を測定する。こうして得られた抗原抗体反応の前後での
表面プラズモン共振角の差が、抗体と反応した抗原の数
に相当するので、これを溶質として存在した抗原の濃度
に換算する。

【０００３】ＳＰＲセンサ装置は、検出表面上から約１
００ｎｍ以内に存在する被検体の屈折率変化を高感度に
感知するため、検出表面上で流体が渦を巻くなど流れの
乱れが生じた場合には正確な共振角が得られない。そこ
で、従来のＳＰＲセンサ装置のセンサセルでは、検出表
面上の流体の流れを完全な層流にするために、センサセ
ルの流路径や流体の流速等のパラメーターから決まるあ
る程度以上の長さをもった長い流路が検出表面と平行に
配されている。

【０００４】ところで、液体クロマトグラフィ（以下、
ＬＣという〉は、低〜高分子の物質の電気的性質あるい
は分子サイズの違いを利用して所望の物質を精製する手
法であり、現在では主に生理活性物質の精製等に広く用
いられている。その際、生体物質の追跡には２６０ｎｍ
あるいは２８０ｎｍの紫外光（以下、ＵＶという）吸光
度計が最も広く用いられており、所望の物質を含む種々
の物質溶出位置はＵＶ吸収のチャ一トで判別することが
できる。

【０００５】しかし、ＵＶ吸収チャート上のどのピーク
が所望の物質なのかを判断するためには、それぞれ所定
の容量で分別された溶出液の生理活性をＬＣ後に改めて
測定する必要がある。ところが一般にこれらの生理活性
の測定（バイオアッセイ）は繁雑な、しかも熟練を要す
る操作を伴い、かつ長時間を要するものである。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】通常、ＳＰＲセンサ装
置の検出表面はプリズム上に形成される。検出表面上で
乱流を生じさせないようにするには、上述したようにセ
ンサセルに適当な距離の直線流路を要するので、センサ
セルとプリズムが大型化し、ＳＰＲセンサ装置自体も大
型化する。同時にプリズムは比較的高価な部品であるた
め、コストも高いものになる。これを回避するために流
体の流速を遅くすると測定に要す時間が長くなりセンサ
の実用性を損なってしまう。

【０００７】また、従来のＳＰＲセンサ装置は、溝状の
細長い穴を有するゴム製パッキンとセンサ検出部である
プリズムとで、センサセルの流路を構成している。この
ため構造的に耐圧力性が乏しく低圧の流体測定にのみ使
用されており、圧力を高くしなければならない用途、た
とえば液体クロマトグラフィなどには使用できない。

【０００８】センサセル内の流路では、様々な制約上、
流路が直角もしくはそれに近い角度で曲がった部分を作
らざるを得ない。この流路の曲がる部分では、流体のよ
どみを生じるため流体の交換性が悪く、さらに検出表面
近傍で気泡が発生した場合、気泡が抜けにくく測定精度
を悪化させる。

【０００９】混合試料中に検出したい対象が複数あり、
一つの対象が表面プラズモン共鳴法で検出可能で別の対
象が電極型センサで検出可能である場合、それぞれのセ
ンサを独立して用いて測定しなければならない。これは
上述したように流体を層流でセンサセル中を流す必要と
相俟って、センサ装置構成が大型化することを意味す
る。

【００１０】従来のＳＰＲセンサ装置の操作手順は、代
表的な用途である抗原の測定を例にとると、次のような
ものである。抗原と特異的に反応する抗体が検出表面に
固定化される。最初に、抗原を含まないバッファ液の共
振角を測定する。次に抗原を含むバッファ液で検出表面
を一定時間満たして抗原抗体反応を生じさせる。反応
後、抗原を含まないバッファ液で検出表面を洗浄し、反
応後の共振角を測定する。そして、抗原抗体反応の前後
での共振角の差を求め、それを抗原濃度に換算する。こ
のように１回の測定には、反応前の測定、反応、反応後
の測定という少なくとも3段階の手順が必要であり、こ
のために測定に要する時間が長くなり、リアルタイムの
レスポンスを期待されるセンサの魅力を損なっている。

【００１１】また、ＬＣに関しては、前述したように、
ＬＣにより分離精製された個々の物質の生理活性の測定
に多大な労力と時間を要している。

【００１２】従って、本発明の目的は、小型で測定精度
の高いＳＰＲセンサ装置を提供することにある。

【００１３】本発明の別の目的は、小型で複数物質の同
時検出が可能なＳＰＲセンサ装置を提供することにあ
る。

【００１４】本発明のまた別の目的は、検出精度の高い
ＳＰＲ検出方法を提供することにある。

【００１５】本発明のまた別の目的は、ＬＣを用いた生
理活性物質の分離精製及び生理活性物質の測定と、ＳＰ
Ｒ装置による所望の生理活性物質のピークの同定とを実
質的に同時に行える画期的な分析システムを提供するこ
とにある。

【００１６】本発明の更に別の目的は、小型で、短時間
で測定結果が得られ、混合試料中の成分分離と特定の物
質に対する特異性を有する成分の決定とを同時に行うＳ
ＰＲセンサ装置および分析システムを提供することにあ
る。

【００１７】

【課題を解決するための手段】本発明の第１の側面に従
うＳＰＲセンサ装置は、ＳＰＲセンサの検出表面に流体
を供給するための供給管をセンサセル内に有している。
この供給管は、その内部を流体が層流となって内部を流
れるのに十分な長さをもち、その流体出口は、検出表面
に対し近接して正対するように配置されている。この構
成によれば、被検液などの流体は供給管内で乱れのない
層流となり、この層流のまま供給管から出て検出表面に
接し、検出表面と供給管出口との間のわずかな隙間を通
って移動し排出される。流体が排出のために移動すると
きには流れが乱れることが予想されるが、ＳＰＲセンサ
は検出表面からわずか100nm程度の極近傍の被検体しか
検出できないため、この乱流の影響は非常に小さい。ま
た、供給管の出口が検出表面に正対させるためには、供
給管は典型的には検出表面に対して直角に立った姿勢で
配置されることになる。この配置により、ＳＰＲセンサ
のサイズを大型化することなしに、供給管の長さを十に
長くすることが可能である。因みに、流体の流れが層流
となるような供給管の長さは、供給管の内径や流体の流
速などのパラメ一夕から決められる。

【００１８】供給管の内径は、検出表面に照射される表
面プラズモン励起光のスポットの径よりも大きいことが
望ましい。表面プラズモンの励起光源には半導体レーザ
ーやLEDが使われる。これらの光は通常１ｍｍ以下のス
ポット径に絞り込むことは容易である。そして、供給管
の内径を１ｍｍ以上にすることも容易である。供給管の
内径が表面プラズモン励起光のスポット径よりも大きい
ことにより、表面プラズモンが励起される検出表面の全
域を層流がカバーすることになる。

【００１９】供給管の出口付近の内径は出口に向かって
喇叭状に滑らかに拡大していることが望ましい。これに
よって検出表面に接した流体がスムースに移動しやすく
なり流れの乱れが低減される。また、供給管の出口面が
検出表面に対して平行であることが望ましい。これによ
って検出表面に接した流体が移動するための検出表面と
平行な流路が確保され、流れの乱れが低減される。

【００２０】検出表面と供給管の出口との距離を調節す
るために機構を設けることができる。この距離がある値
以上になると、流体は乱流となって検出表面に接するこ
とになる。層流のまま検出表面に届くための距離は流速
によって異なる。流速に対応して距離を調整することに
よって、流体を層流のまま検出表面へ導くことが可能と
なる。

【００２１】検出表面に接した流体を排出するための排
出管は、供給管より大きい内径をもち、供給管を包囲す
るようにして配置して、その排出管の入口面を検出表面
の周囲にてＳＰＲセンサ表面と結合するように取り付け
ることができる。このような排出管を用いることによ
り、排出管自体がセンサセルのケーシングとなって、セ
ンサセルの構造がシンプルとなるので、ＳＰＲセンサ及
びセンサセルを小型にまとめることが容易である。ま
た、排出管の入口面をＳＰＲセンサ表面と強固に密着さ
せることにより、高耐圧のセンサセルを構成することも
容易である。耐圧の観点から、排出管及び供給管は断面
が円形の管であることが望ましい。

【００２２】排出管の入口付近の内径はＳＰＲセンサ表
面に連続的につながるよう曲線的に狭まっていることが
望ましい。これによって検出表面に接した後の被検体は
流れが大きく乱されることなく排出管を通って排出され
る。

【００２３】供給管の外周面及び排出管の内周面の一方
又は双方に、電気化学センサのための電極を取り付ける
ことができる。混合被検液中のある成分は表面プラズモ
ンにより、またある成分は電気化学センサによって同一
センサセル内で同時に測定される。

【００２４】本発明の第２の側面に従うＳＰＲ検出方法
は、被検液をＳＰＲセンサに導入している間における、
ＳＰＲセンサが検出する表面プラズモン共振角の単位時
間当たりの変化量から被検液に含まれる目的物質の濃度
を求めるものである。目的物質がＳＰＲセンサの代表的
アプリケーションである抗原である例では、まず抗原を
含まないバッファー液が検出表面に流され、次に抗原を
含む被検液が流される。この被検液が流されている間、
共振角は時間とともに変化し、ある時間が経過した後ほ
ぼ一定の値に落ち着く。この共振角が時間とともに変化
するときの単位時間当たりの変化量は、抗原濃度と相関
している。本発明の方法は、この単位時間当たりの共振
角変化量から目的物質の濃度を決定する。単位時間当た
りの共振角変化量は、後述するように分散が小さいの
で、この方法による測定精度は高い。

【００２５】本発明の第３の側面に従う分析システム
は、被検液に含まれる複数物質を分離するカラムと、カ
ラムからの溶出液が導入される吸光度計と、カラムから
の溶出液が導入される、目的物質に応答する信号を出力
するＳＰＲセンサ装置とを備える。例えば、複数種類の
タンパクを含む混合被検液の例では、混合被検液はまず
ポンプでカラムに押し込まれ、カラム内で個々のタンパ
クに分離される。カラムの後には配管によって吸光度計
がつながっている。分離されたタンパクは吸光度計によ
ってカラムから各種類ごとに出てきたことを確認され
る。また、目的のタンパクと特異的に反応する抗体が固
定化されたＳＰＲセンサ装置が、吸光度計と並列に又は
直列に配管によってつながっている。ＳＰＲセンサ装置
から出力される共振角の信号は、分離された各種タンパ
クがＳＰＲセンサ装置に入るたびに変化するが、タンパ
クが通り抜けるともとの基底値に戻る。しかし、ＳＰＲ
センサ装置に固定化された抗体と特異的に反応するタン
パクが来た場合、タンパクが通り抜けた後もその一部が
抗体と結合しているため、共振角が基底値には戻らな
い。これによって、混合被検液中から目的のタンパクが
いつＳＰＲセンサ装置に入ったのか知ることができ、吸
光度計の信号変化とカラムの特性から、目的のタンパク
の特性などを知ることができる。

【００２６】

【発明の実施の形態】図１は、本発明に係るＳＰＲセン
サ装置の一実施形態の要部の構成を示す。

【００２７】プリズム３の上面に金薄膜を蒸着した検出
表面２が形成されている。プリズム３の一傾斜面の外側
には光源７が配置され、光源７とプリズム３間にはレン
ズ１１が配置される。プリズム３のもう一方の傾斜面に
は、ＣＣＤラインセンサのような受光素子１０が接合さ
れている。これらプリズム３、光源７、レンズ１１、受
光素子１０は、プリズムケース１２内に収納され固定さ
れている。

【００２８】光源７は、検出表面２に向けて、その金薄
膜に表面プラズモンを励起するための励起光線束を発射
する。光源７から発射された励起光線束は、光学系によ
って検出表面２上に円錐状に集光される。検出表面２上
に集光された励起光線束のスポットの直径は、光源７が
例えばＬＥＤの場合は０．５ｍｍ程度であり、また、光
源７がレーザ発振器の場合はμｍオーダになる。励起光
線束は検出表面２から反射され、その反射光線束が受光
素子１０に受光される。受光素子１０は例えばＣＣＤラ
インセンサであって、各画素の受光量を示す信号を出力
する。受光素子１０の出力信号レベルが極小となる画素
位置がプラズモン共振角に対応する。

【００２９】検出表面２に流体を流すためのセンサセル
は、流体を検出表面２に供給するための供給管１と、検
出表面２上を流れた流体を外部へ排出するための排出管
４とを有する。

【００３０】供給管１は円形断面をもつ真っ直ぐな長い
管であり、検出表面２に対して直角に立った姿勢で配置
されている。供給管１内には、ポンプ（図２参照）の力
で流体が検出表面２へ向かって流される。供給管１は、
その内部を流体が乱れの無い層流となって流れるよう
に、供給管１の内径及び流体の流速等のパラメータから
決定された十分な長さを有している。供給管1の内径
（直径）は、光スポットの直径より大きく例えば１ｍｍ
である。

【００３１】供給管１の出口は、検出表面２の光スポッ
トの当たる部分に正対している。この供給管１の出口は
検出表面２に近接しており、この出口の検出表面２から
の距離は管昇降機構５によって調整することができる。
供給管１の出口附近の内径は、出口へ向かって喇叭状に
曲線的に滑らかに拡大しており、出口において検出表面
２と平行面を形成して、この平行面がある程度の距離外
方へ広がっている。

【００３２】供給管１が十分に長いため流体は供給管１
内で層流となり、層流のまま供給管１出口から出る。こ
の層流が乱れずに検出表面２に届く距離は流体の流速に
よって異なる。そこで、管昇降機構５により供給管１出
口と検出表面２間の距離を流速に応じて調整することに
より、どのような流速でも、流体を層流のまま検出表面
２に導くことができる。供給管１の内径が光スポットの
径より大きいため、流体の層流は光スポットの全領域を
カバーする。検出表面２に当たった流体は外方へ流れて
いくが、供給管１の出口附近の内径が喇叭状に滑らかに
広がり、そして出口では検出表面２に対して平行面とな
って検出表面２に平行な流路を形成しているので、流体
の層流は大きく乱れることなく検出表面２から外方へ流
れていく。

【００３３】排出管４は、供給管１より遙かに大きい内
径をもち、断面が円形であり、供給管１を包囲するよう
にして、供給管１と同軸の位置関係をもって、プリズム
３の表面に直角な姿勢で配置されている。排出管４の入
口端部のフランジ４Ａとプリズムケース１２の端部のフ
ランジ１２Ａとがボルト・ナット６で締め付けられてい
て、それにより、排出管４の入口面がプリズム３の表面
に強固に圧着されている。排出管４端面とプリズム３表
面間にはパッキン８が締め付け圧で潰された状態で介在
して、両者のつなぎ目をシールしている。この構造によ
り高耐圧のセンサセルが実現する。排出管４や供給管１
の断面が円形であることも、高耐圧に寄与している。よ
って、高圧流体の測定が可能である。排出管４の入口部
分の内径は、流体の層流を乱さぬよう、内側へ曲線的に
狭まっていて、その入口の内周面はプリズム３表面と連
続的に滑らかにつながっている。

【００３４】供給管１の外周面と排出管４の内周面に、
複数個のリング状電極９が設置されている。これらの電
極９は電気化学センサとして機能することができる。例
えば、この実施形態では３個のリング状電極９があり、
その内の１個は表面が塩化銀であって参照極として動作
し、他の２個は表面が白金であって作用極及び対極とし
てそれぞれ動作する。作用極の表面に例えば酵素である
グルコースオキシターゼを固定化することにより、この
３つの電極９を用いた電気化学センサをグルコースセン
サとして働かせることができる。一方、ＳＰＲセンサの
検出表面２に例えば抗体を固定化することにより、この
ＳＰＲセンサをタンパクセンサとして働かせることがで
きる。このようにして、例えばグルコースとタンパクの
ような２種類の成分を同時に検出することが可能であ
る。

【００３５】図２は、図１に示したＳＰＲセンサ装置に
適用可能なポンプの一例の断面構造を示す。

【００３６】このポンプはシリンジポンプであって、モ
ータ２５によりシリンジ２１内のピストン２３を往復動
させることにより、シリンジ２１内の液溜室２２に外部
の流体を吸入したり、液溜室２２内の流体を外部へ送出
したりすることができる。シリンジ２１は、液溜室２２
に連通した１本の中央流路２７と、シリンジ外へ開口し
た異なる方向を向いた複数本、例えば６本、の外部流路
（図３の平面図参照）２９Ａ〜２９Ｆとを有している。
モータ３３によりシリンジ２１内の回転継ぎ手３１を回
転させてその方向を切り替えることにより、中央流路２
７を６本の外部流路２９Ａ〜２９Ｆのうちの一つに選択
的に連通させることができる。

【００３７】図４は、図１に示したＳＰＲセンサ装置と
図２に示したポンプとを組合せた検出システムの一例の
全体構成を示す。

【００３８】図２に示したポンプ４１がもつ６つの外部
流路のうちの５つ（２９Ｂ〜２９Ｆ）に、バッファ液タ
ンク４３、被検液タンク４５、解離液タンク４７、廃液
管４９、及び図１に示したＳＰＲセンサ装置５１の供給
管１が接続されている。ポンプ４１のモータ２５、３３
（図２参照）は、マイクロコンピュータ５３による制御
下で、モータドライバ５５によって駆動される。ポンプ
４１を通じて、バッファ液、被検液、解離液を選択的に
ＳＰＲセンサ装置５１に選択的に供給することができ
る。ＳＰＲセンサ装置５１の受光素子１０からの出力信
号５７は、マイクロコンピュータ５３に取り込まれ（又
は、図示しない別のコンピュータに取り込まれ）自動処
理される。

【００３９】図５は、本発明のＳＰＲ検出方法の一実施
形態を示すフローチャートである。図６は、この検出方
法を実施している間のＳＰＲセンサ装置におけるプラズ
モン共振角の変化を示している。この検出方法は、図２
に示した検出システムを用いても、また従来の一般的な
検出システムを用いても実施することができるが、図２
のシステムを用いる場合には、図５に示す手順をマイク
ロコンピュータ５３にプログラムすることにより自動的
に行える。

【００４０】まず、ＳＰＲセンサ装置にバッファ液を例
えば２分間送る（ステップＳ１）。この間、プラズモン
共振角は基底値に静定している。次に、被検液（例えば
アルブミン溶液）のＳＰＲセンサ装置への送りを開始す
る（Ｓ２、図６時刻ｔ０）。すると、プラズモン共振角
が変化し始める。被検液を送液し続けている間、時間の
経過とともにプラズモン共振角は被検液内のアルブミン
濃度に応じた固有の値に近づいていく。被検液の送液を
開始してから第１の一定時間、例えば２０秒、が経過し
た時点（図６時刻ｔ１）でプラズモン共振角を測定する
（Ｓ３）。続いて、被検液の送液開始から第２の一定時
間、例えば４０秒、が経過した時点で（図６時刻ｔ２）
再びプラズモン共振角を測定する（Ｓ３）。そして、２
０秒後と４０秒後に測定した２つのプラズモン共振角の
差（つまり、この２０秒間の共振角変化量）からアルブ
ミン濃度を決定する（Ｓ５）。その後、被検液の送液を
止め、次に解離液を例えば３分間流し（Ｓ６）、その
後、バッファ液を４分間流す（Ｓ７）。これにより、プ
ラズモン共振角は基底値に復帰する。

【００４１】ところで、この本発明に従う検出方法は、
被検液の送液中の共振角が変化している間の一定時間帯
（例えば２０秒後から４０秒後まで）における共振角変
化量、換言すれば、被検液送液中の平均的な単位時間当
たり共振角変化量（共振角の時間微分つまり変化速度）
から、被検液内の検出対象物の濃度を決定する方法であ
り、以下、この方法を「微分法」と呼ぶ。これに対し、
従来の検出方法は、被検液の送液開始前の共振角（基底
値）と、被検液を十分な時間送った後の共振角が完全に
変化し終わった時点での共振角（エンドポイント）との
差に基づいて、被検液中の対象物濃度を決定する方法で
あり、以下、この従来方法を「エンドポイント法」と呼
ぶ。

【００４２】図７と図８は、同じＳＰＲセンサ装置と同
じアルブミン標準液とを用いて、微分法及びエンドポイ
ント法により実際にアルブミンの検量線をそれぞれ示
す。なお、図中の縦軸の画素数における１画素は、共振
角における１／１００度に相当する。

【００４３】これらの検量線を作成するため、5種類の
濃度（１、３、１０、３０、１００μｇ／ｍｌ）のアル
ブミン標準液を用意した。1回の測定につきバッファ液2
分間、被検液（アルブミン標準液）1分間、バッファ液2
分間、解離液3分間及びバッファ液4分間の順に送液し、
その間に2秒毎に共振角を計測した。各濃度につき5回づ
つ測定を行った。

【００４４】微分法に関しては、被検液の送液開始後２
０秒から４０秒の２０秒間の共振角変化量から、この２
０秒間における単位時間当たりの共振角変化量を算出し
た。そして、各濃度につき5回の単位時間当たりの共振
角変化量を算出して、その標準偏差に基づくＣＶ（変動
係数）値を求め、更に横軸にアルブミン濃度（対数）、
縦軸に変化量を取って図７に示す検量線を作成した。エ
ンドポイント法については、各濃度につき5回の被検液
送液前後の共振角の差を求め、その標準偏差に基づくＣ
Ｖ値を求め、更に横軸にアルブミン濃度（対数）、縦軸
に上記差を取って図８に示す検量線を作成した。図９
は、こうして求めた微分法とエンドポイント法によるＣ
Ｖ値を対比して示したものである。

【００４５】図７、８から分かるように、微分法でもエ
ンドポイント法でも十分に実用的な検量線を得ることが
できた。しかし、図９から分かるように、ＣＶ値は微分
法の方がエンドポイント法より小さく、特に、低濃度の
アルブミン溶液のＣＶ値を比較すると、例えば、１μｇ
／ｍｌアルブミン溶液ではエンドポイント法８．８％で
あったものが、本発明の微分法では４．２８％と大幅に
改善された。従って、微分法の方がエンドポイント法よ
り精度の高い検出が可能である。

【００４６】図１０〜図１３は、本発明にかかる６５
は、分析システムの幾つかの実施形態の構成を示す。

【００４７】図１０〜図１３において、符号６０は分子
ふるい作用を有する担体を充填したカラム（例えばTSKg
el G3000PWxl）６５を装着したＨＰＬＣ装置（高圧ＬＣ
装置）であり、被検液タンク６１からポンプ６３によっ
て被検液が高圧でカラム６５に送り込まれる。図１０の
実施形態では、カラム６５の下流に吸光度計６７が接続
され、その下流にＳＰＲセンサ検出表面上に目的物質と
特異的反応をする物質を固定化した検出用のＳＰＲセン
サ装置７１と、どのような物質とも反応をしない反応防
止膜をセンサ検出表面上に設けた別のリファレンス用の
ＳＰＲセンサ装置６９とが並列に接続されている。図１
１の実施形態では、カラム６５の下流に吸光度計６７と
検出用ＳＰＲセンサ装置７１とリファレンス用ＳＰＲセ
ンサ装置６９とが並列に接続されている。図１２の実施
形態では、カラム６５の下流に吸光度計６７とリファレ
ンス用ＳＰＲセンサ装置６９と検出用ＳＰＲセンサ装置
７１とが順に直列に接続されている。図１３の実施形態
では、カラム６５の下流にリファレンス用ＳＰＲセンサ
装置６９と吸光度計６７と検出用ＳＰＲセンサ装置７１
とが順に直列に接続されている。なお、検出用ＳＰＲセ
ンサ装置７１を通ると被検液内の目的物質の濃度が低下
するため、図１０、１２、１３のように検出用ＳＰＲセ
ンサ装置７１と他の測定装置とを直列接続する場合に
は、検出用ＳＰＲセンサ装置７１を最下流に配置するべ
きである。ここで用いるＳＰＲセンサ装置６９、７１と
しては、高圧の送液に耐えられる例えば図１に示したよ
うなものが好ましい。

【００４８】図１０〜図１３に示した分析システムで
は、吸光度計６７から出力されるＵＶ吸収チャートのど
のピークが所望の物質に対応するかの同定を、ＳＰＲセ
ンサ装置６９、７１が検出した共振角の差の変化を用い
て実時間で行うことができる。

【００４９】以下に、図１０の実施形態を用いて大腸菌
σ32因子の分離と検出を実際に行った例を説明する。酵
母エキス０．１％を加えたDavis最小培地で大腸菌K−１
２株を３７℃、8時間培養した。その後、菌体を０．１
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて、遠心分離にて
洗浄し、最終的に培養液の１／５容量の０．１Ｍリン酸
緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁させた（菌体濃度；約１０
の１０乗／ｍｌ）。この懸濁液を５ｍｌずつ試験管に分
注し、一方は３７℃、もう一方は４２℃の恒温水槽中で
10分間保温し、保温後、氷冷し、直ちにフレンチプレス
を用いて菌体を粉砕し、遠心分離後の上清（無細胞抽出
液）を回収した。

【００５０】続いて、カラム６５としてTSKgel G3000PW
xlを装着したＨＰＬＣ装置６０を用い、流速１．０ｍｌ
／ｍｉｎの０．２Ｍリン酸緩衝液を移動相として各無細
胞抽出液を分離した。

【００５１】カラム６５の後段において、２８０ｎｍの
吸光度をモニターする吸光度計６７を用いて、カラム６
４からの溶出液の吸光度をモニタリングした。更にその
後段で、抗σ32因子マウスモノクローナル抗体をセンサ
検出表面上に固定化した検出用ＳＰＲセンサ装置７１
と、抗体を固定化せず非特異吸着防止膜をセンサ検出表
面に設けたリファレンス用ＳＰＲセンサ装置６９のＳＰ
Ｒセンサ出力の差分（以下、ＳＰＲレスポンスという）
の変化をモニタリングした。

【００５２】そのモニタリングの結果を、図１４（３７
℃で保温した菌体の場合）と図１５（４２℃で保温した
菌体の場合）に示す。図１４、１５において、点線は吸
光度計の出力の時間経過に伴う変化を示し、実線はＳＰ
Ｒレスポンスの時間経過に伴う変化を示している。図１
４から分かるように、３７℃で保温した菌体の無細胞抽
出液には抗σ32因子マウスモノクローナル抗体との結合
に起因するレスポンスの変化はほとんど認められなかっ
た。これに対し、図１５に矢印で指し示すように、４２
℃で保温した菌体の無細胞抽出液には抗σ32因子マウス
モノクローナル抗体との結合に起因するレスポンスの変
化が明らかに認められた（すなわち、σ32因子がヒート
ショック蛋白であることが確認された）。このように、
吸光度計６７からのＵＶ吸収のパターンとＳＰＲレスポ
ンスのパターンを重ねることで、大腸菌の無細胞抽出液
よりσ32因子に相当する成分の分離と同定が同時に可能
であった。

【００５３】以上、本発明についての幾つかの実施形態
を説明したが、本発明は上記実施例に限られるものでは
なく、その要旨を逸脱しない範囲において種々の変形や
改良を加えた他の形態でも実施することが可能である。
例えば、検出対象が他のタンパク、糖タンパク、核酸な
どであっても上述と同様の効果が得られるのは言うまで
もない。また図１5においてＳＰＲセンサのレスポンス
が変化した後、センサの検出部分に吸着した被検体を塩
酸などを用いて分離再生してその後の測定を続けても良
い。

【００５４】

【発明の効果】本発明の１つの側面に従うＳＰＲセンサ
装置は、小型であっても、層流をセンサ検出表面上を流
せるために測定精度が高い。

【００５５】本発明の別の側面に従うＳＰＲセンサ装置
は、電気的センサを小型に内蔵しているため、小型であ
っても複数物質の同時検出が可能である。

【００５６】本発明のＳＰＲ検出方法である微分法は検
出精度が高い。

【００５７】本発明の分析システムは、ＬＣを用いた生
理活性物質の分離精製及び生理活性物質の測定と、ＳＰ
Ｒ装置による所望の生理活性物質のピークの同定とを実
質的に同時に行えるので、ＬＣを用いた分析の効率が向
上する。

【図面の簡単な説明】

【図１】 本発明のＳＰＲセンサ装置の一実施形態の要
部の断面図。

【図２】 図１に示したＳＰＲセンサ装置に適用可能な
ポンプの一例の断面図。

【図３】 図２のポンプの外部流路の配置を示す平面
図。

【図４】 図１に示したＳＰＲセンサ装置と図２に示し
たポンプとを組合せた検出システムの一例の全体構成
図。

【図５】 本発明のＳＰＲ検出方法の一実施形態を示す
フローチャート。２のポンプの外部流路の配置を示す平
面図。

【図６】 図５の検出方法を実施している間のプラズモ
ン共振角の変化を示す図。

【図７】 本発明の測定方法によるアルブミンの検量線
を示す図。

【図８】 従来法によるアルブミンの検量線を示す図。

【図９】 微分法とエンドポイント法によるＣＶ値を対
比して示したものである。

【図１０】 本発明の分析システムの第１の実施形態の
構成図。

【図１１】 本発明の分析システムの第２の実施形態の
構成図。

【図１２】 本発明の分析システムの第３の実施形態の
構成図。

【図１３】 本発明の分析システムの第４の実施形態の
構成図。

【図１４】 37℃、10分熱処理した大腸菌無細胞抽出液
の溶出液のＵＶ吸収パターンとσ32因子検出用のＳＰＲ
レスポンスのパターンとを示した図。

【図１５】 42℃、10分熱処理した大腸菌無細胞抽出液
の溶出液のＵＶ吸収パターンとσ32因子検出用のＳＰＲ
レスポンスのパターンとを示した図。

【符号の説明】

１ 供給管 ２ ＳＰＲセンサ検出表面 ３ プリズム ４ 排出管 ５ 管昇降機構 ９ 電極 ４１ ポンプ ５１、６９、７１ ＳＰＲセンサ装置 ６０ ＨＰＬＣ装置 ６５ カラム ６７ 吸光度計

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 神崎 景介 福岡県北九州市小倉北区中島２丁目１番１ 号 東陶機器株式会社内 (72)発明者 曾根崎 修司 福岡県北九州市小倉北区中島２丁目１番１ 号 東陶機器株式会社内 (72)発明者 小川 恵美香 福岡県北九州市小倉北区中島２丁目１番１ 号 東陶機器株式会社内

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 表面プラズモン励起光が照射される検出
   表面をもったＳＰＲセンサ表面と、 前記検出表面に流体を供給するための管であって、前記
   流体が層流となって内部を流れるのに十分な長さをも
   ち、前記検出表面に対し近接して正対するよう配置され
   た出口を有する供給管とを有するＳＰＲセンサ装置。
2. 【請求項２】 請求項1に記載のＳＰＲセンサ装置にお
   いて、前記供給管の内径が、前記検出表面に照射される
   前記表面プラズモン励起光のスポットの径よりも大きい
   ＳＰＲセンサ装置。
3. 【請求項３】 請求項１に記載のＳＰＲセンサ装置にお
   いて、前記供給管の前記出口付近の内径が、前記出口に
   向かって喇叭状に滑らかに拡大しているＳＰＲセンサ装
   置。
4. 【請求項４】 請求項1に記載のＳＰＲセンサ装置にお
   いて、前記供給管の出口面が前記検出表面に対して平行
   であるＳＰＲセンサ装置。
5. 【請求項５】 請求項1に記載のＳＰＲセンサ装置にお
   いて、前記検出表面と前記供給管の出口との距離が可変
   であるＳＰＲセンサ装置。
6. 【請求項６】 請求項lに記載のＳＰＲセンサ装置にお
   いて、前記流体を排出するための管であって、前記供給
   管より大きい内径をもち、前記供給管を包囲するように
   して配置され、前記検出表面の周囲にて前記ＳＰＲセン
   サ表面と結合された入口面を有する排出管を更に備えた
   ＳＰＲセンサ装置。
7. 【請求項７】 請求項６に記載のＳＰＲセンサ装置にお
   いて、前記排出管の入口付近の内径が、前記前記ＳＰＲ
   センサ表面に連続的につながるよう曲線的に狭まってい
   るＳＰＲセンサ装置。
8. 【請求項８】 請求項６に記載のＳＰＲセンサ装置にお
   いて、前記供給管の外周面及び前記排出管の内周面の少
   なくとも一方に、電気化学センサのための電極が取り付
   けられているＳＰＲセンサ装置。
9. 【請求項９】 被検液をＳＰＲセンサに導入している間
   における、前記ＳＰＲセンサが検出する表面プラズモン
   共振角の単位時間当たりの変化量から前記被検液に含ま
   れる目的物質の濃度を求めるＳＰＲ検出方法。
10. 【請求項１０】 被検液に含まれる複数物質を分離する
    カラムと、 前記カラムからの溶出液が導入される吸光度計と、 前記カラムからの溶出液が導入される、目的物質に応答
    する信号を出力するＳＰＲセンサ装置とを備えた分析シ
    ステム。