JPH10509039A

JPH10509039A - リボザイムアナログ

Info

Publication number: JPH10509039A
Application number: JP8516243A
Authority: JP
Inventors: グッドチャイルド，ジョン; レナード，トーマス・イー
Original assignee: Idera Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Idera Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1994-11-09
Filing date: 1995-11-08
Publication date: 1998-09-08
Also published as: US5650502A; US5679555A; AU4155396A; WO1996015240A3; CA2204870A1; EP0791060A2; WO1996015240A2

Abstract

(57)【要約】３'から５'へ結合したリボヌクレオチドの配列をエンドヌクレオチド分解により開裂する能力を有するリボザイムアナログを開示する。該リボザイムアナログは、３'から５'へ共有結合した複数のヌクレオチド、および該ヌクレオチドの２つに共有結合した少なくとも一つの非ヌクレオチド性分子を有する堅固な分子性リンカーを含む。本発明のリボザイムアナログの製造方法および利用方法、並びに該リボザイムアナログを含有する医薬組成物およびキットをも開示する。

Description

【発明の詳細な説明】リボザイムアナログ発明の背景本発明は、部位特異的なＲＮＡ開裂に有用なエンドヌクレオチド分解活性および半減期の増大した分子に関する。本発明はまた、ｍＲＮＡの分解による遺伝子発現の制御に関する。リボザイムは、それが結合したＲＮＡ分子、たとえばｍＲＮＡ、ＲＮＡ含有基質およびリボザイムそれ自体において特異的なホスホジエステル結合を開裂する能力を含む触媒活性を有するＲＮＡ分子である。リボザイムは幾つかの物理構造の一つをとり、その一つは「ハンマーヘッド（ hammerhead）」と呼ばれる。ハンマーヘッドリボザイムは、９つの保存された塩基を含有する触媒コア、二本鎖のステムおよびループ構造（ステム−ループII）、および該触媒コアの領域の両側にある（フランキングする）標的ＲＮＡに相補的な２つの領域からなる。フランキング領域は、二本鎖のステムＩおよびIIIを形成することによってリボザイムが標的ＲＮＡに特異的に結合することを可能にする。開裂は、３',５'−リン酸ジエステルから２',３'−環状リン酸ジエステルへのエステル交換反応により特定のリボヌクレオチドトリプレットの隣でシス（すなわち、ハンマーヘッドモチーフを含有する同じＲＮＡ分子の開裂）かまたはトランス（該リボザイムを含有するものとは異なるＲＮＡ基質の開裂）で起こる。現在、この触媒活性にはリボザイムの触媒領域中の特定の高度に保存された配列の存在が必要であると信じられている。リボザイムのエンドヌクレオチド分解活性はインビトロでは示されているが、リボザイムはＲＮアーゼに感受性であるためインビボでの使用は制限されている。さらに、３０またはそれ以上のヌクレオチドを有するリボザイムなどの治療剤の製造は一層高価であり、大量に製造するのは困難である。それゆえ、インビトロおよびインビボでＲＮＡを開裂したりインビボでの使用のために遺伝子発現を制御したりするのに用いることのできるヌクレアーゼ耐性の増大した一層小さな分子に対する必要性が存在する。アンチセンスオリゴヌクレオチドをインビボでの分解影響から保護する努力がなされる中で、これら分子に対して種々の構造上の修飾が施されており、このような修飾にはホスホジエステル結合の非ホスホジエステル結合による置換、種々の糖基および塩基の置換、末端キャッピング基の付加、および存在する構造の自己ハイブリダイズ末端による置換が含まれる（グッドチャィルド（Ｇoodchild）（１９９０）Ｂioconjugate Ｃhem.１：１６５〜１８７；アグラワル（Ａgrawal ）ら（１９９２）Ｔrends.Ｂiotechnol.１０：１５２〜１５８；ＷＯ９３／１５１９４；ＷＯ９４／１０３０１；ＷＯ９４／１２６３３に概説されている）。しかしながら、ＲＮＡ分子をエンドヌクレアーゼによる消化から保護する修飾はまたリボザイムの触媒活性にも影響を及ぼす。たとえば、ペロール（Ｐerreau lt）ら（Ｎature（１９９０）３４４：５６５〜５６７）は、リボザイム配列内の種々の保存された位置でのリボヌクレオチドの２'−デオキシリボヌクレオチドによる置換が触媒効率の９６％の減少となることを報告している。ペロールら（Ｂiochem.（１９９１）３０：４０２０〜４０２５）およびダーン（Ｄahn）ら（Ｂiochem.（１９９０）７２：８１９〜２３）は、種々の２'−ヒドロキシル基の水素原子による置換がハンマーヘッドリボザイムの触媒活性を減少させることを開示している。オルセン（Ｏlsen）ら（Ｂiochem.（１９９１）３０：９７３５〜９７４１）は、すべてのアデノシン残基上の２'−ヒドロキシル基のフッ素かまたは水素による置換がリボザイムの触媒活性を減少させることを報告している。オダイ（Ｏdai）ら（ＦＥＢＳＬett.（１９９０）２６７：１５０〜１５２）は、コア領域中の保存されたグアノシン残基の環外アミノ基の水素による置換が触媒活性を減少させることを報告している。ラッフナー（Ｒuffner）ら（Ｎuc leic Ａcids Ｒes.（１９９０）１８：６０２５〜６０２９）およびブザヤン（Ｂuzayan）ら（Ｎucleic Ａcids Ｒes.（１９９０）１８：４４４７〜４４５１）は、種々のインターヌクレオチドリン酸残基上の酸素原子を硫黄で置換すると触媒活性が減少することを開示している。ピーケン（Ｐieken）ら（Ｓcience（１９９１）２５３：３１４〜３１７）は、アデノシン残基上の種々の２'−ヒドロキシル基をフッ素で置換したとき、およびシチジン残基上の２'−ヒドロキシル基をアミン基で置換したときに触媒活性が減少することを開示している。他の研究グループは、リボザイム内のヌクレオチドをヌクレオチドアナログで置換している。たとえば、ウスマン（Ｕsman）ら（ＷＯ９３／１５１８７）は、触媒活性において重要な部位にリボヌクレオチドまたは核酸アナログ（修飾された糖、リン酸、または塩基を有する）を、触媒活性において重要でない部位に核酸アナログまたはデオキシリボヌクレオチドを有する、リボザイム様の触媒活性を有するキメラポリマーまたは「ヌクレオザイム」をデザインしている。最近、触媒活性を減ずることなく一層安定な分子をデザインする努力の中で、ハンマーヘッドリボザイムのステム−ループII構造の長さを短くするなどの修飾がなされている。たとえば、グッドチャイルドら（Ａrch.Ｂiochem.Ｂiophys.（１９９１）２８４：３８６〜３９１）は、ステムIIおよびループIIを一層短いヌクレオチド配列で置換している。ツシュル（Ｔuschl）ら（Ｐroc.Ｎatl.Ａcad. Ｓci.（ＵＳＡ）（１９９３）９０：６９９１〜６９９４）は、ステムIIを２塩基対まで短くし、４塩基対ループで囲まれたハンマーヘッドリボザイムを調製した。マッコール（ＭcＣall)ら（Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.（ＵＳＡ）８９：５７１０〜５７１４）は、活性を減ずることなく、ステム−ループをワトソン−クリック型の塩基対を形成できない少数のヌクレオチドで置換し、および／またはステム−ループIIおよびフランキングアームをＤＮＡで置換した。リボザイム構造の修飾にはまた、該分子の非コア部分の非ヌクレオチド性分子による置換が含まれる。たとえば、ベンセラー（Ｂenseler）ら（Ｊ.Ａm.Ｃhem. Ｓoc.（１９９３）１１５：８４８３〜８４８４）は、ステムIIの２つの塩基対、およびループIIの４つのすべてのヌクレオチドを、ヘキサエチレングリコール、プロパンジオール、ビス（トリエチレングリコール）ホスフェート、トリス（プロパンジオール）ビスホスフェート、またはビス（プロパンジオール）ホスフェートに基づく非ヌクレオシド結合で置換した。マ（Ｍａ）ら（Ｂiochem.（１９９３）３２：１７５１〜１７５８；Ｎucleic Ａcids Ｒes.（１９９３）２１：２５８５〜２５８９）は、ＴＡＲリボザイムヘアピンの６ヌクレオチドループを非ヌクレオチド性のエチレングリコール関連リンカーで置換した。トムソン（Ｔho mson）ら（Ｎucleic Ａcids Ｒes.（１９９３）２１：５６００〜５６０３）は、ループIIを長さが１３、１７および１９原子の直鎖状の非ヌクレオチド性のリンカーで置換した。しかしながら、現在までのところ、リボザイムのステム−ループ領域および触媒コアの非保存領域のいずれの領域のヌクレオチドも、一層堅固な非ヌクレオチド性の分子では置換されていない。回転の制限された非ヌクレオチド性のリンカーまたはインサートは、可撓性の一層少ない分子を与え、酵素の条件に一層沿うものとなる。それゆえ、必要とされるのは、ヌクレアーゼ耐性およびエンドヌクレオチド分解活性が改善され、速やかにしかも低コストで調製しうる分子である。発明の要約本発明は、エンドヌクレオチド分解により一本鎖ＲＮＡを開裂しうる、ヌクレアーゼ耐性の増大したヌクレオチド触媒分子すなわちリボザイムアナログを提供する。これらリボザイムアナログは、該リボザイムのステム−ループまたは触媒コアの非保存領域のいずれかに置換された少なくとも一つの分子または「ユニット」を含む、堅固な非ヌクレオチド性のリンカーを含む。堅固な分子性リンカーは、少なくとも一つの非ヌクレオチド性分子から形成しうることが見出された。また、リボザイムのステム−ループIIおよび触媒コアの非保存領域の幾つかまたはすべてを少なくとも一つの堅固な非ヌクレオチド性分子で置換することは、得られたリボザイムアナログが一本鎖ＲＮＡをエンドヌクレオチド分解により開裂する能力を損なうことなく行いうることも見出された。ヌクレオチド置換および非ヌクレオチド置換を有するリボザイムが調製されているが、今日まで本件出願におけるような堅固な非ヌクレオチド性分子による置換はなされたことがない。さらに、これまでのところ、ステム−ループIIの全領域の置換は、得られたリボザイムが一本鎖ＲＮＡをエンドヌクレオチド分解により開裂する能力を損なうことなく行われたためしはない。これら知見を用いて本発明を開発したが、本発明は一つの側面において堅固な分子性リンカーを含む。該リンカーは少なくとも一つの堅固な非ヌクレオチド性分子または「ユニット」を含み、該堅固な非ヌクレオチド性分子または「ユニット」は好ましい態様においてシクロヘキサンジオール、ステロイド、ルペンジオール、イソソルビド（isosorbides）またはそれらの組み合わせを含む。本明細書において「非ヌクレオチド性」とは、ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを含まない分子または該分子の特定部分をいう。従って、「ヌクレオチド性」とはヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを含有する分子または該分子の特定部分をいう。本発明の目的のためには、「堅固な」とは、単純な直鎖状分子に比べて分子内回転の自由度が制限された分子構造の物理状態をいう。本発明の幾つかの態様において、リンカーは少なくとも２つの隣接し共有結合した非ヌクレオチド性分子を含む。そのような態様において、リンカーの該分子は、ホスホジエステル結合、アルキルホスホネート結合、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、アルキルホスホノチオエート結合、ホスホルアミデート結合、リン酸エステル結合、カルバメート結合、カーボネート結合、アセトアミデート結合、またはカルボキシメチルエステル結合により、またはそれら結合の組み合わせにより共有結合している。幾つかの好ましい態様において、リンカーは２〜２０の非ヌクレオチド性分子を含む。他の態様において、リンカーは少なくとも４つの共有結合したシクロヘキサンジオールユニット、たとえば、トランス−１,２−シクロヘキサンジオール、シス−１,２−シクロヘキサンジオール、トランス−１,３−シクロヘキサンジオール、シス−１,３−シクロヘキサンジオール、トランス−１,４−シクロヘキサンジオール、シス−１,４−シクロヘキサンジオール、およびそれらの組み合わせを含む。本発明の一つの特定のリンカーは４つのシクロヘキサンジオールユニットからなる。本発明の他の態様において、非ヌクレオチド性の分子性リンカーの調製方法が提供される。この方法において、複数の堅固な非ヌクレオチド性分子が、ホスホジエステル結合、ホスホルアミデート結合、アルキルホスホネート結合、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、アルキルホスホノチオエート結合、リン酸エステル結合、カルバメート結合、カーボネート結合、アセトアミデート結合、カルボキシメチルエステル結合、またはこれらの組み合わせよりなる群から選ばれた結合により共有結合される。一つの態様において、複数のトランス−１−Ｏ−（４,４'−ジメトキシトリチル）−２−Ｏ−（β−シアノエトキシ）−（Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルアミン）］ホスフィノ−１,２−シクロヘキサンジオールユニットが調製される。そのようなユニットの１番目がそのようなユニットの２番目に共有結合する。ついで、そのようなユニットの３番目がそのようなユニットの２番目に共有結合し、そのようなユニットの４番目がそのようなユニットの３番目に共有結合し、かくして分子性リンカーを形成する。本発明の他の側面は、上記方法により調製した分子性リンカーである。他の側面において、本発明は、エンドヌクレオチド分解活性を有し、ハンマーヘッドリボザイムと類似の構造を有するが、対照的にステム−ループII領域中に置換されるかまたはその全領域が上記堅固な分子性リンカーで置換された「リボザイムアナログ」またはリボザイム様ＲＮＡ含有分子を提供する。一つの態様において、本発明のリボザイムアナログは、第一のヌクレオチド性コア領域および第二のヌクレオチド性コア領域によりフランキングされこれら領域に共有した、堅固な非ヌクレオチド性の分子性リンカーを含むヌクレオチド性のステム−ループII領域を有する。これら第一および第二のヌクレオチド性コア領域は触媒コアを形成する。第一のヌクレオチド性フランキング領域は第一の触媒コアに連結し、第二のヌクレオチド性フランキング領域は第二の触媒コア領域に連結される。本発明のリボザイムアナログのステム−ループII領域は、複数の３'から５'へ共有結合した自己ハイブリダイズヌクレオチドを含み、堅固な分子性リンカーに共有結合した３'末端および５'末端を有する。本明細書において「自己ハイブリダイズ」とは、ステム−ループII上のステム領域中に存在し、互いに相補的で通常のワトソン−クリック型の塩基対を形成するヌクレオチドをいう。このステム領域は２本の相捕的なヌクレオチド鎖を有し、これら鎖には一方の鎖上の一つのヌクレオチドと他方の鎖上の一つのヌクレオチドが含まれ、これらが一緒になって塩基対を形成する。一つの制限されない例において、ステム−ループのステムは２〜６の塩基対を有する。ステム−ループIIは、第一および第二のヌクレオチド性の一本鎖ヌクレオチド性コア領域に共有結合している。各ヌクレオチド性コア領域は、複数の３'から５'へ共有結合したヌクレオチドを含み、それぞれ３'末端および５'末端を有する。第一のヌクレオチド性コア領域の３'末端はステム−ループIIの５'末端に連結し、第二のヌクレオチド性コア領域の５'末端はステム−ループIIの３'末端に連結している。触媒コア領域は第一および第二のフランキング領域によりフランキングされている。第一のフランキング領域は少なくとも一部が基質ＲＮＡ分子の第一の標的領域に相補的であり、第二のフランキング領域は少なくとも一部が基質ＲＮＡ分子の第二の標的領域に相補的である。第一のフランキング領域中の少なくとも４つのヌクレオチドが基質ＲＮＡの第一の標的領域中の少なくとも４つのヌクレオチドに相補的であり、第二のフランキング領域中の少なくとも４つのヌクレオチドが基質ＲＮＡの第二の標的領域中の少なくとも４つのヌクレオチドに相捕的である。第一の標的領域と第二の標的領域とは、互いに排他的である。本明細書において「相補的」とは、フランキング領域がヌクレオチドの特定の配列と通常のワトソン−クリック型の塩基対形成によりハイブリダイズしうる能力をいう。「標的ＲＮＡ」および「基質ＲＮＡ」とは、リボザイムアナログによって認識および開裂される、３'から５'へ共有結合したリボヌクレオチドからなるオリゴリボヌクレオチドをいう。第一のフランキング領域の３'末端は第一のヌクレオチド性コア領域の５'末端に連結し、第二のフランキング領域の５'末端は第二のヌクレオチド性コア領域の３'末端に連結している。幾つかの態様において、第一および第二のフランキング領域および第一および第二のヌクレオチド性コア領域は、ホスホジエステル結合、アルキルホスホネート結合、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、アルキルホスホノチオエート結合、ホスホルアミデート結合、リン酸エステル結合、カルバメート結合、カーボネート結合、アセトアミデート結合、カルボキシメチルエステル結合、またはこれら結合の組み合わせよりなる群から選ばれたインターヌクレオチド結合により共有結合した複数のヌクレオチドを含む。好ましい態様において、第一および第二のフランキング領域および第一および第二のヌクレオチド性コア領域は、リボヌクレオチド、リボヌクレオチドのアナログ、デオキシリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドのアナログ、およびこれらの組み合わせからなる。本明細書においてデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはヌクレオチドの「アナログ」とは、修飾した構造を有するヌクレオチドをいう。修飾としては、ヌクレオチドの糖、塩基またはリン酸基を含むヌクレオチドのいずれかの部分での付加、還元または置換が挙げられる。幾つかの態様において、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのアナログは、アルキルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホノチオエート、ホスホルアミデート、リン酸エステル、リン酸トリエステル、カルバメート、カーボネート、アセトアミデート、カルボキシメチルエステル、およびこれらの組み合わせである。一つの特定の態様において、リボザイムアナログ中の少なくとも一つのリボヌクレオチドアナログは２'− Ｏ−メチルリボヌクレオチドアナログである。本発明の他の態様において、触媒コアを形成する２つのヌクレオチド性コア領域によってフランキングされた堅固な分子性リンカー、および２つのフランキング領域を含むリボザイムアナログが提供される。リンカーは、２つのヌクレオチド性コア領域に共有結合した少なくとも一つの非ヌクレオチド性分子を含む。各ヌクレオチド性コア領域は複数の３'から５'へ共有結合したヌクレオチドを含み、それぞれ３'末端および５'末端を有する。各フランキング領域は、少なくとも４つの３'から５'へ共有結合したヌクレオチドを含む。第一のヌクレオチド性コア領域の５'末端は第一のフランキング領域の３'末端に共有結合し、第二のヌクレオチド性コア領域の３'末端は第二のフランキング領域の５'末端に共有結合している。第一のフランキング領域の少なくとも一部は基質ＲＮＡ分子上の第一の標的領域に相補的であり、第二のフランキング領域の少なくとも一部は同基質ＲＮＡ分子上の第二の標的領域に相補的である。本発明の他の側面は、基質ＲＮＡ分子の発現を制御する方法である。この方法において、本発明のリボザイムアナログを用意し、これを用いて該ＲＮＡと接触させる。「用意」とは、供給、利用可能または調製することをいう。該リボザイムアナログの第一のフランキング領域が該基質ＲＮＡの第一の標的領域にハイブリダイズし、第二のフランキング領域が該基質ＲＮＡの第二の標的領域にハイブリダイズし、かくして該リボザイムアナログが該基質ＲＮＡを開裂することを可能にする。このようにして、該基質ＲＮＡの発現、すなわちタンパク質に翻訳される能力が制御される。該方法の幾つかの態様において、開裂しようとする基質ＲＮＡはまた、リボザイムアナログに接触させると同時にファシリテーターオリゴヌクレオチドにも接触させる。本明細書において「ファシリテーターオリゴヌクレオチド」とは、該リボザイムアナログのいずれかのフランキング領域によってターゲティングされる第一または第二の標的領域に近接するＲＮＡ基質上のリボヌクレオチド配列に相補的でハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチドをいう。本発明の他の態様において、一本鎖のＲＮＡ含有基質を部位特異的に開裂する方法が提供され、該方法は、本発明のリボザイムアナログを用意し、ついで該リボザイムアナログの第一のフランキング領域が該基質ＲＮＡの第一の標的領域にハイブリダイズし、該リボザイムアナログの第二のフランキング領域が該基質ＲＮＡの第二の標的領域にハイブリダイズし、かくして該リボザイムアナログが該ＲＮＡ基質を部位特異的に開裂することを可能にするように、該ＲＮＡ含有基質分子を該リボザイムアナログと接触させることを含む。本明細書において「部位特異的開裂」とは、リボヌクレオチドの特定の配列の前または後で基質ＲＮＡ分子のリン酸骨格を酵素的に切断することをいう。幾つかの態様において、該方法はさらに、該基質ＲＮＡ分子を該リボザイムアナログに接触させると同時にファシリテーターオリゴヌクレオチドに接触させることを含む。本発明の他の側面は、本明細書に記載するリボザイムアナログの製造方法である。この方法において、第一のフランキング領域を複数のヌクレオチドを共有結合することにより形成する。このことは、一つのヌクレオチドの３'末端を他のヌクレオチドの５'末端に連結させ、以下同様に行うことによって行う。ついで、第一のフランキング領域の５'末端に第一のヌクレオチド性コア領域のヌクレオチドを３'から５'へ一つずつ共有結合させる。ついで、二本鎖ステムIIの一方の鎖のヌクレオチドを第一のヌクレオチド性コア領域の５'末端に３'から５'へ共有結合させる。ついで、堅固な分子性リンカーを形成する少なくとも一つの非ヌクレオチド性分子をステムII領域の５'末端に共有結合により結合させる。幾つかの態様において、これら共有結合は、ホスホジエステル結合、アルキルホスホネート結合、リン酸エステル結合、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、アルキルホスホノチオエート結合、カルバメート結合、カーボネート結合、アセトアミデート結合、カルボキシメチルエステル結合、またはホスホルアミデート結合である。ついで、ステムIIの第二の鎖を該リンカーの非結合末端に対して構築する。このことは、該リンカーの非ヌクレオチド性分子にヌクレオチドの３'末端を結合させ、ついで該リンカーにすでに結合したヌクレオチドに複数のヌクレオチドを３'から５'へ一つずつ共有結合させ、ついで互いに、すでに結合したヌクレオチドの５'末端に結合すべきヌクレオチドの３'末端を結合させることにより行う。同様に、ステムIIの第二の鎖の３'末端に第二のヌクレオチド性コア領域を形成する複数のヌクレオチドを共有結合し、一つのヌクレオチドの５'末端を最初にステムIIの第二の鎖の３'末端に結合させる。ついで、第二のフランキング領域を形成する複数のヌクレオチドを、第二の触媒コア領域の５'末端に共有結合させる。このことは、一つのヌクレオチドの３'末端を触媒コア領域の５'末端に結合させ、ついで結合したヌクレオチドの５'末端に他のヌクレオチドの３'末端を同様に結合させ、以下同様にすることによって行う。本発明の他の側面は、上記方法に従って調製したリボザイムアナログである。本発明はまた、生理学的に許容しうる担体中に本発明のリボザイムアナログを含む治療組成物をも提供する。幾つかの態様において、該組成物はさらにファシリテーターオリゴヌクレオチドを含む。本発明のさらに他の側面は、本発明の少なくとも一つのリボザイムアナログを含むキットである。幾つかの態様において、該キットはさらにファシリテーターオリゴヌクレオチドを含む。他のキットはまた生理学的に許容しうる担体を含む。本発明の他の側面は、ヌクレオチド性ステム−ループII領域、第一および第二のフランキング領域、および第一および第二の触媒コア領域を含み、該第一の触媒コア領域が堅固な分子性リンカーを含むリボザイムアナログである。このヌクレオチド性ステム−ループII領域は３'末端および５'末端を有し、３'から５'へ共有結合し自己ハイブリダイズする複数のヌクレオチドを含む。第一および第二の触媒コア領域は、それぞれ３'から５'へ共有結合した複数のヌクレオチドからなり、各コア領域は３'末端および５'末端を有する。第一の触媒コア領域中の堅固な分子性リンカーは非保存性ヌクレオチドと置換しており、該領域中の２つのヌクレオチドと共有結合している。第一の触媒コア領域の３'末端はステム−ループII領域の５'末端と共有結合しており、第二の触媒コア領域の５'末端はステム−ループII領域の３'末端に共有結合している。第一の触媒コア領域の５'末端には第一のフランキング領域が共有結合しており、第二の触媒コア領域の３'末端には第二のフランキング領域が共有結合している。第一および第二のフランキング領域は、それぞれ３'から５' へ共有結合した複数のヌクレオチドを含み、各フランキング領域は３'末端および５'末端を有し、第一のフランキング領域の少なくとも一部は基質ＲＮＡ分子の第一の標的領域に相捕的であり、第二のフランキング領域の少なくとも一部は該基質ＲＮＡ分子の第二の標的領域に相補的である。本発明の幾つかの態様において、ステム−ループIIおよび触媒コア領域の少なくとも一つの両者が堅固な分子性リンカーを含む。図面の簡単な説明本発明の上記および他の目的、その種々の特徴、並びに本発明そのものは、添付の図面とともに以下の記載を読んだときに一層完全に理解される。該図面において：図１は、基質ＲＮＡにハイブリダイズした共通ハンマーヘッドリボザイムの模式図であり、保存されたリボヌクレオチド（Ｃ、Ｕ、Ｇ、Ａ、Ｇ、Ａ、Ｇ、Ａ、Ａ）および非保存性ヌクレオチド（Ｎ）が該リボザイムの触媒コア中に存在し、該基質ＲＮＡ中のヌクレオチド（Ｙ）の３'側で開裂が起こることを示す；図２Ａは、基質ＲＮＡにハイブリダイズした本発明のリボザイムアナログの一つの態様の模式図であり、「Ｘ_n」はリンカー内の非ヌクレオチド性分子を示す；図２Ｂは、基質ＲＮＡにハイブリダイズした本発明のリボザイムアナログの他の態様の模式図であり、「Ｘ_n」はリンカー内の非ヌクレオチド性分子を示す；図２Ｃは、基質ＲＮＡにハイブリダイズした本発明のリボザイムアナログの他の態様の模式図であり、「Ｘ_n」はリンカー内の非ヌクレオチド性分子を示す；図２Ｄは、基質ＲＮＡにハイブリダイズした本発明のリボザイムアナログのさらに他の態様の模式図であり、「Ｘ_n」はリンカー内の非ヌクレオチド性分子を示す；図３Ａは、本発明の分子性リンカーに有用な代表的なシクロヘキサンジオールユニットの模式図である；図３Ｂは、本発明の分子性リンカーに有用な代表的なイソソルビドの模式図である；図３Ｃは、本発明の分子性リンカーに有用なステロイドの模式図である；図３Ｄは、本発明の分子性リンカーに有用な代表的なルペンジオールの模式図である；図４は、本発明の分子性リンカーに有用なシクロヘキサンジオールユニットの調製を示す模式図である；図５は、リン造影剤（phosphor imager）により生成したポリアクリルアミドゲルのオートラジオグラムであり、ｐＨ８および９においてリボザイムアナログＴＬＩ−８６Ａで処理した³²Ｐ標識基質ＲＮＡの開裂生成物およびリボザイム（対照）で処理した基質ＲＮＡの開裂生成物および非処理基質ＲＮＡおよびリボザイムＲＺＭＺ−１（対照）について行ったものである；図６は、リン造影剤により生成したポリアクリルアミドゲルのオートラジオグラムであり、ｐＨ８〜１０においてリボザイム対照ＴＬＩ−７１Ａで処理した³² Ｐ標識基質ＲＮＡの開裂生成物、ｐＨ８〜１０においてリボザイムアナログＴＬ１−７５Ａで処理した基質ＲＮＡの開裂生成物、リボザイム対照の開裂生成物、および非処理基質ＲＮＡ対照について行ったものである；図７Ａは、基質ＲＮＡにハイブリダイズした本発明のリボザイムアナログの一つの態様およびファシリテーターオリゴヌクレオチド（Ｆ１）の模式図である；図７Ｂは、基質ＲＮＡにハイブリダイズした本発明のリボザイムアナログの他の態様およびファシリテーターオリゴヌクレオチド（Ｆ１）の模式図である；図８は、リン造影剤により生成したポリアクリルアミドゲルのオートラジオグラムであり、ファシリテーターオリゴヌクレオチド（Ｆ１）の存在下または不在下、４５℃にてリボザイムアナログＴＬ１−１２８ＡまたはＴＬ１−１３４Ａで処理した³²Ｐ標識基質ＲＮＡの開裂生成物、およびファシリテーターオリゴヌクレオチド（Ｆ１）の存在下または不在下、３７℃にてリボザイム処理したまたは処理していない基質ＲＮＡ（対照）について行ったものである；図９は、ファシリテーターオリゴヌクレオチドＦ１の存在下または不在下にてリボザイムアナログＲ４５および対照リボザイムＲ２２を³²Ｐ標識基質ＲＮＡとともにインキュベートし、得られた開裂生成物をＰＡＧＥ、オートラジオグラフィー、およびスキャニングデンシトメトリーにより定量した消化実験の結果を示すグラフである。好ましい態様の詳細な説明本明細書中に引用する特許および科学文献は当業者に利用可能な知識を確立するものである。発行された米国特許、許された特許出願、およびそれらに引用された文献は参照のため本明細書中に引用する。ハンマーヘッドリボザイムはハーゼロッフ（Ｈaseloff）およびゲルラッハ（Ｇerlach）によって作成されたが（Ｎature（１９８８）３３４：５８５〜５９１）、図１に示してあるように、９つの保存されたリボヌクレオチドを有する触媒コア領域の２つの部分を連結し、標的ＲＮＡに相補的な２つの領域によってフランキングされた、二本鎖のステムおよびループ構造（ステム−ループII）からなる。フランキング領域は、二本鎖のステムＩおよびIIIを形成することによりリボザイムが標的ＲＮＡに特異的に結合するのを可能にする。現在信じられているところではリボザイムが一本鎖ＲＮＡを開裂する能力を維持するためにはリボザイムの触媒コア領域のヌクレオチド配列の大部分が保存されていなければならないが（コイスミ（Ｋoisumi）ら（１９９１）Ｂiochem.３０：５１４５〜５１５０；トムソン（Ｔhomson）ら（１９９３）Ｎucleic Ａcids Ｒes.２１：５６００〜５６０３）、今や該開裂はリボザイムのステム−ループまたは触媒コア領域中にヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ以外の堅固な分子を含有する分子によって達成しうることがわかった。さらに、これら非ヌクレオチド性の分子は一緒に連結することによってアンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイムアナログおよび他の分子に有用な分子性リンカーを形成しうる。これら知見に基づいて本発明を開発したものであり、本発明は、堅固な非ヌクレオチド性の分子性リンカーおよび該リンカーを含有するハンマーヘッドリボザイムのアナログを提供するものである。後者のハンマーヘッドリボザイムアナログは一本鎖ＲＮＡおよびＲＮＡ含有基質をエンドヌクレオチド分解により開裂する能力を有する。それゆえ、本発明によるリボザイムアナログはＲＮＡ特異的な制限エンドヌクレアーゼとして有用であり、そのようなものとしてＲＮＡリガーゼと組み合わせたときに組換えＲＮＡ分子の調製を可能にする。本発明のリボザイムアナログは、リボザイムのステム−ループII、またはステム−ループIIおよび／または少なくとも一つの非保存性触媒コア領域が、ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログのいずれをも含有しない堅固な分子性リンカーで部分的または完全に置換されている点で共通のハンマーヘッドリボザイムとは構造が異なる（図２Ａ〜２Ｄ参照）。リンカーは少なくとも一つの堅固な非ヌクレオチド性の分子または「ユニット」を含有しており、これら非ヌクレオチド性の分子または「ユニット」は、シクロヘキサンジオール、ステロイド、ルペンジオール、またはイソソルビド、またはリンカーが２以上の分子からなる場合にはこれらの組み合わせである。代表的なシクロヘキサンジオール、イソソルビド、ステロイド、およびルペンジオールユニットは、それぞれ図３Ａ〜３Ｄに示してある。該リンカーを構成する該分子の堅固さは、リボザイムアナログの触媒活性を維持するのを助ける。分子性リンカーは、種々の市販の（たとえば、アルドリッチ・ケミカル（Ａlr ich Ｃhemical）、ミルウォーキー、ウイスコンシンからのもの）非ヌクレオチド性ユニット、たとえばシクロヘキサンジオール、ルペンジオール、ステロイド（β−エストラジオール）、およびイソソルビドから調製できる。ついで、前駆体分子をヌクレオチドについて自動合成のために誘導体化するのと同様の仕方で（たとえば、ジメトキシトリチル化やホスフィチル化（phosphitylation））誘導体化する。別のやり方として、非ヌクレオチド性の分子は、当該技術分野で公知の方法を用い、または下記実施例に記載する新規なプロトコールにより、一層塩基性の出発化合物から合成する。たとえば、シクロヘキサンジオールユニットであるトランス−１−Ｏ−（４, ４'−ジメトキシトリチル）−２−Ｏ−［β−シアンエトキシ（Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルアミノ）］ホスフィノ−１,２−シクロヘキサンジオール（図３Ａ）は、トランス−１−Ｏ−ジメトキシトリチル−１,２−シクロヘキサンジオール（このもの自体はトランス−１,２−シクロヘキサンジオールをジメトキシトリチルクロライドおよびジメチルアミノピリジンで処理することにより調製する）から調製できる。この合成は図４に記載してある。かくして調製した前駆体をテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）の蒸発により乾燥させ、ＴＨＦ中のβ−シアノエトキシ −Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルアミノクロロ−ホスフィンおよびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）で処理し、シリカゲルカラム上のクロマトグラフィーにより精製する。他の調製可能でリンカーに用いることのできるシクロヘキサンジオールの例としては、これらに限られるものではないが、シス−１,２−シクロヘキサンジオール、シス−およびトランス−１,３−シクロヘキサンジオール、およびシス− およびトランス−１,４−シクロヘキサンジオールが挙げられる。調製可能な代表的な有用なイソソルビド（またはビス融合テトラヒドロフラン）は、２−Ｏ− （４,４−ジメトキシトリチル）−５−Ｏ−［β−シアノエトキシ（Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルアミノ）］ホスフィノ−１,４：３,６−ジアンヒドロ−Ｄ−グルシトール（図３Ｂ）である。有用なルペンジオールの非限定的な例は、２８−Ｏ−（４,４'−ジメトキシトリチル）−３−Ｏ−（β−シアノエトキシ−Ｎ,Ｎ−ジジイソプロピルアミノホスフィノ）−ベツリン（図３Ｄ）である。分子性リンカーは、よく知られたＨ−ホスホネート、ホスホルアミダイト、または手動もしくは自動合成機により行う他の方法を用い、インターヌクレオチド結合を形成するのと同様の仕方で、個々の非ヌクレオチド性ユニットを一つずつ共有結合することによって該ユニットの幾つかの組み合わせから調製できる。たとえば、リンカーは、ヌクレオチドまたはリンカー分子の結合したコントロールポアガラス固相支持体を用い、マによって概略の示された手順（Ｂiochemis try（１９９３）３２：１７５１〜１７５８）により調製できる。少なくとも一つのリボヌクレオシドを含有するリボザイムアナログについては、オギルビー（上掲）の脱保護および精製プロトコールを用いることができる。リボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドアナログを含有しないリボザイムアナログを調製するには、アトキンソン（Ａtkinson）らの脱保護および標準精製法（Ｏligonucleot ide synthesis：ＡＰractical Ａpproach（ゲイト（Ｇait）編）ＩＲＬプレス（オックスフォード）１９８４、３５〜８１頁中）を用いることができる。しかしながら、幾つかのリボザイムアナログにおいては、たとえばユニットがルペンジオールである場合など、一つの非ヌクレオチド性ユニットがリンカーとして充分である。分子性リンカーは、その一方の末端が第一のヌクレオチド性コア領域の３'末端に結合しており、他方の末端が第二のヌクレオチド性コア領域の５'末端に結合している。第一のヌクレオチド性コア領域の５'末端は第一のフランキング領域の３'末端に共有結合しており、ヌクレオチド性コア領域の３'末端は第二のフランキング領域の５'末端に共有結合している。各フランキング領域は少なくとも４つの隣接し共有結合したヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログからなる。さらに、各フランキング領域は、開裂しようとするＲＮＡ基質上の標的領域に相補的で該領域にハイブリダイズしうるヌクレオチド配列を含む。フランキング領域に相補的な標的領域は、開裂部位の位置に依存して、隣接しているかまたは１または幾つかのヌクレオチドにより隔てられている。本発明のリボザイムアナログまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドのフランキング領域は、デオキシリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドのアナログ、リボヌクレオチド、リボヌクレオチドのアナログ、またはそれらの組み合わせからなり、一つのヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログの５'末端と他のヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログの３'末端とが共有結合している。これらフランキング領域は長さが少なくとも４ヌクレオチドであるが、６〜５０ヌクレオチドの長さであるのが好ましく、６〜１５ヌクレオチドのフランキング領域が最も一般的である。リボザイムアナログのフランキング領域および他のヌクレオチド性領域はホスホルアミデートやＨ−ホスホネート化学などの当該技術分野で認識された方法により調製でき、該方法は米国特許第５,１４９,７８９号に記載されている標準Ｈ −ホスホネート化学を用い、または標準ホスホルアミダイト化学（たとえば、ボーケージ（Ｂeaucage）（Ｍeth.Ｍol.Ｂiol.（１９９３）２０：３３〜６１）；ダマー（Ｄamha）ら（Ｐrotocols for Ｏligonucleotides and Ａnalogs;Ｓynth esis and Ｐroperties（アグラワル編）（１９９３）ヒューマナ・プレス、トトワ、ニュージャージー、８１〜１１４頁中；またはウールマン（Ｕhlman）ら（Ｃhem.Ｒev.（１９９０）９０：５３４〜５８３））を用い、手動または自動合成機により行うことができる。リボザイムアナログのフランキング領域および他のヌクレオチド性領域はまた、該リボザイムアナログが基質ＲＮＡにハイブリダイズする能力を損なうことなく、ヌクレアーゼ消化に対して保護するために多くの仕方で修飾できる。たとえば、リボザイムアナログのフランキング領域および他のヌクレオチド性部分のヌクレオチドを、一方のヌクレオチドの５'末端と他方のヌクレオチドの３'末端との間でホスホジエステルインターヌクレオチド結合以外の結合で共有結合でき、その際、３'リン酸基はいずれかの化学基で置換されていてよい。そのような化学基の例としては、アルキルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホノチオエート、ホスホルアミデート、カルバメート、アセトアミデート、カルボキシメチルエステル、カーボネートおよびリン酸エステルが挙げられる。他の修飾としては、ヌクレオチド性コア領域またはフランキング領域の内部または末端におけるものが挙げられ、インターヌクレオシドリン酸結合へのコレステリル化合物またはジアミン化合物（アミノ基と末端リボース、デオキシリボースとの間に種々の炭素数の残基を有する）の付加、およびリン酸修飾が挙げられる。そのような修飾オリゴヌクレオチドの例としては、修飾した塩基および／または糖（リボースの代わりのアラビノースなど）を有するヌクレオチド配列、またはその３'位および５'位の両方において酸素またはリン酸以外の化学基に結合した糖を有する３',５'−置換ヌクレオチドを含む。他の修飾ヌクレオチド配列は、その３'および／または５'末端においてヌクレアーゼ耐性を付与する嵩ばった置換基または自己ハイブリダイズ領域でキャッピングされているか、またはヌクレオチド当たり一つの非架橋性の酸素に置換を有する。そのような修飾は、インターヌクレオシド結合の幾つかまたはすべてにおいて、並びにオリゴヌクレオチドのいずれかの末端または両末端において、および／または該分子の内部にあってよい。これら修飾オリゴヌクレオチドの調製は、当該技術分野でよく知られている（アグラワルら（１９９２）Ｔrends.Ｂiotechnol.１０；１５２〜１５８；グッドチャイルド（１９９０）Ｂioconjugate Ｃhem.２：１６５〜１８７；ゾン（Ｚon ）、Ｐrotocols for Ｏligonucleotides and Ａnalogs（アグラワル編）ヒューマナ．プレス、トトワ、ニュージャージー（１９９４）２０巻、１６５〜１８９頁中に概説されている）。たとえば、ヌクレオチドはホスホルアミダイト、Ｈ− ホスホネートまたはメチルホスホノアミダイト化学などの当該技術分野で認められた技術を用いて共有結合できる。第一のフランキング領域の３'末端および第二のフランキング領域の５'末端は、上記方法のいずれかにより触媒コアに共有結合させる。幾つかの態様において、第一および／または第二のフランキング領域は、その５'末端にアデニンなどの少なくとも一つのリボヌクレオチドを含み、これが触媒コアの第二のヌクレオチド性コア領域の３'末端に共有結合する。図２Ａ〜２Ｄに模式的に示した本発明の幾つかの代表的なリボザイムアナログの構造上の特徴を下記表１に要約してある。「フランキング領域」は第一および第二の各フランキング領域中のヌクレオチド数を示し、「リンカーサイズ」はリンカー中の非ヌクレオチド性ユニット数を示す。本明細書に記載する方法を用い、代表的なリボザイムアナログであるＴＬ１− ７５Ａ（配列番号１）、ＴＬ１−８６Ａ（配列番号２）、およびＲ４５（配列番号１９）を合成し、下記のようにして一本鎖基質ＲＮＡを用いてヌクレオチド分解活性について試験した。これら実験は、２０ｍＭ塩化マグネシウムを含有する緩衝液中にてｐＨ８、９および１０で同時に行った。マグネシウムはリボザイムにエンドヌクレオチド開裂活性を付与する。ＲＺＭＺ−１（配列番号１３）、すなわち既知の触媒活性を有するリボザイムを陽性対照として用い、マグネシウムの存在下での基質ＲＮＡ（配列番号１４）を陰性対照として用いた。ＵＶ分析により決定したストック溶液の濃度に基づき、リボザイムアナログＴＬ１−７５Ａ（配列番号１）およびＴＬ１−８６Ａ（配列番号２）の試料を試験管にアリコートし、蒸発させた。ついで、前以て［α−³²Ｐ］ＡＴＰを用いて３７℃で１０分間インキュベートして内部を放射性標識しておいた基質ＲＮＡ（配列番号１４）をマグネシウム含有緩衝液中に入れ、種々のリボザイムアナログの試料に加えた。これら反応混合物を３７℃で１時間インキュベートし、ついでＰＡＧＥに供した。ついで、ゲル中の開裂生成物をオートラジオグラフィーにより分析した。代表的なアッセイの結果を図５および６に示す。これらゲルにおいて本発明のリボザイムアナログとともにインキュベートした基質ＲＮＡ試料は、一層低分子量で一層速やかに移動する開裂生成物に部分的に破壊された。これら結果は、試験したリボザイムアナログが、試験したすべてのｐＨにおいてエンドヌクレオチド分解活性を有することを示している。本発明のリボザイムアナログの開裂能力は、リボザイムアナログに近接してハイブリダイズするファシリテーターオリゴヌクレオチドを系に導入することにより促進することができる。そのようなファシリテーターオリゴヌクレオチドは、フランキング領域がリボザイムアナログの５'側または３'側にて結合するＲＮＡ基質配列に隣接する基質ＲＮＡ上の標的配列に結合するように選択する。基質ＲＮＡ、リボザイムアナログおよびファシリテーターオリゴヌクレオチドによって形成された触媒複合体を図７Ａおよび７Ｂに示す。幾つかの状況においては２つのファシリテーターオリゴヌクレオチドの組み合わせが用いられ、その場合、一方のファシリテーターはリボザイムアナログの第一の（５'）フランキング配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列に直接近接した基質ＲＮＡ部分にハイブリダイズし、他方のファシリテーターはリボザイムアナログの第二の（３'）フランキング配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列に直接近接した基質ＲＮＡ部分にハイブリダイズする。別の態様として、複数のファシリテーターを用いてリボザイムアナログ活性を促進することができる。たとえば、３つのファシリテーターを用いた系では、２つのファシリテーターは第一の（５'）フランキング配列に相補的なＲＮＡ基質配列に隣接して結合することができ、一方、単一の別のファシリテーターは第二の（３'）フランキング領域に相補的なＲＮＡ基質配列に隣接して結合することができる。さらに、ファシリテーターオリゴヌクレオチドは、リボザイムアナログのフランキング配列に相補的な基質配列に直ちには隣接しないＲＮＡ基質の領域に相補的なヌクレオチド配列を有していてよい。たとえば、リボザイムアナログとファシリテーターオリゴヌクレオチドとが基質ＲＮＡに結合したときにリボザイムアナログとファシリテーターオリゴヌクレオチドとの間に１〜約５オリゴヌクレオチドの小さなギャップが存在するように、ファシリテーターを合成することができる。通常、ファシリテーターとリボザイムアナログとの間のギャップは０〜２ヌクレオチドの範囲であろう。最も頻繁には、ファシリテーターとリボザイムアナログとの間にはヌクレオチドギャップは存在しないであろう。本発明のファシリテーターオリゴヌクレオチドは、一般に約５〜５０ヌクレオチドを有する。より好ましいファシリテーターオリゴヌクレオチドは約５〜１５デオキシリボヌクレオチドを含む。本発明による特に好ましいファシリテーターは約１３のヌクレオチドを含む。特定の長さのファシリテーターを選択することは、リボザイムアナログのフランキング配列の長さと関係する。さらに、幾つかのファシリテーターデオキシヌクレオチドは、その一部がＲＮＡ基質配列に相補的であり、別の一部は基質ＲＮＡ配列に相補的ではないヌクレオチドの配列を有する。ファシリテーターオリゴヌクレオチドは自動ＤＮＡ合成機により、またはＤＮＡ鋳型から手動により合成できる。ファシリテーターオリゴヌクレオチドは、合成し、その後、リボザイムアナログによる基質開裂速度に影響を及ぼしたり、細胞による取り込みを増大させたり、または分解に対する耐性を高めたりするような残基を含むように修飾することができる。たとえば、開裂部位近傍に結合した基質ＲＮＡの塩基数を増加させることにより、ファシリテーターは一層短いフランキング配列で一層速やかに作用するリボザイムアナログの使用を可能にする。ウを用いた系では、２つのファシリテーターは第一の（５'）フランキング配列に相補的なＲＮＡ基質配列に隣接して結合することができ、一方、単一の別のファシリテーターは第二の（３'）フランキング領域に相補的なＲＮＡ基質配列に隣接して結合することができる。さらに、ファシリテーターオリゴヌクレオチドは、リボザイムアナログのフランキング配列に相補的な基質配列に直ちには隣接しないＲＮＡ基質の領域に相補的なヌクレオチド配列を有していてよい。たとえば、リボザイムアナログとファシリテーターオリゴヌクレオチドとが基質ＲＮＡに結合したときにリボザイムアナログとファシリテーターオリゴヌクレオチドとの間に１〜約５オリゴヌクレオチドの小さなギャップが存在するように、ファシリテーターを合成することができる。通常、ファシリテーターとリボザイムアナログとの間のギャップは０〜２ヌクレオチドの範囲であろう。最も頻繁には、ファシリテーターとリボザイムアナログとの間にはヌクレオチドギャップは存在しないであろう。本発明のファシリテーターオリゴヌクレオチドは、一般に約５〜５０ヌクレオチドを有する。より好ましいファシリテーターオリゴヌクレオチドは約５〜１５デオキシリボヌクレオチドを含む。本発明による特に好ましいファシリテーターは約１３のヌクレオチドを含む。特定の長さのファシリテーターを選択することは、リボザイムアナログのフランキング配列の長さと関係する。さらに、幾つかのファシリテーターデオキシヌクレオチドは、その一部がＲＮＡ基質配列に相補的であり、別の一部は基質ＲＮＡ配列に相補的ではないヌクレオチドの配列を有する。ファシリテーターオリゴヌクレオチドは自動ＤＮＡ合成機により、またはＤＮＡ鋳型から手動により合成できる。ファシリテーターオリゴヌクレオチドは、合成し、その後、リボザイムアナログによる基質開裂速度に影響を及ぼしたり、細胞による取り込みを増大させたり、または分解に対する耐性を高めたりするような残基を含むように修飾することができる。たとえば、開裂部位近傍に結合した基質ＲＮＡの塩基数を増加させることにより、ファシリテーターは一層短いフランキング配列で一層速やかに作用するリボザイムアナログの使用を可能にする。ウイルスにおける適用においては、ファシリテーターは内生のリボヌクレアーゼＨによるウイルスＲＮＡの開裂をも行わせる点で二重の利点を有する。本発明の他のリボザイムアナログの触媒能およびファシリテーターオリゴヌクレオチドが該触媒能を促進する能力をさらに示すため、以下の研究を行った。リボザイムアナログＲ４５（配列番号１９）および対照のリボザイムＲ２２（配列番号２０）をファシリテーターオリゴヌクレオチド（Ｆ１）の不在下および存在下で基質ＲＮＡとともにインキュベートした。Ｒ４５およびＲ２２は、ともにフランキング領域がホスホロチオエートインターヌクレオチド結合により連結した分子を含有するＲＮＡである。図９Ａおよび９Ｂに示す結果は、ファシリテーターの存在下ではリボザイムアナログＲ４５（配列番号１９）はリボザイム対照Ｒ２２（配列番号２０）と触媒活性が同等であることを示している。リボザイムアナログ活性に対するファシリテーター分子の存在の影響およびフランキング配列の長さの減少の影響を示すため、それぞれフランキング領域の長さが６ヌクレオチドである種々のリボザイムアナログ（ＴＬ１−１２８Ａ（配列番号３）；ＴＬ１−１３０Ａ（配列番号４）；ＴＬ１−１３２Ａ（配列番号５）；およびＴＬ１−１３４Ａ（配列番号６））を３７℃にて基質ＲＮＡ（Ｓ２）（配列番号１４）およびマグネシウムとともに、またはマグネシウムの存在下で基質ＲＮＡおよびファシリテーターオリゴヌクレオチド（配列番号１６）とともにインキュベートした。対照のリボザイムＲ₅（配列番号１５）も同様に処理した。１０分後に反応混合物の試験管からアリコートを取り、インキュベートしないリボザイムアナログの対照とした。１時間後、反応混合物を氷上に置いた。ＲＮＡ基質＋ファシリテーターストック溶液のアリコートもまたインキュベートしないＲＮＡ対照とした。得られた開裂生成物をポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により分析した。図８に示す結果は、本発明のリボザイムアナログとともにインキュベートした基質ＲＮＡ試料が、対照のリボザイムの場合と同じ部位での特異的開裂により一層低分子量で一層速やかに移動する開裂生成物に部分的に分解されたことを示している。インキュベーション混合物にファシリテーターオリゴヌクレオチドを加えた場合には開裂が一層進み（レーン７、９、１１、および１３）、本発明のリボザイムアナログがＲＮＡを開裂する能力をさらに示していた。本発明のリボザイムアナログは、本発明のリボザイムアナログを入れた容器、種々のリボザイムアナログを入れた容器、またはリボザイムアナログとファシリテーターオリゴヌクレオチドとを入れた容器、および／またはファシリテーターオリゴヌクレオチドのみを入れた容器を含む、キットの形態でのあらゆる使用方法のために提供できる。各容器中のリボザイムアナログの量またはリボザイムアナログとファシリテーターオリゴヌクレオチドとの量は、一つの治療投与量またはアッセイに充分なものであってよい。別のやり方として、キットの構成成分の量は、たとえばＲＮＡ分子をインビトロで開裂するのに使用する場合に、容器から少量のアリコートのみを一度にサンプリングすればよいように濃縮することができる。キットはリボザイムアナログおよびファシリテーターオリゴヌクレオチドを活性な形態で保存しなければならない。本発明はまた、治療に有用なリボザイムアナログ、またはリボザイムアナログとファシリテーターオリゴヌクレオチドとを含む、治療用組成物をも提供する。これら治療用組成物は、リボザイムアナログおよび／またはリボザイムアナログとファシリテーターオリゴヌクレオチドとを最初に生体内に、その後、標的細胞中に送達しうる仕方で個体に投与しなければならない。一つの投与方法は、生理学的に許容しうる担体とともに少なくとも一つの上記リボザイムアナログを含有する治療用組成物によるものである。幾つかの治療用組成物は２以上のタイプの本発明のリボザイムアナログを含み、さらに幾つかの組成物はファシリテーターオリゴヌクレオチドを含む。本明細書において「生理学的に許容しうる担体」とは、いずれかおよびすべての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤、およびオリゴヌクレオチドの取り込み改善剤などを含む。薬理学的に活性な物質のためのそのような媒体および剤の使用は、当該技術分野でよく知られている。通常の媒体または剤が活性成分と適合しない場合を除く他、通常の媒体または剤を治療用組成物に使用することができる。補助的な活性成分を組成物中に配合することもできる。注射に使用するのに適した剤型としては、滅菌水溶液または分散液および滅菌注射液または分散液を即座に調製するための滅菌粉末が挙げられる。いずれの場合も剤型を滅菌しなければならない。それは製造および貯蔵の条件下で安定でなければならず、細菌や真菌などの微生物の汚染作用に対して保存しなければならない。担体は溶媒または分散媒体であってよい。微生物の作用からの保護は、種々の抗菌および抗真菌剤によりもたらすことができる。注射可能な治療剤の吸収の遅延は、吸収遅延剤の組成物の使用によりもたらすことができる。本発明の治療用組成物は、通常の非毒性の薬理学的に許容しうる担体、アジュバントおよびビヒクルを含む単位投与量組成物にて、非経口、経口、スプレイの吸入、または経直腸により投与できる。本明細書において「非経口」とは、皮下注射、静脈内注射、筋肉内注射、胸骨内注射または注入法を含む。１回投与剤型を形成する担体物質を配合した活性リボザイムアナログの量は、治療しようとするホストおよび特定の投与経路により異なるであろう。ある特定の患者についての特定の投与レベルは、使用した特定の組成物の活性、年齢、体重、一般的な健康状態、性別、食事、投与時間、投与経路、治療を受けている特定の疾患の重篤度を含む種々の因子に依存するであろう。本発明のリボザイムアナログそれ自体または治療用組成物中のリボザイムアナログは、リボザイムまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いる技術分野の当業者によく知られた目的のために投与することができる。たとえば、ウイルスに感染した細胞は、ウイルス遺伝子の発現を阻止するために該ウィルス遺伝子に対応する特定のｍＲＮＡのヌクレオチド配列に相補的なフランキング配列を有するリボザイムアナログで処理することができる。同様に、リボザイムアナログは、癌関連遺伝子の発現を停止させ、または過剰発現される遺伝子の発現を停止させるために投与することができる。下記実施例は本発明を製造および実施するために好ましい態様を示すものであるが、本発明がこれらに限定されることを意図するものではない。なぜなら、別の方法を利用して同様の結果を得ることができるからである。実施例１．堅固な分子性リンカーの調製トランス−１−Ｏ−（４,４'−ジメトキシトリチル）−２−Ｏ−［β−シアノエトキシ（Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルアミノ）］ホスフィノ−１,２−シクロヘキサンジオール含有リンカーを調製するため、該ユニットの前駆体であるトランス− １−Ｏ−ジメトキシトリチル−１,２−シクロヘキサンジオールが必要である。この前駆体は以下のようにして調製する。１.１６ｇ（１０ミリモル）のトランス−１,２−シクロヘキサンジオールを５０ｍｌの無水ピリジンに溶解した。この溶液を蒸発乾固し、この手順を２回繰り返して存在する水をすべて除去した。ついで、フラスコを密封し、アルゴンガスを一度に流した。ついで、３.４ｇ（１０.１ミリモル）のジメトキシトリチルクロライドおよび２０ｍｇのジメチルアミノピリジンを５０ｍｌの無水ピリジン中に溶解することにより溶液を調製した。この溶液を第一の混合物に注射器にて３０分間かけて滴下した。ついで、この反応混合物を室温にて１８時間撹拌した。上記溶液のアリコートをヘキサン：酢酸エチル：トリエチルアミン（５０：２０：１）中の薄層クロマトグラフィーにより分析したところ、所望の生成物に対応するスポットおよびジアルキル化生成物およびジメトキシトリタノールに対応するかすかなスポットが得られた。溶媒を真空除去し、残渣を１２５ｍｌのジクロロメタン中に取った。これを５％重炭酸ナトリウム、および食塩水で２回洗浄した。溶媒を除去し、得られたゴム状物をヘキサン：酢酸エチル：トリエチルアミン中に取り、同溶媒を含むシリカゲルカラムに適用した。所望の生成物を含むフラクションをコンバインし、蒸発させて１.０ｇ（２.３８ミリモル）（２５％収率）の生成物を得た。この方法により調製した物質を、３.７２ｇ（８.９ミリモル）のジメトキシトリチルシクロヘキサンジオール（前駆体）を４０ｍｌの無水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中に溶解し、蒸発乾固することにより次工程に用いた。この手順を２回繰り返した。ついで、残渣を４０ｍｌのＴＨＦ中に取り、これに６.２ｍｌのジイソプロピルエチルアミン（３５.４ミリモル）を加えた。フラスコを密封し、アルゴンガスを一度に流した。ついで、２５ｍｌの乾燥ＴＨＦ中の４.２１ｇ（１７.８ミリモル）の［β−シアノエトキシ（Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルアミノ）］クロロホスフィンを室温にて撹拌しながら３０分間かけて滴下した。白色の沈殿が生成した。最終添加の４５分後、ヘキサン：酢酸エチル：トリエチルアミン（５０：２０：１）中のＴＬＣは反応が完了したことを示した。１ｍｌの水を加え、反応混合物を１５分間撹拌した。溶媒を蒸発させ、残渣を２５０ｍｌの酢酸エチル中に取った。有機層を７５ｍｌの５％重炭酸ナトリウムで１回、７５ｍｌの食塩水で１回洗浄した。ついで、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、蒸発させて小容量とした。得られた残渣をシリカゲルカラムに適用し、所望の生成物をヘキサン：酢酸エチル：トリエチルアミン（５０：２０：１）中で溶出した。所望の生成物を含有するフラクションをプールし、蒸発して、３.６８ｇ（５.９４ミリモル）（６７％収率）の所望の生成物を得た。２．リボザイムアナログの化学合成非修飾（ホスホジエステル結合した）リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、または両者を含むヌクレオチド性フランキング領域を、米国特許第５, １４９,７８９号に記載されている標準Ｈ−ホスホネート化学を用い、またはボーケージ（Ｍeth.Ｍol.Ｂiol.（１９９３）２０：３３〜６１）またはウールマンら（Ｃhem.Ｒev.（１９９０）９０：５３４〜５８３）により記載された標準ホスホルアミダイト化学を用い、自動ＤＮＡ合成機（アプライド・バイオシステムズ（Ａpplied ＢioＳystems）、フォスターシティー、カリフォルニア）にて１.０μモルスケールで合成した。ホスホルアミダイト、メチルホスホネート、および／または２'−Ｏ−メチル置換を前以て選択した位置で含む少なくとも一つの非ホスホジエステルインターヌクレオチド結合を有するフランキング領域を、アグラワルおよびグッドチャイルド（Ｔetrahedron Ｌett.（１９８７）２８：３５３９〜３５４２）；アグラワルら（Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.（ＵＳＡ）（１９８８）７０７９〜７０８３）；および／またはウールマンら（Ｃhem.Ｒev .（１９９０）９０：５３４〜５８３）に記載された手順を用いて調製した。少なくとも一つのホスホロジチオエート、カルバメート、リン酸エステル、２'− Ｏ−メチル、アルキルホスホネート、ホスホルアミデート、アルキルホスホノチオエート、カーボネート、アセトアミデート、および／またはカルボキシメチルエステルヌクレオチドアナログを有するフランキング領域の調製は、当該技術分野で認められた方法、たとえばＰrotocols Ｆor Ｏligonucleotides and Ａnalogs（Ｍ eth.Ｍol.Ｂio.（アグラワル編）ヒューマナ・プレス、トトワ、ニュージャージー、２０巻、１９９３）；アグラワルら（１９９２）Ｔrends.Ｂiotechnol.１０：１５２〜１５８；グッドチャイルド（１９９０）Ｂioconjugate Ｃhem.１：１６５〜１８７；およびウールマンら（Ｃhem.Ｒev.（１９９０）９０：５３４〜５８３）において概説されている方法により行う。リボヌクレオチドのコア領域中への導入は、ウスマン（Ｕsman）らの標準法（（１９８７）Ｊ.Ａmer.Ｃhem.Ｓoc.１０９：７８４５〜７８５４）により行った。非ヌクレオチド性ホスホルアミダイトのオリゴヌクレオチド中への導入も、ヌクレオチドの場合と同じ標準プロトコールを用いて行った。支持体からの生成物の開裂および脱保護は、密封した試験管中にて１ｍｌの濃アンモニア水：エタノール（３：１、ｖ／ｖ）中、５５℃で加熱することにより行った。１４,０００ｒｐｍにて３分間遠心分離した後、ＣＰＧ支持体を４００ μｌの水で２回洗浄し、コンバインした上澄み液および洗浄液を半分に分割し、別々の試験管に入れ、蒸発乾固した。一方の試験管を後に使用するために−２０ ℃で貯蔵し、他方の試験管をＴＨＦ中のテトラ−Ｎ−ブチルアンモニウムフルオライド（ＴＢＡＦ）（アルドリッチ・ケミカル、ミルウォーキー、ウイスコンシン）１.０Ｍ（４００μｌ）で室温にて１６時間処理した。３．リボザイムアナログの精製オリゴヌクレオチドの試料に４００μｌの５０ｍＭトリス、ｐＨ８および０. ０５％オレンジＧ染料（シグマ（Ｓigma）、セントルイス、ミズーリ）を含有する８００μｌの９５％ホルムアミドを加えた。ついで、試料を８Ｍ尿素を含有する１５％ポリアクリルアミドゲル上に適用した。染料がゲルの底に達するまで、２５ワット定常電力で電気泳動を行った。蛍光バックグラウンドに対してＵＶランプで陰影を付すことにより所望のバンドを同定した。このバンドをゲルから切り出し、乳棒でつぶし、１２ｍｌの０.５Ｍ酢酸アンモニウムで１２時間抽出した。この混合物を遠心分離し、コンバインした上澄み液をＣ₁₈Ｓep−Ｐakカートリッジ（ウォーターズ（Ｗaters）、マールボロ、マサチューセッツ）に１分間当たり２ｍｌの速度で通した。カートリッジを水洗し、リボザイムアナログを４ｍｌの５０％アセトニトリル水溶液を用い、１分間当たり２ｍｌにて溶出した。溶出液を蒸発させ、残渣を２００μｌの０.３ＭＮａＣｌ中に取った。ついで、６００μｌの無水エタノールを加え、混合物を−２０℃にて１６時間貯蔵した。混合物を１４,０００ｒｐｍにて２０分間遠心分離し、上澄み液をデカントした。得られたペレットを２００μｌの０.１ＭＮａＣｌ中に再溶解し、６００μｌの無水エタノールで沈殿させた。懸濁液をドライアイス上に３０分間置き、遠心分離した。上澄み液を除き、ペレットを４００μｌの水中に溶解し、使用するときまで−２０℃で貯蔵した。４．ファシリテーターオリゴヌクレオチドの調製非修飾（ホスホジエステル結合した）デオキシリボヌクレオチドを含むファシリテーターオリゴヌクレオチドを、上記実施例２に記載したように自動ＤＮＡ合成機（アプライド・バイオシステムズ、フォスターシティー、カリフォルニア）にて合成した。５．開裂活性のアッセイ［α−³²Ｐ］ＡＴＰ（アマーシャム、アーリントンハイツ、イリノイ）を用いて内部を放射性標識した基質ＲＮＡを、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（ニューイングランド・バイオラブズ、ビバリー、マサチューセッツ）および二本鎖プロモーターを有する化学合成した一本鎖鋳型（ミリガン（Ｍilligan）ら（１９８７）Ｎu cleic Ａcids Ｒes.１５：８７８３〜８７９８）を用い、グッドチャイルドらの記載（Ａrch.Ｂiochem.Ｂiophys.（１９９１）２８４：３８６〜３９１）に従って調製した。実験は２０ｍＭ塩化マグネシウムを含有する５０ｍＭトリス緩衝液中、ｐＨ８、９および１０で同時に行った。最終的なリボザイムアナログの濃度はすべての場合に５０μＭであり、基質ＲＮＡの最終濃度は４ｎＭであった。最終的な反応容量は５μｌであった。活性な対照リボザイム（配列番号１３）を陽性対照として用ぃ、２０ｍＭ塩化マグネシウム、５０ｍＭトリス中の基質ＲＮＡ（配列番号１４）単独を陰性対照として用いた。ＵＶ分析により決定したストック溶液の濃度に基づき、リボザイムアナログ試料ＴＬ１−７５Ａ（配列番号１）およびＴＬ１ −８６Ａ（配列番号２）を蒸発により濃縮した。基質ＲＮＡをトリス−マグネシウム緩衝液中に取り、上記蒸発させたリボザイムアナログの試料に加えた。ついで、この混合物を３７℃で１時間インキュベートした。つぎに、０.０５％オレンジＧ染料（シグマ、セントルイス、ミズーリ）を含有する５μｌの９５％ホルムアミド染料を加え、８Ｍ尿素を含有する前以て加熱した（４５℃）１５％ポリアクリルアミドゲルに反応混合物を直接適用した。ゲルをリン造影剤（モレキュラー・ダイナミックス（Ｍolecular Ｄynamics）、サニーベール、カリフォルニア）およびオートラジオグラフィーにより分析した。６．リボザイムアナログの開裂活性に対するフランキング配列の長さの減少の影響およびファシリテーターの存在の影響下記の手順を用い、リボザイムアナログＴＬ１−１２８Ａ（配列番号３）、ＴＬ１−１３０Ａ（配列番号４）、ＴＬ１−１３２Ａ（配列番号５）、およびＴＬ１−１３４Ａ（配列番号６）の開裂活性に対するフランキング配列の長さの減少の影響およびファシリテーターの存在の影響を調べた。処理で得られたリボザイムアナログのストック溶液の濃度に基づき、それぞれ２５ピコモルのリボザイムアナログを取り、蒸発により濃縮した。基質ＲＮＡ（Ｓ２）（配列番号１４）の調製は、ミリガンらの基質ＲＮＡ（Ｎucleic Ａcids Ｒes.（１９８７）１５：８７８３〜８７９８）に基づき、グッドチャイルドらの手順（Ａrch.Ｂiochem. Ｂiophys.（１９９１）２８４：３８６〜３９１）に従って行った。２つの基質ストック溶液を調製した；一方のストック溶液は０.５μＭの基質ＲＮＡを含み、他方のストック溶液は０.５μＭの基質ＲＮＡプラス１.０μＭのファシリテーターオリゴヌクレオチド（Ｆ１）（配列番号１６）を含んでいた。両ストック溶液は５０ｍＭトリス、ｐＨ７.４、および２０ｍＭ塩化マグネシウムを含んでいた。すべてのリボザイム試料は２０ｍＭ塩化マグネシウムおよび５０ｍＭトリス、ｐＨ７.４を含んでいた。対照のリボザイムＲ５（配列番号１７）も同様に処理した。最終的な反応容量は１０μｌであった。すべての試験管を３７℃にて１０分間加熱した。５μｌアリコートを基質ストック溶液および基質＋ファシリテーターストック溶液から取った。０.０５％オレンジＧ染料（シグマ、セントルイス、ミズーリ）を含有する５μｌの９５％ホルムアミドを加え、これら混合物（インキュベートしない対照とした）を氷上に置いた。リボザイムアナログまたはリボザイム対照Ｒ５（配列番号１７）を含有する各試験管に５μｌの基質ストックを加えることにより反応を開始した。ファシリテーターを用いた反応も同様にして開始した。５μｌをインキュベートした対照として取った。ついで、５μｌの基質＋ファシリテーターをインキュベートしないＲＮＡ対照として取り、５μｌをリボザイムアナログ含有の試験管２本に加えた。インキュベートしない対照を含有するものを除くすべての試験管を３７ ℃で１時間加熱した。７．開裂生成物の電気泳動分析上記実施例５に記載した各反応試験管に２０μｌのオレンジホルムアミド染料を加え、これら内容物を８Ｍ尿素を含有する１５％ポリアクリルアミドゲル上に適用し、４５℃に加熱した。染料がゲルの底に達するまで、電気泳動を２５ワットの定常電力にて行った。リン造影剤からの結果を図５〜８に示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ【要約の続き】

Claims

【特許請求の範囲】１．下記からなるリボザイムアナログ：（ａ）３'末端および５'末端を有し、３'から５'へ共有結合した複数の自己ハイブリダイズヌクレオチドおよび該自己ハイブリダイズヌクレオチドの２つに共有結合した堅固な分子性リンカーを含むヌクレオチド性ステム−ループII領域であって、該リンカーが少なくとも一つの堅固な非ヌクレオチド性分子を含むもの；（ｂ）第一および第二のヌクレオチド性コア領域であって、これら領域はそれぞれ３'から５'へ共有結合した複数のヌクレオチドを含み、それぞれ３'末端および５'末端を有し、該第一のヌクレオチド性コア領域の３'末端は該ステム−ループ領域の５'末端に共有結合しており、該第二のヌクレオチド性コア領域の５'末端は該ステム−ループII領域の３'末端に共有結合しており、該第一のヌクレオチド性領域および該第二のヌクレオチド性領域は触媒コアを形成し、該触媒コアは下記第一および第二のフランキング領域によりフランキングされているもの、（ｃ）第一および第二のフランキング領域であって、これら領域はそれぞれ３' から５'へ共有結合した複数のヌクレオチドを含み、それぞれ３'末端および５' 末端を有し、該第一のフランキング領域の少なくとも一部は基質ＲＮＡ分子の第一の標的領域に相補的であり、該第二のフランキング領域の少なくとも一部は該基質ＲＮＡ分子の第二の標的領域に相補的であり、該第一のフランキング領域の３'末端は該第一のヌクレオチド性コア領域の５'末端に共有結合しており、該第二のフランキング領域の５'末端は該第二のヌクレオチド性コア領域の３'末端に共有結合しているもの。２．該ステム−ループ領域中の該リンカーが少なくとも２つの隣接し共有結合した非ヌクレオチド性分子を含む、請求項１に記載のリボザイムアナログ。３．該ステム−ループ領域中の該リンカーが約２〜２０の非ヌクレオチド性分子を含む、請求項２に記載のリボザイムアナログ。４．該ステム−ループ領域中の該リンカーが、ホスホジエステル、アルキルホスホネート、ホスホルアミデート、ホスホロチオエート、リン酸エステル、ホスホロジチオエート、アルキルホスホノチオエート、カルバメート、アセトアミデート、カーボネート、カルボキシメチルエステル、およびそれらの組み合わせよりなる群から選ばれた共有結合により、互いに、および該第一のコア領域および該第二のコア領域に、結合した少なくとも２つの非ヌクレオチド性分子を含む、請求項２に記載のリボザイムアナログ。５．該リンカー中の該非ヌクレオチド性分子が、シクロヘキサンジオール、ステロイド、ルペンジオール、イソソルビドおよびそれらの組み合わせよりなる群から選ばれたものである、請求項１に記載のリボザイムアナログ。６．該リンカーが少なくとも４つの隣接し共有結合したシクロヘキサンジオール分子を含む、請求項５に記載のリボザイムアナログ。７．該リンカーが、トランス−１,２−シクロヘキサンジオール、シス−１,２− シクロヘキサンジオール、トランス−１,３−シクロヘキサンジオール、シス− １,３−シクロヘキサンジオール、トランス−１,４−シクロヘキサンジオール、シス−１,４−シクロヘキサンジオールおよびそれらの組み合わせよりなる群から選ばれたシクロヘキサンジオールを含む、請求項５に記載のリボザイムアナログ。８．該第一のフランキング領域および該第二のフランキング領域中のヌクレオチドおよび該第一のヌクレオチド性コア領域および該第二のヌクレオチド性コア領域中のヌクレオチドが、ホスホジエステル、アルキルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホノチオエート、ホスホルアミデート、リン酸エステル、カルバメート、カーボネート、アセトアミデート、カルボキシメチルエステル、およびそれらの組み合わせよりなる群から選ばれたインターヌクレオチド結合により共有結合されている、請求項１に記載のリボザイムアナログ。９．該第一のフランキング領域および該第二のフランキング領域および該第一のヌクレオチド性コア領域および該第二のヌクレオチド性コア領域が、リボヌクレオチド、リボヌクレオチドのアナログ、デオキシリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドのアナログおよびそれらの組み合わせよりなる群から選ばれたヌクレオチドからなる、請求項１に記載のリボザイムアナログ。１０．該第一のフランキング領域および該第二のフランキング領域および該第一の触媒コア領域および該第二の触媒コア領域中のリボヌクレオチドアナログおよびデオキシリボヌクレオチドアナログが、アルキルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホノチオエート、ホスホルアミデート、リン酸エステル、カルバメート、カーボネート、アセトアミデート、カルボキシメチルエステル、およびそれらの組み合わせよりなる群から選ばれたものである、請求項９に記載のリボザイムアナログ。１１．該第一のフランキング領域および該第二のフランキング領域中および該第一のヌクレオチド性コア領域および該第二のヌクレオチド性コア領域中のリボヌクレオチドアナログの少なくとも一つが２'−Ｏ−メチルアナログである、請求項９に記載のリボザイムアナログ。１２．該第一のフランキング領域および該第二のフランキング領域が、それぞれ、少なくとも４つのヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１に記載のリボザイムアナログ。１３．該第一のフランキング領域中の少なくとも４つのヌクレオチドが標的ＲＮＡの少なくとも４つのヌクレオチドの第一のセットに相補的であり、該第二のフランキング領域中の少なくとも４つのヌクレオチドが標的ＲＮＡの少なくとも４つのヌクレオチドの第二のセットに相補的であり、該第一のセットと該第二のセットとが互いに排他的である、請求項１２に記載のリボザイムアナログ。１４．ＲＮＡ分子の発現を制御する方法であって、（ａ）下記からなるリボザイムアナログ：（i）３'末端および５'末端を有し、３'から５'へ共有結合した複数の自己ハイブリダイズヌクレオチドおよび該自己ハイブリダイズヌクレオチドの２つに共有結合した堅固な分子性リンカーを含むヌクレオチド性ステム−ループII領域であって、該リンカーが少なくとも一つの堅固な非ヌクレオチド性分子を含むもの、該ヌクレオチド性ステム−ループII領域は下記第一および第二のヌクレオチド性コア領域によりフランキングされている；（ii）第一および第二のヌクレオチド性コア領域であって、これら領域はそれぞれ３'から５'へ共有結合した複数のヌクレオチドを含み、それぞれ３'末端および５'末端を有し、該第一のヌクレオチド性コア領域の３'末端は該ステム−ループ領域の５'末端に共有結合しており、該第二のヌクレオチド性コア領域の５'末端は該ステム−ループ領域の３'末端に共有結合しており、該第一のヌクレオチド性コア領域および該第二のヌクレオチド性コア領域は触媒コアを形成しているもの、および（iii）第一および第二のフランキング領域であって、これら領域はそれぞれ３' から５'へ共有結合した複数のヌクレオチドを含み、それぞれ３'末端および５' 末端を有し、該第一のフランキング領域の少なくとも一部は基質ＲＮＡ分子の第一の標的領域に相補的であり、該第二のフランキング領域の少なくとも一部は該基質ＲＮＡ分子の第二の標的領域に相補的であり、該第一のフランキング領域の３'末端は該第一のヌクレオチド性コア領域の５'末端に共有結合しており、該第二のフランキング領域の５'末端は該第二のヌクレオチド性コア領域の３'末端に共有結合しているものを用意し、ついで（ｂ）該ＲＮＡ分子を該リボザイムアナログと、該第一のフランキング領域が該ＲＮＡ分子の該第一の標的領域とハイブリダイズし、該第二のフランキング領域が該ＲＮＡ分子の該第二の標的領域とハイブリダイズするように接触させることを含み、該リボザイムアナログは該ＲＮＡ分子を開裂し、それによって該ＲＮＡの発現を制御することを特徴とする方法。１５．該接触工程が、該ＲＮＡ分子を該リボザイムアナログに接触させるのと同時に該ＲＮＡ分子をファシリテーターオリゴヌクレオチドと接触させることをさらに含む、請求項１４に記載の方法。１６．一本鎖ＲＮＡ含有基質分子を部位特異的に開裂する方法であって、（ａ）下記からなるリボザイム：（i）３'末端および５'末端を有し、３'から５'へ共有結合した複数の自己ハイブリダイズヌクレオチドおよび該自己ハイブリダイズヌクレオチドの２つに共有結合した堅固な分子性リンカーを含むヌクレオチド性ステム−ループII領域であって、該リンカーが少なくとも一つの堅固な非ヌクレオチド性分子を含むもの、（ii）第一および第二のヌクレオチド性コア領域であって、これら領域はそれぞれ３'から５'へ共有結合した複数のヌクレオチドを含み、それぞれ３'末端および５'末端を有し、該第一のヌクレオチド性コア領域の３'末端は該ステム−ループ領域の５'末端に共有結合しており、該第二のヌクレオチド性コア領域の５'末端は該ステム−ループII領域の３'末端に共有結合しており、該第一のヌクレオチド性コア領域および該第二のヌクレオチド性コア領域は触媒コアを形成し、該触媒コアは下記第一および第二のフランキング領域によりフランキングされているもの、（iii）第一および第二のフランキング領域であって、これら領域はそれぞれ３' から５'へ共有結合した複数のヌクレオチドを含み、それぞれ３'末端および５' 末端を有し、該第一のフランキング領域の少なくとも一部は基質ＲＮＡ分子の第一の標的領域に相補的であり、該第二のフランキング領域の少なくとも一部は該基質ＲＮＡ分子の第二の標的領域に相補的であり、該第一のフランキング領域の３'末端は該第一のヌクレオチド性コア領域の５'末端に共有結合しており、該第二のフランキング領域の５'末端は該第二のヌクレオチド性コア領域の３'末端に共有結合しているものを用意し、ついで（ｂ）該ＲＮＡ含有基質分子を該リボザイムアナログと、該リボザイムの該第一のフランキング領域が該基質分子の該第一の標的領域とハイブリダイズし、該リボザイムアナログの該第二のフランキング領域が該基質分子の該第二の標的領域とハイブリダイズするように接触させ、該リボザイムアナログは該分子中の該ＲＮＡを開裂することを特徴とする方法。１７．該ＲＮＡ含有基質分子を該リボザイムアナログに接触させるのと同時に該ＲＮＡ含有基質分子をさらにファシリテーターオリゴヌクレオチドと接触させる、請求項１６に記載の方法。１８．下記からなるリボザイムアナログ：（ａ）少なくとも一つの非ヌクレオチド性分子を含む堅固な分子性リンカーであって、下記第一のヌクレオチド性コア領域および第二のヌクレオチド性コア領域によりフランキングされ、該領域に共有結合しているもの、（ｂ）第一のヌクレオチド性コア領域および第二のヌクレオチド性コア領域であって、これらヌクレオチド性コア領域はそれぞれ３'から５'へ共有結合した複数のヌクレオチドを含み、それぞれ３'末端および５'末端を有し、該第一のヌクレオチド性コア領域と該第二のヌクレオチド性コア領域とは触媒コアを形成し、該触媒コアは下記第一および第二のヌクレオチド性フランキング領域によりフランキングされているもの、（ｃ）３'から５'へ共有結合した少なくとも４つのヌクレオチドを含み、３'末端および５'末端を有する第一のヌクレオチド性フランキング領域であって、該第一のフランキング領域の少なくとも一部は基質ＲＮＡ分子の第一の標的領域に相補的であり、その３'末端が該触媒コアの該第一のヌクレオチド性コア領域の５'末端に共有結合しているもの、および（ｄ）３'から５'へ共有結合した少なくとも４つのヌクレオチドを含み、３'末端および５'末端を有する第二のヌクレオチド性フランキング領域であって、該第二のフランキング領域の少なくとも一部は該基質ＲＮＡ分子の第二の標的領域に相補的であり、その５'末端が該触媒コアの該第二のヌクレオチド性コア領域の３'末端に共有結合しているもの。１９．該リンカーが少なくとも２つの隣接し共有結合した非ヌクレオチド性分子を含む、請求項１８に記載のリボザイムアナログ。２０．該リンカーが２〜２０の非ヌクレオチド性分子を含む、請求項１９に記載のリボザイムアナログ。２１．該リンカーが、ホスホジエステル、アルキルホスホネート、ホスホルアミデート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、リン酸エステル、アルキルホスホノチオエート、カルバメート、カーボネート、カルボキシメチルエステル、アセトアミデート、およびそれらの組み合わせよりなる群から選ばれた結合により、互いに、および該触媒コア中の該ヌクレオチドに、共有結合した少なくとも２つの非ヌクレオチド性分子を含む、請求項１９に記載のリボザイムアナログ。２２．該リンカー中の該非ヌクレオチド性分子が、シクロヘキサンジオール、ステロイド、ルペンジオール、イソソルビドおよびそれらの組み合わせよりなる群から選ばれたものである、請求項１８に記載のリボザイムアナログ。２３．該リンカーが少なくとも４つの隣接し共有結合したシクロヘキサンジオール分子を含む、請求項２２に記載のリボザイムアナログ。２４．該リンカーが、トランス−１,２−シクロヘキサンジオール、シス−１,２ −シクロヘキサンジオール、トランス−１,３−シクロヘキサンジオール、シス −１,３−シクロヘキサンジオール、トランス−１,４−シクロヘキサンジオール、シス−１,４−シクロヘキサンジオールおよびそれらの組み合わせよりなる群から選ばれたシクロヘキサンジオールを含む、請求項２２に記載のリボザイムアナログ。２５．該第一のフランキング領域および該第二のフランキング領域中のヌクレオチドおよび該触媒コア中のヌクレオチドが、ホスホジエステル、アルキルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホノチオエート、ホスホルアミデート、リン酸エステル、カルバメート、カーボネート、アセトアミデート、カルボキシメチルエステル、およびそれらの組み合わせよりなる群から選ばれたインターヌクレオチド結合により共有結合されている、請求項１８に記載のリボザイムアナログ。２６．該第一のフランキング領域および該第二のフランキング領域および該触媒コアが、リボヌクレオチド、リボヌクレオチドのアナログ、デオキシリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドのアナログおよびそれらの組み合わせよりなる群から選ばれたヌクレオチドを含む、請求項１８に記載のリボザイムアナログ。２７．該第一のフランキング領域および該第二のフランキング領域中および該触媒コア中のリボヌクレオチドアナログおよびデオキシリボヌクレオチドアナログが、アルキルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホノチオエート、ホスホルアミデート、リン酸エステル、カルバメート、カーボネート、アセトアミデート、カルボキシメチルエステル、およびそれらの組み合わせよりなる群から選ばれたものである、請求項２６に記載のリボザイムアナログ。２８．該第一のフランキング領域および該第二のフランキング領域中および該触媒コア中のリボヌクレオチドアナログの少なくとも一つが２'−Ｏ−メチルアナログである、請求項２６に記載のリボザイムアナログ。２９．該第一のフランキング領域および該第二のフランキング領域が、それぞれ、少なくとも４つのヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、またはそれらの組み合わせを含む、請求項２３に記載のリボザイムアナログ。３０．該第一のフランキング領域中の少なくとも４つのヌクレオチドが該基質ＲＮＡ分子の該第一の標的領域中の少なくとも４つのヌクレオチドに相補的であり、該第二のフランキング領域中の少なくとも４つのヌクレオチドが該基質ＲＮＡ分子の該第二の標的領域中の少なくとも４つのヌクレオチドに相補的であり、該第一の標的領域と該第二の標的領域とが互いに排他的である、請求項１８に記載のリボザイムアナログ。３１．基質ＲＮＡ分子の発現を制御する方法であって、（ａ）下記からなるリボザイムアナログ：（i）少なくとも一つの非ヌクレオチド性分子を含む堅固な分子性リンカーであって、下記第一のヌクレオチド性コア領域および第二のヌクレオチド性コア領域によりフランキングされ、該領域に共有結合しているもの、（ii）第一のヌクレオチド性コア領域および第二のヌクレオチド性コア領域であって、これらヌクレオチド性コア領域はそれぞれ３'から５'へ共有結合した複数のヌクレオチドを含み、それぞれ３'末端および５'末端を有し、該第一のヌクレオチド性コア領域と該第二のヌクレオチド性コア領域とは触媒コアを形成し、該触媒コアは下記第一および第二のヌクレオチド性フランキング領域によりフランキングされているもの、（iii）３'から５'へ共有結合した少なくとも４つのヌクレオチドを含み、３'末端および５'末端を有する第一のヌクレオチド性フランキング領域であって、該第一のフランキング領域の少なくとも一部は基質ＲＮＡ分子の第一の標的領域に相補的であり、その３'末端が該触媒コアの該第一のヌクレオチド性コア領域の５'末端に共有結合しているもの、および（iv）３'から５'へ共有結合した少なくとも４つのヌクレオチドを含み、３'末端および５'末端を有する第二のヌクレオチド性フランキング領域であって、該第二のフランキング領域の少なくとも一部は該基質ＲＮＡ分子の第二の標的領域に相補的であり、その５'末端が該触媒コアの該第二のヌクレオチド性コア領域の３'末端に共有結合しているものを用意し、ついで（ｂ）該基質ＲＮＡ分子を該リボザイムアナログと、該第一のフランキング領域が該基質ＲＮＡ分子の該第一の標的領域とハイブリダイズし、該第二のフランキング領域が該基質ＲＮＡ分子の該第二の標的領域とハイブリダイズするように接触させ、該基質ＲＮＡ分子は該リボザイムアナログにより開裂されることを含み、該リボザイムアナログは該ＲＮＡ分子を開裂し、それによって該基質ＲＮＡ分子の発現を制御することを特徴とする方法。３２．該接触工程が、該ＲＮＡを該リボザイムアナログに接触させるのと同時に該ＲＮＡをファシリテーターオリゴヌクレオチドと接触させることをさらに含む、請求項３１に記載の方法。３３．一本鎖ＲＮＡ含有基質分子を部位特異的に開裂する方法であって、（ａ）下記からなるリボザイムアナログ：（i）少なくとも一つの非ヌクレオチド性分子を含む堅固な分子性リンカーであって、下記第一のヌクレオチド性コア領域および第二のヌクレオチド性コア領域によりフランキングされ、該領域に共有結合しているもの、（ii）第一のヌクレオチド性コア領域および第二のヌクレオチド性コア領域であって、これらヌクレオチド性コア領域はそれぞれ３'から５'へ共有結合した複数のヌクレオチドを含み、それぞれ３'末端および５'末端を有し、該第一のヌクレオチド性コア領域と該第二のヌクレオチド性コア領域とは触媒コアを形成し、該触媒コアは下記第一および第二のヌクレオチド性フランキング領域によりフランキングされているもの、（iii）３'から５'へ共有結合した少なくとも４つのヌクレオチドを含み、３'末端および５'末端を有する第一のヌクレオチド性フランキング領域であって、該第一のフランキング領域の少なくとも一部は基質ＲＮＡ分子の第一の標的領域に相補的であり、その３'末端が該触媒コアの該第一のヌクレオチド性コア領域の５'末端に共有結合しているもの、および（iv）３'から５'へ共有結合した少なくとも４つのヌクレオチドを含み、３'末端および５'末端を有する第二のヌクレオチド性フランキング領域であって、該第二のフランキング領域の少なくとも一部は該基質ＲＮＡ分子の第二の標的領域に相補的であり、その５'末端が該触媒コアの該第二のヌクレオチド性コア領域の３'末端に共有結合しているものを用意し、ついで（ｂ）該ＲＮＡ含有基質分子を該リボザイムアナログと、該第一のフランキング領域が該ＲＮＡ含有基質分子の該第一の標的領域とハイブリダイズし、該リボザイムアナログの該第二のフランキング領域が該ＲＮＡ含有基質分子の該第二の標的領域とハイブリダイズするように接触させ、該リボザイムアナログは該分子中の該ＲＮＡを部位特異的に開裂することを特徴とする方法。３４．該ＲＮＡ含有分子を該リボザイムアナログに接触させるのと同時に該ＲＮＡ含有分子をさらにファシリテーターオリゴヌクレオチドと接触させる、請求項３３に記載の方法。３５．下記からなるリボザイムアナログ：（ａ）３'末端および５'末端を有し、３'から５'へ共有結合した複数の自己ハイブリダイズヌクレオチドを含むヌクレオチド性ステム−ループII領域、（ｂ）第一および第二の触媒コア領域であって、これら領域はそれぞれ３'から５'へ共有結合した複数のヌクレオチドを含み、それぞれ３'末端および５'末端を有し、該第一の触媒コア領域はさらに、該ヌクレオチドの２つに共有結合し非保存性のヌクレオチドを置換する堅固な分子性リンカーを含み、該リンカーは少なくとも一つの堅固な非ヌクレオチド性分子を含み、該第一の触媒コア領域の３'末端は該ステム−ループ領域の５'末端に共有結合しており、該第二の触媒コア領域の５'末端は該ステム−ループII領域の３'末端に共有結合しているもの、（ｃ）第一および第二のフランキング領域であって、これら領域はそれぞれ３' から５'へ共有結合した複数のヌクレオチドを含み、それぞれ３'末端および５' 末端を有し、該第一のフランキング領域の少なくとも一部は基質ＲＮＡ分子の第一の標的領域に相補的であり、該第二のフランキング領域の少なくとも一部は該基質ＲＮＡ分子の第二の標的領域に相補的であり、該第一のフランキング領域の３'末端は該第一の触媒コア領域の５'末端に共有結合しており、該第二のフランキング領域の５'末端は該第二の触媒コア領域の３'末端に共有結合しているもの。３６．該ヌクレオチド性ステム−ループII領域が、該自己ハイブリダイズヌクレオチドの２つに共有結合した第二の堅固な分子性リンカーをさらに含み、該第二のリンカーは少なくとも一つの堅固な非ヌクレオチド性分子を含む、請求項３５に記載のリボザイムアナログ。３７．基質ＲＮＡ分子の発現を制御する方法であって、（ａ）下記からなるリボザイムアナログ：（i）３'末端および５'末端を有し、３'から５'へ共有結合した複数の自己ハイブリダイズヌクレオチドを含むヌクレオチド性ステム−ループII領域、（ii）第一および第二の触媒コア領域であって、これら領域はそれぞれ３'から５'へ共有結合した複数のヌクレオチドを含み、それぞれ３'末端および５'末端を有し、該第一の触媒コア領域はさらに、該ヌクレオチドの２つに共有結合し非保存性のヌクレオチドを置換する堅固な分子性リンカーを含み、該リンカーは少なくとも一つの堅固な非ヌクレオチド性分子を含み、該第一の触媒コア領域の３'末端は該ステム−ループ領域の５'末端に共有結合しており、該第二の触媒コア領域の５'末端は該ステム−ループII領域の３'末端に共有結合しているもの、（iii）第一および第二のフランキング領域であって、これら領域はそれぞれ３' から５'へ共有結合した複数のヌクレオチドを含み、それぞれ３'末端および５' 末端を有し、該第一のフランキング領域の少なくとも一部は基質ＲＮＡ分子の第一の標的領域に相補的であり、該第二のフランキング領域の少なくとも一部は該基質ＲＮＡ分子の第二の標的領域に相補的であり、該第一のフランキング領域の３'末端は該第一の触媒コア領域の５'末端に共有結合しており、該第二のフランキング領域の５'末端は該第二の触媒コア領域の３'末端に共有結合しているものを用意し、ついで（ｂ）該基質ＲＮＡ分子を該リボザイムアナログと、該第一のフランキング領域が該基質ＲＮＡ分子の該第一の標的領域とハイブリダイズし、該第二のフランキング領域が該基質ＲＮＡ分子の該第二の標的領域とハイブリダイズするように接触させ、該基質ＲＮＡ分子は該リボザイムアナログにより開裂されることを含み、該リボザイムアナログは該ＲＮＡ分子を開裂し、それによって該基質ＲＮＡ分子の発現を制御することを特徴とする方法。３８．該接触工程が、該ＲＮＡを該リボザイムアナログに接触させるのと同時に該ＲＮＡをファシリテーターオリゴヌクレオチドと接触させることをさらに含む、請求項３７に記載の方法。３９．一本鎖ＲＮＡ含有基質分子を部位特異的に開裂する方法であって、（ａ）下記からなるリボザイム：（i）３'末端および５'末端を有し、３'から５'へ共有結合した複数の自己ハイブリダイズヌクレオチドを含むヌクレオチド性ステム−ルーブII領域、（ii）第一および第二の触媒コア領域であって、これら領域はそれぞれ３'から５'へ共有結合した複数のヌクレオチドを含み、それぞれ３'末端および５'末端を有し、該第一の触媒コア領域はさらに、該ヌクレオチドの２つに共有結合し非保存性のヌクレオチドを置換する堅固な分子性リンカーを含み、該リンカーは少なくとも一つの堅固な非ヌクレオチド性分子を含み、該第一の触媒コア領域の３'末端は該ステム−ループ領域の５'末端に共有結合しており、該第二の触媒コア領域の５'末端は該ステム−ループII領域の３'末端に共有結合しているもの、（iii）第一および第二のフランキング領域であって、これら領域はそれぞれ３' から５'へ共有結合した複数のヌクレオチドを含み、それぞれ３'末端および５' 末端を有し、該第一のフランキング領域の少なくとも一部は基質ＲＮＡ分子の第一の標的領域に相補的であり、該第二のフランキング領域の少なくとも一部は該基質ＲＮＡ分子の第二の標的領域に相補的であり、該第一のフランキング領域の３'末端は該第一の触媒コア領域の５'末端に共有結合しており、該第二のフランキング領域の５'末端は該第二の触媒コア領域の３'末端に共有結合しているものを用意し、ついで（ｂ）該ＲＮＡ含有基質分子を該リボザイムアナログと、該第一のフランキング領域が該ＲＮＡ含有基質分子の該第一の標的領域とハイブリダイズし、該リボザイムアナログの該第二のフランキング領域が該ＲＮＡ含有基質分子の該第二の標的領域とハイブリダイズするように接触させ、該リボザイムアナログは該分子中の該ＲＮＡを部位特異的に開裂することを特徴とする方法。４０．該ＲＮＡ含有分子を該リボザイムアナログに接触させるのと同時に該ＲＮＡ含有分子をさらにファシリテーターオリゴヌクレオチドと接触させる、請求項３９に記載の方法。４１．請求項１に記載のリボザイムアナログを含むキット。４２．ファシリテーターオリゴヌクレオチドをさらに含む請求項１に記載のキット。４３．請求項１８に記載のリボザイムアナログを含むキット。４４．ファシリテーターオリゴヌクレオチドをさらに含む請求項４３に記載のキット。４５．請求項３５に記載のリボザイムアナログを含むキット。４６．ファシリテーターオリゴヌクレオチドをさらに含む請求項４５に記載のキット。４７．生理学的に許容しうる媒体中に請求項１に記載のリボザイムアナログを含む治療用組成物。４８．生理学的に許容しうる媒体中に請求項１８に記載のリボザイムアナログを含む治療用組成物。４９．生理学的に許容しうる媒体中に請求項３５に記載のリボザイムアナログを含む治療用組成物。５０．シクロヘキサンジオール、ステロイド、ルペンジオール、イソソルビドおよびそれらの組み合わせよりなる群から選ばれた少なくとも一つの非ヌクレオチド性分子を含む堅固な分子性リンカー。５１．該リンカーが、ホスホジエステル、ホスホルアミデート、アルキルホスホネート、ホスホロチオエート、アセトアミデート、ホスホロジチオエート、リン酸エステル、アルキルホスホノチオエート、カルバメート、カーボネート、カルボキシメチルエステル、およびそれらの組み合わせよりなる群から選ばれた結合により互いに共有結合した少なくとも２つの隣接した非ヌクレオチド性の分子を含む、請求項５０に記載の分子性リンカー。５２．２〜２０の共有結合した非ヌクレオチド性の分子を含む、請求項５１に記載の分子性リンカー。５３．少なくとも４つの隣接し共有結合したシクロヘキサンジオール分子を含む、請求項５０に記載の分子性リンカー。５４．トランス−１,２−シクロヘキサンジオール、シス−１,２−シクロヘキサンジオール、トランス−１,３−シクロヘキサンジオール、シス−１,３−シクロヘキサンジオール、トランス−１,４−シクロヘキサンジオール、シス−１,４− シクロヘキサンジオールおよびそれらの組み合わせよりなる群から選ばれたシクロヘキサンジオールを含む、請求項５０に記載の分子性リンカー。５５．請求項４３に記載の堅固な分子性リンカーの製造方法であって、（ａ）複数のトランス−１−Ｏ−（４,４'−ジメトキシトリチル）−２−Ｏ−［ β−シアノエトキシ−（Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルアミノ）］ホスフィノ−１,２− シクロヘキサンジオールユニットを調製し、（ｂ）第一のトランス−１−Ｏ−（４,４'−ジメトキシトリチル）−２−Ｏ−［ β−シアノエトキシ−（Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルアミノ）］ホスフィノ−１,２− シクロヘキサンジオールユニットを第二のトランス−１−Ｏ−（４,４'−ジメトキシトリチル）−２−Ｏ−［β−シアノエトキシ−（Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルアミノ）］ホスフィノ−１,２−シクロヘキサンジオールユニットにホスホジエステル結合により共有結合させ、（ｃ）第三のトランス−１−Ｏ−（４,４'−ジメトキシトリチル）−２−Ｏ−［ β−シアノエトキシ−（Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルアミノ）］ホスフィノ−１,２− シクロヘキサンジオールユニットを該第二のトランス−１−Ｏ−（４,４'−ジメトキシトリチル）−２−Ｏ−［β−シアノエトキシ−（Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルアミノ）］ホスフィノ−１,２−シクロヘキサンジオールユニットに共有結合させ、（ｄ）第四のトランス−１−Ｏ−（４,４'−ジメトキシトリチル）−２−Ｏ−［ β−シアノエトキシ−（Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルアミノ）］ホスフィノ−１,２− シクロヘキサンジオールユニットを該第三のトランス−１−Ｏ−（４,４'−ジメトキシトリチル）−２−Ｏ−［β−シアノエトキシ−（Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルアミノ）］ホスフィノ−１,２−シクロヘキサンジオールユニットに共有結合させ、かくして分子性リンカーを形成することを特徴とする方法。５６．請求項５５に記載の方法により製造された分子性リンカー。