JPH10508499A - カンピロバクターのゲノム核酸配列と特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、Ｃ．コリ（C.coli）種に属する株のゲノム核酸と特異的にハイブリダイズし、該株に属さないカンピロバクテリアの核酸とも、カンピロバクター属に近いバクテリアのゲノム核酸とも通常の条件下でハイブリダイズしないＣ．コリから単離された核酸配列に関する。前記配列のフラグメントはカンピロバクター・コリ（Camp ylobacter coli）の特定の配列の増幅のための特異的プライマーとして、及びカンピロバクター・コリの核酸配列に特異的な核酸プローブとして用いられ得る。本発明は、生物サンプル中のカンピロバクター・コリの株の存在を検出するための方法並びにその方法を行うためのキットにも関する。

Description

【発明の詳細な説明】 カンピロバクターのゲノム核酸配列と特異的にハイブリダイズするヌクレオチド 配列 本発明は、カンピロバクター・コリ（Campylobacter coli）の特定の核酸配列 、並びにこの配列の、カンピロバクター・コリの配列の検出のための特定のヌク レオチドプローブとしての適用、又はこの配列のフラグメントの、生物試料中のカンピロバクター・コリ の DNAもしくは RNAの増幅のためのヌクレオチドプライ マーとしての適用に関する。 カンピロバクター（Campylobacter）感染は、ヒト及び野生又は家庭内動物に 影響を及ぼす世界全部で極めて一般的なものである。 現在カンピロバクターと呼ばれるそのバクテリアは、20世紀の初めに発見され たが、それらの特徴がそれらの同定及びそれらの培養を困難なものにしているの で、長い間、認識されなかった。それはヒツジ及びウシにおいて最初に単離されビブリオ・フェトゥス（Vibrio fetus） と呼ばれ、次に後にカンピロバクター・ フェトゥス(Campylobacter fetus) が単離された。ヒトカンピロバクター症の最 初の症例が記載されたのは1946年の初めであったが、カンピロバクター感染の重 要性が証明され、認識され得たのはカンピロバクターのための選択培地が完成し 始めた1972年の初めであった。 カンピロバクター・フェトゥスタイプの種の命名以来、多数の他の種及び亜種 が発見されており、新しい分類基準をしばしば提唱する著者ら及び分類法に従っ て、その数は種々である。これらの種の中で、ヒト及び／又は動物の病理に最も 頻繁に関連するのは、カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni） 、カンピロバ クター・コリ（Campylobacter coli） 及びカンピロバクター・フェトゥス(Campy lobacter fetus) である。 現在、カンピロバクター・ジェジュニ及びカンピロバクター・コリが頻繁にヒ トにおける感染性の下痢の原因となる。 1986年にフランスにおいて設立された“カンピロバクター感染の国家監督組織 ”は、報告されるケースの基本的疫学及び臨床学データを明らかにする評価を毎 年出版する。 ヒトの種において、Ｃ．ジェジュニ又はＣ．コリの腸内の感染の主な症状は下 痢である。その最も深刻なケースにおいて、それは、脱水に極めてセンシティブ である子供及び乳児に特に危険であり得る水分の深刻な喪失に関連し得る。しか しながら、カンピロバクター腸炎はしばしば合併症を伴うことなく、１週間で自 然に下痢がなくなることさえあり得る。しかしながら、その糞培養物が数週間又 は数ヶ月間まで陽性であり続けることがあり、そのケースの５〜10％は、再発し 得る。従って、特に、カンピロバクターが日和見性バクテリアのようにふるまう 免疫抑制され、又は深刻な障害（AIDS、肝臓の肝硬変、癌、白血病等）を有する 患者に対する治療及び厳密な継続管理が本質的である。 まれ又は例外的ではあるが、Ｃ．ジェジュニ又はＣ．コリ感染の他の結果：腸 間膜腺炎、胆嚢炎、尿感染、髄膜炎、敗血症、結節性紅斑又はギャン−バレー症 候群等も記載されている。 動物において、カンピロバクターは、通常多数の種：ウシ、ヒツジ、ブタ、飼 鳥類、野生の鳥類、イヌ及びネコの消化管内に共生して生きている。これらの動 物は、病気又は健康な担体のいずれかにかかわらず、微生物の大きな貯蔵所を形 成するので、重要な汚染の危険が生ずる。ウシ及びヒツジにおける明らかな感染 の場合において、1931年における最初の記載から、“ウシ赤痢”の原因であると してＣ．ジェジュニが知られている。それは、ウシへの影響とは別に、その動物 の環境（土、水）に微生物をまきちらすことによりヒトに伝染することとなり得 る。無症候の動物、“健康な担体”においてでさえ、ヒトへの伝染がおこり得る ：それは、これらの動物もしくはそれらの排出物との直接的接触により、又は汚 染された食物もしくは水（それらの調製の間に汚染され、あまり焼かれていない 肉、低温殺菌されていないミルク、汚染された水等）の消費による。 防止の観点から、いずれかの汚染を防止するために、適切な測定の手段により 可能な限り早く病原体Ｃ．ジェジュニ又はＣ．コリを同定することがヒト及び動 物の両方に重要である。これは特に、滅菌状態が重要視されなければならない農 産物産業の場合である。いずれかの新しい再発を防止するためにカンピロバクタ ー 感染後に治療された病人の正確な継続管理を行うことがヒト病原学において同 様に重要である。 最後に、感染を知った場合、感染の進行を防ぎ、又は伝染体の増殖さえ防ぐで あろう正確かつ有効な治療を施すことができるように、原因である微生物を正確 に同定すること、及び病気の発生後迅速にこれを行うことが極めて重要である。 しかしながら、カンピロバクターの同定及び原因とされる種の決定は容易でない 。実際、それらの単離は特別の培地を必要とし、少くとも48時間培養することに より豊富にした後でなければ、現在のそれらの慣用的検出は行われ得ない。これ は、迅速な診断が必要とされる場合に極めて長い。他方、異なる種間に存在する 表現型の差異を利用する細胞学的及び／又は生化学的技術により微生物の診断が 行われるなら、特に変異体が供された特徴のために現れる場合に、診断の誤差が 生ずる。Ｃ．ジェジュニ及びＣ．コリの識別の場合、その差異の特有の判定基準 は馬尿酸塩の加水分解であり（Ｃ．ジェジュニはそれを加水分解することができ るが、Ｃ．コリはできない）、馬尿酸塩−陰性Ｃ．ジェジュニ株が存在するため この区別が行われ得ないことが時にある n et al.，J.Clin.Microbiol.，1987；25，1747〜1752）。 カンピロバクター属に属する株を同定するための分子ハイブリダイゼーション を用いる試みが提唱されている。しかしながら、これらの方法は、培養後まで同 定を許容せず；それらはその生物サンプル中でこのバクテリアを検出するのに十 分にセンシティブでない。これにより、放射能プローブ(Ng et al.，Mol.Cell.P robes，1987，１，233〜243)又は非放射能プローブ(Chevrier et al.，J.Clin.M icrobiol.，1989，27，321〜326)のいずれかを用いるカンピロバクターの同定及 び分類の方法が提唱されているが、これらの方法は全体のゲルプローブを用い、 検出のしきい値が十分に高く、約１０⁵バクテリアである（Chevrier et al.，前 掲）ため、検出されるべき病原体の培養により豊富にすることが必要とされる。 種の診断の目的でのＣ．ジェジュニの特定の核酸に基づく調査がPicken et al ．(Mol.Cell.Probes，1987，１，245〜259)，Korolik et al.，(J.Gen.Microbio l.，1988，134 ，521〜529)及びZhou and Wang(Zbl.Bakt.，1989，272 ，186〜1 90)により行われているが、特異性の問題が残っており、これらの潜在的プロー ブの配列は決定されていない。 現在、本発明の著者である本発明者らは、Ｃ．ジェジュニ種の特定の DNA配列 を発見した(FR−2701・028)。この配列は、生物試料中でこの種を検出し、同定 することができる PCRテストを完了するのに用いられている（Stonnet and Gues don，FEMS Immunol.Med.Microbiol.，1993，7，337〜344)。その配列の高い特異 性を考慮に入 れると、この PCRテストでは、Ｃ．ジェジュニと同様に臨床的に重要であるＣ． コリ 種が検出されない。現在、Ｃ．コリを含む好熱性カンピロバクターについて の同定及び識別の特定の方法は、Eyers et al.により記載されている（J.Clin.M icrobiol.，1993，31，3340〜3343）。しかしながら、種の特定のプライマーは 、テストされるべき株の DNAがちょうどプライマーの配列において変異を有する 時に“誤った陰性”の結果を得る可能性を排除しない23Ｓリボソーム RNAをコー ドする遺伝子の超可変領域中で選択されている。 しかしながら、これらの理由は、本発明者らがカンピロバクター・コリの特定 の DNA配列を単離し、これらの配列から PCR技術に基づく同定の方法及び分子の ハイブリダイゼーションの技術を開始することを発展させる目的として選択する ことを導いた。これらの２つの技術の組合せは達成されるべき極めて低い検出し きい値を許容し、これは単一のＣ．コリバクテリアが生物試料中で検出され、同 定されることを許容する。 本発明者らは、カンピロバクター・コリ種の特異的検出に利用できる核酸配列 を単離した。 これにより本発明は、Ｃ．コリ種に属する株のゲノム核酸と特異的にハイブリ ダイズし、この種に属しないカンピロバクテリアの核酸と、又はカンピロバクタ ー 属に関連するバクテリアのゲノム核酸と通常の条件下でハイブリダイズしない ヌクレオチド配列に関する。 同様に本発明は、配列番号：１の配列を有する核酸配列、これに相補的な配列 、又は１以上の塩基の変異挿入、欠失もしくは置換によりそれから異なる配列に 関する。 “１以上の塩基による変異、挿入、欠失又は置換によりそれから異なる配列” は、Sambrook J.，Fritsch E.F．and Maniatis T.(19 89)：Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Ed．Cold Spring Harbor Labo ratory（9.47〜9.62）により定義される通常のストリンジェンシーの条件下で配 列番号：１の配列又はその相補的配列とハイブリダイズする配列を意味するとし て理解される。 これらの条件は、平均融解温度Ｔ_mから決定される。 好ましくは、最も有利な配列は、温度範囲（Ｔ_m−15℃）〜（Ｔ_m−20℃）にお いてハイブリダイズするものである。 問題の配列は有利には、少くとも12ヌクレオチドを含む。 本発明はまた、先に規定されるようなヌクレオチド配列、特に No．Ｉ−1491 下で1994年11月14日に National Collection of Microorganism Culturesに寄託 された配列番号：１の配列を含むプラスミドpCS1を含むクローニングベクターに 関する。 先に規定されるヌクレオチド配列は DNA配列又は RNA配列であり得る。 配列番号：１の配列のフラグメントの正確なサイズは 604bpである。 最初に、各々酵素HindIII， BglII及びEcoR Ｖにより消化されたＣ．コリ種の 異なる株(C.coli CIP 70.54，C.coli CIP 70.77，C.coli CIP 70.78，C.coli CI P 70.79，C.coli CIP 70.80，C.coli CIP 70.81，C.coli CIP 71.5，C.coli CIP 103753，C.coli A630臨床用単離物)のゲノム DNAに基づくサザン（Southern） の技術に従ってフラグメントCS１をハイブリダイゼーションテストに用いた。全 ての株はプローブCS１とハイブリダイズする DNAフラグメントを有する。用いた 酵素HindIII， BglII及びEcoR Ｖに従うと、これらのフラグメントは各々2.3kb， 3.5kb又は 2.7及び６kbのサイズを有する。 同じタイプの他のテストにおいて、カンピロバクターの他の種（カンピロバク ター・ジェジュニ 、Ｃ．ラリ（C.lari）、Ｃ．フェト ゥス亜種フェトゥス 、Ｃ．フェトゥス亜種ベネレアリス（venerealis）、Ｃ．ハ イポインテスチナリス （C.hypointestinalis）、Ｃ．スプトルム（C.sputorum） 亜種スプトルム、Ｃ．スプトルム亜種ブブルス(bubulus)、Ｃ．コンシスス（C.c oncisus ）、Ｃ．クルブス（C.curvus）及びＣ．フェカリス(C.fecalis)）又は他 のバクテリア属(大腸菌、アルコバクター・クリアエロフィルス（Arcobacter cr yaerophylus ）、ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori ）、サルモネ ラ・チフィムリウム (Salmonella typhimurium))からの標的 DNAに基づくプロー ブとしてCS１フラグメントを用いた。これらの標的 DNAを酵素HindIIIにより消 化した。Ｃ．コリ（陽性対照）の DNAとの大きなハイブリダイゼーションがオー トラジオグラフィー後３時間に観察された。24時間、露出した後、Ｃ．ジェジュ ニ の DNAからわずかなシグナルが見られた。このクロスハイブリダイゼーション は、Ｃ．ジェジュニとＣ．コリとの間にゲノムレベルで30〜50％の相同性がある ので、解釈できない。CS１フラグメントはテストされた他の DNAのいずれともハ イブリダイズしない。極めて長い露出時間（72時間）の後でさえ、オートラジオ グラフィーでシグナルを見ることはできなかった。 その部分の、又はこれらの機能的に等価な変異体の配列番号：１の配列は、カ ンピロバクター・コリ の検出及び同定のための分子ハイブリダイゼーション技術 に用いられ得る。 機能的に等価な変異体は、これらのフラグメントの特異性に関する本質的特性 が影響を受けることなく塩基対が変異され、欠失され、挿入され又は置換されて いる配列を含む。 本発明によるヌクレオチド配列は、特にカンピロバクター・コリのための特異 的核酸プローブとして又はカンピロバクター・コリの特異的配列の増幅のための オリゴヌクレオチドプライマーとしてヒ ト又は獣医学における診断及び疫学的適用を有する。 本発明によるプローブは、有利には、先に記載の配列又は配列のフラグメント 中に少くとも20の保存性ヌクレオチドを含む。 プローブは DNAプローブ又は RNAプローブである。 本発明に記載されるヌクレオチド配列は、これにより、及び生物試料におけるカンピロバクター・コリ の株を特異的に及び直接的に検出するためのプローブと して用いられ得る。非標識配列がプローブとして直接用いられ得るが、その配列 は多くの適用のために利用できるプローブを得るために、放射能因子（³²Ｐ，³⁵ Ｓ，³Ｈ，²⁵Ｉ）により又は非放射能分子（ビオチン、アセチルアミノフルオレ ン、ジゴキシゲニン、５−ブロモデオキシウリジン）により一般に標識される。 この最後の場合、FR2 422 956及び FR2 518 755に記載される標識方法の１つ を用いることができよう。ハイブリダイゼーション技術は種々の様式で行われ得 る（Mattheus，J.A．and Kricka，L.J.Anal.Biochem．1988，169，1〜25）。最 も一般的な方法は、支持体（ニトロセルロース、ナイロン、ポリスチレン等）上 にカンピロバクター・コリの細胞から抽出された核酸を固定化すること、並びに 十分に規定された条件下でプローブと共に固定化された標的核酸をインキュベー トすることからなる。ハイブリダイゼーションの後、過剰のプローブが除去され 、その形成されたハイブリッド分子は、適切な方法（プローブに関連した放射能 の、蛍光の、又は酵素活性の測定）により検出される。 他の適用において、本明細書に記載される核酸プローブは、捕獲プローブとし て用いられ得る。この過程において、そのプローブは支持体上に固定化され、Ｃ ．コリ から抽出された標的核酸との特異的ハイブリダイゼーションによる捕獲を 供する。必要に応じて、固 体支持体は試料から分離され、次に捕獲プローブと標的核酸との間に形成された 二本鎖は、容易に検出可能な因子で標識された第２の検出プローブにより検出さ れる。 十分な量のカンピロバクター・コリの核酸が分析されるべきサンプルから抽出 され得る場合、本願に記載される配列は、これらのサンプル中でカンピロバクタ ー・コリ に属する株を直接検出及び同定するのに利用できる。反対の場合、液体 培地中の迅速な培養がカンピロバクター・コリの核酸の抽出前に行われ得、又は そのサンプルから抽出されたカンピロバクター・コリの核酸の少量が PCR技術の ような増幅技術にかけられ得る。 配列番号：１の配列及びそれ由来の配列は、オリゴヌクレオチドプライマーを 選択するために、特に PCR技術のために同様に用いられ得る。 この技術は、増幅されるべきフラグメント周りのオリゴヌクレオチドの対の選 択を必要とする(米国特許4 683 202)。これらのオリゴデオキシリボヌクレオチ ド又はオリゴリボヌクレオチドプライマーは、有利には18〜30の間の長さ、好ま しくは、18〜22ヌクレオチドの長さを有する。その２つのプライマーの１つはそ のマトリックスの（＋）鎖に相補的であり、他方のプライマーは（−）鎖に相補 的である。これらのプライマーが二次構造又は互いに相補的な配列を有さないこ とが重要である。更に、各々のプライマーの長さ及び配列は、プライマーが原核 又は真核細胞からの他の核酸とハイブリダイズしないこと、特にサンプルを汚染 するおそれがあり得るコリ種に属さないカンピロバクターの核酸と、及びヒト D NA又は RNAとハイブリダイズしないように選択されなければならない。 カンピロバクター・コリに属する株の核酸配列の増幅のための特異的プライマ ーとして選択されたアンプリマーは、例えばGriffais et al．(Nucleic Acids Res．1991，19，3887〜3891)により記載される方法に 従って選択される。 配列番号：１の配列から開始して、本発明者らは、PCRテストを行うためにオ リゴヌクレオチドを選択した。これらのオリゴヌクレオチドにより、先に示され る10の他のカンピロバクター、特にＣ．ジェジュニの DNAの、又は大腸菌、ヘリ コバクター・ピロリ（Helicobacter pylori ）、サルモネラ・タイフィムリウム （Salmonella typhimurium ）及びアルコバクター・クリエロフィルス（Arcobact er cryaerophilus ）の DNAの目に見える増幅なしに、彼らはカンピロバクター・ コリ の特異的増幅を得た。 極めて特に好ましいプライマーの対は、配列： の配列番号：１由来のオリゴヌクレオチド CSF及び CSRにより示される。 先に記載されるプライマーにより遺伝増幅により得られた核酸のフラグメント も同様に本発明の対象物を形成する。 その増幅されたフラグメントは、アガロースもしくはポリアクリルアミドゲル での電気泳動後、又はキャピラリー電気泳動後、あるいはクロマトグラフィー技 術（ゲルろ過、又は疎水もしくはイオン交換クロマトグラフィー）後に同定され 得る。増幅の特異性は、配列番号：１のヌクレオチド配列、これのフラグメント 、これらの配列もしくはこれらのフラグメントを含むプラスミド、これらの配列 もしくは配列のフラグメントの又は増幅産物の相補的オリゴヌクレオチドをプロ ーブとして用いる分子ハイブリダイゼーションにより制御され得る。 本発明はまた、生物試料中のカンピロバクター・コリの株の存在 を検出する方法であって、 ｉ）先に定義されるようなプライマーと呼ばれるオリゴヌクレオチドフラグメ ントの対を生物試料に接触させるステップであって、前記試料中に含まれる核酸 が、必要に応じて、カンピロバクター・コリに属する株の核酸との前記プライマ ーのハイブリダイゼーションを許容する条件下で先にハイブリダイゼーションに アクセス可能にされているステップと、 ii）前記カンピロバクター・コリの株の核酸を増幅するステップと、 iii）前記プライマーにより囲まれたフラグメントに対応する核酸のフラグメ ントの増幅を明らかにするステップと、 iv）可能であれば、例えば特異的プローブハイブリダイゼーションにより、配 列決定することにより、又は制限部位分析により、前記増幅されたフラグメント の配列を立証するステップと、 を特徴とする方法にも関する。 本発明は更に、生物試料中のカンピロバクター・コリに属する株の存在の検出 のためのキット又はパックであって、次の要素： −先に定義されるような一対のオリゴヌクレオチドと、 −カンピロバクター・コリに属する株の核酸の増幅を行うのに必要な試薬と、 −可能であれば、前記増幅されたフラグメントが立証されるのを許容する構成 物、特に先に定義されるような核酸プローブと、 を含むことを特徴とするキット又はパックに関する。 このキットは、更に有利には、標識又は非標識プローブを含む。これらは溶液 中であり得、又は支持体上に固定化され得る。本キットは、バクテリアの溶菌及 び標的核酸の抽出のために必要な試薬、並びに選択された方法に対応したハイブ リダイゼーション及び洗浄 溶液も含み得る。 本発明は、以下の実施例及び添付の図面に更に詳細に説明される。 図１は、プローブとして用いられるCS１フラグメントとのＣ．コリの異なる株 の DNAのハイブリダイゼーションプロファイルを示す。 図２は、プライマーの CSF及び CSR対での PCRによる増幅の後に得られた電気 泳動結果を示す。 実施例１： Ｃ．コリのゲノムバンクの作製。 そのバンクのスクリーニング及び特異的フラグメントの配列の決定： Ｃ．コリ CIP 70.80のゲノム DNAを、37℃で１時間、製造元により推奨される 緩衝液中で DNAのμｇ当り 0.5Ｕの酵素を作用させることにより、制限エンドヌ クレアーゼHindIIIにより部分的に消化する。これらの条件は、30〜40kbの間の 長さのフラグメントを有利に得ることを許容する。消化した後、その DNAフラグ メントを含む混合物をフェノール／クロロホルム抽出により精製し、その DNAを エタノールで沈殿させる。 そのベクターはコスミド pHC79である。それを酵素HindIIIにより消化して、 いずれの自己連結をも避けるため脱リン酸化する。 700ngのベクターと３μｇの30／40kbの DNAフラグメントとを混合することに より、連結を行い、その混合物を適切な緩衝液中５ユニットのT4 DNAリガーゼを 添加した後、18時間、12℃で処置する。 その組換えコスミドを試験管内でキャプシドに包み、バクテリア（大腸菌HB10 1）を形質転換するのに用いる。その形質転換されたバクテリアをLB培地中で37 ℃で１時間、インキュベートし、次に25μ ｇ／mlのアンピシリンを含む選択寒天培地上に広げる。次にアンピシリン耐性の コロニーをそれらのテトラサイクリンへのセンシティビティーについて全てテス トする；実際、30／40kbの DNAフラグメントは、テトラサイクリンに対する耐性 遺伝子(Tet)を不活性化し、アンピシリンに対する耐性遺伝子(Amp)を保護するよ うにベクター内に挿入される。 アンピシリン耐性(Amp^r)でテトラサイクリンにセンシティブ(Tet^s)な 200の最 初の形質転換体コロニーの DNAのミニ調製をアルカリ溶菌技術に従って行う。次 にこれらの調製物の DNAを制限エンドヌクレアーゼHindIIIにより消化し、0.8％ アガロースゲル上での電気泳動により分析し、次にナイロンフィルターに移す。 その DNAを３分間、254nmのUVへの露出により不可逆的に固定する。 これらの異なるフィルターを、10％デキストランスルフェートを含む６×SSC 緩衝液（１×SSC は0.15M NaCl及び 0.015Ｍクエン酸ナトリウムに相当する）、 濃縮 Denhardt ５×の溶液(Denhardt １×の溶液は0.02％のFicoll、0.02％のポ リビニルピロリドン及び0.02％のウシ血清アルブミンに相当する)、10mM EDTA、 0.5％ SDS、100μｇ／mlの変性サケ*** DNA及び次の２の種：Ｃ．ジェジュニ C IP 70.2、Ｃ．コリ CIP 70.80の１の、多重プライシングにより³²Ｐで放射能標 識されたゲノム DNA中で65℃で16〜18時間、インキュベートする。 ハイブリダイゼーションの後、そのフィルターを65℃で２×SSC中10分間で２ 回、65℃で２×SSC ＋ 0.1％ SDS中30分間で１回、そして最後に65℃で 0.1×SS C 中10分間で１回、洗浄する。そのまだ湿っているフィルターを、15分〜３日間 、増感紙と共に−80℃でオートラジオグラフィーにかける。 これらのハイブリダイゼーションにより、CS１と呼ばれる約 2.3 kbのフラグメントを含むコスミドクローンが単離される。 そのフラグメントの特異性は実施例２に記載されるように立証された。 ２本鎖の DNAのアルカリ変性の後に、コスミドに直接基づくＴ７シーケンシン グキット(Pharmacia)を用いるSanger法に従って、CS１フラグメントを配列決定 した。³⁵Ｓで標識されたdATPで全ての配列決定反応を行った。 フラグメントの配列決定された部分(600塩基対)は、本記載に添付された配列 表に示される。“Genebank”及び“EMBL”データバンクとこれにより決定された フラグメントCS１の 600ヌクレオチドとの比較は、今日知られている配列とのい ずれの大きな相同性もない。 実施例２： 本発明の核酸配列をプローブとして用いるサザン技術による DNA分析： 本研究に用いたバクテリアのリスト及び引用は次の通りである：カンピロバクター ： Ｃ．ジェジュニ亜種ジェジュニ CIP 70.2，CIP 70.86，CIP 81.1 Ｃ．ジェジュニ亜種ドイレイ（doylei）CIP 103751 C.coli CIP 70.80，CIP 71.5，CIP 70.81，CIP 70.79，CIP 70.78，CIPI 70.7 7，CIP 70.54 Ｃ．ラリ CIP 102722 Ｃ．アプサリエンシス（C.upsaliensis ）CIP 103681 Ｃ．フェトゥス亜種フェトゥス CIP 5395 Ｃ．フェトゥス亜種ベネレアリス（venerealis）CIP 6829 Ｃ．ハイオインテスチナリス（C.hyointestinalis ）（臨床用単離物） Ｃ．スプトルム（C.sputorum）亜種スプトルム CCUG 9728 Ｃ．スプトルム亜種ブブルス（bubulus ）CIP 53103 Ｃ．コンシスス（C.concisus）（臨床用単離物） Ｃ．フェカリス（C.fecalis）CIP 12014 Ｃ．クルブス(C.Curvus)(臨床用単離物)非カンピロバクター ： アルコバクター・クリアロフィラ（Arcobacter cryaerophila ） CCUG 17801 ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori ）CIP 101260 大腸菌 HB101 サルモネラ亜属タイフィムリウム（typhimurium）C 53 サルモネラ亜属サラマエ（salamae） サルモネラ亜属ジアリゾナエ（diarizonae） エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus fecalis）JH2−SM エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）D372（臨床用単離物 ） バクテロイデス・フラギリス（Bacteroides fragilis）E134（臨床用単離物） バクテロイデス・フラギリス F238（臨床用単離物） 結果を図１に示す。ここで、そのトラックの番号は先に列記される株の順番に 対応する。 Ｃ．コリ以外のカンピロバクター属に属するバクテリアの DNA： 、カンピロバクターを次の様に処理する：各々のペトリ皿のバクテリアを２mlの TE−グルコース緩衝液(25mM tris HCl、pH８、10mM EDTA、50mMグルコース）に 収集し、５分間、5000ｇで遠心し、その ペレットをTEグルコース中に再分散して洗浄し、次に再び遠心し、そのバクテリ アを 100μｌのTE緩衝液(10mM tris HCl、pH８、１mM EDTA)中に再懸濁し、そし てその DNAをPitcher et al.の技術(Lett.Appl.Microbiol.，1989，8，151〜156 )に従って抽出する。これにより抽出されたDNA ２μｇを酵素HindIIIにより全て 消化する。次に得られたフラグメントを、0.8％の TAEを含アガロースゲル上の 電気泳動により分離し、その後サザン技術に従ってナイロン膜に移す。 移されたフラグメントを分子ハイブリダイゼーションにより分析する。³²Ｐに より標識されたプローブCS１はＣ．コリの DNAを特異的に検出し、Ｃ．ジェジュ ニ のゲノム上に位置した DNAフラグメントと極めて少しハイブリダイズする以外 は他のカンピロバクターのゲノム DNAとハイブリダイズしない。このクロスハイ ブリダイゼーションは18時間の露出の後まで検出されないが、Ｃ．コリの DNAは ３時間の露出後に検出可能である。 カンピロバクター属に属さないバクテリアのDNA： これらのバクテリア及び陽性対照として用いたＣ．コリの DNAを制限酵素Hind III により加水分解し、次にそのフラグメントをアガロースゲル上での電気泳動 により分離し、Hybond−Ｎナイロン膜上に移した。これらの異なる DNAフラグメ ントをランダムプライム DNAラベリングキット（Boehringer）の技術に従って、³² Ｐで標識されたフラグメントCS１をプローブとして用いて、分子ハイブリダイ ゼーションにより分析する。オートラジオグラフィーは、Ｃ．コリの種のみが検 出されることを示す。72時間の露出後でさえ非カンピロバクター種の DNAのハイ ブリダイゼーションは検出され得ない。 実施例３ 本発明に関連する核酸配列で開始する定義されるプライマーでのＣ．コリ の DNAの試験管内酵素増幅。 プライマーの選択： PCRの特異性を決定するのは本質的にオリゴヌクレオチドプライマーの３′端 であることが示されている。これにより、この３′領域が増幅されるべき標的に 完全に特異的であることが重要である。 カンピロバクターのゲノムが極めて低い割合のグアニン及びシトシン（Ｇ＋Ｃ の28〜38％の間）を有するなら、本発明者らはその３′端がＧ＋Ｃで豊富である プライマーが高い特異性を有し得るだろうと考える。 コンピュータープログラムにより、本発明者らは、配列CS１の内側にCS１上に １回のみ存在するＧ＋Ｃの豊富な領域があることを発見した。それは、プライマ ーの配列が位置したこれらの領域から開始し、約20ヌクレオチドの長さを得るよ うに終了する。 オリゴヌクレオチドプライマーの合成： CSF及び CSRと呼ばれ、22ヌクレオチドの長さを有する配列CS１由来のプライ マーを、Institut Pasteurの有機化学サービスによる自動システム上でのホスホ ルアミジト法により合成した。各々のプライマーの濃度は分光光度計により測定 される。 増幅： １μＭの CSF及び CSRオリゴヌクレオチド及び30〜100ngのカンピロバクター の異なる株の DNAを、25mM KCl、20mM tris HCl、pH 8.5、1.5mM MgCl₂、200μ Ｍデオキシリボヌクレオチドトリホスフェート及び 100μｇ／mlのウシ血清アル ブミンを含む緩衝液中 0.5ユニットの Taqポリメラーゼであって、その反応物の 最終容量を50μｌとしたものと共に用いて、Saiki et al.により記載されるプロ トコル(Science，1988，239，487〜491)に従って、試験管内酵素増幅技術(PCR) を行う。PCR段階のパラメーターを次のようにして 選択した：94℃で５分、60℃で１分、72℃で１分、次に（94℃で１分、60℃で１ 分、72℃で１分）を38回、及び94℃で１分、60℃で１分、そして72℃で５分の最 後のサイクル。次に自動装置を用いて40サイクルを行う。その最後のサイクルの 後、分析するまでその試料を４℃に維持する。 増幅された試料のアガロースゲルでの電気泳動分析： 増幅された試料10μｌを１μｇ／mlのエチジウムブロミドを含む TBE緩衝液(0 .04Ｍトリス−ボレート、0.001Ｍ EDTA)中で２％アガロースゲル上におく。その 増幅されたフラグメントをUV下で視覚化し、そのゲルをPolaroid 667フィルムを 用いて写真をとる。 異なる種のカンピロバクターの DNA並びに CSF及び CSRプライマーで得られた 結果は、得られた増幅フラグメントの長さがこのプライマーの対で予測された 2 58塩基対の理論的長さに相当することを示す。 これらの結果に加えて、分析された DNAが次の種又は属：Ｃ．ジェジュニ亜種ジェジュニ 、Ｃ．ジェジュニ亜種ドイレイ、Ｃ．ラリ、Ｃ．アプサリエンシス、Ｃ．フェトゥス 亜種フェトゥス、Ｃ．フェトゥス亜種ベネレアリス、Ｃ．ハイオ インテスチナリス 、Ｃ．クリエロフィラ、Ｃ．スプトルム亜種スプトルム、Ｃ． スプトルム 亜種ブブルス、Ｃ．フェカリス、Ｃ．コンシスス、Ｃ．クルブス、大 腸菌、ヘリコバクター・ピロリ、アルコバクター・クリエロフィルス、サルモネ ラ 亜種サラマエ、サルモネラ亜種ジアリゾナエ、エンテロコッカス・フェカリス 、エンテロコッカス・フェシウム、バクテロイドス・フラギリス又はヒト細胞の 抽出物である場合、いずれの増幅されたフラグメントも見られない。もちろん、 テストされたＣ．コリの全ての株は陽性結果を示し、病気の人々から収集した株 又は単離物であり得る。 結論として、全てのこれらの結果は、PCR技術により及び本発明に記載される プライマーにより、Ｃ．コリ種を特異的に検出することが可能となり、それはＣ ．コリ に感染した病気の人々及び生物試料の単離物が同定され得ることを考慮さ せ、これにより本方法が臨床細菌学の分野、獣医学及び農産物工業において利用 可能となる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．カンピロバクター・コリ（Campylobacter coli）種に属する株のゲノム核 酸と特異的にハイブリダイズし、該株に属さないカンピロバクテリアの核酸とも 、カンピロバクター属に関連するバクテリアのゲノム核酸とも通常の条件下でハ イブリダイズしない核酸配列であって、該配列が、配列番号：１、それに相補的 な配列、又は１以上の塩基の変異、挿入、欠失もしくは置換によりそれらから異 なる配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有することを特徴とする 核酸配列。 ２．請求項１に記載のヌクレオチド配列を含むクローニングベクター。 ３． No.Ｉ−1491下で1994年11月14日にナショナル・コレクション・オブ・ マイクロオルガニズム・カルチャーズに寄託されたプラスミド。 ４．請求項１に記載のヌクレオチド配列の中から選択される少くとも20の連続 ヌクレオチドを含むカンピロバクター・コリの核酸の特異的核酸プローブ。 ５．前記プローブが支持体上に固定化され、捕獲プローブとして用いられるこ とを特徴とする請求項４に記載の核酸プローブ。 ６．カンピロバクター・コリの核酸配列を増幅するための特異的オリゴヌクレ オチドプライマーの対であって、該対が、請求項１に記載の配列の中から選択さ れる18〜30ヌクレオチド、好ましくは18〜22ヌクレオチドを有するオリゴヌクレ オチドの対を含むことを特徴とする対。 ７．配列： のオリゴヌクレオチド対により形成されることを特徴とする請求項６に記載のカ ンピロバクター・コリ の核酸配列を増幅するための特異的オリゴヌクレオチドプ ライマーの対。 ８．請求項６又は７に記載のオリゴヌクレオチドプライマーの対の手段により 、遺伝子増幅技術により、特にPCR技術によりＣ．コリの核酸を増幅することに より得られる核酸フラグメント。 ９．生物試料中のカンピロバクター・コリの存在を検出する方法であって、該 方法が、 ａ）請求項６又は７に記載のプライマーの対に前記生物試料を接触させるステ ップであって、前記生物試料中に含まれるカンピロバクター・コリの核酸が、必 要に応じて、カンピロバクター・コリに属する核酸とのプライマーのハイブリダ イゼーションを許容する条件下で、先にハイブリダイゼーションにアクセス可能 にされているステップと、 ｂ）前記カンピロバクター・コリに属する核酸を増幅させるステップと、 ｃ）前記プライマーにより囲まれたフラグメントに相当するカンピロバクター ・コリ の核酸のフラグメントの増幅を証明するステップと、 ｄ）可能であれば、例えば特異的プローブハイブリダイゼーションにより、配 列決定により又は制限部位分析により前記増幅されたフラグメント配列を確認す るステップと、 を含むことを特徴とする方法。 10．生物試料中のカンピロバクター・コリの存在を検出するためのキットであ って、 請求項６又は７に記載の一対のプライマーと、 カンピロバクター・コリの核酸の増幅を行うために必要な試薬と、 可能であれば、増幅されたフラグメントの配列が確認されるのを許容する構成 物、特に請求項４又は５に記載の核酸プローブと、 を含むことを特徴とするキット。