JPH10147538A - 医療用アンチトロンビン−ｉｉｉの製造法 - Google Patents
医療用アンチトロンビン−ｉｉｉの製造法Info
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- JPH10147538A JPH10147538A JP8309281A JP30928196A JPH10147538A JP H10147538 A JPH10147538 A JP H10147538A JP 8309281 A JP8309281 A JP 8309281A JP 30928196 A JP30928196 A JP 30928196A JP H10147538 A JPH10147538 A JP H10147538A
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Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 アンチトロンビン−III （ＡＴ−III ）
含有水溶液を加熱処理して、医療用ＡＴ−III を製造す
る方法であって、加熱処理後のＡＴ−III の活性が加熱
処理前の８５％以上に維持され、加熱処理後のＡＴ−II
I の単量体の割合が９５％以上に維持されるように、選
択された安定化剤の存在下で加熱処理を行う方法。 【効果】 ウイルス不活化のためにＡＴ−III 含有水溶
液を加熱処理した場合に、ＡＴ−III の活性を安定に保
ち、ＡＴ−III の変性を低減化することができる。医療
上極めて安全性、有用性が高いＡＴ−III を製造するこ
とができる。
含有水溶液を加熱処理して、医療用ＡＴ−III を製造す
る方法であって、加熱処理後のＡＴ−III の活性が加熱
処理前の８５％以上に維持され、加熱処理後のＡＴ−II
I の単量体の割合が９５％以上に維持されるように、選
択された安定化剤の存在下で加熱処理を行う方法。 【効果】 ウイルス不活化のためにＡＴ−III 含有水溶
液を加熱処理した場合に、ＡＴ−III の活性を安定に保
ち、ＡＴ−III の変性を低減化することができる。医療
上極めて安全性、有用性が高いＡＴ−III を製造するこ
とができる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、医療用アンチトロ
ンビン−III の製造法に関する。
ンビン−III の製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】アンチトロンビン−III （以下、ＡＴ−
III という。）は血漿中に存在するα 2 グロブリンに属
する糖蛋白質の一種で、その分子量は６５０００〜６８
０００であり、プロテアーゼ阻害活性を有し、トロンビ
ンの凝固活性を強く阻害する。
III という。）は血漿中に存在するα 2 グロブリンに属
する糖蛋白質の一種で、その分子量は６５０００〜６８
０００であり、プロテアーゼ阻害活性を有し、トロンビ
ンの凝固活性を強く阻害する。
【０００３】また、トロンビンに対する阻害作用のみな
らず、その他の凝固因子、例えば活性化Ｘ因子、活性化
IX因子等に対する阻害作用も有している。その他、プラ
スミンやトリプシンに対する阻害作用のあることも報告
されている。これらの阻害作用は、一般にヘパリンの共
存下でより速やかに進行することが知られている。この
ような薬理作用を有するＡＴ−III は、凝固亢進の補
正、具体的には汎発性血管異常症（ＤＩＣ）の治療を目
的として用いられるものである。
らず、その他の凝固因子、例えば活性化Ｘ因子、活性化
IX因子等に対する阻害作用も有している。その他、プラ
スミンやトリプシンに対する阻害作用のあることも報告
されている。これらの阻害作用は、一般にヘパリンの共
存下でより速やかに進行することが知られている。この
ような薬理作用を有するＡＴ−III は、凝固亢進の補
正、具体的には汎発性血管異常症（ＤＩＣ）の治療を目
的として用いられるものである。
【０００４】ところで、ＡＴ−III を血漿中から回収
し、あるいは異種の細胞に産生させて回収する場合に
は、肝炎ウイルス等の夾雑ウイルスの混在の可能性を否
定することができず、何らかのウイルス不活化処理が必
要である。
し、あるいは異種の細胞に産生させて回収する場合に
は、肝炎ウイルス等の夾雑ウイルスの混在の可能性を否
定することができず、何らかのウイルス不活化処理が必
要である。
【０００５】ウイルス不活化処理のうち、液状加熱処理
の具体例として、６０℃，１０時間にて液状加熱処理す
る方法がよく知られている。しかし、ＡＴ−III はｐＨ
６〜８で安定ではあるが、５６℃，６時間の加熱処理
で、８０％失活することが報告されている（J. Biol. C
hem., 246, 3694, 1971 ）。１４．７ｗ／ｖ％のクエン
酸ナトリウムの存在下で、６０℃，１０時間の液状加熱
処理をすれば、ＡＴ−III の活性が安定に保たれること
が数多く報告されている（Thrombosis Resarch,22 233,
1981及びJ. Biol. Chem., 256, 12140, 1981）。しか
し、０．３５〜１．５Ｍ（１０．２９〜４４．１２ｗ／
ｖ％）のクエン酸ナトリウムの存在下でも、ＡＴ−III
を液状で加熱した場合、免疫電気泳動による分析の結
果、ＡＴ−III の変性が認められている（Vox Sang, 4
8, 325, 1985 ）。
の具体例として、６０℃，１０時間にて液状加熱処理す
る方法がよく知られている。しかし、ＡＴ−III はｐＨ
６〜８で安定ではあるが、５６℃，６時間の加熱処理
で、８０％失活することが報告されている（J. Biol. C
hem., 246, 3694, 1971 ）。１４．７ｗ／ｖ％のクエン
酸ナトリウムの存在下で、６０℃，１０時間の液状加熱
処理をすれば、ＡＴ−III の活性が安定に保たれること
が数多く報告されている（Thrombosis Resarch,22 233,
1981及びJ. Biol. Chem., 256, 12140, 1981）。しか
し、０．３５〜１．５Ｍ（１０．２９〜４４．１２ｗ／
ｖ％）のクエン酸ナトリウムの存在下でも、ＡＴ−III
を液状で加熱した場合、免疫電気泳動による分析の結
果、ＡＴ−III の変性が認められている（Vox Sang, 4
8, 325, 1985 ）。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、ＡＴ−
III を液状で加熱した場合に、ＡＴ−III の活性を安定
に保ち、ＡＴ−III の変性（ダイマー化やポリマー化等
のコンフォメーションの変化）を低減化することによっ
て、医療用に適したＡＴ−III を製造する方法を開発す
べく、鋭意研究を重ねた。
III を液状で加熱した場合に、ＡＴ−III の活性を安定
に保ち、ＡＴ−III の変性（ダイマー化やポリマー化等
のコンフォメーションの変化）を低減化することによっ
て、医療用に適したＡＴ−III を製造する方法を開発す
べく、鋭意研究を重ねた。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明は、上記課題を解
決するものであり、ＡＴ−III 含有水溶液を加熱処理し
て、医療用ＡＴ−III を製造する方法であって、加熱処
理後のＡＴ−III の活性が加熱処理前の８５％以上に維
持され、加熱処理後のＡＴ−III の単量体の割合が９５
％以上に維持されるように、選択された安定化剤の存在
下で加熱処理を行うことを特徴とする。
決するものであり、ＡＴ−III 含有水溶液を加熱処理し
て、医療用ＡＴ−III を製造する方法であって、加熱処
理後のＡＴ−III の活性が加熱処理前の８５％以上に維
持され、加熱処理後のＡＴ−III の単量体の割合が９５
％以上に維持されるように、選択された安定化剤の存在
下で加熱処理を行うことを特徴とする。
【０００８】（Ｉ）出発原料 本発明で使用されるＡＴ−III 含有水溶液は、ヒト由来
のもので医薬として使用できる程度に精製されたもので
あれば特に制限されるものではなく、例えばヒトの全
血、血漿、血清又は凝固した血液から圧搾された血清等
から精製することができる。使用される血液としては、
特にＨＢｓ抗原、抗ＨＩＶ抗体、抗ＡＴＬＶ抗体、抗Ｈ
ＣＶ抗体に対して陰性であり、ＧＴＰが正常値の２倍以
下であるものが好ましい。
のもので医薬として使用できる程度に精製されたもので
あれば特に制限されるものではなく、例えばヒトの全
血、血漿、血清又は凝固した血液から圧搾された血清等
から精製することができる。使用される血液としては、
特にＨＢｓ抗原、抗ＨＩＶ抗体、抗ＡＴＬＶ抗体、抗Ｈ
ＣＶ抗体に対して陰性であり、ＧＴＰが正常値の２倍以
下であるものが好ましい。
【０００９】血液、血漿からのＡＴ−III の精製法とし
ては、例えば特開昭４８−３５０１７号公報（米国特許
３８４２０６１号）、特開昭５４−９５７１５号公報
（米国特許４３４０５８９号）、特開平１−２７５６０
０号公報（ＥＰ３３９９１９）、ＥＰ５５１０８４に開
示の方法等が例示される。
ては、例えば特開昭４８−３５０１７号公報（米国特許
３８４２０６１号）、特開昭５４−９５７１５号公報
（米国特許４３４０５８９号）、特開平１−２７５６０
０号公報（ＥＰ３３９９１９）、ＥＰ５５１０８４に開
示の方法等が例示される。
【００１０】例えば、血漿からクリオプリシピテートを
除去した上清の低温エタノール画分IV−１、画分IV又は
画分II＋III を、さらにヘパリンアフィニティークロマ
トグラフィー等の操作を経て精製する方法等が挙げられ
る。
除去した上清の低温エタノール画分IV−１、画分IV又は
画分II＋III を、さらにヘパリンアフィニティークロマ
トグラフィー等の操作を経て精製する方法等が挙げられ
る。
【００１１】また、細胞培養法〔例えば、特表昭５７−
５００７６８号公報（ＥＰ５３１６５）参照〕、遺伝子
工学法〔例えば、特開昭５８−１６２５２９号公報（Ｅ
Ｐ９０５０５）参照〕等により調製されるＡＴ−III も
使用できる。
５００７６８号公報（ＥＰ５３１６５）参照〕、遺伝子
工学法〔例えば、特開昭５８−１６２５２９号公報（Ｅ
Ｐ９０５０５）参照〕等により調製されるＡＴ−III も
使用できる。
【００１２】（II）加熱処理 本発明における加熱処理は、ＡＴ−III 含有水溶液を加
熱する処理であり、夾雑の可能性のあるウイルスを不活
化するのに充分な温度及び時間行えばよい。具体的には
５０〜７０℃、好ましくは約６０℃にて、１０分間〜２
０時間、好ましくは約１０時間行われる。また、溶液の
ｐＨは一般的には５〜１０、好ましくは６．５〜９．０
であり、適当な低塩濃度緩衝液で調整されていることが
より好ましい。ＡＴ−III 含有水溶液は、ＡＴ−III を
通常１０〜５００単位／ｍｌ、好ましくは１〜２００単
位／ｍｌ、より好ましくは２５〜１００単位／ｍｌの割
合で含有するものである。本明細書においてＡＴ−III
１単位とは、正常人血漿１ｍｌ中に含まれるＡＴ−III
量に相当するＡＴ−III の活性をいう。ＡＴ−III活性
は、例えば合成基質を用いたＡＴ−III 活性測定キット
（テストチームＡＴ−III ・２キット、第一化学薬品社
製）等により測定することができる。
熱する処理であり、夾雑の可能性のあるウイルスを不活
化するのに充分な温度及び時間行えばよい。具体的には
５０〜７０℃、好ましくは約６０℃にて、１０分間〜２
０時間、好ましくは約１０時間行われる。また、溶液の
ｐＨは一般的には５〜１０、好ましくは６．５〜９．０
であり、適当な低塩濃度緩衝液で調整されていることが
より好ましい。ＡＴ−III 含有水溶液は、ＡＴ−III を
通常１０〜５００単位／ｍｌ、好ましくは１〜２００単
位／ｍｌ、より好ましくは２５〜１００単位／ｍｌの割
合で含有するものである。本明細書においてＡＴ−III
１単位とは、正常人血漿１ｍｌ中に含まれるＡＴ−III
量に相当するＡＴ−III の活性をいう。ＡＴ−III活性
は、例えば合成基質を用いたＡＴ−III 活性測定キット
（テストチームＡＴ−III ・２キット、第一化学薬品社
製）等により測定することができる。
【００１３】加熱処理は、加熱処理後の総ＡＴ−III 活
性が加熱処理前の総ＡＴ−III 活性の８５％以上、好ま
しくは９５％以上に維持され、さらにＡＴ−III の単量
体の割合が９５％以上、好ましくは９９％以上に維持さ
れるように行われる。
性が加熱処理前の総ＡＴ−III 活性の８５％以上、好ま
しくは９５％以上に維持され、さらにＡＴ−III の単量
体の割合が９５％以上、好ましくは９９％以上に維持さ
れるように行われる。
【００１４】ＡＴ−III の単量体の割合は、例えばＧ
３，０００ＳＷXLカラムを０．３Ｍ−塩化ナトリウム、
０．０５Ｍ−リン酸緩衝溶液（ｐＨ７．０）で平衡化し
た後に、高速液体クロマトグラフィー分析により測定す
ることができる。
３，０００ＳＷXLカラムを０．３Ｍ−塩化ナトリウム、
０．０５Ｍ−リン酸緩衝溶液（ｐＨ７．０）で平衡化し
た後に、高速液体クロマトグラフィー分析により測定す
ることができる。
【００１５】かかる残存活性及び単量体の割合の条件を
満たすためには、例えば以下に示す安定化剤の混在下で
加熱処理を行えばよい。
満たすためには、例えば以下に示す安定化剤の混在下で
加熱処理を行えばよい。
【００１６】（III ）安定化剤 加熱処理の際に選択された安定化剤としては、有機酸
塩、糖類及び塩化ナトリウムが好ましい。
塩、糖類及び塩化ナトリウムが好ましい。
【００１７】本発明で使用される有機酸は、脂肪族又は
芳香族、飽和又は不飽和、一塩基酸（モノカルボン
酸）、二塩基酸（ジカルボン酸）又は三塩基酸（トリカ
ルボン酸）のいずれでもよい。好ましくは炭素数２〜１
０、より好ましくは炭素数２〜６のものが挙げられる。
一塩基酸としては、グリシン、アラニン、バリン、ロイ
シン、イソロイシン等の一塩基酸のアミノ酸が例示され
る。二塩基酸としては、シュウ酸、マロン酸、コハク
酸、グルタル酸、アジピン酸等の飽和脂肪族ジカルボン
酸、マレイン酸、フマル酸等の不飽和脂肪族ジカルボン
酸、フタル酸等の芳香族ジカルボン酸、アスパラギン
酸、グルタミン酸等の二塩基酸のアミノ酸、リンゴ酸、
酒石酸等の二塩基酸のヒドロキシ酸が例示される。三塩
基酸としては、クエン酸等の三塩基酸のヒドロキシ酸が
例示される。好ましくは、リンゴ酸、酒石酸、マレイン
酸、アスパラギン酸、クエン酸であり、より好ましくは
リンゴ酸、クエン酸である。
芳香族、飽和又は不飽和、一塩基酸（モノカルボン
酸）、二塩基酸（ジカルボン酸）又は三塩基酸（トリカ
ルボン酸）のいずれでもよい。好ましくは炭素数２〜１
０、より好ましくは炭素数２〜６のものが挙げられる。
一塩基酸としては、グリシン、アラニン、バリン、ロイ
シン、イソロイシン等の一塩基酸のアミノ酸が例示され
る。二塩基酸としては、シュウ酸、マロン酸、コハク
酸、グルタル酸、アジピン酸等の飽和脂肪族ジカルボン
酸、マレイン酸、フマル酸等の不飽和脂肪族ジカルボン
酸、フタル酸等の芳香族ジカルボン酸、アスパラギン
酸、グルタミン酸等の二塩基酸のアミノ酸、リンゴ酸、
酒石酸等の二塩基酸のヒドロキシ酸が例示される。三塩
基酸としては、クエン酸等の三塩基酸のヒドロキシ酸が
例示される。好ましくは、リンゴ酸、酒石酸、マレイン
酸、アスパラギン酸、クエン酸であり、より好ましくは
リンゴ酸、クエン酸である。
【００１８】さらに、かかる有機酸は塩の態様をしてい
てもよい。有機酸の塩としては、例えばナトリウム塩、
カリウム塩等のアルカリ金属塩、カルシウム塩等のアル
カリ土類金属塩、アンモニウム塩等の有機塩等が例示さ
れる。好ましくは、ナトリウム塩又はカルシウム塩であ
る。本発明で使用される有機酸塩として、より好ましく
はリンゴ酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムであり、特
に好ましくはクエン酸ナトリウムである。
てもよい。有機酸の塩としては、例えばナトリウム塩、
カリウム塩等のアルカリ金属塩、カルシウム塩等のアル
カリ土類金属塩、アンモニウム塩等の有機塩等が例示さ
れる。好ましくは、ナトリウム塩又はカルシウム塩であ
る。本発明で使用される有機酸塩として、より好ましく
はリンゴ酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムであり、特
に好ましくはクエン酸ナトリウムである。
【００１９】有機酸もしくはその塩は、好ましくは３〜
２０ｗ／ｖ％、より好ましくは３〜１０ｗ／ｖ％、特に
好ましくは３〜５ｗ／ｖ％の範囲となるように添加され
る。この添加量が３ｗ／ｖ％未満の場合、安定化効果が
低下する。
２０ｗ／ｖ％、より好ましくは３〜１０ｗ／ｖ％、特に
好ましくは３〜５ｗ／ｖ％の範囲となるように添加され
る。この添加量が３ｗ／ｖ％未満の場合、安定化効果が
低下する。
【００２０】糖類又は塩化ナトリウムの添加は、有機酸
の添加量を低くし、ＡＴ−III 活性の失活の原因となる
二峰性（ＡＴ−III のダイマー化及びポリマー化）を防
ぐことができる。本発明で使用される糖類としては、例
えば単糖類、二糖類、糖アルコール、アミノ糖等が挙げ
られる。単糖類としてはグルコース、フルクトース、ガ
ラクトース、マンノース、アラビノース、イノシトール
等が、二糖類としてはサッカロース、ラクトース、マル
トース等が、また糖アルコールとしてはマンニトール、
ソルビトール、キシリトール等が例示される。またアミ
ノ糖としては、グルコサミン及びアミノ糖誘導体である
Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン等が例示される。好ま
しくは、サッカロース、ラクトース、ソルビトール、イ
ノシトール、マルトース、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサ
ミン、マンニトールである。
の添加量を低くし、ＡＴ−III 活性の失活の原因となる
二峰性（ＡＴ−III のダイマー化及びポリマー化）を防
ぐことができる。本発明で使用される糖類としては、例
えば単糖類、二糖類、糖アルコール、アミノ糖等が挙げ
られる。単糖類としてはグルコース、フルクトース、ガ
ラクトース、マンノース、アラビノース、イノシトール
等が、二糖類としてはサッカロース、ラクトース、マル
トース等が、また糖アルコールとしてはマンニトール、
ソルビトール、キシリトール等が例示される。またアミ
ノ糖としては、グルコサミン及びアミノ糖誘導体である
Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン等が例示される。好ま
しくは、サッカロース、ラクトース、ソルビトール、イ
ノシトール、マルトース、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサ
ミン、マンニトールである。
【００２１】糖類は、好ましくは１０〜６０ｗ／ｖ％、
より好ましくは２０〜５０ｗ／ｖ％、特に好ましくは２
０〜３０ｗ／ｖ％の範囲となるように添加される。この
添加量が１０ｗ／ｖ％未満の場合、安定化効果が低下
し、逆に添加量が６０ｗ／ｖ％を超える場合、安定化効
果は良好となるが、夾雑ウイルスも安定化される可能性
があるので好ましくない。
より好ましくは２０〜５０ｗ／ｖ％、特に好ましくは２
０〜３０ｗ／ｖ％の範囲となるように添加される。この
添加量が１０ｗ／ｖ％未満の場合、安定化効果が低下
し、逆に添加量が６０ｗ／ｖ％を超える場合、安定化効
果は良好となるが、夾雑ウイルスも安定化される可能性
があるので好ましくない。
【００２２】塩化ナトリウムは、好ましくは０．５〜
３．０Ｍ、より好ましくは１．０〜２．５Ｍ、特に好ま
しくは１．５〜２．０Ｍとなるように添加される。この
添加量が０．５Ｍ未満の場合、安定化効果が低下し、逆
に添加量が３．０Ｍを超える場合、安定化効果は良好と
なるが、溶解性が低下するので好ましくない。
３．０Ｍ、より好ましくは１．０〜２．５Ｍ、特に好ま
しくは１．５〜２．０Ｍとなるように添加される。この
添加量が０．５Ｍ未満の場合、安定化効果が低下し、逆
に添加量が３．０Ｍを超える場合、安定化効果は良好と
なるが、溶解性が低下するので好ましくない。
【００２３】但し、本発明においては、加熱処理後の総
ＡＴ−III 活性が加熱処理前の総ＡＴ−III 活性の８５
％以上に維持され、さらに加熱処理後のＡＴ−III の単
量体の割合が９５％以上に維持されるという条件を満た
す限り、上記の安定化剤の添加量に限定されるものでは
ない。
ＡＴ−III 活性が加熱処理前の総ＡＴ−III 活性の８５
％以上に維持され、さらに加熱処理後のＡＴ−III の単
量体の割合が９５％以上に維持されるという条件を満た
す限り、上記の安定化剤の添加量に限定されるものでは
ない。
【００２４】（IV）後処理 本発明により製造されたＡＴ−III は、医療用とし好適
に用いられ、必要に応じて透析、除菌濾過、ｐＨ調整を
行った後に分注される。また、所望により凍結乾燥製剤
としてもよい。
に用いられ、必要に応じて透析、除菌濾過、ｐＨ調整を
行った後に分注される。また、所望により凍結乾燥製剤
としてもよい。
【００２５】本発明により製造されたＡＴ−III は、先
天性ＡＴ−III 欠乏に起因する血栓形成傾向及びＡＴ−
III 低下を伴う汎発性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）の治
療に有用である。ＡＴ−III の投与方法は、従来のＡＴ
−III 注射剤もしくは点滴剤の処方に準じることがで
き、例えば液状製剤を緩徐に静注もしくは点滴静注する
方法が挙げられる。
天性ＡＴ−III 欠乏に起因する血栓形成傾向及びＡＴ−
III 低下を伴う汎発性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）の治
療に有用である。ＡＴ−III の投与方法は、従来のＡＴ
−III 注射剤もしくは点滴剤の処方に準じることがで
き、例えば液状製剤を緩徐に静注もしくは点滴静注する
方法が挙げられる。
【００２６】通常、ＡＴ−III は１日１，０００〜３，
０００単位（又は２０〜６０単位／kg）の割合で投与さ
れるが、かかる投与量は年齢、体重、症状等により適宜
増減してもよい。なお、産科的、外科的ＤＩＣ等で緊急
処置として本剤を使用する場合は、１日１回４０〜６０
単位／ｋｇを投与することが好ましい。液状製剤の浸透
圧は、ヒト及び動物の生理的条件と同じかもしくはそれ
に近いことが好ましい。
０００単位（又は２０〜６０単位／kg）の割合で投与さ
れるが、かかる投与量は年齢、体重、症状等により適宜
増減してもよい。なお、産科的、外科的ＤＩＣ等で緊急
処置として本剤を使用する場合は、１日１回４０〜６０
単位／ｋｇを投与することが好ましい。液状製剤の浸透
圧は、ヒト及び動物の生理的条件と同じかもしくはそれ
に近いことが好ましい。
【００２７】
【実施例】次に、実施例を示して本発明をさらに具体的
に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるもの
でない。
に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるもの
でない。
【００２８】実施例１ コーンの冷エタノール分画法で得られた画分IV−１のペ
ースト１０ｋｇを生理食塩水１００リットルに懸濁し、
硫酸バリウムを５ｗ／ｖ％になるように加え、室温で３
０分間攪拌し、微量に存在するプロトロンビンを硫酸バ
リウムに吸着させて除去した。この上清液をｐＨ６．５
に調整し、ポリエチレングリコール♯４，０００（平均
分子量試験２６００〜３８００、日本曹達社製、以下同
じ）を１３ｗ／ｖ％となるように加え、生じた沈澱を遠
心分離して除き、さらにポリエチレングリコール♯４，
０００を３０ｗ／ｖ％になるように加え、生じた沈澱を
遠心分離して回収した。
ースト１０ｋｇを生理食塩水１００リットルに懸濁し、
硫酸バリウムを５ｗ／ｖ％になるように加え、室温で３
０分間攪拌し、微量に存在するプロトロンビンを硫酸バ
リウムに吸着させて除去した。この上清液をｐＨ６．５
に調整し、ポリエチレングリコール♯４，０００（平均
分子量試験２６００〜３８００、日本曹達社製、以下同
じ）を１３ｗ／ｖ％となるように加え、生じた沈澱を遠
心分離して除き、さらにポリエチレングリコール♯４，
０００を３０ｗ／ｖ％になるように加え、生じた沈澱を
遠心分離して回収した。
【００２９】この沈澱を冷生理食塩水約２０リットルに
溶解し、予め生理食塩水で調整されたヘパリンセファロ
ース（ファルマシア社製）のカラムに注入し、ＡＴ−II
I をカラムに吸着させた。このカラムを０．４Ｍの塩化
ナトリウム溶液で洗浄して不純蛋白を除いた後、２．０
Ｍの塩化ナトリウム溶液をカラムに流して溶出してくる
部分を回収した。
溶解し、予め生理食塩水で調整されたヘパリンセファロ
ース（ファルマシア社製）のカラムに注入し、ＡＴ−II
I をカラムに吸着させた。このカラムを０．４Ｍの塩化
ナトリウム溶液で洗浄して不純蛋白を除いた後、２．０
Ｍの塩化ナトリウム溶液をカラムに流して溶出してくる
部分を回収した。
【００３０】このＡＴ−III の水溶液に、表１に記載の
安定化剤を添加し、ｐＨ７．８に調整した後、６０℃で
１０時間の加熱処理を施した。３Ｍ塩化ナトリウム含有
２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で平
衡化したブチル型ポリビニル系担体（ブチルトヨパール
６５０、東洋曹達（株）製）にＡＴ−III 含有水溶液を
接触させた後に、上記緩衝液で展開し、未吸着画分を回
収した。続いて０．５％クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ７．５）に対して一夜透析を行い、精製されたＡＴ−
III を得た。
安定化剤を添加し、ｐＨ７．８に調整した後、６０℃で
１０時間の加熱処理を施した。３Ｍ塩化ナトリウム含有
２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で平
衡化したブチル型ポリビニル系担体（ブチルトヨパール
６５０、東洋曹達（株）製）にＡＴ−III 含有水溶液を
接触させた後に、上記緩衝液で展開し、未吸着画分を回
収した。続いて０．５％クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ７．５）に対して一夜透析を行い、精製されたＡＴ−
III を得た。
【００３１】加熱処理後の精製された各ＡＴ−III の活
性を測定し、加熱処理前のＡＴ−III 活性に対する残存
率を求めた。さらに、各ＡＴ−III の単量体の割合を求
めた。
性を測定し、加熱処理前のＡＴ−III 活性に対する残存
率を求めた。さらに、各ＡＴ−III の単量体の割合を求
めた。
【００３２】（１）ＡＴ−III 活性の測定及び活性残存
率の計算 ＡＴ−III 活性は、ＡＴ−III 活性測定キット（テスト
チームＡＴ−III ・２キット、第一化学薬品社製）を用
いて、以下の方法で行った。
率の計算 ＡＴ−III 活性は、ＡＴ−III 活性測定キット（テスト
チームＡＴ−III ・２キット、第一化学薬品社製）を用
いて、以下の方法で行った。
【００３３】検体希釈液５０μｌ〔２．４Ｕ／ｍｌヘパ
リン，４０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液，０．１４Ｍ Ｎ
ａＣｌ，１０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．４）中〕をチュ
ーブに採り、ヒトトロンビン溶液〔０．９％塩化ナトリ
ウム、０．０５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ），０．
０５％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）♯６０００
（平均分子量試験７３００〜９３００、日本曹達社製）
中、１Ｕ／ｍｌトロンビン含有〕１００μｌを加え、３
７℃で５分間プレインキュベートした後、合成基質液
（Ｓ−２２３８：ＨＤ−フェニルアラニル−Ｌ−ピペコ
リル−Ｌ−アルギニル−ｐ−ニトロアニリド・二塩酸
塩）１００μｌを加え、さらに３７℃で５分間インキュ
ベートした。発色後、クエン酸溶液を１ｍｌ加えて反応
を停止させ、分光光度計で波長４０５ｎｍの吸光度を測
定した。測定検体と同時に正常ヒト血漿（１Ｕ ＡＴ−
III ／ｍｌ）を測定し、その検量線から検体のＡＴ−II
I 活性（Ｕ／ｍｌ）を測定した。
リン，４０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液，０．１４Ｍ Ｎ
ａＣｌ，１０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．４）中〕をチュ
ーブに採り、ヒトトロンビン溶液〔０．９％塩化ナトリ
ウム、０．０５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ），０．
０５％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）♯６０００
（平均分子量試験７３００〜９３００、日本曹達社製）
中、１Ｕ／ｍｌトロンビン含有〕１００μｌを加え、３
７℃で５分間プレインキュベートした後、合成基質液
（Ｓ−２２３８：ＨＤ−フェニルアラニル−Ｌ−ピペコ
リル−Ｌ−アルギニル−ｐ−ニトロアニリド・二塩酸
塩）１００μｌを加え、さらに３７℃で５分間インキュ
ベートした。発色後、クエン酸溶液を１ｍｌ加えて反応
を停止させ、分光光度計で波長４０５ｎｍの吸光度を測
定した。測定検体と同時に正常ヒト血漿（１Ｕ ＡＴ−
III ／ｍｌ）を測定し、その検量線から検体のＡＴ−II
I 活性（Ｕ／ｍｌ）を測定した。
【００３４】ＡＴ−III 活性の残存率は、加熱処理前の
総ＡＴ−III 活性〔Ｕ／ｍｌ×液量（ｍｌ）〕に対す
る、加熱処理後の各ＡＴ−III における総ＡＴ−III 活
性の百分率により求め、表１にまとめた。
総ＡＴ−III 活性〔Ｕ／ｍｌ×液量（ｍｌ）〕に対す
る、加熱処理後の各ＡＴ−III における総ＡＴ−III 活
性の百分率により求め、表１にまとめた。
【００３５】（２）ＡＴ−III 比活性 各検体を吸光度Ａ280nm で測定して蛋白質量を求めた。
上記により求められたＡＴ−III 活性を蛋白質量で除し
て、各検体の比活性（Ｕ／Ａ280nm ）を求め、表１にま
とめた。
上記により求められたＡＴ−III 活性を蛋白質量で除し
て、各検体の比活性（Ｕ／Ａ280nm ）を求め、表１にま
とめた。
【００３６】（３）高速液体クロマトグラフィー（ＨＰ
ＬＣ）分析 Ｇ３，０００ＳＷXLカラム（東ソー社製）を０．３Ｍ−
ＮａＣｌ加０．０５Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）で
平衡化した後、流速０．７ｍｌ／分で測定を行った。Ｈ
ＰＬＣ分析によるＡＴ−III の単量体の割合を表１に示
す。なお、表１の結果から、ＡＴ−III の変性（ダイマ
ー化やポリマー化等のコンフォメーションの変化）の割
合を求めることができる。
ＬＣ）分析 Ｇ３，０００ＳＷXLカラム（東ソー社製）を０．３Ｍ−
ＮａＣｌ加０．０５Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）で
平衡化した後、流速０．７ｍｌ／分で測定を行った。Ｈ
ＰＬＣ分析によるＡＴ−III の単量体の割合を表１に示
す。なお、表１の結果から、ＡＴ−III の変性（ダイマ
ー化やポリマー化等のコンフォメーションの変化）の割
合を求めることができる。
【００３７】
【表１】
【００３８】クエン酸ナトリウムと塩化ナトリウムとを
添加すると相乗効果が認められ、ダイマー化やポリマー
化を防ぐことができ、クエン酸ナトリウムが低濃度でも
安定化効果は認められた。なお、表中、Na-Citはクエン
酸ナトリウムを、Sorb. はソルビトールをそれぞれ示
す。
添加すると相乗効果が認められ、ダイマー化やポリマー
化を防ぐことができ、クエン酸ナトリウムが低濃度でも
安定化効果は認められた。なお、表中、Na-Citはクエン
酸ナトリウムを、Sorb. はソルビトールをそれぞれ示
す。
【００３９】
【発明の効果】ウイルス不活化のためにＡＴ−III を液
状で加熱した場合に、ＡＴ−III の活性を安定に保ち、
ＡＴ−III の変性（ダイマー化やポリマー化等のコンフ
ォメーションの変化）を低減化することができ、医療上
極めて安全性、有用性が高いＡＴ−III を製造すること
ができる。
状で加熱した場合に、ＡＴ−III の活性を安定に保ち、
ＡＴ−III の変性（ダイマー化やポリマー化等のコンフ
ォメーションの変化）を低減化することができ、医療上
極めて安全性、有用性が高いＡＴ−III を製造すること
ができる。
Claims (7)
- 【請求項１】 アンチトロンビン−III 含有水溶液を加
熱処理して、医療用アンチトロンビン−III を製造する
方法であって、加熱処理後のアンチトロンビン−III の
活性が加熱処理前の８５％以上に維持され、加熱処理後
のアンチトロンビン−III の単量体の割合が９５％以上
に維持されるように、選択された安定化剤の存在下で加
熱処理を行うことを特徴とする医療用アンチトロンビン
−IIIの製造法。 - 【請求項２】 選択された安定化剤が、有機酸塩、糖類
及び塩化ナトリウムである請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 有機酸塩がクエン酸ナトリウムである請
求項２記載の方法。 - 【請求項４】 糖類がソルビトールである請求項２記載
の方法。 - 【請求項５】 塩化ナトリウムの含有量が０．５〜２．
５Ｍである請求項２記載の方法。 - 【請求項６】 クエン酸ナトリウムの含有量が３〜２０
ｗ／ｖ％である請求項３記載の方法。 - 【請求項７】 ソルビトールの含有量が１０〜６０ｗ／
ｖ％である請求項４記載の方法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8309281A JPH10147538A (ja) | 1996-11-20 | 1996-11-20 | 医療用アンチトロンビン−ｉｉｉの製造法 |
| US08/974,191 US5989593A (en) | 1996-11-20 | 1997-11-19 | Method for producing antithrombin-III, method for purifying it, and preparation containing it |
| EP97120271A EP0844254A3 (en) | 1996-11-20 | 1997-11-19 | Method for producing antithrombin-III, method for purifying it, and preparation containing it |
| TW086117349A TW565453B (en) | 1996-11-20 | 1997-11-20 | Method for purifying antithrombin-III |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8309281A JPH10147538A (ja) | 1996-11-20 | 1996-11-20 | 医療用アンチトロンビン−ｉｉｉの製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10147538A true JPH10147538A (ja) | 1998-06-02 |
Family
ID=17991118
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8309281A Abandoned JPH10147538A (ja) | 1996-11-20 | 1996-11-20 | 医療用アンチトロンビン−ｉｉｉの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH10147538A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20150101454A (ko) * | 2012-12-28 | 2015-09-03 | 세이가가쿠 고교 가부시키가이샤 | 리물루스 시험에 사용되는 안티트롬빈 ⅲ 용 전처리제 및 전처리 방법 |
-
1996
- 1996-11-20 JP JP8309281A patent/JPH10147538A/ja not_active Abandoned
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20150101454A (ko) * | 2012-12-28 | 2015-09-03 | 세이가가쿠 고교 가부시키가이샤 | 리물루스 시험에 사용되는 안티트롬빈 ⅲ 용 전처리제 및 전처리 방법 |
| JPWO2014104352A1 (ja) * | 2012-12-28 | 2017-01-19 | 生化学工業株式会社 | リムルス試験に付されるアンチトロンビンｉｉｉ用の前処理剤及び前処理方法 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A762 | Written abandonment of application |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A762 Effective date: 20060510 |