JPH10147538A - 医療用アンチトロンビン−iiiの製造法 - Google Patents
医療用アンチトロンビン−iiiの製造法Info
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- JPH10147538A JPH10147538A JP8309281A JP30928196A JPH10147538A JP H10147538 A JPH10147538 A JP H10147538A JP 8309281 A JP8309281 A JP 8309281A JP 30928196 A JP30928196 A JP 30928196A JP H10147538 A JPH10147538 A JP H10147538A
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Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 アンチトロンビン−III (AT−III )
含有水溶液を加熱処理して、医療用AT−III を製造す
る方法であって、加熱処理後のAT−III の活性が加熱
処理前の85%以上に維持され、加熱処理後のAT−II
I の単量体の割合が95%以上に維持されるように、選
択された安定化剤の存在下で加熱処理を行う方法。 【効果】 ウイルス不活化のためにAT−III 含有水溶
液を加熱処理した場合に、AT−III の活性を安定に保
ち、AT−III の変性を低減化することができる。医療
上極めて安全性、有用性が高いAT−III を製造するこ
とができる。
含有水溶液を加熱処理して、医療用AT−III を製造す
る方法であって、加熱処理後のAT−III の活性が加熱
処理前の85%以上に維持され、加熱処理後のAT−II
I の単量体の割合が95%以上に維持されるように、選
択された安定化剤の存在下で加熱処理を行う方法。 【効果】 ウイルス不活化のためにAT−III 含有水溶
液を加熱処理した場合に、AT−III の活性を安定に保
ち、AT−III の変性を低減化することができる。医療
上極めて安全性、有用性が高いAT−III を製造するこ
とができる。
Description
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、医療用アンチトロ
ンビン−III の製造法に関する。
ンビン−III の製造法に関する。
【0002】
【従来の技術】アンチトロンビン−III (以下、AT−
III という。)は血漿中に存在するα 2 グロブリンに属
する糖蛋白質の一種で、その分子量は65000〜68
000であり、プロテアーゼ阻害活性を有し、トロンビ
ンの凝固活性を強く阻害する。
III という。)は血漿中に存在するα 2 グロブリンに属
する糖蛋白質の一種で、その分子量は65000〜68
000であり、プロテアーゼ阻害活性を有し、トロンビ
ンの凝固活性を強く阻害する。
【0003】また、トロンビンに対する阻害作用のみな
らず、その他の凝固因子、例えば活性化X因子、活性化
IX因子等に対する阻害作用も有している。その他、プラ
スミンやトリプシンに対する阻害作用のあることも報告
されている。これらの阻害作用は、一般にヘパリンの共
存下でより速やかに進行することが知られている。この
ような薬理作用を有するAT−III は、凝固亢進の補
正、具体的には汎発性血管異常症(DIC)の治療を目
的として用いられるものである。
らず、その他の凝固因子、例えば活性化X因子、活性化
IX因子等に対する阻害作用も有している。その他、プラ
スミンやトリプシンに対する阻害作用のあることも報告
されている。これらの阻害作用は、一般にヘパリンの共
存下でより速やかに進行することが知られている。この
ような薬理作用を有するAT−III は、凝固亢進の補
正、具体的には汎発性血管異常症(DIC)の治療を目
的として用いられるものである。
【0004】ところで、AT−III を血漿中から回収
し、あるいは異種の細胞に産生させて回収する場合に
は、肝炎ウイルス等の夾雑ウイルスの混在の可能性を否
定することができず、何らかのウイルス不活化処理が必
要である。
し、あるいは異種の細胞に産生させて回収する場合に
は、肝炎ウイルス等の夾雑ウイルスの混在の可能性を否
定することができず、何らかのウイルス不活化処理が必
要である。
【0005】ウイルス不活化処理のうち、液状加熱処理
の具体例として、60℃,10時間にて液状加熱処理す
る方法がよく知られている。しかし、AT−III はpH
6〜8で安定ではあるが、56℃,6時間の加熱処理
で、80%失活することが報告されている(J. Biol. C
hem., 246, 3694, 1971 )。14.7w/v%のクエン
酸ナトリウムの存在下で、60℃,10時間の液状加熱
処理をすれば、AT−III の活性が安定に保たれること
が数多く報告されている(Thrombosis Resarch,22 233,
1981及びJ. Biol. Chem., 256, 12140, 1981)。しか
し、0.35〜1.5M(10.29〜44.12w/
v%)のクエン酸ナトリウムの存在下でも、AT−III
を液状で加熱した場合、免疫電気泳動による分析の結
果、AT−III の変性が認められている(Vox Sang, 4
8, 325, 1985 )。
の具体例として、60℃,10時間にて液状加熱処理す
る方法がよく知られている。しかし、AT−III はpH
6〜8で安定ではあるが、56℃,6時間の加熱処理
で、80%失活することが報告されている(J. Biol. C
hem., 246, 3694, 1971 )。14.7w/v%のクエン
酸ナトリウムの存在下で、60℃,10時間の液状加熱
処理をすれば、AT−III の活性が安定に保たれること
が数多く報告されている(Thrombosis Resarch,22 233,
1981及びJ. Biol. Chem., 256, 12140, 1981)。しか
し、0.35〜1.5M(10.29〜44.12w/
v%)のクエン酸ナトリウムの存在下でも、AT−III
を液状で加熱した場合、免疫電気泳動による分析の結
果、AT−III の変性が認められている(Vox Sang, 4
8, 325, 1985 )。
【0006】
【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、AT−
III を液状で加熱した場合に、AT−III の活性を安定
に保ち、AT−III の変性(ダイマー化やポリマー化等
のコンフォメーションの変化)を低減化することによっ
て、医療用に適したAT−III を製造する方法を開発す
べく、鋭意研究を重ねた。
III を液状で加熱した場合に、AT−III の活性を安定
に保ち、AT−III の変性(ダイマー化やポリマー化等
のコンフォメーションの変化)を低減化することによっ
て、医療用に適したAT−III を製造する方法を開発す
べく、鋭意研究を重ねた。
【0007】
【課題を解決するための手段】本発明は、上記課題を解
決するものであり、AT−III 含有水溶液を加熱処理し
て、医療用AT−III を製造する方法であって、加熱処
理後のAT−III の活性が加熱処理前の85%以上に維
持され、加熱処理後のAT−III の単量体の割合が95
%以上に維持されるように、選択された安定化剤の存在
下で加熱処理を行うことを特徴とする。
決するものであり、AT−III 含有水溶液を加熱処理し
て、医療用AT−III を製造する方法であって、加熱処
理後のAT−III の活性が加熱処理前の85%以上に維
持され、加熱処理後のAT−III の単量体の割合が95
%以上に維持されるように、選択された安定化剤の存在
下で加熱処理を行うことを特徴とする。
【0008】(I)出発原料 本発明で使用されるAT−III 含有水溶液は、ヒト由来
のもので医薬として使用できる程度に精製されたもので
あれば特に制限されるものではなく、例えばヒトの全
血、血漿、血清又は凝固した血液から圧搾された血清等
から精製することができる。使用される血液としては、
特にHBs抗原、抗HIV抗体、抗ATLV抗体、抗H
CV抗体に対して陰性であり、GTPが正常値の2倍以
下であるものが好ましい。
のもので医薬として使用できる程度に精製されたもので
あれば特に制限されるものではなく、例えばヒトの全
血、血漿、血清又は凝固した血液から圧搾された血清等
から精製することができる。使用される血液としては、
特にHBs抗原、抗HIV抗体、抗ATLV抗体、抗H
CV抗体に対して陰性であり、GTPが正常値の2倍以
下であるものが好ましい。
【0009】血液、血漿からのAT−III の精製法とし
ては、例えば特開昭48−35017号公報(米国特許
3842061号)、特開昭54−95715号公報
(米国特許4340589号)、特開平1−27560
0号公報(EP339919)、EP551084に開
示の方法等が例示される。
ては、例えば特開昭48−35017号公報(米国特許
3842061号)、特開昭54−95715号公報
(米国特許4340589号)、特開平1−27560
0号公報(EP339919)、EP551084に開
示の方法等が例示される。
【0010】例えば、血漿からクリオプリシピテートを
除去した上清の低温エタノール画分IV−1、画分IV又は
画分II+III を、さらにヘパリンアフィニティークロマ
トグラフィー等の操作を経て精製する方法等が挙げられ
る。
除去した上清の低温エタノール画分IV−1、画分IV又は
画分II+III を、さらにヘパリンアフィニティークロマ
トグラフィー等の操作を経て精製する方法等が挙げられ
る。
【0011】また、細胞培養法〔例えば、特表昭57−
500768号公報(EP53165)参照〕、遺伝子
工学法〔例えば、特開昭58−162529号公報(E
P90505)参照〕等により調製されるAT−III も
使用できる。
500768号公報(EP53165)参照〕、遺伝子
工学法〔例えば、特開昭58−162529号公報(E
P90505)参照〕等により調製されるAT−III も
使用できる。
【0012】(II)加熱処理 本発明における加熱処理は、AT−III 含有水溶液を加
熱する処理であり、夾雑の可能性のあるウイルスを不活
化するのに充分な温度及び時間行えばよい。具体的には
50〜70℃、好ましくは約60℃にて、10分間〜2
0時間、好ましくは約10時間行われる。また、溶液の
pHは一般的には5〜10、好ましくは6.5〜9.0
であり、適当な低塩濃度緩衝液で調整されていることが
より好ましい。AT−III 含有水溶液は、AT−III を
通常10〜500単位/ml、好ましくは1〜200単
位/ml、より好ましくは25〜100単位/mlの割
合で含有するものである。本明細書においてAT−III
1単位とは、正常人血漿1ml中に含まれるAT−III
量に相当するAT−III の活性をいう。AT−III活性
は、例えば合成基質を用いたAT−III 活性測定キット
(テストチームAT−III ・2キット、第一化学薬品社
製)等により測定することができる。
熱する処理であり、夾雑の可能性のあるウイルスを不活
化するのに充分な温度及び時間行えばよい。具体的には
50〜70℃、好ましくは約60℃にて、10分間〜2
0時間、好ましくは約10時間行われる。また、溶液の
pHは一般的には5〜10、好ましくは6.5〜9.0
であり、適当な低塩濃度緩衝液で調整されていることが
より好ましい。AT−III 含有水溶液は、AT−III を
通常10〜500単位/ml、好ましくは1〜200単
位/ml、より好ましくは25〜100単位/mlの割
合で含有するものである。本明細書においてAT−III
1単位とは、正常人血漿1ml中に含まれるAT−III
量に相当するAT−III の活性をいう。AT−III活性
は、例えば合成基質を用いたAT−III 活性測定キット
(テストチームAT−III ・2キット、第一化学薬品社
製)等により測定することができる。
【0013】加熱処理は、加熱処理後の総AT−III 活
性が加熱処理前の総AT−III 活性の85%以上、好ま
しくは95%以上に維持され、さらにAT−III の単量
体の割合が95%以上、好ましくは99%以上に維持さ
れるように行われる。
性が加熱処理前の総AT−III 活性の85%以上、好ま
しくは95%以上に維持され、さらにAT−III の単量
体の割合が95%以上、好ましくは99%以上に維持さ
れるように行われる。
【0014】AT−III の単量体の割合は、例えばG
3,000SWXLカラムを0.3M−塩化ナトリウム、
0.05M−リン酸緩衝溶液(pH7.0)で平衡化し
た後に、高速液体クロマトグラフィー分析により測定す
ることができる。
3,000SWXLカラムを0.3M−塩化ナトリウム、
0.05M−リン酸緩衝溶液(pH7.0)で平衡化し
た後に、高速液体クロマトグラフィー分析により測定す
ることができる。
【0015】かかる残存活性及び単量体の割合の条件を
満たすためには、例えば以下に示す安定化剤の混在下で
加熱処理を行えばよい。
満たすためには、例えば以下に示す安定化剤の混在下で
加熱処理を行えばよい。
【0016】(III )安定化剤 加熱処理の際に選択された安定化剤としては、有機酸
塩、糖類及び塩化ナトリウムが好ましい。
塩、糖類及び塩化ナトリウムが好ましい。
【0017】本発明で使用される有機酸は、脂肪族又は
芳香族、飽和又は不飽和、一塩基酸(モノカルボン
酸)、二塩基酸(ジカルボン酸)又は三塩基酸(トリカ
ルボン酸)のいずれでもよい。好ましくは炭素数2〜1
0、より好ましくは炭素数2〜6のものが挙げられる。
一塩基酸としては、グリシン、アラニン、バリン、ロイ
シン、イソロイシン等の一塩基酸のアミノ酸が例示され
る。二塩基酸としては、シュウ酸、マロン酸、コハク
酸、グルタル酸、アジピン酸等の飽和脂肪族ジカルボン
酸、マレイン酸、フマル酸等の不飽和脂肪族ジカルボン
酸、フタル酸等の芳香族ジカルボン酸、アスパラギン
酸、グルタミン酸等の二塩基酸のアミノ酸、リンゴ酸、
酒石酸等の二塩基酸のヒドロキシ酸が例示される。三塩
基酸としては、クエン酸等の三塩基酸のヒドロキシ酸が
例示される。好ましくは、リンゴ酸、酒石酸、マレイン
酸、アスパラギン酸、クエン酸であり、より好ましくは
リンゴ酸、クエン酸である。
芳香族、飽和又は不飽和、一塩基酸(モノカルボン
酸)、二塩基酸(ジカルボン酸)又は三塩基酸(トリカ
ルボン酸)のいずれでもよい。好ましくは炭素数2〜1
0、より好ましくは炭素数2〜6のものが挙げられる。
一塩基酸としては、グリシン、アラニン、バリン、ロイ
シン、イソロイシン等の一塩基酸のアミノ酸が例示され
る。二塩基酸としては、シュウ酸、マロン酸、コハク
酸、グルタル酸、アジピン酸等の飽和脂肪族ジカルボン
酸、マレイン酸、フマル酸等の不飽和脂肪族ジカルボン
酸、フタル酸等の芳香族ジカルボン酸、アスパラギン
酸、グルタミン酸等の二塩基酸のアミノ酸、リンゴ酸、
酒石酸等の二塩基酸のヒドロキシ酸が例示される。三塩
基酸としては、クエン酸等の三塩基酸のヒドロキシ酸が
例示される。好ましくは、リンゴ酸、酒石酸、マレイン
酸、アスパラギン酸、クエン酸であり、より好ましくは
リンゴ酸、クエン酸である。
【0018】さらに、かかる有機酸は塩の態様をしてい
てもよい。有機酸の塩としては、例えばナトリウム塩、
カリウム塩等のアルカリ金属塩、カルシウム塩等のアル
カリ土類金属塩、アンモニウム塩等の有機塩等が例示さ
れる。好ましくは、ナトリウム塩又はカルシウム塩であ
る。本発明で使用される有機酸塩として、より好ましく
はリンゴ酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムであり、特
に好ましくはクエン酸ナトリウムである。
てもよい。有機酸の塩としては、例えばナトリウム塩、
カリウム塩等のアルカリ金属塩、カルシウム塩等のアル
カリ土類金属塩、アンモニウム塩等の有機塩等が例示さ
れる。好ましくは、ナトリウム塩又はカルシウム塩であ
る。本発明で使用される有機酸塩として、より好ましく
はリンゴ酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムであり、特
に好ましくはクエン酸ナトリウムである。
【0019】有機酸もしくはその塩は、好ましくは3〜
20w/v%、より好ましくは3〜10w/v%、特に
好ましくは3〜5w/v%の範囲となるように添加され
る。この添加量が3w/v%未満の場合、安定化効果が
低下する。
20w/v%、より好ましくは3〜10w/v%、特に
好ましくは3〜5w/v%の範囲となるように添加され
る。この添加量が3w/v%未満の場合、安定化効果が
低下する。
【0020】糖類又は塩化ナトリウムの添加は、有機酸
の添加量を低くし、AT−III 活性の失活の原因となる
二峰性(AT−III のダイマー化及びポリマー化)を防
ぐことができる。本発明で使用される糖類としては、例
えば単糖類、二糖類、糖アルコール、アミノ糖等が挙げ
られる。単糖類としてはグルコース、フルクトース、ガ
ラクトース、マンノース、アラビノース、イノシトール
等が、二糖類としてはサッカロース、ラクトース、マル
トース等が、また糖アルコールとしてはマンニトール、
ソルビトール、キシリトール等が例示される。またアミ
ノ糖としては、グルコサミン及びアミノ糖誘導体である
N−アセチル−D−グルコサミン等が例示される。好ま
しくは、サッカロース、ラクトース、ソルビトール、イ
ノシトール、マルトース、N−アセチル−D−グルコサ
ミン、マンニトールである。
の添加量を低くし、AT−III 活性の失活の原因となる
二峰性(AT−III のダイマー化及びポリマー化)を防
ぐことができる。本発明で使用される糖類としては、例
えば単糖類、二糖類、糖アルコール、アミノ糖等が挙げ
られる。単糖類としてはグルコース、フルクトース、ガ
ラクトース、マンノース、アラビノース、イノシトール
等が、二糖類としてはサッカロース、ラクトース、マル
トース等が、また糖アルコールとしてはマンニトール、
ソルビトール、キシリトール等が例示される。またアミ
ノ糖としては、グルコサミン及びアミノ糖誘導体である
N−アセチル−D−グルコサミン等が例示される。好ま
しくは、サッカロース、ラクトース、ソルビトール、イ
ノシトール、マルトース、N−アセチル−D−グルコサ
ミン、マンニトールである。
【0021】糖類は、好ましくは10〜60w/v%、
より好ましくは20〜50w/v%、特に好ましくは2
0〜30w/v%の範囲となるように添加される。この
添加量が10w/v%未満の場合、安定化効果が低下
し、逆に添加量が60w/v%を超える場合、安定化効
果は良好となるが、夾雑ウイルスも安定化される可能性
があるので好ましくない。
より好ましくは20〜50w/v%、特に好ましくは2
0〜30w/v%の範囲となるように添加される。この
添加量が10w/v%未満の場合、安定化効果が低下
し、逆に添加量が60w/v%を超える場合、安定化効
果は良好となるが、夾雑ウイルスも安定化される可能性
があるので好ましくない。
【0022】塩化ナトリウムは、好ましくは0.5〜
3.0M、より好ましくは1.0〜2.5M、特に好ま
しくは1.5〜2.0Mとなるように添加される。この
添加量が0.5M未満の場合、安定化効果が低下し、逆
に添加量が3.0Mを超える場合、安定化効果は良好と
なるが、溶解性が低下するので好ましくない。
3.0M、より好ましくは1.0〜2.5M、特に好ま
しくは1.5〜2.0Mとなるように添加される。この
添加量が0.5M未満の場合、安定化効果が低下し、逆
に添加量が3.0Mを超える場合、安定化効果は良好と
なるが、溶解性が低下するので好ましくない。
【0023】但し、本発明においては、加熱処理後の総
AT−III 活性が加熱処理前の総AT−III 活性の85
%以上に維持され、さらに加熱処理後のAT−III の単
量体の割合が95%以上に維持されるという条件を満た
す限り、上記の安定化剤の添加量に限定されるものでは
ない。
AT−III 活性が加熱処理前の総AT−III 活性の85
%以上に維持され、さらに加熱処理後のAT−III の単
量体の割合が95%以上に維持されるという条件を満た
す限り、上記の安定化剤の添加量に限定されるものでは
ない。
【0024】(IV)後処理 本発明により製造されたAT−III は、医療用とし好適
に用いられ、必要に応じて透析、除菌濾過、pH調整を
行った後に分注される。また、所望により凍結乾燥製剤
としてもよい。
に用いられ、必要に応じて透析、除菌濾過、pH調整を
行った後に分注される。また、所望により凍結乾燥製剤
としてもよい。
【0025】本発明により製造されたAT−III は、先
天性AT−III 欠乏に起因する血栓形成傾向及びAT−
III 低下を伴う汎発性血管内凝固症候群(DIC)の治
療に有用である。AT−III の投与方法は、従来のAT
−III 注射剤もしくは点滴剤の処方に準じることがで
き、例えば液状製剤を緩徐に静注もしくは点滴静注する
方法が挙げられる。
天性AT−III 欠乏に起因する血栓形成傾向及びAT−
III 低下を伴う汎発性血管内凝固症候群(DIC)の治
療に有用である。AT−III の投与方法は、従来のAT
−III 注射剤もしくは点滴剤の処方に準じることがで
き、例えば液状製剤を緩徐に静注もしくは点滴静注する
方法が挙げられる。
【0026】通常、AT−III は1日1,000〜3,
000単位(又は20〜60単位/kg)の割合で投与さ
れるが、かかる投与量は年齢、体重、症状等により適宜
増減してもよい。なお、産科的、外科的DIC等で緊急
処置として本剤を使用する場合は、1日1回40〜60
単位/kgを投与することが好ましい。液状製剤の浸透
圧は、ヒト及び動物の生理的条件と同じかもしくはそれ
に近いことが好ましい。
000単位(又は20〜60単位/kg)の割合で投与さ
れるが、かかる投与量は年齢、体重、症状等により適宜
増減してもよい。なお、産科的、外科的DIC等で緊急
処置として本剤を使用する場合は、1日1回40〜60
単位/kgを投与することが好ましい。液状製剤の浸透
圧は、ヒト及び動物の生理的条件と同じかもしくはそれ
に近いことが好ましい。
【0027】
【実施例】次に、実施例を示して本発明をさらに具体的
に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるもの
でない。
に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるもの
でない。
【0028】実施例1 コーンの冷エタノール分画法で得られた画分IV−1のペ
ースト10kgを生理食塩水100リットルに懸濁し、
硫酸バリウムを5w/v%になるように加え、室温で3
0分間攪拌し、微量に存在するプロトロンビンを硫酸バ
リウムに吸着させて除去した。この上清液をpH6.5
に調整し、ポリエチレングリコール♯4,000(平均
分子量試験2600〜3800、日本曹達社製、以下同
じ)を13w/v%となるように加え、生じた沈澱を遠
心分離して除き、さらにポリエチレングリコール♯4,
000を30w/v%になるように加え、生じた沈澱を
遠心分離して回収した。
ースト10kgを生理食塩水100リットルに懸濁し、
硫酸バリウムを5w/v%になるように加え、室温で3
0分間攪拌し、微量に存在するプロトロンビンを硫酸バ
リウムに吸着させて除去した。この上清液をpH6.5
に調整し、ポリエチレングリコール♯4,000(平均
分子量試験2600〜3800、日本曹達社製、以下同
じ)を13w/v%となるように加え、生じた沈澱を遠
心分離して除き、さらにポリエチレングリコール♯4,
000を30w/v%になるように加え、生じた沈澱を
遠心分離して回収した。
【0029】この沈澱を冷生理食塩水約20リットルに
溶解し、予め生理食塩水で調整されたヘパリンセファロ
ース(ファルマシア社製)のカラムに注入し、AT−II
I をカラムに吸着させた。このカラムを0.4Mの塩化
ナトリウム溶液で洗浄して不純蛋白を除いた後、2.0
Mの塩化ナトリウム溶液をカラムに流して溶出してくる
部分を回収した。
溶解し、予め生理食塩水で調整されたヘパリンセファロ
ース(ファルマシア社製)のカラムに注入し、AT−II
I をカラムに吸着させた。このカラムを0.4Mの塩化
ナトリウム溶液で洗浄して不純蛋白を除いた後、2.0
Mの塩化ナトリウム溶液をカラムに流して溶出してくる
部分を回収した。
【0030】このAT−III の水溶液に、表1に記載の
安定化剤を添加し、pH7.8に調整した後、60℃で
10時間の加熱処理を施した。3M塩化ナトリウム含有
20mMクエン酸ナトリウム緩衝液(pH7.5)で平
衡化したブチル型ポリビニル系担体(ブチルトヨパール
650、東洋曹達(株)製)にAT−III 含有水溶液を
接触させた後に、上記緩衝液で展開し、未吸着画分を回
収した。続いて0.5%クエン酸ナトリウム緩衝液(p
H7.5)に対して一夜透析を行い、精製されたAT−
III を得た。
安定化剤を添加し、pH7.8に調整した後、60℃で
10時間の加熱処理を施した。3M塩化ナトリウム含有
20mMクエン酸ナトリウム緩衝液(pH7.5)で平
衡化したブチル型ポリビニル系担体(ブチルトヨパール
650、東洋曹達(株)製)にAT−III 含有水溶液を
接触させた後に、上記緩衝液で展開し、未吸着画分を回
収した。続いて0.5%クエン酸ナトリウム緩衝液(p
H7.5)に対して一夜透析を行い、精製されたAT−
III を得た。
【0031】加熱処理後の精製された各AT−III の活
性を測定し、加熱処理前のAT−III 活性に対する残存
率を求めた。さらに、各AT−III の単量体の割合を求
めた。
性を測定し、加熱処理前のAT−III 活性に対する残存
率を求めた。さらに、各AT−III の単量体の割合を求
めた。
【0032】(1)AT−III 活性の測定及び活性残存
率の計算 AT−III 活性は、AT−III 活性測定キット(テスト
チームAT−III ・2キット、第一化学薬品社製)を用
いて、以下の方法で行った。
率の計算 AT−III 活性は、AT−III 活性測定キット(テスト
チームAT−III ・2キット、第一化学薬品社製)を用
いて、以下の方法で行った。
【0033】検体希釈液50μl〔2.4U/mlヘパ
リン,40mM トリス−塩酸緩衝液,0.14M N
aCl,10mM EDTA(pH8.4)中〕をチュ
ーブに採り、ヒトトロンビン溶液〔0.9%塩化ナトリ
ウム、0.05%ウシ血清アルブミン(BSA),0.
05%ポリエチレングリコール(PEG)♯6000
(平均分子量試験7300〜9300、日本曹達社製)
中、1U/mlトロンビン含有〕100μlを加え、3
7℃で5分間プレインキュベートした後、合成基質液
(S−2238:HD−フェニルアラニル−L−ピペコ
リル−L−アルギニル−p−ニトロアニリド・二塩酸
塩)100μlを加え、さらに37℃で5分間インキュ
ベートした。発色後、クエン酸溶液を1ml加えて反応
を停止させ、分光光度計で波長405nmの吸光度を測
定した。測定検体と同時に正常ヒト血漿(1U AT−
III /ml)を測定し、その検量線から検体のAT−II
I 活性(U/ml)を測定した。
リン,40mM トリス−塩酸緩衝液,0.14M N
aCl,10mM EDTA(pH8.4)中〕をチュ
ーブに採り、ヒトトロンビン溶液〔0.9%塩化ナトリ
ウム、0.05%ウシ血清アルブミン(BSA),0.
05%ポリエチレングリコール(PEG)♯6000
(平均分子量試験7300〜9300、日本曹達社製)
中、1U/mlトロンビン含有〕100μlを加え、3
7℃で5分間プレインキュベートした後、合成基質液
(S−2238:HD−フェニルアラニル−L−ピペコ
リル−L−アルギニル−p−ニトロアニリド・二塩酸
塩)100μlを加え、さらに37℃で5分間インキュ
ベートした。発色後、クエン酸溶液を1ml加えて反応
を停止させ、分光光度計で波長405nmの吸光度を測
定した。測定検体と同時に正常ヒト血漿(1U AT−
III /ml)を測定し、その検量線から検体のAT−II
I 活性(U/ml)を測定した。
【0034】AT−III 活性の残存率は、加熱処理前の
総AT−III 活性〔U/ml×液量(ml)〕に対す
る、加熱処理後の各AT−III における総AT−III 活
性の百分率により求め、表1にまとめた。
総AT−III 活性〔U/ml×液量(ml)〕に対す
る、加熱処理後の各AT−III における総AT−III 活
性の百分率により求め、表1にまとめた。
【0035】(2)AT−III 比活性 各検体を吸光度A280nm で測定して蛋白質量を求めた。
上記により求められたAT−III 活性を蛋白質量で除し
て、各検体の比活性(U/A280nm )を求め、表1にま
とめた。
上記により求められたAT−III 活性を蛋白質量で除し
て、各検体の比活性(U/A280nm )を求め、表1にま
とめた。
【0036】(3)高速液体クロマトグラフィー(HP
LC)分析 G3,000SWXLカラム(東ソー社製)を0.3M−
NaCl加0.05Mリン酸塩緩衝液(pH7.0)で
平衡化した後、流速0.7ml/分で測定を行った。H
PLC分析によるAT−III の単量体の割合を表1に示
す。なお、表1の結果から、AT−III の変性(ダイマ
ー化やポリマー化等のコンフォメーションの変化)の割
合を求めることができる。
LC)分析 G3,000SWXLカラム(東ソー社製)を0.3M−
NaCl加0.05Mリン酸塩緩衝液(pH7.0)で
平衡化した後、流速0.7ml/分で測定を行った。H
PLC分析によるAT−III の単量体の割合を表1に示
す。なお、表1の結果から、AT−III の変性(ダイマ
ー化やポリマー化等のコンフォメーションの変化)の割
合を求めることができる。
【0037】
【表1】
【0038】クエン酸ナトリウムと塩化ナトリウムとを
添加すると相乗効果が認められ、ダイマー化やポリマー
化を防ぐことができ、クエン酸ナトリウムが低濃度でも
安定化効果は認められた。なお、表中、Na-Citはクエン
酸ナトリウムを、Sorb. はソルビトールをそれぞれ示
す。
添加すると相乗効果が認められ、ダイマー化やポリマー
化を防ぐことができ、クエン酸ナトリウムが低濃度でも
安定化効果は認められた。なお、表中、Na-Citはクエン
酸ナトリウムを、Sorb. はソルビトールをそれぞれ示
す。
【0039】
【発明の効果】ウイルス不活化のためにAT−III を液
状で加熱した場合に、AT−III の活性を安定に保ち、
AT−III の変性(ダイマー化やポリマー化等のコンフ
ォメーションの変化)を低減化することができ、医療上
極めて安全性、有用性が高いAT−III を製造すること
ができる。
状で加熱した場合に、AT−III の活性を安定に保ち、
AT−III の変性(ダイマー化やポリマー化等のコンフ
ォメーションの変化)を低減化することができ、医療上
極めて安全性、有用性が高いAT−III を製造すること
ができる。
Claims (7)
- 【請求項1】 アンチトロンビン−III 含有水溶液を加
熱処理して、医療用アンチトロンビン−III を製造する
方法であって、加熱処理後のアンチトロンビン−III の
活性が加熱処理前の85%以上に維持され、加熱処理後
のアンチトロンビン−III の単量体の割合が95%以上
に維持されるように、選択された安定化剤の存在下で加
熱処理を行うことを特徴とする医療用アンチトロンビン
−IIIの製造法。 - 【請求項2】 選択された安定化剤が、有機酸塩、糖類
及び塩化ナトリウムである請求項1記載の方法。 - 【請求項3】 有機酸塩がクエン酸ナトリウムである請
求項2記載の方法。 - 【請求項4】 糖類がソルビトールである請求項2記載
の方法。 - 【請求項5】 塩化ナトリウムの含有量が0.5〜2.
5Mである請求項2記載の方法。 - 【請求項6】 クエン酸ナトリウムの含有量が3〜20
w/v%である請求項3記載の方法。 - 【請求項7】 ソルビトールの含有量が10〜60w/
v%である請求項4記載の方法。
Priority Applications (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP8309281A JPH10147538A (ja) | 1996-11-20 | 1996-11-20 | 医療用アンチトロンビン−iiiの製造法 |
US08/974,191 US5989593A (en) | 1996-11-20 | 1997-11-19 | Method for producing antithrombin-III, method for purifying it, and preparation containing it |
EP97120271A EP0844254A3 (en) | 1996-11-20 | 1997-11-19 | Method for producing antithrombin-III, method for purifying it, and preparation containing it |
TW086117349A TW565453B (en) | 1996-11-20 | 1997-11-20 | Method for purifying antithrombin-III |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP8309281A JPH10147538A (ja) | 1996-11-20 | 1996-11-20 | 医療用アンチトロンビン−iiiの製造法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH10147538A true JPH10147538A (ja) | 1998-06-02 |
Family
ID=17991118
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP8309281A Abandoned JPH10147538A (ja) | 1996-11-20 | 1996-11-20 | 医療用アンチトロンビン−iiiの製造法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH10147538A (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20150101454A (ko) * | 2012-12-28 | 2015-09-03 | 세이가가쿠 고교 가부시키가이샤 | 리물루스 시험에 사용되는 안티트롬빈 ⅲ 용 전처리제 및 전처리 방법 |
-
1996
- 1996-11-20 JP JP8309281A patent/JPH10147538A/ja not_active Abandoned
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20150101454A (ko) * | 2012-12-28 | 2015-09-03 | 세이가가쿠 고교 가부시키가이샤 | 리물루스 시험에 사용되는 안티트롬빈 ⅲ 용 전처리제 및 전처리 방법 |
JPWO2014104352A1 (ja) * | 2012-12-28 | 2017-01-19 | 生化学工業株式会社 | リムルス試験に付されるアンチトロンビンiii用の前処理剤及び前処理方法 |
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A762 | Written abandonment of application |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A762 Effective date: 20060510 |