JPH09500009A - Ｃ型肝炎ウイルス４、５及び６型 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 新たに解明されたＣ型肝炎ウイルス４及び５型の配列が、新たに発見された６型の配列と共に記載される。ＮＳ４、ＮＳ５及びコア領域内のユニークな型特異的配列は、ＨＣＶの検出及び１〜６型への遺伝子型別を可能にする。抗原ペプチド及び免疫分析が記載される。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｃ型肝炎ウイルス４、５及び６型 技術分野 本発明は、新たに解明されたＣ型肝炎ウイルス４型（ＨＣＶ−４）及び５型（ ＨＣＶ−５）の配列及び新たに発見された６型（ＨＣＶ−６）に関する。特に、 Ｃ型肝炎ウイルス４、５及び６型の病因並びに生体試料中のＨＣＶ−４、ＨＣＶ −５及びＨＣＶ−６の検出用免疫分析に有効なポリヌクレオチド及び免疫反応性 ポリペプチドに関し、更に、ワクチンにおけるＨＣＶ−４、ＨＣＶ−５及びＨＣ Ｖ−６抗原特異的ポリペプチドの使用に関する。発明の背景 急性ウイルス性肝炎は、慢性の肝臓損傷を引き起こすことのある疾患である。 臨床的には、黄疸、肝痛覚及び血清レベルのアラニンアミノトランスフェラーゼ 及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼの上昇を含む患者の一組の明瞭な 症状によって診断される。血清学的免疫分析は、通常、特定の種類のウイルス作 因を診断するために行われる。歴史的には、肝炎の症状を示しかつＡ型肝炎ウイ ルス、Ｂ型肝炎ウイルス又、エプスタイン・バールウイルス又はサイトメガロウ イルスによって感染されていない患者は、怠慢により臨床的には非Ａ非Ｂ型肝炎 （ＮＡＮＢＨ）として診断された。 長い間、非Ａ非Ｂ型肝炎の作因はわかりにくいままであった。そこで、多くの 場合のＮＡＮＢＨがＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）と呼ばれる異なったウイルスよ ることが確かめられた。欧州特許出願第 0318216号には、１ＨＣＶ株由来のｃＤ ＮＡ、ポリヌクレオチドプローブ及び免疫分析において有用なポリペプチドが開 示されている。更に、その株についての情報が欧州特許出願第 0388232号に記載 されている。 ＨＣＶゲノムは、構造及び非構造領域を含む大きなポリタンパク質前駆体をコ ードするものである。単一のタンパク質が生産された後に種々のタンパク質に切 断されることは明らかである。そこで、その構造及び非構造タンパク質のほとん どが試験管内ＲＮＡ翻訳及び発現において組換えタンパク質として同定された。 Ｃ及びＥ領域は、各々ヌクレオキャプシド構造タンパク質とエンベロープ構造タ ンパク質をコードする。更に、まだはっきりしない機能を有する非構造(ＮＳ)タ ンパク質をコードする少なくとも５つの領域が続いている。その体制は、次の通 りであると考えられている(A．Alberti，Journal of Hepatology，1991; 12;279 -282)。 ある種の免疫反応性タンパク質は、組換えタンパク質として、例えば、Ｃ２２（ コア領域に）、Ｃ３３（ＮＳ３領域に）、５−１−１及びＣ１００（共にＮＳ４ 領域に）及びＮＳ５（ＮＳ５領域）として記載された。現在のC型肝炎の診断は 、たいてい、そのＣ−１００クローンの産物に対する抗体を検出する方法に基づ くものである。このクローンは、ＮＳ３−ＮＳ４ゲノム領域の部分に対応する大 きなウイルス抗原（Ｃ１００）を生じるようにオーバーラップクローンの連結反 応により作製された。次いで、Ｃ１００をヒトスーパーオキシドジスムターゼ( ＳＯＤ)遺伝子と融合し、大きな組換え融合タンパク質（Ｃ１００−３）として 使用して発現させ、放射能標識分析法（ＲＩＡ）及び酵素結合免疫吸着分析法（ ＥＬＩＳＡ）を展開するために固相に用いた。 ＨＣＶをスクリーニングするのに有効であると主張されたポリヌクレオチドが 欧州特許出願第 0398748号に開示されている。欧州特許出願第 0414475号には、 培養細胞におけるＨＣＶの増殖及び診断に有用な抗原の生産が開示されている。 欧州特許出願第 0445423号には、ＨＣＶ抗体を検出するために改良された免疫分 析法であることが明記されているものが開示されている。 英国の血液銀行は、供血者のＨＣＶ成分に対する抗体の通常の試験を実施して いる。１世代分析は、Ｃ１００−３ポリペプチドに対するＨＣＶ抗体の検出を含 むものであった。そのＣ１００−３抗体は、ウイルスの非構造領域内の複合ポリ タンパク質抗原を認識し、ＨＣＶ感染の一致したマーカーである。しかしながら 、急性感染症においては、この抗体は、露出後のセロコンバージョンが遅い（典 型的には２２週間）ために信頼性がない。更に、そのＣ１００−３抗体試験は、 Ｃ 型肝炎ウイルスに対する特異性がない。 ２世代抗体試験は、ウイルスの高度に保存されたコア領域からの構造抗原及び 非構造抗原を表す組換え抗原及び／又は合成線状ペプチドを使用する。しかしな がら、２世代ＥＬＩＳＡ試験は、虚偽の陽性反応を生じることがあることが判明 している。ＨＣＶゲノムからの４種類の抗原を取込む組換え免疫ブロット分析（ ＲＩＢＡ−２）は、純粋な抗ＨＣＶ反応性をの同定する方法であるというもので ある。しかしながら、結果は“不確定”であることがある。本発明の研究者らは 、ＨＣＶ陽性供血者の５−１−１、Ｃ１００、Ｃ３３及びC２２抗原に対する種 々の反応性を報告し(The Lancet，338; Oct.19，1991)、ＨＣＶポリヌクレオチ ドを増幅するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて血液試料中に存在するＨ ＣＶＲＮＡの直接検出結果とこれらを比較した。しかしながら、その研究は、Ｈ ＣＶ感染症のはっきりした診断がまだ可能でないことを示している。 最近、配列がかなり異なる別の種類のＨＣＶが発見され、これらはＨＣＶ−２ 、３及び４と呼ばれた。我々の国際出願第93/10239号（1993年５月27日に公開さ れた）には、ＨＣＶ−２、３及び４の特定の抗原配列が記載されている。ＨＣＶ −４として開示された配列は、５′ＮＣＲ及びコア領域にのみある。前者は、Ｈ ＣＶの免疫分析に用いられるタンパク質をコードしないが、コア領域は保存され る傾向がある。発明の要約 本発明は、ＨＣＶゲノムの特定領域におけるポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)に より増幅されかつ系統発生分析により確認された配列比較によるＨＣＶの以前に は未知の６型変異体の発見を含むものである。本発明は、ＨＣＶ−４、ＨＣＶ− ５、ＨＣＶ−６特異的であるポリヌクレオチド配列及びポリペプチドを同定した 。これらは、ＨＣＶ−４、ＨＣＶ−５、ＨＣＶ−６感染を診断するために用いら れるので、ＨＣＶ感染の明確な試験に含まれねばならない。 本発明の１態様は、肝炎ウイルス４、５又は６型にユニークなヌクレオチド配 列を有するポリヌクレオチドを提供するものである。 その配列は、他のＨＣＶ型によって共有されないのでＨＣＶ型をユニークに検 出するために用いることができる意味で関係しているＨＣＶ型にユニークである 。 ＨＣＶ４、５及び６間の配列変動性は、ＮＳ４、ＮＳ５及びコア領域に特に見ら れるので、特に型特異的ポリヌクレオチド及びペプチドが得られるのはこれらの 領域からである。型特異的とは、そのＨＣＶ型にユニークな配列を含むことを意 味する。更に、各ＨＣＶ型の中に多数のサブタイプが存在し、小さな配列変動が ある。 本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス４及び６型（ＨＣＶ−４及びＨＣＶ−６）にユニ ークなＮＳ５ポリヌクレオチド配列;及びＨＣＶ−４、ＨＣＶ−５及びＨＣＶ− ６に各々ユニークなＮＳ４配列を含むものである。これらの配列は、ｃＤＮＡを 含むＲＮＡ又はＤＮＡ配列であってもよい。場合によっては、これらのＤＮＡ配 列はポリメラーゼ連鎖配列によって増幅される。ＤＮＡ配列は、ハイブリッド形 成プローブとして用いることができる。これらの配列は、組換え（即ち、形質転 換細胞で発現された）又は合成であってもよく、場合によっては長い配列の中に 含まれていてもよい。同様に、ポリヌクレオチドが特異的プローブとしてなお機 能するのであれば、欠失、挿入又は置換も許容される。また、抗原タンパク質を コードするポリヌクレオチド配列が特に有効である。 本発明の他の態様は、肝炎ウイルス４、５又は６型にユニークなアミノ酸配列 を有するペプチドを提供するものである。 本発明は、ＮＳ５領域からの抗原ＨＣＶ−４又はＨＣＶ−６特異的ポリペプチ ド又はＮＳ４領域からの抗原ＨＣＶ−４、ＨＣＶ−５又はＨＣＶ−６特異的ポリ ペプチド；又はこれらの抗原を含むポリペプチドを含むものである。このペプチ ドの複数のコピーが多抗原ペプチドコアに結合される。 本ペプチドは、検出を容易にするために標識され、例えば、対応する抗体を検 出する免疫分析に有用な、ＮＳ５領域からの標識抗原ＨＣＶ−４又はＨＣＶ−６ 特異的ポリペプチド又はＮＳ４領域からの標識抗原ＨＣＶ−４、ＨＣＶ−５又は ＨＣＶ−６特異的ポリペプチド;（又はその混合物）であってもよい。 これらのポリペプチドは、ＮＳ４又はＮＳ５全領域を必ずしも含まないが、Ｈ ＣＶの具体的な型にユニークなその特徴的部分（通常特徴的エピトープ）が用い られることは理解されねばならない。 本発明の別の態様は、本ペプチド、特にＨＣＶ−４又はＨＣＶ−６ＮＳ５抗原 又はＨＣＶ−４、ＨＣＶ−５又はＨＣＶ−６ＮＳ４抗原に対する抗体、特に治療 及び診断に有用なモノクローナル抗体を提供するものである。即ち、標識抗体は 生体内診断に用いられる。細胞障害因子をもつ抗体は、ＨＣＶ−４、ＨＣＶ−５ 又はＨＣＶ−６感染細胞を攻撃するために用いられる。 本発明の別の態様は、免疫原性ペプチド、特にＨＣＶ−４又はＨＣＶ−６ＮＳ ５ペプチド又は免疫原性ＨＣＶ−４、ＨＣＶ−５又はＨＣＶ−６ＮＳ４ポリペプ チドを含むワクチンを提供するものである。 本発明の別の態様は、試験管内ＨＣＶ型別方法であって、制限断片を得るＨＣ Ｖ含有試料のエンドヌクレアーゼ消化を行い、その制限パターンがＨＣＶ−４、 ＨＣＶ−５又はＨＣＶ−６の特徴を示すことを含む方法を提供するものである。 更に、本発明は、ＨＣＶ−４、ＨＣＶ−５又はＨＣＶ−６抗原エピトープ（又 はそれに対する抗体）を少なくとも１種含むポリペプチド並びに必要な分取用試 薬、洗浄試薬、検出試薬及びシグナル発生試薬を含む分析キットを包含する。 ＨＣＶ−４、ＨＣＶ−５又はＨＣＶ−６特異的ポリヌクレオチド配列は、ハイ ブリッド形成法によりＨＣＶウイルス自体（通常はＰＣＲによって増幅される） の同定に用いられる。 可変領域に対応する、例えば、ＮＳ５又はＮＳ４領域内のオリゴヌクレオチド は、型特異的ＰＣＲに用いることができる。外部センスオリゴヌクレオチド内部 センスプライマーは、２つの保存アンチセンスプライマーと組合わせてＨＣＶ４ 、５及び６型に特異的な検出法に用いられる。 また、本発明は、本明細書で定義されたＤＮＡ配列を含む発現ベクターであっ て、適切な宿主中で本明細書で定義されたペプチドを産生するＤＮＡ配列を発現 させることができる発現ベクターを提供するものである。 その発現ベクターは、通常、適切な宿主中でＤＮＡ配列を発現させるＤＮＡの 制御要素を含む。これらの要素は、宿主によって異なるが、通常、プロモーター 、リボソーム結合部位、翻訳開始及び停止部位及び転写終結部位が含まれる。か かるベクターの例としては、プラスミド及びウイルスが挙げられる。本発明の発 現ベクターは、染色体外ベクター及び宿主細胞の染色体に組込まれるベクターの 双 方を包含する。E.coliに使用する場合、発現ベクターは、本発明のＤＮＡ配列を 任意により、例えばＢ−ガラクトシダーゼをコードするＤＮＡ配列の５′端ある いは３′端又は例えばｔｒｐE遺伝子をコードするＤＮＡ配列の３′端に結合し た融合体として含んでもよい。昆虫バキュロウイルス（ＡｃＮＰＶ）系に使用す る場合、ＤＮＡ配列はポリヘドリンコーディング配列に任意に融合されてもよい 。 本発明は、また、本明細書で定義された発現ベクターで形質転換された宿主細 胞を提供するものである。 本発明と使用する宿主細胞の例としては、細菌、酵母、哺乳動物及び昆虫細胞 のような原核細胞及び真核細胞が挙げられる。かかる細胞の具体例は、E.coli、S.cerevisiae 、P.pastoris、チャイニーズハムスター卵巣細胞及びマウス細胞及 びSpodoptera frugiperda及びTricoplusia niである。宿主細胞の選択は、多く の要因に左右されるが、ＨＣＶウイルスペプチドの翻訳後修飾が重要である場合 には、真核宿主が好ましい。 本発明は、また、本明細書で定義されたペプチドの調製方法であって、本明細 書で定義されたＤＮＡ配列をＨＣＶゲノムから分離するか又は本明細書で定義さ れたペプチドをコードするＤＮＡ配列を合成するか又は該ペプチドをコードする ＤＮＡ配列を作成する工程、適切な宿主中で発現することができるように発現ベ クターに該ＤＮＡ配列を挿入する工程、該発現ベクターで宿主細胞を形質転換す る工程、その形質転換宿主細胞を培養する工程及び該ペプチドを単離する工程を 含む方法を提供するものである。 該ペプチドをコードするＤＮＡ配列は、標準方法を用いて合成される(Gait,Ol ligonucleotide Synthesis :A Practical Approach，1984，Oxford，IRLPress)。 上記のように得られた所望のＤＮＡ配列は、既知の手法及び標準手法を用いて 発現ベクターに挿入される。その発現ベクターは、通常、制限酵素を用いて切断 され、ＤＮＡ配列が平滑端又は付着端連結反応を用いて挿入される。切断は、通 常、ＤＮＡ配列が挿入されるとその発現を行うＤＮＡ機能要素の制御のもとにあ るように発現ベクターの便利な位置の制限部位で行われる。 宿主細胞の形質転換は、標準手法を用いて行われる。ある表現型マーカーは、 通常、発現ベクターを巧く挿入する形質転換細胞と巧く挿入しないものを区別す るために用いられる。その形質転換宿主細胞の培養と要求されたペプチドの分離 も標準手法を用いて行われる。 即ち、本発明のペプチドは、組換えＤＮＡ技術によって調製されるか又は、例 えば自動シンセサイザーを用いて合成される。 本明細書で用いられる“ペプチド”(及び“ポリペプチド”)なる語は、抗原性 として最低数のアミノ酸残基を有するエピトープペプチドをオリゴペプチドを介 してタンパク質まで含むものである。このペプチドは、形質転換細胞から発現さ れた組換えペプチドであってもよいし、化学合成によって生産された合成ペプチ ドであってもよい。 本発明のペプチドに特異的な抗体は、そのペプチドを用いて産生させることが できる。その抗体は、そのペプチドのバッチ品質制御試験に；ペプチド又はウイ ルス溶菌液の精製に；エピトープマッピングに；標識された場合、抗体検出用競 合的型分析における複合体として；及び抗原検出分析に用いられる。 本発明のペプチドに対するポリクローナル抗体は、免疫応答を促進させるため にキャリヤに任意に結合されていてもよいペプチドをマウス、ラット、ヒツジ又 はウサギのような哺乳動物宿主に注入し、そのようにして産生された該抗体を回 収することにより得られる。本ペプチドは、通常、本ペプチドが生理的に許容し うる希釈剤と混合されている注入可能な製剤の形で投与される。フロイント完全 アジュバント（ＦＣＡ）又はフロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）のような アジュバントが該製剤中に含まれる。該製剤は、通常、適切な時間をかけて宿主 に注入され、血漿試料が適切な間隔で抗ＨＣＶウイルス抗体の分析用に採血され る。適切なレベルの活性が得られると、宿主から採血する。次いで、標準方法を 用いて、例えば、プロテインＡ又はイオン交換クロマトグラフィーによって抗体 が血漿から抽出及び精製される。 本発明のペプチドに対するモノクローナル抗体は、不死化細胞系の細胞をトポ グラフィー的に関連したペプチドのウイルスに対して抗体を産生する細胞と融合 し、その融合不死化細胞系を培養することにより得られる。典型的には、マウス 又はラットのような非ヒト哺乳動物宿主に該ペプチドを接種する。該宿主が抗体 応答を開始するのに十分な時間が経過した後、脾細胞のような抗体産生細胞を取 り出す。マウス又はラット骨髄腫細胞系のような不死化細胞系の細胞を抗体産生 細胞と融合し、所望のモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマのような細 胞系を同定するために得られた融合物をスクリーンする。その融合細胞系を培養 し、該モノクローナル抗体がポリクローナル抗体の精製と同様の哺乳動物で培養 基から精製される。 本発明に基づく診断分析は、ＨＣＶ感染の有無を決定するために用いられ、そ のＨＣＶ型が含まれる。また、かかる感染の治療をモニターするために、例えば 、インターフェロン治療に用いられる。 ウイルス感染の診断用分析においては、ウイルス核酸、ウイルス抗原又はウイ ルス抗体の検出を各々含む基本的に３種類の異なった方法が採用される。ウイル ス核酸は、一般にはウイルス自体の存在の最良の指標と見なされ、感染している らしい材料を同定する。しかしながら、核酸の検出は、通常、標的レベルが非常 に低いので抗原又は抗体の検出ほど端的でない。ウイルス抗原は、ウイルスの存 在のマーカーとして及び感染の指標として用いられる。ウイルスによっては、試 料中に存在する抗原の量が少なく検出が難しいことがある。抗体検出は、実際に は、宿主免疫系が多量の循環抗体を産生することにより感染に対する応答を増幅 することから比較的端的である。抗体応答の種類は、たいてい臨床上有効であり 、例えば、ＩｇＧクラスよりＥgＭクラス抗体が最近の感染を示し、具体的なウ イルス抗原に対する応答はウイルスのクリアランスと関連がある。即ち、ウイル ス感染の診断に採用される正確な方法は、具体的な状況及び探究された情報に左 右される。ＨＣＶの場合、診断分析はこれらの３種類の方法のいずれを具体化し てもよい。 ウイルス核酸の検出を含むＨＣＶ診断用分析においては、本方法は、試験試料 中に存在するウイルスＲＮＡ又はそのウイルスＲＮＡから合成されたｃＤＮＡを 本発明のヌクレオチド配列に対応するか又は本発明のペプチドをコードするＤＮ Ａ配列とハイブッレド形成する工程、及びＨＣＶウイルス核酸を同定するために 得られた核酸ハイブリッドをスクリーンする工程、を含むものである。本方法の 適用は、通常、ウイルスＲＮＡが高レベルで存在すると考えられる肝生検の ような適切な組織の試験試料に限定される。本発明のヌクレオチド配列に対応す るか又は本発明のペプチドをコードするＤＮＡ配列は、プラスミド内に任意に含 まれていてもよいオリゴヌクレオチド又はｃＤＮA配列の形を取ってもよい。核 酸ハイブリッドのスクリーニングは、標識ＤＮＡ配列を用いて行うことが好まし い。本発明のペプチドは、ペプチドのウイルス核酸への結合が結合部位にあまり に近接している標識によって妨害されないように標識がペプチドから十分に離れ て位置しているオリゴヌクレオチド部分であることが好ましい。ハイブリッドを 更に確認し、もって、ＨＣＶ核酸を同定するために、１種類又は別の種類のスク リーニングが１ラウンド以上行われる。ハイブリッド形成工程及びスクリーニン グ工程は、当該技術で既知の方法に従って行われる。 更に、ウイルス核酸の検出方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＲＣ）を用いて ウイルスＤＮＡの増幅を含むものである。選択されたプライマーは、問題のＨＣ Ｖ型配列に特異的であるので、その特定のＨＣＶ型とのみ増幅が起こる。また、 増幅されたコピー配列の大きさ及び数は特定のＨＣＶ型の特徴を示したり、選択 されたエンドヌクレアーゼで特徴的な制限パターンを有する。 ウイルス抗原又は抗体の検出を含むＨＣＶ診断用分析においては、本方法は、 試験試料を本発明のペプチド又は該ペプチドに対するポリクローナル又はモノク ローナル抗体と接触させる工程及び該試験試料中に抗原−抗体結合が含まれてい るかを決定する工程を含むものである。このために、本明細書で定義されたペプ チド又はそれに対するポリクローナル又はモノクローナル抗体及び試験試料中に 抗体又は抗原との結合が各々含まれて免疫複合体を生成しているかを決定する手 段を含む試験キットが提供される。試験試料は、適切な組織又は生理的液体、例 えば、血液（血清又は血漿）、唾液、尿、脳脊髄液、汗、涙又は組織浸出液のい ずれかから採取される。生理的液体が得られる場合には、存在するウイルス抗原 又は抗体が任意に濃縮されてもよい。 種々の分析方式が用いられる。本ペプチドは、溶液からＨＣＶに対する抗体を 選択的に捕捉するために、既に捕捉されたその抗体を選択的に標識するために及 びその抗体を捕捉及び標識双方をするために用いることができる。更に、本ペプ チドは、ペプチドと反応する抗体を相を分離させずに溶液として検出する種々の 均質系分析方式に用いられる。 本ペプチドが溶液から抗体を捕捉するために用いられる分析のタイプは、本ペ プチドを固体表面上に固定化することを含む。この表面は、いくつかの方法で洗 浄できなければならない。適切な表面の例としては、種々のタイプの（マイクロ タイターウェル；ビーズ、種々のタイプのディップスティック；吸引チップ；電 極；及び光学装置に成形された）ポリマー、粒子(例えば、ラテックス；安定化 赤血球；細菌又は真菌細胞；胞子；金又は他の金属又は金属含有ゾル；及びタン パク質コロイド)（通常、粒径は0.02〜５ミクロンである）、膜（例えば、ニト ロセルロース；ろ紙；酢酸セルロース；及び有機又は無機材料の高多孔性／高表 面積膜）が挙げられる。 ペプチドの表面への結合は、界面活性剤、溶媒、塩及び／又はカオトロピック イオンを含めてもよい最適組成物の溶液からの受動吸着；又は活性化学結合によ ることができる。活性結合は、表面に露出される種々の反応性又は活性化しうる 官能基（例えば、縮合剤；活性酸エステル、ハロゲン化物及び無水物；アミノヒ ドロキシル又はカルボキシル基；スルフィドリル基；カルボニル基；ジアゾ基； 又は不飽和基）を介するものである。場合によっては、その活性結合は、タンパ ク質（それ自体が受動的に表面に結合されるか又は活性結合を介する）、例えば 、アルブミン又はカゼインを介してもよく、ウイルスペプチドが種々の方法によ って化学的に結合される。この方法においてタンパク質を使用すると、等電点、 電荷、親水性又は他の物理化学的性質のために有利である。また、ウイルスペプ チドは、表面（一般的であるが必ずしも膜ではない）に結合した後に反応混合液 が免疫沈降のように電気泳動分離される。 本発明においては、交差反応性を遮断する阻止ペプチドを供給し、特定の試験 位置に存在する抗原の種類とだけ反応する試料中のＨＣＶ抗体のみを残すことが 好ましい。例えば、ＨＣＶ−６を検出するようにした試験位置は、ＨＣＶ１〜５ 型に対する反応性を有する抗体全てと反応すると共に６型反応性のみを有する抗 体を残すＨＣＶ−１〜５ペプチドを含む阻止混合液によって遮断される。 ペプチドを担持する表面を試験試料（場合によっては阻止混合液の存在下）と を接触させ、反応させ、必要な場合には種々の手段（例えば、洗浄、遠心、ろ過 、 磁性又は毛細管現象）によって余分な試料を除去した後、検出可能なシグナルを 与える手段によって捕捉された抗体が検出される。例えば、これは、捕捉された 抗体と反応する上記の標識分子又は粒子（例えば、プロテインＡ又はプロテイン Ｇ等；抗化学種又は抗免疫グロブリンサブタイプ；リウマチ因子；又は競合又は 阻止方法で用いられたペプチドに対する抗体）又はペプチド内に含まれるエピト ープを含む分子を使用することにより達成される。本発明においては、ホースラ ディッシュペルオキシダーゼに結合した抗ヒトＩｇＧを加え、次いで呈色する基 質と反応させることにより結合した酵素を検出することが好ましい。 検出可能なシグナルは、光学的又は放射性又は物理化学的といった当該技術で 既知の手段によって生じ、分子又は粒子を、例えば、染料、放射能標識、蛍光、 発光、化学発光、電気活性化学種、磁気共鳴化学種又は発蛍光団で標識すること により直接的に又は分子又は粒子を任意の種類の測定可能な変化を生じることが できる酵素自体で標識することにより間接的に示される。また、検出可能なシグ ナルは、例えば凝集を用いて又は表面が粒子の形にある場合には回折又は複屈折 作用を介して得られる。 ペプチド自体が既に捕捉された抗体を標識するために用いられる分析には、検 出を可能にするそのペプチドのある標識化形態が必要である。その標識化は、ペ プチドに、例えば、放射能標識、磁気共鳴化学種、粒子又は酵素標識を化学的又 は受動的に結合することによる直接のもの；又は標識形態をペプチドと反応する 分子に結合することによる間接のものである。標識をペプチドに結合する化学は 、アミノ基のようなペプチドに既に存在する部分を直接介するか又はマレイミド 基のような中間部分を介することができる。抗体の捕捉は、結合される特定の抗 体又は免疫複合体を生じる受動又は活性吸着を含む試薬として既に言及された表 面に対するものである。特に、抗体の捕捉は、抗化学種又は抗免疫グロブリンサ ブタイプ、リウマチ因子、プロテインＡ、Ｇ等又はペプチドに含まれたエピトー プを含む分子によるものである。 標識ペプチドは、上記で例示した表面のいずれかに対する特定の分子に対する 結合が試料中の抗原によって阻止される競合結合方法で用いられる。また、試料 中の抗原が上記表面のいずれかに特異的に又は非特異的に結合しかつ特定の２価 又は多価分子（例えば、抗体）に結合し、残りの原子価は標識ペプチドを捕捉す るために用いられる非競合方法で用いられる。 たいてい均質分析においては、ペプチドと抗体は別々に標識されるので、抗体 が遊離溶液中で組換えペプチドと反応する場合、その２つの標識は相互に作用し て、例えば、一方の標識によって捕捉されたエネルギーをもう一方の標識へ非放 射移動することを可能にし、励起した第２標識又は消光した第１標識を適切に検 出する（例えば、蛍光定量法、磁気共鳴法又は酵素測定法により）。試料中のウ イルスペプチドあるいは抗体を添加すると、標識した一組の相互作用を制限する ので検出器において異なったレベルのシグナルを生じる。 更に、ＨＣＶ抗体を検出するのに可能な分析方式は、直接サンドイッチ酵素免 疫分析（ＥＩＡ）方式である。抗原ペプチドは、マイクロタイターウェルに被覆 される。酵素が結合される試験試料及びペプチドが同時に添加される。試験試料 中に存在するＨＣＶ抗体は、ウェルを被覆するペプチド及び酵素結合ペプチドの 双方に結合する。典型的には、同じペプチドがサンドイッチの両側に用いられる 。洗浄後、色の変化を含む特定の基質を用いて結合した酵素が検出される。 また、抗ヒトＩｇＧ及び／又はＩｇＭ抗体が固体基質に被覆されるＩｇＧ／Ｉ ｇＭ抗体捕捉ＥＬＩＳＡを用いることが可能である。試験試料を加える場合には 、試料中に存在するＩｇＧ及び／又はＩｇＭが抗ヒト抗体に結合する。結合した ＩｇＧ及び／又はＩｇＭは、その抗体の全集団を表す。本発明のペプチドは、ペ プチド内に存在する抗原決定基に対する応答で産生したＩｇＧ及び／又はＩｇＭ 抗体、即ち、ペプチドが由来するＨＣＶ型に感染の結果として産生したその抗体 にのみ結合する。ペプチド／抗体複合体の検出の場合、ペプチド自体を直接標識 しておいてもよいし、捕捉抗体と相互に作用させた後にペプチドをペプチドに結 合する標識分子と反応させてもよい。 これにより、本発明のペプチドが多くの方式において、即ち遊離ペプチドとし て、古典的ＥＬＩＳＡ、競合ＥＬＩＳＡ、ｂ膜結合ＥＩＡ及び免疫沈降を含む分 析においてＨＣＶ感染の検出に用いられることがわかる。ペプチド複合体は、増 幅した分析及びＩｇＧ／ＩｇＭ抗体捕捉ＥＬＩＳＡにおいて用いられる。 本発明の分析は、例えば、供与した血液のスクリーニングに又は臨床用に、例 えば、ＨＣＶ感染症の検出、型別及びモニターに用いられる。スクリーニング用 の場合、好適な分析方式は、自動化することができるもの、特に、マクロタイタ ープレート方式及びビーズ方式である。臨床用の場合、そのような方式に加えて 、小規模な又は単一の使用に適するもの、例えば、ラテックス分析が用いられる 。スクリーニング手順における確認分析の場合、ウエスタン又は他の免疫ブロッ ティング試験の使用に適したストリップに抗原を存在させることができる。 上記で示したように、試験試料、特に、供与した血液のスクリーニングにおい て抗ＨＣＶ抗体の存在を検出するために現在用いられている分析は、ＨＣＶ１型 から得られた抗原ペプチドのみを使うものであり、かかる抗原が他のＨＣＶ遺伝 子型を検出することは確実でない。従って、ＨＣＶ−１の試験を他の全ての遺伝 子型、例えば、２、３、４、５及び６及び更に発見される別の遺伝子型の試験で 補足することが望ましいことは明らかである。 特に、本発明は、従来の分析（ＨＣＶ１型をコードした抗原を用いる）による 供血者スクリーニングを、例えばＨＣＶ−４又はＨＣＶ−６のＮＳ５配列又はＨ ＣＶ−４、ＨＣＶ−５又はＨＣＶ−６のＮＳ４配列に見出される抗原領域に対応 するオリゴペプチドを含む第２試験で補足することを可能する。 遺伝子型スペクトルを試験するために、ＨＣＶの１つの遺伝子型から１種以上 の抗原ペプチドを各々含む一連の分析手段、例えば、マイクロタイタープレート の一連のウェル又はビーズ方式を用いる等価なものが提供される。かかる分析方 式は、試料中に存在するＨＣＶ型を決定するために用いられる。またあるいは更 に、分析手段は、１以上の型からの抗原ペプチドを含んでもよく、例えば、マイ クロウェル又はビーズは１以上の型からのペプチドで被覆される。 また、ＨＣＶ−４、ＨＣＶ−５又はＨＣＶ−６の抗原領域に対応するオリゴペ プチドは、これらの異なったＨＣＶ型に感染した個体を区別するために別個に用 いられる。かかる分析は、ＨＣＶ４、５及び６型の抗原領域のオリゴペプチドで 被覆したウェル又はビーズセットを用いる間接酵素免疫分析（ＥＩＡ）の方式で あってもよい。存在するであろう少しの交差反応性は、阻止量の可溶性異型オリ ゴペプチドを含んだ希釈剤に試験試料を希釈することにより吸収させて固相に結 合した型特異的抗体反応性を有する抗体のみを確実にすることができる。 試験用ＨＣＶ抗原を１種以上、特に、ゲノムの構造領域由来の抗原ペプチドを 少なくとも１種及び非構造領域由来の抗原ペプチドを少なくとも１種含む組合わ せ、特に、コア抗原とＮＳ３、ＮＳ４及びＮＳ５領域より選ばれた抗原少なくと も１種の組合わせを使用することが有利である。ウェル又はビーズは、別個に抗 原で被覆される。しかしながら、２種以上の抗原ペプチドを単一ポリペプチドと して、好ましくは組換え融合ポリペプチドとして融合することが有利である。か かる方法の利点は、個々の抗原が所定の一定比率（通常等モル）で混合すること ができること及び単一ポリペプチドのみが生産、精製及び確認するのに必要であ ることである。１種以上のかかる融合ポリペプチドが、場合によっては１種以上 の非融合ペプチドに加えて分析において用いられる。融合ポリペプチドにおいて 抗原の多くの組合わせが可能であり、例えば、融合ポリペプチドが１つの型のみ からの抗原の所望の範囲を含んでもよいし、１以上の型からの抗原を含んでもよ いことが理解されるであろう。 発現技術により多ペプチド抗原を含むポリペプチドを得る１つの方法は、個々 のコーディング配列を単一オープンリーディングフレームに融合するものである 。各成分ペプチドの抗原活性が他のペプチドに相対する位置によって著しく妥協 されないような方法で融合が行われなければならないことは当然のことである。 実際のペプチド間結合において配列の種類に対して特に注意しなければならない ことは当然のことである。得られたコーディング配列は、例えば、一般の組換え ペプチドに関する上記のように発現させることができる。かかる融合ポリペプチ ドを得ることができる方法は当該技術において既知であり、ＨＣＶ１型株の多抗 原を含む組換え融合ポリペプチドの生産は英国特許出願第 2 239245号に記載さ れている。ペプチド複合体は、増幅した分析及びＩｇＧ／ＩｇＭ抗体捕捉ＥＬＩ ＳＡに用いられる。 本発明のペプチドは、人においてＨＣＶに対する免疫を誘導するワクチン製剤 に混合される。そのワクチンは、ＨＣＶ１〜６型の抗原を含めてもよい。この目 的のために、本ペプチドは薬学的に許容しうるキャリヤと共に存在させる。 ワクチン製剤中に使用する場合、本ペプチドは、Clarkeら（Nature，1987，33 0 ，381-384）に記載されているＢ型肝炎コア融合粒子又はTam(RNAS，1988，85 ，5409-5413)に記載されているポリリシンに基づくポリマーの一部として任意 に存在させてもよい。 また、本ペプチドは、リポソーム又はＩＳＣＯＭＳのような微粒子構造に任意 に結合させてもよい。 ワクチン用の薬学的に許容しうるキャリヤとしては、本ペプチドを患者に導入 するために賦形剤として使用するのに適した液体媒体が含まれる。かかる液体媒 体の例は、生理的食塩水である。本ペプチドは、キャリヤ中に溶解あるいは固体 として懸濁される。 また、ワクチン製剤は、免疫応答を刺激するためのアジュバントを含めてもよ く、もって、ワクチンの効果が高められる。アジュバントの例としては、水酸化 アルミニウム及びリン酸アルミニウムが挙げられる。 ワクチン製剤は、最終ペプチド濃度が0.01〜5mg／ml、好ましくは0.03〜2mg／ mlの範囲で含まれる。ワクチン製剤は、滅菌容器に取込まれ、次いで密閉され、 低温、例えば４℃で貯蔵されるか又は凍結乾燥される。 人においてＨＣＶに対する免疫を誘導するために、１回以上のワクチン製剤用 量が投与される。各投与量は、0.1〜2ml、好ましくは0.2〜1mlとする。人におい てＨＣＶに対する免疫を誘導する方法は、上記で定義されたワクチン製剤の有効 量を投与することを含むものである。 また、本発明は、人においてＨＣＶに対する免疫を誘導するのに有用なワクチ ンの調製において本明細書で定義されたペプチドの使用を提供するものである。 本発明のワクチンは、経口及び非経口（例えば、静脈内、皮下又は筋肉内）注 射を含むワクチン投与に便利な方法により投与される。治療は、１回のワクチン 用量か又は時間をかけて複数回用量からなるものである。図面の説明 ここで、本発明の例を実施例によってのみ記載する。 図１は、実施例１から推測されたＨＣＶ４及び６型のＮＳ５領域部分のアミノ 酸配列の比較である（１ａ型と対比）。比較した配列数は、第２欄に示されてい る。１文字アミノ酸コードが用いられている。ＨＣＶ型内の変動性のある位置及 び頻度は、下つき添字で示されている。 図２は、ＨＣＶ−４（３配列）及びＨＣＶ−６（１配列）のＮＳ５領域におけ る対応するＤＮＡヌクレオチド配列を示すものである。 図３は、６７ＨＣＶ単離物からのＮＳ５配列の系統発生分析であり、ＨＣＶ主 要型（１〜６の番号がつけられる）及びサブタイプ（ａ、ｂ及びｃと表される） を示し、ＨＣＶ−４とＨＣＶ−６が異なった型であることを示すものである。配 列距離は、表示された目盛りによる図表上の間隔に比例する。 図４は、ＨＣＶ−４、ＨＣＶ−５及びＨＣＶ−６のＮＳ４領域の２領域をＰＣ Ｒ増幅するために実施例２で用いられたＤＮＡプライマー配列を示すものである 。 図５は、実施例２で説明されたヌクレオチド配列から推定されたＨＣＶ−４、 ＨＣＶ−５又はＨＣＶ−６のＮＳ４領域の２つの部分領域のＤＮＡ及びアミノ酸 配列を示すものであり、比較のため、ＨＣＶ−１、２及び３の対応する領域が示 されており、ＨＣＶ−３領域１及び２は国際出願93/10239号の図９ｂのアミノ酸 １６９１〜１７０８及び１７１０〜１７２８に各々対応する（Simmondsら，1993 ，J．Clin．Microb．31:1493も参照）。実施例１（ＨＣＶ−４及びＨＣＶ−６；ＮＳ５領域配列） 試料。 スコットランド、エジプト及び香港の合計１６人のＨＣＶ感染供血者 及びレバノンの慢性肝炎をもつ患者からの血漿を４及び６型のＮＳ５配列の分析 に用いた。 ヌクレオチド配列の分析。 ＮＳ５領域の配列を得るために、ウイルスＲＮＡ を逆転写し、ＨＣＶの種々の変異型の中で高度に保存されると考えられる以前に 発表されたプライマーとの単独反応のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増 幅させた(Enomotoら，1990)。いくつかの配列の場合、新しい２つのプライマー 、１２２（センス配向；５′CTC AAC CGT CAC TGA GAG AGA CAT３′）及び１２ ３（アンチセンス；５′GCT CTC AGG TTC CGC TCG TCC TCC３′）と組み合わせ たプライマー５５４及び５５５(Chanら，1992b)を用いて第２ＰＣＲを行った。 産物ＤＮＡをSimmonds & Chan，1993に記載されている手順に従ってリン酸化し 、精製し、ｐＵＣ１９のＳｍａＩ部位にクローン化した(Yanisch-Perronら，198 5)。また、増幅したＤＮＡを精製し、Simmondsら，1990及びChaら，1992に記載 され ているように直接配列決定した。これらの方法は、始原型ウイルスの位置７９７ ５〜８１９６（Chooら，1991での番号）に相同なＤＮＡの２２２ｂｐ断片の比較 を可能にした。結果を図１及び図２に示す。 ヌクレオチド配列の比較。 ＧＤＥ配列分析パッケージで実施されるようにCL USTAL V プログラム(Higginsら，1992)を用いてヌクレオチド配列を並べた。配 列対間の距離は、トランジションとトランスバージョンの種々の割合及び４つの ヌクレオチドの種々の頻度を可能にするモデル(Felsenstein，1991)を用いて、D r．J．Felsensteinの好意で提供されたPHYLIPパッケージ(バージョン3、4)の DN ADISTプログラム(Felsenstein，1991)を用いて算出した。系統発生図表は、PHYL IPプログラム，NEIGHBORを用いる以前の対方向距離セットで隣接結合演算法(Sai touら，1987)を用いて作った。図３に示された系統発生図表は根がない。また、 等価な系統発生関係は、最大可能性分析（PHYLIPプログラムDNAMI; データは図 示せず）及び隣接結合図表の２００ブートストラップ複製物(PHYLIPプログラムS EQBOCT及びCONSENSE)にも見出された。実施例２（ＨＣＶ−４、−５又は−６；ＮＳ４領域配列） ＰＣＲ増幅を用いてＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）４、５及び６型のＮＳ４領域 からＤＮＡ配列を単離することを試みた。制限部位を含むプライマーを用いるこ とを決定し、もって、付着末端クローニングによりＰＣＲ産物のクローニングを 可能にした。また、新しいプライマーをＨＣＶＮＳ４遺伝子の比較的に保存され た領域から設計した。クローニング戦略は、次のように特定の数工程を含んだ。 (i)クレノウ修復。 増幅したＤＮＡの末端をクレノウＤＮＡポリメラーゼで修 復して制限部位を含む末端が完全であることを確実にした。 (ii)末端のキナーゼ化。 Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いてＰＣＲ産物末 端をリン酸化した。これは、コンカテマー化工程における産物の自己連結反応を 可能にした。 (iii)ＰＣＲ産物のカコンカテマー化。 長いコンカテマー配列を形成するため にＤＮＡ断片を一緒に結合した。この工程により、切断工程の効率を著しく高め るプライマー末端にコードされた制限部位が取込まれた。 (iv)制限消化。 ＰＣＲ産物を要求した制限酵素で一晩消化して付着末端を露 出させた。 (v)プラスミドベクターへの連結反応。 一般手順及び試薬は、Maniatisら“Molecular Cloning:A Laboratory Manual ”,Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor: New York に記載さ れている。 ａ）ＮＳ４配列のＰＣＲ増幅 プライマー００７を用いてｃＤＮＡを合成した後、ＰＣＲ増幅を３ラウンド行 った。００７と４３５を用いて１ラウンド、次いで５３５１と５９４３（共にＢ ａｍＨＩ制限部位をコードする）を用いて２ラウンドにより４及び５型を増幅し た。００７と２５３、２８１及び２２１を用いて１ラウンド、次いで５３５１及 び５９４３を用いて２ラウンドにより６型配列を増幅した。５つの第３ラウンド 反応の最低限の産物をクローニングエ程用にプールした。ベクターへの最後の連 結反応の効率は、増幅したＤＮＡの高濃度に依存すると考えられた。プライマー 反応を図４に示す。 ｂ）クローニング 慣用のアガロースゲル(0.5×トリス酢酸塩ＥＤＴＡ(ＴＡＥ))からの切除によ りＰＣＲ産物を単離した。ガラスウールを介して遠心することによりそのアガロ ースからＤＮＡを再生利用した。ＤＮＡの合計量を増加させるために溶出液をプ ールした。エタノール沈降によりＴＡＥ溶出液からＤＮＡを回収した。（沈降し たＤＮＡはアガロースから化学的に不活性なデブリをいくらか含んだが、これは ベクターに結合する前の次の工程を妨害しなかった。マジックプレプカラム(Pro mega)を用いることができるが、多量のＴＡＥ溶出液を取り扱う場合にはエタノ ール沈降が簡便で安価で効率がよい。） ｃ）クレノウ修復 沈澱したＤＮＡ沈降物を下記のものを含むクレノウ反応混合液５０μlに再び 懸濁した。 ポリヌクレオチドキナーゼバッファー(１０×) ５μl、 3.3mMdＮＴＰｓ（最終濃度３３μM） 0.5μl、 少なくとも１００ngの精製ＰＣＲ断片、 蒸留水 ５０μlまで、及び クレノウＤＮＡポリメラーゼ ５単位。 （１０×は、試薬を反応混合液中所望の最終濃度を１０倍で加えたことを意味す る） ３７℃で３０分間インキュベートし、次いで７５℃で１０分間加熱不活性 化した。 クレノウ反応は、ＢａｍＨＩ制限部位が位置する末端を修復する。Ｔ４ＤＮＡ ポリメラーゼは、そのエキソヌクレアーゼ活性によりそれらの部位を除去するの でこの反応に用いてはならない。 ｄ）末端のキナーゼ化 上記反応混合液に下記のものを加えた。 １００mMrＡＴＰ ５μl、及び Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ １０単位。 この反応混合液を３７℃で３０〜６０分間インキュベートし、前のように加熱不 活性化した。 ｅ）コンカテマー化 次いで、多量のマルチマー中にＢａｍＨＩ制限部位を取込むために、ＰＣＲ産 物をコンカテマー化した。 リン酸化反応のために、下記のものを加えた。 １０×リガーゼバッファー ６μl、及び Ｔ４ＤＮＡリガーゼ ５単位。 連結反応物を１５℃で一晩インキュベートした。コンカテマー化反応物を前述 のように加熱不活性化した。 ｆ）制限消化 コンカテマー化ＰＣＲ産物をモノマーにＢａｍＨＩ制限酵素を用いて消化し、 付着末端を同時に露出させた。加熱不活性化連結反応混合液に下記のものを加え た。 １０×Ｂバッファー(Boehringer) ６μl、及び ＢａｍＨＩ １０〜２０単位。 消化混合液を３７℃で一晩インキュベートした。酵素は加熱により全く不活性 化されないが、反応混合液をとにかく前のように熱処理した。 この点で、ＤＮＡをマジックプレプカラムで精製して切断した末端を除去した 。可能な限り濃縮するために、１０μlのマジックプレプカラムからＤＮＡを溶 離した。 ｇ）ベクターへの連結反応 連結反応に１００ngの細菌プラスミドベクターｐＵＣ１８を用いた。プラスミ ドベクターＤＮＡをＢａｍＨＩ切断し、“Geneclean”(Bio 101)を用いて精製し たが、脱リン酸化しなかった。(脱リン酸化反応は、ベクターの連結反応効率を 非常に低下させることが判明した。) 後述されるように青−白色の選択がコロ ニーを同定するのに十分であることが計画された。連結反応混合液は下記のもの を含有した。 上記のように産生された精製挿入ＤＮＡ １０μｌ、 プラスミドベクターＤＮＡ ５μl、 １０×リガーゼバッファー １.５μl、及び リガーゼ １単位。 反応混合液を１５℃で一晩インキュベートした。 ｈ）E.coliの形質転換 細胞株、XL-1 Blue(Stratagene)を用いて細菌形質転換を行った。細胞を、塩 化カルシウム標準法で形質転換用コンピテントにし、２００μlずつグリセロー ル／塩化カルシウム懸濁液で急速凍結して貯蔵した。３μlの連結反応産物を用 いて１００μlの急速解凍コンピテントXL-1 Blue細胞を形質転換した（１mlのＬ ブイヨンを添加した後、振盪しながら氷上で１０分、４２℃で２分、３７℃で１ 時間）。細胞を２００μl ずつＸ−Ｇａｌ(２０μg/ml)、ＩＰＴＧ(0.1mM)、Ａ ｐ(５０μg/ml)及びＴｅｔ(12.5μg/ml)を含むＬ寒天プレート上で平板培養した 。培地中に化学薬品ＩＰＴＧ（イソプロピルーβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド ）及びＸ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルーβ−Ｄ−ガラク トピラノシド）が存在するので、１ａｃＺ酵素ペプチドをコードするｐＵＣ系の ようなプラスミドを含むコロニー中に青色が生じる。これらのプラスミドのポリ リンカー領域にクローン化ＤＮＡを挿入すると、１ａｃＺペプチド配 列が中断され、もって、プラスミドの酵素産生能が破壊される。従って、組換え プラスミドを含む細菌コロニーは白色である。 ｉ）白色コロニーの分析 青−白色選択により、組換えペプチドを含む細胞コロニーが同定された。これ らのコロニーを集め、それらからミニプラスミド調製物によりＤＮＡを調製した 。そのＤＮＡをＢａｍＨＩで消化すると、プラスミドがクローン化挿入断片を含 むことが確認された。そのプラスミドＤＮＡをガラスミルクで精製し、Ｍ１３前 進及び逆向プライマーを有するＵＳＢシークエナーゼキットを用いて配列決定し た。 ｊ）検討 このプロトコールは多数の工程を含むが、実施することは簡単である。更に、 実験により、本方法は程度の高い再現性を有することが判明した。理論的には、 このクローニング戦略は、ＰＣＲ産物が内部ＢａｍＨＩ部位を含む場合には実験 してはならない。しかしながら、６型の場合に得られたＮＳ４配列はそのような 内部部位を含み、短縮した６型配列が実際にクローニング実験の主な産物でなか った明白な理由はない。 図５は、ＨＣＶ１〜３型（比較として）及び４〜６型に関する２つのＮＳ４領 域のＤＮＡ及びアミノ酸配列を示すものである。実施例３（ＮＳ４ペプチドの合成） ＨＣＶ１〜６型のＮＳ領域内の下記ペプチドを合成した。４〜６型は本発明に よる新規な配列であるが、１〜３型は比較のため及び完全なＨＣＶ血清型別分析 おける使用のために存在させる。 ペプチドの合成の代表例は次の通りである。 （ａ）多抗原ペプチドＭＤＬ０２９の合成 血清型別分析を巧く実験するためには、Tam(Tam J.P.，1988，Proc.Natl.Acad ．Sci.USA.，85:5409:5413）によって開発された多抗原ペプチドコア(K₄K₂K)を 担持する特別の樹脂支持体上でペプチドを合成することが必要である。ペプチド は全てFASTmoc^TM化学を行うApplied Biosystemsモデル432A シネルギーペプチド シンセサイザーで合成した。ペプチド合成は、標準実験プログラムを変更せずに 用いて行った。使用した試薬は全てApplied Biosystems Limited（英国、ワーリ ントン、バーチウッドサイエンスパーク、ケルビンクローズ）から入手した。Ｍ ＡＰ樹脂は、ＨＭＰリンカーとβアラニン内部標準アミノ酸を有するポリオキシ エチレン／ポリスチレンコポリマー上のヘプタリシル(K₄K₂K)コアとした。全て のアミノ酸のＮ−ａ−アミノ基を９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏ ｃ）基で保護した。反応側鎖基を有するアミノ酸を次のように保護した。 合成の進行は、カップリング及び脱保護混合液の伝導率を測定することにより モニターした。伝導率トレースに異常はなく、合成は成功とみなした。 合成後、完全に保護されたペプチド樹脂を５０ml容量の三角ポリプロピレン管 に移し、チオアニソール（0.15ml）、エタンジチオール（0.15ml）及びトリフル オロ酢酸（ＴＦＡ；2.7ml）で処理した。混合液を室温で３時間攪拌し、次いで パスツールピペットのガラスウールでろ過し、ろ液をネジ蓋付ガラスビンに入っ た２０mlの tert.ブチルメチルエーテル（ＴＭＢＥ）に滴下するとペプチドが沈 澱した。試験管を遠心し、液を吸引すると試験管にペプチド沈降物が残った。ペ プチドをＴＥＢＥで２０mlずつ３回洗浄し、へらを用いて沈降物を分離し、遠心 してペプチドを回収した。最後にペプチドを減圧下室温で乾燥した。 ペプチドの純度を分析するために、少量の試料を精製水に溶解し、逆相高性能 液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による分析にかけた。逆相カラムは、Ｃ₄ マトリックスを含む２５０×4.6mmとした。3.5％アセトニトリルから７０％アセ トニトリルまでの勾配を用いて流速1.5ml min^-1で３０分かけてペプチドを溶離 した。溶離液を２１４nmでモニターしてペプチドを検出した。実施例４ （ＨＣＶ１〜６血清型決定用分析） 我々は、生体試料中に存在する抗体を産生したＨＣＶ血清型を区別することが できる選択競合に基づく分析を開発した。典型的には、試料はＣ型肝炎感染が確 認されたヒトからの血清又は血漿である。 分析は、Ｃ型肝炎ウイルス１、２、３、４、５及び６型のＮＳ４タンパク質中 の可変配列を含む１７種の異なった合成ペプチドの選択性によるものである。Ｈ ＣＶ血清型のＮＳ４に高められた抗血清と他の血清型の相同領域間に交差反応性 があるが、これは真の反応性を完全に除去せずに阻止することができる。これを 考慮して、我々は、同量の１７ペプチドを全て有するマイクロタイタープレー トのコーティングウェルを含む分析方式を開発した。種々の阻止ペプチド混合液 を各々入れる８個の重複実験ウェルで試料を試験する。分析プロトコールの終わ りに１つの試験試料と不完全な対照ウェルのみが呈色し、もって、感染している Ｃ型肝炎ウイルスの血清型を同定する。 ポリスチレンマイクロウェルプレートにペプチドの各々をほぼ等モル量被覆す ることにより、血清型別分析用プレートを調製する。ペプチドを精製水に溶解し 、混合液を下記濃度にした。 厳密に言えば各マイクロウェルは検出されることが企図される型のペプチドを含 むことのみ必要であるが、各マイクロウェルを６抗原型全てで被覆することが便 利である。 １００μlのペプチド混合液をプレートの各ウェルに加え４℃で一晩インキュ ベートすることにより、ペプチドをプレートに結合させた。 種々の血清型間の十分な区別を得るためには、試験試料に競合する異種ペプチ ドを加えることが必要である。競合溶液を分析試料希釈剤に溶解してコーティン グ濃度に対して１００倍過剰量の競合ペプチドを得る。阻止する血清型に従って 種々の競合溶液が分類される、即ち、競合溶液１は２〜５型のペプチドを含む。 競合溶液は、１０μl 中必要とされる過剰量を有するようにする。競合溶液は次 の通りである。 血清型別分析を用いるためのプロトコールは次の通りである。 １）希釈剤試料１８０μlを各ウェルに加える。 ２）阻止ペプチド１０μlを適切なウェルに加える。 ３）試料１０μlを６ウェルの各々に加える。 ４）プレートを混合し、３７℃で１時間インキュベートする。 ５）ウェルを３回洗浄する。 ６）複合体１００μlを各ウェルに加える。 ７）３７℃で１時間インキュベートする。 ８）ウェルを３回洗浄する。 ９）ＴＭＢ溶液（3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン、過酸化水素、バッファー 等を含む）１００μlを加える。 10）３７℃で３０分間インキュベートする。 11）硫酸で反応を停止させる。 12）４５０nm／６９０nmの光学濃度を読み取る。 抗ＨＣＶ抗体を含むことが既知の試料を、上記のように全量２００μl中で１ ００倍過剰量の競合ペプチドと１／２０の希釈度で試験する。インキュベートし た後、試料を取り出し、ウェルを洗浄する。ホースラディシュペルオキシダーゼ に結合した抗ヒト免疫グロブリンＧを加え、捕捉された抗ＨＣＶ抗体に結合する 。次いで、酵素複合体を取り出し基質と、酵素の存在下に無色から呈色した溶液 に変える色素原を加えることにより、結合抗体を可視化する。色の強さを測定す ることができ、存在する酵素量に正比例する。ある種の試料に関する結果を表１ に示す。実施例５ （ＨＣＶ４〜６血清型決定用分析） 実施例４の分析方式と別のものを開発した。本分析は、４、５及び６型のペプ チドのみを使用する範囲に更に限定される。ある試料の場合、１型ペプチドとの 交差反応性がより大きいために誤った結果を生じることがある。より限定された 分析を行うためのプロトコールは、実施例４に示したものと同じである。 実施例４に記載されたようにＨＣＶ４〜６型分析用プレートを調製し、違いは 使用ペプチドの数を減らしたことだけである。ペプチドを精製水に溶解し、混合 液を下記濃度にした。 １００μlのペプチド混合液をプレートの各ウェルに加え４℃で一晩インキュベ ートすることにより、ペプチドをプレートに結合させる。 種々の血清型間の十分な区別を得るためには、競合する異種ペプチドを試験試 料に加えることが必要である。競合溶液を分析試料希釈剤に溶解してコーティン グ濃度に対して１００倍過剰量の競合ペプチドを得る。阻止する血清型に従って 種々の競合溶液が分類される、即ち、競合溶液４は５及び６型のペプチドを含む 。 競合溶液は、１０μl中必要とされる過剰量を有するようにする。競合溶液は次 の通りである。 抗ＨＣＶ抗体を含むことが既知の試料を、実施例４に記載されているように全 量２００μl中で１００倍過剰量の競合ペプチド溶液と１／２０の希釈度で試験 する。インキュベートした後、試料を取り出し、ウエルを洗浄する。ホースラデ ィシュペルオキシダーゼに結合した抗ヒト免疫グロブリンＧを加え、捕捉された 抗ＨＣＶ抗体に結合させる。次いで、酵素複合体を取り出し基質と、酵素の存在 下に無色から呈色した溶液に変える色素原を加えることにより、結合抗体を可視 化する。色の強さを測定することができ、存在する酵素量に正比例する。ある種 の試料に関する結果を表２に示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 19/00 8517−4Ｈ Ｃ０７Ｋ 19/00 Ｃ１２Ｐ 21/08 9358−4Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｑ 1/68 9453−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｇ０１Ｎ 33/53 8310−2Ｊ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 33/576 8310−2Ｊ 33/576 Ｚ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＦＩ，ＪＰ，Ｕ Ｓ (72)発明者 シモンズ ピーター イギリス エディンバラ イーエイチ３ ９エルエル グレンガイル テラス １ (72)発明者 ヤップ ペン リー イギリス エディンバラ イーエイチ９ １ジェイゼット メドー プレイス ５ (72)発明者 パイク イアン ヒューゴ イギリス ケント ビーアール２ ９アー ルエックス ブロムリー クーパー ロー ド ８

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．肝炎ウイルス４、５又は６型にユニークなヌクレオチド配列を有するが、４ 型の５′ＮＣＲ及びコア配列のないポリヌクレオチド。 ２．該配列がペプチドをコードする請求項１記載のポリヌクレオチド。 ３．該ペプチドが抗原ペプチドである請求項２記載のポリヌクレオチド。 ４．ＮＳ４領域をコードする請求項１〜３のいずれか1項に記載のポリヌクレオ チド又はその一部。 ５．ＨＣＶ−４のＮＳ４領域又はその一部をコードする請求項４記載のポリヌク レオチド。 ６．ＨＣＶ−５のＮＳ４領域又はその一部をコードする請求項４記載のポリヌク レオチド。 ７．ＨＣＶ−６のＮＳ４領域又はその一部をコードする請求項４記載のポリヌク レオチド。 ８．ＮＳ５領域又はその一部をコードする請求項１〜３のいずれか１項に記載の ポリヌクレオチド。 ９．ＨＣＶ−４のＮＳ５領域又はその一部をコードする請求項８記載のポリヌク レオチド。 10．ＨＣＶ−６のＮＳ５領域又はその一部をコードする請求項８記載のポリヌク レオチド。 11．下記のものより選ばれた配列を有する請求項１記載のポリヌクレオチド。 12．ｃＤＮＡ配列である請求項１〜１１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチ ド。 13．肝炎ウイルス４、５又は６型にユニークなアミノ酸配列を有するが、４型の コア配列のないペプチド。 14．抗原領域を含む請求項13記載のペプチド。 15．ＮＳ４領域又はその抗原部分からの請求項14記載のペプチド。 16．ＨＣＶ−４のＮＳ４領域又はその抗原部分からの請求項15記載のペプチド。 17．ＨＣＶ−５のＮＳ４領域又はその抗原部分からの請求項15記載のペプチド。 18．ＨＣＶ−６のＮＳ４領域又はその抗原部分からの請求項15記載のペプチド。 19．ＮＳ５領域又はその抗原部分からの請求項14記載のペプチド。 20．ＨＣＶ−４のＮＳ５領域又はその抗原部分からの請求項19記載のペプチド。 21．ＨＣＶ−６のＮＳ５領域又はその抗原部分からの請求項19記載のペプチド。 22．下記のものより選ばれた抗原配列を有する請求項14記載のペプチド。 抗原ペプチドを付与するように続いている欠失、挿入又は置換を有するその配 列変異体。 23．多抗原ペプチドコアに結合される請求項22記載のペプチド。 24．下記のものより選ばれた配列を有する請求項23記載のペプチド。 25．他のペプチドに融合して融合ペプチドを形成する請求項13〜22のいずれか１ 項に記載のペプチド。 26．β−ガラクトシダーゼ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、ｔｒｐＥ 又はポリヘドリンコーディング配列からなる群より選ばれた他のペプチドに融 合した請求項25記載のペプチド。 27．標識される請求項13〜26のいずれか１項に記載のペプチド。 28．請求項14〜27のいずれか１項に記載の抗原ペプチドに対する抗体。 29．請求項14〜27のいずれか１項に記載の抗原ペプチドを含むワクチン製剤。 30．請求項14〜27のいずれか１項に記載の抗原ペプチドを結合した固体基質を含 む免疫分析装置。 31．ＨＣＶ−４、ＨＣＶ−５及びＨＣＶ−６抗原ペプチドを各々含む一連の位置 を有するプレートを含むＨＣＶ型別用請求項30記載の装置。 32．各位置が抗原阻止ＨＣＶペプチド混合液を含み、各位置における該混合液が 、その位置が検出しようとするＨＣＶ型のペプチドを除外している請求項31記載 の装置。 33．ＨＣＶ１〜６型の検出用請求項31又は32記載の装置。 34．請求項28記載の抗体を結合した固体基質を含む免疫分析装置。 35．試料中のＨＣＶ抗体を試験管内でスクリーニングする方法であって、 請求項14〜27のいずれか１項に記載の抗原ペプチドを使用する免疫分析を行う 工程；及び産生した抗体−抗原複合体を検出する工程、を含む方法。 36．該抗原ペプチドを基質に結合し、該試料中に存在するＨＣＶ抗体が該ペプチ ドに結合される請求項35記載の方法。 37．抗体阻止ＨＣＶペプチド混合液を該試料と共に該基質に結合した抗原ペプチ ドに被覆し、該混合液が、検出しようとするＨＣＶ型の前記結合抗原ペプチドを 除外している請求項36記載の方法。 38．前記結合抗原ペプチドを含む前記抗原ペプチド混合液を該基質に結合させる 請求項37記載の方法。 39．該試料中に存在するＨＣＶ抗体が該基質に捕捉され、次いで捕捉されたＨＣ Ｖ抗体の検出のために前記抗原ペプチドが被覆される請求項35記載の方法。 40．試料中のＨＣＶを試験管内で試験する方法であって、該試料中に存在するＨ ＣＶポリヌクレオチドを逆転写する工程、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅す る工程、及び請求項１〜12のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドをプローブ として使用することによりその増幅したＨＣＶポリヌクレオチドを検出する工程 、を含む方法。 41．試験管内ＨＣＶ型別方法であって、ＨＣＶ含有試料のエンドヌクレアーゼ消 化を行って制限断片を得る工程を含み、その制限パターンがＨＣＶ−４、ＨＣＶ −５又はＨＣＶ−６の特徴を示す方法。