JPH08508342A

JPH08508342A - 化学発光反応の促進

Info

Publication number: JPH08508342A
Application number: JP6521849A
Authority: JP
Inventors: クリツカ，ラリー・ジヤン
Original assignee: ブリテイツシユ・テクノロジー・グループ・リミテツド
Priority date: 1993-04-01
Filing date: 1994-03-31
Publication date: 1996-09-03
Also published as: GB2276721B; WO1994023060A2; EP0692033A1; DE69408974T2; FI954653A; DE69408974D1; AU6382794A; GB2276721A; WO1994023060A3; CA2157592A1; EP0692033B1; GB9406587D0; GB9306888D0; FI954653A0

Abstract

(57)【要約】ルミノールなどの縮合芳香族ジアシル環式ヒドラジド、ペルオキシダーゼ酵素触媒、過酸化水素などの酸化剤およびエンハンサーの高められた化学発光（ＥＣＬ）反応において、４−ビフェニルホウ酸などの有機ホウ素エンハンサーをホウ素を含まないエンハンサー、特にフェノール性または芳香族アミンエンハンサー、とりわけ４−ヨードフェノールと組み合わせて使用すると有益であることが見出された。ＥＣＬ反応は、診断アッセイで有用である。

Description

【発明の詳細な説明】化学発光反応の促進発明の背景１．発明の分野本発明は、特に診断測定で使用するための高められた化学発光反応およびその測定で使用するための診断キットに関する。２．関連技術の説明化学発光反応は、化学反応の結果、光を放射する反応である。その発光は一般に十分な時間持続するので、放射された光を検出または測定することができ、それにより、被分析物の検出または定量化が可能である。本発明に係る化学発光反応は、縮合芳香族ジアシル環式ヒドラジド（ＦＡＤＣＨ）（特に２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン（ＤＰＤ）、とりわけルミノール）と酸化剤（特に過酸化水素）および酸化剤によるＦＡＤＣＨの酸化を触媒するペルオキシダーゼ酵素（特にホースラディッシュペルオキシダーゼ）との間の反応である。酸化が光の放出を伴う。上記反応を使用する発光アッセイには、いくつかの種類がある。本発明は、主に、ペルオキシダーゼの有無または量を測定するものに関し、主として、ペルオキシダーゼをリガンドに結合させて標識化し、発光反応を使用してその標識を検出または定量するアッセイである。この中には、ペルオキシダーゼ標識に基づくＥＬＩＳＡ、競合ＥＩＡおよび核酸ハイブリッド形成アッセイが含まれる。しかし、例えば分析の目的で、遊離ペルオキシダーゼを測定するアッセイも含まれる。発光アッセイの総説は、L．J．kricka，Clinical Chemistry37，1472-1481（1 991）によって出版されている。ＦＡＤＣＨのペルオキシダーゼ触媒による化学発光酸化の感度は、試薬にエンハンサー、例えば６−ヒドロキシベンゾチアゾール（欧州特許Ｎｏ．８７９５９Ｂまたは米国特許４８４２９９７）、特定のフェノール（欧州特許Ｎｏ．１１６４５４Ｂまたは米国特許Ｎｏ．４５９８０４４）または特定の芳香族アミン（英国特許Ｎｏ．２１６２９４６Ｂまたは米国特許Ｎｏ．４７２９９５０）を含めることにより高めることができる。この種の化学発光反応を高める別の種類の置換フェノールは、オルトおよび／またはパラ位がイミダゾリルまたはベンズイミダゾリルで置換されたフェノール（英国特許Ｎｏ．２２０５９４５Ｂまたは米国特許５０４３２６６）である。これらの特許は、BritiSh Technolo gy Group Ltd．名義である。欧州特許出願公開Ｎｏ．２１９３５２Ａ（Minnesot a Mining and Mfg．Co．）は、エンハンサーとして、英国特許Ｎｏ．２１６２９４６Ａで先に挙げられた芳香族アミンのいくつかを含む種々の芳香族アミンを記載している。種々のエンハンサーを記載している他の特許出願としては、欧州特許出願３８４，２７１Ａ（Takeda）、３６１，４７０Ａ（Fujirebio）、４５５，４７１Ａ（Hitachi Chemical）および５０５，１９８Ａ（Sanyo）ならびに米国特許５，２７９，９４０（Kissel，Eastman Kodakへ譲渡）が挙げられる。最近、本発明者は、有機ホウ素化合物群を含む新規の化学発光エンハンサーを見出した。これらは、英国特許出願Ｎｏ．２２６５４５９ＡまたはＰＣＴ出願ＷＯ９３／１６１９５に記載されているが、それらは、本出願の優先日には未公開であった。本発明の目的は、有効なエンハンサーの範囲を拡張することである。これは、エンハンサーとして試すための候補化合物をどのようにして選択すべきかを説明する理論または機構が何も発表されていないので、困難な仕事である。本発明の目的に対して、「エンハンサー」という用語または関連用語を使用するときは、化合物の少なくとも１つの濃度で、光の全出力または化学発光アッイの信号：バックグランド比を増加させる化合物を意味するものとする。発明の要旨縮合芳香族ジアシル環式ヒドラジド（ＦＡＤＣＨ）、ペルオキシダーゼ酵素触媒および酸化剤の化学発光反応による光出力（信号）および／または光出力の信号：バックグランド比の増加、および／またはバックグランドの光出力の減少が、この反応を、エンハンサーを組み合わせて使用し、その一方を有機ホウ素エンハンサーとし、他方をホウ素原子を含まない有機エンハンサー、好ましくはフェノール性エンハンサーとして行うことにより可能になることが見出された。「信号」は、ペルオキシダーゼの存在下での光出力のレベルを意味し、「バックグランド」は、ペルオキシダーゼが存在しない場合である。エンハンサーの組み合わせの多くが、信号および／または信号：バックグランド比を、個々のエンハンサーを組み合わせて使用するときに予測される相加効果よりも高いレベルに増加させることが見出された。本発明は、第一に、化学発光反応の光出力を増加させる方法、第二に、その反応を使用して行うアッセイ方法、および第三に、そのアッセイで使用するための個々の成分のキットを含み、キットは、エンハンサーの組み合わせを含み、好ましくはＦＡＤＣＨもしくはペルオキシダーゼまたはその両方とともに含み、所望により酸化剤も含む。図面の簡単な説明図１は、種々の濃度のフェノール性エンハンサー（ＰＩＰ）の光放射（信号）強度対有機ホウ素エンハンサー（Ｋ）の濃度のプロットを示す。図２は、最初に従来のフェノール性エンハンサー（Amer1iteシグナル試薬）を使用し、次に有機ホウ素エンハンサー（Ｋ）を追加した場合の信号／バックグランド比対ペルオキシダーゼ濃度のプロットを示す。好ましい態様の説明エンハンサーの組み合わせは、多くの方法において、信号、バックグランドおよび／または信号：バックグランド比に影響を及ぼす。その信号は、（ｉ）個々のエンハンサーをその濃度で使用するときの高い方のレベルよりも高いレベルに増加することができるが、それらの予測される相加性値よりも小さく、あるいは、（ii）その濃度でエンハンサーを組み合わせたときの予測される相加性値よりも大きいレベルに増加することができる。前者の効果（ｉ）は、以後、「タイプＩ効果」と言い、後者の効果（ii）は「タイプII効果」と言う。後者が、相乗的促進の最良の例である。信号：バックグランド比も同様に、（ｉ）個々のエンハンサーの高い方のレベルよりも高いレベルに増加することができるが、予測される相加性値よりも小さく（以後、「タイプＩ効果」と言う。）、あるいは、（ii）予測される相加性値よりも大きいレベルに増加することができる（以後、「タイプII効果」と言う。）。すなわち、タイプＩおよびタイプII効果は、信号または信号／バックグランド比の増加レベルを意味するのに使用する用語であり、タイプII効果が相乗作用の最良の例である。発光のバックグランドレベルは、その濃度での個々のエンハンサーのいずれかよりも低いレベルに減少させることができる。これも、タイプＩ効果として記載する。光出力の「バックグランド」レベルについて述べるときは、タイプＩ効果のみに関係する。すなわち、エンハンサーの組み合わせは、バックグランドの発光レベルを、個々のエンハンサーのいずれかより小さいレベルに低下させる。相加性値の概念は、バックグランド発光の低下について記載するときは無関係であり、従って、タイプII効果には相当しない。定義によると、各々のエンハンサーは、個々に、少なくとも１組の条件下で、エンハンサーを使用しない反応に対して、信号または信号：バックグランド比を増加させることが要求される。しかし、組み合わせの場合は、１個のエンハンサーのみを使用して行う反応に対して上記で定義した促進、すなわちタイプＩまたはタイプII効果を生じるか、またはバックグランドの減少を生じることが条件である。種々のタイプＩおよびタイプII効果は、Ｅ１およびＥ２の二つのエンハンサーを使用した例により容易に理解することができる。バックグランド発光Ａ．バックグランドの光放射は、いずれかのエンハンサーを個々に使用して得られる値より低い値に減少させることができる。信号Ａ．ペルオキシダーゼの存在下での光の放射は、いずれかのエンハンサーを個々に使用して得られる信号より高い値に増加させることができる（タイプＩ効果）。Ｂ．ペルオキシダーゼの存在下での光の放射は、個々のエンハンサーを組み合わせたときの予測される相加性値よりも高い値に増加させることができる（タイプII効果）。信号／バックグランド（Ｓ／Ｂ）比Ａ．ペルオキシダーゼの存在下での信号／バックグランド比は、いずれかのエンハンサーを個々に使用して得られる信号／バックグランド比より高い値に増加させることができる（タイプＩ効果）。Ｂ．ペルオキシダーゼの存在下での信号／バックグランド比は、個々のエンハンサーを組み合わせたときの信号／バックグランド比の予測される相加性値よりも高い値に増加させることができる（タイプII効果）。本発明で使用する化学発光エンハンサーの組み合わせは、有機ホウ素エンハンサーおよび非ホウ素エンハンサーから成り、またはそれらを含む。有機ホウ素エンハンサーは、少なくとも１個のホウ素原子を含む有機化合物であり、上記化学発光反応を高めることができる。好ましくは、ホウ素原子に結合したベンゼン環を含み、最も好ましくは、環置換フェニルホウ酸（ring-substit uted phenylboronic acid）である。好ましい有機ホウ素エンハンサーは、式（Ｉ）［式中、Ｒ基は同一であり、各々は水素、ｎ−ブチル、４’−クロロフェニルおよび３’，５’−ジクロロフェニルから成る群から選択され；または、Ｒが一緒になってＯ，Ｏ−プロピレンを形成し（それによって、ホウ素原子とともに環式エーテルを形成する。）；Ｗは、水素、メチル、メトキシ、ヒドロキシおよび塩素から成る群から選択され；Ｘは、水素、塩素、アミノおよびニトロから成る群から選択され；Ｙは、水素、メチル、カルボキシ、塩素、臭素、ヨウ素、フェニル、フェノキシ、４’−クロロアニリノ、４’−ボロニルフェニル、４’−ブロモフェニル、２’−カルボキシエテニルおよびトリメチルシリルから成る群から選択され；Ｚは、水素、５−クロロ、５−ブロモ、５−（３’−トリフルオロメチル）フェニルアゾおよび６−クロロから成る群から選択され；あるいは、ＷおよびＸが一緒になって縮合ベンゼン環を表してもよく、ＸおよびＹが一緒になって、ナフタレン環位置番号の６位がヒドロキシで置換された縮合ベンゼン環を表してもよく、ただし、（１）各Ｒが水素の場合、（ａ）Ｗ、Ｘ、Ｙ、Ｚは各々水素であるか：または（ｂ）Ｗ、ＸおよびＺは各々水素であり、Ｙはヨウ素、臭素、塩素、トリメチルシリル、フェノキシ、フェニル、４’− クロロアニリノ、メチル、４’−ボロニルフェニルおよび２’−カルボキシエテニルから成る群から選択されるか；または（ｃ）ＷおよびＺが各々水素であって、（ｉ）ＸおよびＹが一緒になってナフタレン環位置番号の６位がヒドロキシで置換された縮合ベンゼン環を表すか、（ii）Ｘがニトロおよび塩素のいずれかで、Ｙが塩素であるか、（iii）Ｘがニトロで、Ｙがカルボキシであり；または（ｄ）Ｗ、ＹおよびＺが各々水素であって、Ｘはアミノ、塩素またはニトロであり；または（ｅ）ＷおよびＸが一緒になって縮合ベンゼン環を表し、ＹおよびＺが各々水素を表すか；または（ｆ）ＸおよびＹが各々水素であって、（ｉ）Ｗがメトキシであり、Ｚが５−ブロモであるか、（ii）Ｗがヒドロキシであり、Ｚが５ −（３’−トリフルオロメチル）フェニルアゾであるか、（iii）Ｗがメチルであり、Ｚが水素であり；または（ｇ）Ｗが塩素であり、Ｘが塩素であって、ＹおよびＺが各々水素であるか；または（ｈ）ＷおよびＹが各々塩素であり、Ｘがアミノであって、Ｚが６−クロロであり；（２）Ｒが各々ｎ−ブチルである場合、Ｗ、ＸおよびＺは各々水素であって、Ｙは臭素または４’−ブロモフェニルであり；（３）Ｒが各々４’−クロロフェニルである場合、Ｗ、ＸおよびＺは各々水素であって、Ｙはクロロであり；（４）Ｒが各々３’，５’−ジクロロフェニルである場合、ＷおよびＹは各々水素であり、Ｘは塩素であり、Ｚは５ −クロロであり；及び（５）Ｒが一緒になってＯ，Ｏ−プロピレンを表す場合、Ｘ、ＹおよびＺは各々水素である。］の化合物ならびにビス（カテコール）ホウ酸塩、ボログリシン、ペンタエリスリトールホウ酸塩、４−（３’−ボロノ−４ ’−ヒドロキシ−フエニルアゾ）安息香酸、ジフェニルイソブトキシボラン、ジフェニルホウ酸無水物（diphenylboronic anhydride）およびジメチルフェニルホウ酸（dimethylboronic acids）である。特に好ましい有機ホウ素エンハンサーは、ｐ−ヨードフェニルホウ酸、ｐ−ブロモフェニルホウ酸、４−ビフェニルホウ酸、４−（トリメチルシリル）ベンゼンホウ酸、２−ヒドロキシ−５−〔（３’−トリフルオロメチル）フェニルアゾ〕ベンゼンホウ酸、ボログリシン、４−クロロ−３−ニトロフェニルホウ酸、４−クロロフェニルホウ酸、４−（２’−カルボキシエテニル）フェニルホウ酸、４−（４’−ブロモフェニル）フェニル−ジ−ｎ−ブトキシボラン、４− クロロフェニル−ジ−（４’−クロロフェノキシ）ボラン、４，４’−ビス（フェニルホウ酸）、ジフェニルホウ酸無水物、４−（４’−クロロアニリノ）フェニルホウ酸および４−ブロモフェニル−ジ−ｎ−ブトキシボランを含む。フェノール性エンハンサーは、式（II）：［式中、（ｉ）ＡおよびＱは水素であり、Ｒ₁は（ａ）ハロゲン；（ｂ）フェニル；（ｃ）［式中、Ｒ₂は−ＣＨ₂−、−Ｏ−もしくは−Ｎ＝Ｎ−であって、Ｖは水素であるか、または、Ｒ₂が−Ｏ−、−Ｓ−または −Ｓ−Ｓ−であってＶはヒドロキシである。］；（ｄ）（ｅ）（ｆ）−ＣＨ＝ＣＨ−Ｒ₃（Ｒ₃はカルボキシまたは２，４−ジニトロフェニルである。）；（ｇ）−ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＯＯＣ₂Ｈ₅またはＣ₁〜Ｃ₆アルキル；（ｊ）イミダゾール−１−イルまたはベンズイミダゾール−２−イル；（ｋ）４−チアゾリル、４−オキサゾリルまたは４−イミダゾリル（各々、環置換されていてもよい。）；（ｌ）４−アセタミド；および（ｍ）１，２，３，４−チアトリアゾリル−５−アミノであるか；（ii）Ａが水素であり；ＱがハロゲンまたはＣ₁〜Ｃ₆ アルキルであり；Ｒ₁がハロゲンであるか；（iii）Ａがハロゲンであり；Ｑが水素であり；Ｒ₁がハロゲンまたはフェニルであるか：あるいは、（iv）Ａが水素またはハロゲンであり；Ｒ₁が−Ｓ（ＣＨ₂）_n −Ｒ₄（ｎは１〜５の整数を表し、Ｒ₄は水素、シアノ、モルホリノ、カルボン酸、炭素数２〜７のアルコキシカルボニル基、金属カルボン酸塩、アミド、アルデヒドまたはアリルを表す。）またはフェニル基（ハロゲン原子で置換されていてもよい。）であるか、Ｒ₁およびＱが一緒になってナフタレン核を完成させる鎖を表し、その鎖は、Ｒ₁からＱの方向に下記式：［式中、Ｒ₅は水素またはハロゲンである。］を有し、その結果、式（II）の化合物は、式（VI）：のβ−ナフトールとなり、上記（ｉ）、（ii）、（iii）および（iv）において「ハロゲン」は、塩素、臭素またはヨウ素を意味する。］の化合物を含む。好ましいフェノール性エンハンサーは、４−クロロフェノール、４−ブロモフェノール、４−ヨードフェノール、４−ブロモ−２−クロロフェノール、２，４ −ジクロロフェノール、３，４−ジクロロフェノール、４−メチルフェノール、４−ｔ−ブチルフェノール、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸エチル、４−ベンジルフェノール、４−（２’，４’−ジニトロスチリル）フェノール、４−ヒドロキシ桂皮酸、４−フェニルフェノール、２−クロロ−４−フェニルフェノール、４−（４’−ヒドロキシフェニル）ベンゾフェノン、４−（フェニルアゾ）フェノール、４−（２’−カルボキシフェニルアゾ）フェノール、４ −フェノキシフェノール、４−（４’−ヒドロキシフェノキシ）フェノール、４ −ヒドロキシフェニルスルフィド、４−ヒドロキシフェニルジスルフィド、（４ −シアノメチルチオ）フェノール、４−シアノメチルチオ−２−フルオロフェノール、４−シアノメチルチオ−２−クロロフェノール、４−シアノメチルチオ− ２−ブロモフェノール、４−イミダゾール−１−イルフェノール、ナフト−２−オール、１−ブロモナフト−２−オール、６−ブロモナフト−２−オールおよび１，６−ジブロモナフト−２−オールの化合物から成る群から選択される。最も好ましいフェノール性エンハンサーとしては、４−ヨードフェニル、４− ヒドロキシ桂皮酸、４−イミダゾール−１−イルフェノール、４−フェニルフェノールおよび４−ブロモフェノールが挙げられる。上記有機ホウ素エンハンサーは、上記英国特許出願Ｎｏ．２２６５４５９Ａに記載された化合物である。上記フェノール性エンハンサーは、上記欧州特許Ｎｏ．１１６４５４Ｂ、英国特許２２０５９５４Ｂ、欧州特許出願公開Ｎｏ．３８４２７１Ａ、４５５４７１Ａおよび５０５１９８Ａならびに米国特許５，２７９，９４０に記載された化合物であり、そのエンハンサーおよびそれらの組成物に関する内容は、参考文献として本明細書にとり込まれる。使用できる他のエンハンサーは、上記で挙げた他の特許文献に記載されている化合物であり、例えば、英国特許２１６２９４６Ｂによるアミンエンハンサーが挙げられ、そのエンハンサーおよびそれらの組成物に関する内容は、参考文献として本明細書にとり込まれる。エンハンサーの好ましい組み合わせは、好ましい有機ホウ素エンハンサーと好ましいフェノール性エンハンサーとの組み合わせである。特に好ましい組み合わせは、有機ホウ素エンハンサーが４−ビフェニルホウ酸、４−ヨードフェニルホウ酸、トランス−４−（２’−カルボキシエテニル）フェニルホウ酸または４− ブロモフェニルホウ酸であり、フェノール性エンハンサーが４−フェニルフェノール、４−ヨードフェノール、４−ヒドロキシ桂皮酸または４−ブロモフェノールである組み合わせである。行われる実験操作またはアッセイに応じて、信号もしくは信号：バックグランド比の改善またはバックグランド発光の有益な減少のいずれかに重点を置く。例えば、ルミノール−過酸化物アッセイ試薬からのバックグランドの光放射が低いのが好ましいのは、アッセイ試薬のバックグランドが、この種の化学発光アッセイにおけるペルオキシダーゼの検出範囲を限定する主要な要因であるためである。ペルオキシダーゼの存在下での信号が高いのが好ましいのは、高い光レベルの測定が簡単で、便利であるからである（例えば、広範囲の光放出検出器−写真フィルム、ケイ素光ダイオード−の使用が可能である。）。ペルオキシダーゼアッセイにおいて、信号／バックグランド比が増加すると、アッセイの感度が改善され、従って、ペルオキシダーゼの増加量間の識別可能性が改善される。信号／バックグランド比の増加は、多数の方法で達成することができる。信号を増加させたり、バックグランドを減少させたり、あるいは、これらの効果の組み合わた方法も考えられる。例えば、信号／バックグランド比の増加は、ペルオキシダーゼの存在下で信号を低下させるが、アッセイバックグランドのかなりの減少を生じるエンハンサーの組み合わせにより得ることができる。本発明は、上記で述べた反応体を含む、いかなる目的の、いかなる化学発光反応の改善にも適用されるが、主に興味深いのはアッセイ、特に例えば抗原または抗体のアッセイを行うイムノアッセイとの関連である。本明細書における「アッセイ」は、検出、半定量および定量を含む。典型的には、アッセイは、光出力が、使用されたペオキシダーゼの量に関連するように行われ、その場合、ペルオキシダーゼが直接測定される物質となる。同様に、測定すべき物質が別の反応体である場合は、「信号」が測定すべき物質の存在を示し、その物質が無い場合が「バックグランド」である。本発明は、上記の４個の反応体のいずれか一つの有無または量を測定するために使用することができるが、そのような反応体は、必ずしも測定すべき物質自体でなくてもよい。すなわち、酸化剤は、サンプルに対して行われる初期の反応または初期反応のカスケードの結果として生じさせることができる。ペルオキシダーゼまたはＦＡＤＣＨは、例えば抗原を測定するためのイムノアッセイで使用される抗体に結合した形態にすることができる。本発明は、従って、その有無または量が、ＦＡＤＣＨ、ペルオキシダーゼ酵素、酸化剤およびエンハンサーから成る群から選択される反応体の有無または量と関連する物質の診断アッセイのどんな方法にも適用できる。反応体はともに化学発光反応において反応可能であり、化学発光反応において反応が行われ、光出力が検出または測定されるので、測定すべき物質の有無または量は光出力に関連する。信号：バックグランド比の改善は、化学発光アッセイの感度の調節において重要である。従って、本発明のエンハンサーは、高い感度を必要とするような状況、例えば、ブロットアッセイにおいて特に有用である。すなわち、本発明は、ウェスタン、サザンおよびノーザンブロットアッセイを含むブロットアッセイならびにドットブロットおよび他の核酸ハイブリッド形成アッセイにおいて特に有用である。最良の結果は、より高いｐＨで得られる。好ましくは、全ての試薬を混合するときに、ｐＨが７．５〜９の範囲である。本発明では、化学発光するどんな縮合芳香族ジアシル環式ヒドラジド（ＦＡＤＣＨ）も使用することができる。すなわち、ペルオキシダーゼ触媒の存在下、添加した酸化剤により酸化して化学発光を生じることができるＦＡＤＣＨであればいずれも使用するとができる。好ましくは、ＦＡＤＣＨの芳香族残基がベンゼン環から成るか、それを含むＦＡＤＣＨであり、該ベンゼン環は、化学発光を生じるために適切な方法で置換されていてもよく、通常はアミノまたは置換アミノ基で置換されている。芳香族部分がベンゼノイドである場合、ＦＡＤＣＨはジヒドロフタラジンジオン（ＤＰＤ）である。ＤＰＤの例は、上記特許明細書に見ることができ、ルミノール（最も好ましい）、イソルミノール、６−（Ｎ−４−アミノブチル−Ｎ−エチル）アミノ−２，３−ジヒドロフタラジンジオン（ＡＢＥＩ）、６−（Ｎ−６−アミノヘキシル−Ｎ−エチル）アミノ−２，３−ジヒドロフタラジンジオン（ＡＨＥＩ）および７−ジメチルアミノナフタレン−１，２−ジカルボン酸ヒドラジドが挙げられる。あるいは、ＦＡＤＣＨの芳香族残基が非ベンゼノイド、特にピリジノイド残基であるＦＡＤＣＨでもよく、例えば、欧州特許出願４９１４７７Ａ（Takeda Chemical Indu stries Ltd．）（参考文献として本明細書に取り込まれる。）に記載の式（ＶII ）：［式中、Ｒ_aは炭化水素基またはヘテロ環式基で、それらは置換されていてもよく、Ｒ_bはヒドロキシ基、チオール基、アミノ基またはモノ置換アミノ基であり、Ｒ_bがモノ置換アミノ基である場合、Ｒ_bはＲ_aと一緒になって環を形成してもよく、Ｒ_cは水素原子、置換されていてもよいヒドロキシ基、置換されていてもよいアミノ基、置換されていてもよいチオール基、ハロゲン原子、ヘテロ環式基、ニトロ基、シアノ基、エステル化またはアミド化されていてもよいカルボキシル基、アジド基、スルホ基または有機スルホニル基であり、ただし、Ｒ_aが脂肪族基である場合、Ｒ_cは水素原子以外であり、Ｄは酸素原子もしくは硫黄原子またはその塩である。］のピリドピリダジン化合物、特に７−〔４−（３−アミノプロピルオキシ）フェニル〕−８−ヒドロキシピリド〔３，４−ｄ〕ピリダジン−１，４−ジオンが挙げられるが、その中で、通常はルミノールが好ましい。ＦＡＤＣＨは遊離形でもよく、または、リガンドと結合して直接標識となってもよい。そのような発光団−標識アッセイは公知である。酸化剤は、光放射反応においてＦＡＤＣＨを酸化するどんな添加物質でもよい（空気中の酸素以外）。通常は過酸化水素であるが、他には、過ホウ酸塩（ナトリウム塩など）がある。一般的には、酸化剤濃度が０．５μモル〜３００ミリモル／ｌ、好ましくは１０〜２００ミリモル／ｌの範囲である。ペルオキシダーゼ酵素は、通常はＨＲＰであり、発光アッセイでの使用に適切な等級のものである。好ましくは、ＨＲＰが、例えばSigmaＶＩＡまたはＩＸ型の塩基性イソ酵素である。それは、遊離形でもリガンドに結合していてもよい。ミクロペルオキシダーゼは、通常、標識化ペルオキシダーゼアッセイには適さないが、他の反応体の一つが標識化される場合は使用できる。ペルオキシダーゼ酵素は、例えば抗体に直接結合することにより標識として使用でき、または、アビジンもしくはストレプトアビジンに結合させてもよく、その結果、ビオチン：アビジン／ストレプトアビジン結合相互作用を使用して標識化を高めることができる。化学発光反応の反応体の濃度は、行われるアッセイの性質、特に反応体のどれがアッセイされるかに依存する。一般的には、ＦＡＤＣＨの濃度が大きいほど、光出力が大きい。すなわち、ペルオキシダーゼまたは酸化剤をアッセイする場合は、過剰のＦＡＤＣＨを使用するのが好ましい。一般的に、ＦＡＤＣＨ濃度は０．５μモル〜２００ミリモル／ｌが好ましく、好ましくは０．０５〜２００ミリモル／ｌ、最も好ましくは０．１〜１ミリモル／ｌである。ペルオキシダーゼの濃度は、ペルオキシダーゼがアッセイされる反応体ではない場合に重要である。過剰のペルオキシダーゼは、通常は光強度に対する顕著な影響はなく、ペルオキシダーゼは再利用される触媒である。従って、ルミノールまたは酸化剤をアッセイする場合、ペルオキシダーゼは適度な濃度、例えば０．０１μｇ〜５０００ｍｇ／ｌ、好ましくは５０ｍｇ／ｌ以下で存在させればよいが、ペルオキシダーゼ１ｇ当たりの活性に依存する。個々のエンハンサーの濃度は、通常は０．０１μモル〜４モル／ｌ、好ましくは１０μモル〜１００ミリモル／ｌの範囲である。エンハンサーまたはその一種またはその誘導体は反応中にＦＡＤＣＨと競合し、従ってエンハンサーとＦＡＤＣＨとの相対濃度を最適化するのが好ましいと考えられる。典型的には、ＦＡＤＣＨが一方のエンハンサーの１．２５〜２０モル倍過剰となるように存在させる。下記の実施例から明らかなように、個々のエンハンサーの濃度は、化学発光反応において好ましい改善を最も有利にもたらすように変えることができ、例えば、エンハンサーの組み合わせ全体または各エンハンサーの相対濃度は、バックグランドの発光を減少させるように調節することができ、あるいは、信号出力または信号：バックグランド比を改善するように調節することができる。これらの変更は、当業者には周知であり、好ましい効果は、最小の試行およびエラーで得られるであろう。要するに、化学発光反応の全ての条件および特徴、その反応体、アッセイの適用など（上記記載と一致しない点は除く）は、欧州特許Ｎｏ．１１６４５４Ｂに記載の通りにすることができ、該特許の関係した箇所を参考文献として本明細書に取り込む。実施例使用する略号および他の説明有機ホウ素エンハンサーＫ：４−ビフェニルホウ酸（４−biphenylboronic acid）＝４−フェニルイルホウ酸（４−phenylylboric acid）ＰＩＢＡ：４−ヨードフェニルホウ酸（４−iodophenylboronic acid）ＰＨＣＢＡ：トランス−４−（３−プロペン酸）フェニルホウ酸＝トランス−４ −（２’−カルボキシエテニル）フェニルホウ酸ＰＢＢＡ：４−ブロモフェニルホウ酸フェニル性エンハンサーＰＨＤ：４−フェニルフェノールＰＢＰ：４−ブロモフェノールＰＨＣＡ：４−ヒドロキシ桂皮酸ＰＩＰ：４−ヨードフェノール４−ＡＰ：４−アセタミドフェノール６−ＢＮ：６−ブロモ−２−ナフトール２，４−ＤＣＰ２，４−ジクロロフェノールアミンエンハンサー４−ＭＡ：４−アニシジン＝４−メトキシアニリンＴＭＢ：Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルベンジジン発光の値は、任意の単位の光出力（ｈν）である。Ｓ＝信号（ペルオキシダーゼを含む）Ｂ＝バックグランド（ペルオキシダーゼを含まない）Ｓ／Ｂ＝信号：バックグランド比「１：ｎに希釈」（ｎは特定の数字）という表現は、濃厚溶液１部をｎ−１部の希釈剤で希釈してｎ部の希釈溶液を得ることを意味する（全て、体積部）。希釈度は、濃厚溶液の１ｍｌ未満の端数は無視する。すなわち、５０．５ｍｌを１：１０に希釈するということは、希釈剤を用いて５００ｍｌにすることを意味する。Ｙ＝はいＮ＝いいえＡ＝ストック溶液の濃度「Amerlite」は登録商標である。実施例１：信号およびバックグランドの化学発光測定の標準的方法ＰＨＣＢＡ（１０ミリモル／ｌ）およびＰＨＣＡ（１０ミリモル／ｌ）のストック溶液をＤＭＳＯ中に調製し、トリス緩衝液（０．１モル／ｌ，ｐＨ８．６）で希釈した。ルミノール−過酸化水素試薬を次のように調製した。ナトリウムルミノール（１２．５ｍｇ）を５０ｍｌのトリス緩衝液（０．１ｍｌ／ｌ，ｐＨ８．６）に溶解し、１５．５μｌの過酸化水素（３０％ｗ／ｖ）を０．５ｍｌのトリス緩衝液（０．１モル／ｌ，ｐＨ８．６）と混合した。これら二つの溶液を一緒にしてトリス緩衝液（０．１モル／ｌ，ｐＨ８．６）で１：１０に希釈した。１０μｌのＰＨＣＡ（０〜１０ミリモル／ｌ）、１０μｌのＰＨＣＢＡ（０〜１ミリモル／ｌ）および１００μｌのルミノール−過酸化物をマイクロウェルで混合し、Amershamプレート読み取り機を使用して光の放射を測定した。この読み取りにより、化学発光のバックグランドのレベルが得られる。実験を繰り返したが、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（１０ μｌ，同じトリス緩衝液における１ｍｇ／ｍｌのストック溶液の１：１０，０００希釈）もマイクロウェルに添加して行った。 Amershamプレート読み取り機を使用して測定した光放射が化学発光の信号レベルとなる。信号：バックグランド比はそれから簡単に得られる。実施例２：バックグランドの発光においてタイプＩ効果（減少）を生じるエンハンサーの組み合わせバックグランドの発光を、表１に挙げたエンハンサーの組み合わせを使用して実施例１に記載したように測定した。表１において、Ｅ１およびＥ２は二つのエンハンサーであり、一方（Ｅ１）は有機ホウ素エンハンサー、他方（Ｅ２）はフェノール性エンハンサーである。Ｖ／Ａの欄は、測定管に添加する前のＥ１エンハンサーの体積および濃度を示す。各測定では、各Ｅ２エンハンサーの１ｍＭストック溶液１０μｌを添加した。Ｅ１＋Ｅ２が二つのエンハンサーの組み合わせである。組み合わせでは、エンハンサーＥ１およびＥ２の混合物を、個々にテストするときに使用する濃度で含めた。各組み合わせＥ１＋Ｅ２において、バックグランドの発光は、Ｅ１またはＥ２のいずれかを個々に使用した場合よりも低かった（すなわち、タイプＩ効果）。実施例３：化学発光反応の信号に対してタイプII効果（増加）を生じるエンハンサーの組み合わせ化学発光の信号レベルを、表２に挙げたエンハンサーの組み合わせを使用して、実施例１に記載したように測定した。表２において、Ｅ１は有機ホウ素エンハンサーであり、Ｅ２はフェノール性エンハンサーである。Ａの欄は、エンハンサーのストック溶液の濃度を示し、その１０μｌを各測定で使用した。「ｈν」の欄は、エンハンサーまたは組み合わせの光出力を任意の単位で示す。組み合わせＥ１＋Ｅ２においては、各エンハンサーを１０μｌずつ添加して測定した。各組み合わせにおいて、タイプII効果が認められた。すなわち、Ｅ１＋Ｅ２の光出力は、Ｅ１およびＥ２に対して個々に認められる値の和より大きかった。実施例４：信号：バックグランド比に対してタイプII効果を生じるエンハンサーの組み合わせ信号：バックグランド比を、表３に挙げたエンハンサーの組み合わせに対して、実施例１に記載したように計算した。表３において、Ｅ１は有機ホウ素エンハンサーであり、Ｅ２はフェノール性エンハンサーである。Ａの欄は、エンハンサーのストック溶液の濃度を示し、その１０μｌを各測定で使用した。Ｓ／Ｂは、各エンハンサーまたは組み合わせの信号：バックグランド比を示す。組み合わせＥ１＋Ｅ２においては、各エンハンサーを１０μｌずつ添加して測定した。各組み合わせにおいて、信号：バックグランド比に対するタイプII効果が認められた。実施例２〜４のまとめ下記表４および５に、実施例２〜４のデータをまとめる。表４は、組み合わせによりタイプＩ効果を示すかどうかに関し、表５は、組み合わせによりタイプII 効果を示すかどうかに関する。各表には、各組み合わせに対して、３個の印が、バックグランド、信号、信号：バックグランド比の順に並んでいる。使用した印は、Ｙ＝はい、Ｎ＝いいえ、＊＝適用できない、である。タイプＩ効果またはタイプII効果が組み合わせの少なくとも一つの濃度で生じた場合は、正の反応（Ｙ）とする。実施例５Ａ．タイプII効果を示すペルオキシダーゼに対して高められたアッセイ４−ヨードフェノール（ＰＩＰ）−ルミノール−過酸化物反応およびAmerlite シグナル試薬（ＡＳＲ）（エンハンサーとしてＰＩＰを含むと考えられる。）に対する４−ビフェニルホウ酸（Ｋ）の影響を調べた。ＨＲＰ触媒によるルミノール−過酸化物−ＰＩＰ反応に対するＫの影響ルミノール−過酸化水素試薬を次のように調製した。ナトリウムルミノール（１２．５ｍｇ）を５０ｍｌのトリス緩衝液（０．１モル／ｌ，ｐＨ８．６）に溶解し、１５．５μｌの過酸化水素（３０％ｗ／ｖ）を０．５ｍｌのトリス緩衝液（０．１モル／ｌ，ｐＨ８．６）と混合した。これら二つの溶液を一緒にして希釈した（１：１０希釈）。ＫおよびＰＩＰのストック溶液（１０ミリモル／ｌ）をＤＭＳＯ中に調製し、希釈液を０．１モル／ｌのトリス緩衝液（ｐＨ８．６）で調製した。ルミノール−過酸化水素試薬（１００μｌ）、１０μｌのＰＩＰ（０．１ミリモル／ｌ）、および１０μｌのＫ（０．００５〜１ミリモル／ｌ）またはコントロールとしての１０μｌのトリス緩衝液（０．１モル／１，ｐＨ８．６）をマイクロウェル中で混合した。光放射を２５分間モニターした。図１は、ＨＲＰを検出するためのＰＩＰで高められた反応に対するＫの影響を示す。Ｋの濃度は、ｘ軸に沿ってミリモル／ｌで示し、光信号出力（任意の単位）は、ｙ軸に沿って示す（対数目盛り）。Ｂ．ＨＲＰの検出限界および基準曲線ＶＩ−Ａ型ＨＲＰのストック溶液（１ｍｇ／ｍｌトリス緩衝液，ｐＨ８．６）の希釈物のサンプル（１０μｌ）を、４−フェニルホウ酸を含む（最終濃度２５ μモル／ｌ）Amerliteシグナル試薬（ＡＳＲ）１００μｌを使用して分析した。図２は、従来の試薬（ＡＳＲ）または相乗的に高められた試薬を使用して測定したＨＲＰの基準曲線を示す。図２において、ＨＲＰの濃度（ゼプトモル（１× １０^-21モル））をｘ軸に示し、信号：バックグランド比をｙ軸に示す。相乗的に高められた終点を使用したＨＲＰの検出限界は、１９．５ゼプトモル（１９．５×１０^-21モル）であり、これは、これまで記載された最も感度の高いＨＲＰアッセイであると考えられる。実施例６チロトロピンの相乗的に高められたエンザイムイムノアッセイ（タイプII効果）実施例５に記載した相乗的に高められた（Ｋ）ペルオキシダーゼアッセイを、２種類の異なるＴＳＨエンザイムイムノアッセイにおいて従来の終点と比較した。ＴＳＨアッセイキットおよびＴＳＨ−３０アッセイキットは、 Kodak Clinical Diagnostics（ニューヨーク州ロチェスター）から購入した。予めBio-Rad（カリフオルニア州リッチモンド）ＴＳＨキットを使用してＴＳＨ分析を行った臨床標本は、方法の比較研究のために使用した。Amerliteシグナル試薬における４−フェニルホウ酸（Ｋ）濃度の最適化 Amerliteシグナル試薬（ＡＳＲ）を使用したＨＲＰの検出に対する種々の量のＫの影響をテストして、Ｋの最適（動力学および信号）濃度を決定した（データは示していない）。ＡＳＲは、エンハンサーとして４−ヨードフェノールを含む。すなわち、ＫをＡＳＲとともに使用すると、タイプII効果を生じる上記で示したエンハンサーの組み合わせとなる。ＴＳＨアッセイに対しては、１．０１ミリモル／ｌの濃度のＫを選択した。Kodak Amerlite ＴＳＨアッセイ全てのアッセイを、製造者の指示に従って行った。基準曲線は２回分析し、臨床標本は、単独個体として分析した。各ＴＳＨアッセイを、従来の試薬および相乗的に高められたアッセイ試薬（１０μｌ、０．１μモル／１，４−フェニルホウ酸／１００μｌＡＳＲ）の両方を使用して行った。Kodak Amerlite ＴＳＨ−３０超高感度アッセイ全てのアッセイを、製造者の指示に従って行った。基準曲線は２回分析し、臨床標本は、単独個体として分析した。各ＴＳＨアッセイを、従来の試薬および相乗的に高められたアッセイ試薬（１０μｌ、０．１μモル／１、４−フェニルホウ酸／１００μｌＡＳＲ）の両方を使用して行った。ＴＳＨ検出限界検出限界を２種類の方法で測定した。Ｉ．ゼロ基準は重複して（ｎ＝２０）分析し、検出限界は、ゼロおよび最低基準を使用する２点間基準曲線に基づいて、平均＋２ＳＤから求めた（平均値）。 II．ゼロ基準は重複して（ｎ＝２０）分析し、検出限界は、ゼロおよび最低基準の１：４０希釈を使用する２点間基準曲線に基づいて、平均＋２ＳＤから求めた（平均値）。アッセイの実施２つの異なる終点を使用して得た臨床サンプルに対するＴＳＨ値を比較すると、下記表６に示されるように、うまく一致した。ＴＳＨの検出限界は、下記表７に示すように、新しく相乗的に高められた終点を使用して２倍以上改善された。この改良ＴＳＨアッセイは、これまで記載した中で最も高感度のＴＳＨアッセイであると考えられる。実施例７エンハンサーとして４−アセタミドフェノールおよび２種類の有機ホウ素化合物のいずれかの使用４−アセタミドフェノール（４−ＡＰ）、４−ビフェニルホウ酸（Ｋ）および４−ブロモフェニルホウ酸（ＰＢＢＡ）のＤＭＳＯにおけるストック溶液（全て１ｍｇ／ｍｌ）をトリス緩衝液（０．１モル／ｌ，ｐＨ８．６）で希釈した。希釈は次のように行った。４−ＡＰ：０，１：１０，１：１００，１：１０００ＫまたはＰＢＢＡ：０，１：２，１：５，１：１０，１：２０，１：５０，１：１００および１：２００実施例１の方法に従ったが、実施例１に開示したエンハンサー溶液の代わりに、４−ＡＰ、ＫおよびＰＢＢＡ溶液、または４−ＡＰおよびＫ溶液の両方、または４−ＡＰおよびＰＢＢＡ溶液の両方を使用した。Ｋおよび４−ＡＰの組み合わせは、一貫してタイプIIIの効果が得られ、下記表８に示すように、Ｋまたは４−ＡＰのいずれか単独の場合よりバックグランド発光が低かった。他方、組み合わせによる信号：バックグランド比がエンハンサーを個々に使用したときの値の和より相乗的に大きくなるタイプII効果は、Ｋの濃度が低い方で、４−ＡＰの濃度が最高である場合のみ認められた。大体同様の結果が、ＰＢＢＡと４−ＡＰとの組み合わせに対して得られた。実施例８エンハンサーとして２種類のアミンのいずれかと有機ホウ素化合物の使用４−アニシジン（＝４−メトキシアニリン＝４−ＭＡ）（１０ｍｇ／ｍｌ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルベンジジン（＝ＴＭＢ）（１ｍｇ／ｍｌ）、４−ビフェニルホウ酸（Ｋ）（１ｍｇ／ｍｌ）のストック溶液（全てＤＭＳＯ溶液）を各々、１：１０，０００、１：５００および１：２０に希釈した。実施例１の方法に従ったが、実施例１に開示したエンハンサー溶液の代わりに、４−ＭＡ、ＴＭＢおよびＫ溶液、または４−ＭＡおよびＫ溶液の両方、またはＴＭＢおよびＫ溶液の両方を使用し、ＨＲＰは、１：１０，０００の代わりに１：５００，０００に希釈した。表１０に見られるように、エンハンサーの組み合わせにより、信号／バックグランド比のタイプII効果による増加、信号のタイプＩ（４−ＭＡ）またはタイプ II（ＴＭＢ）による増加、およびバックグランド発光の減少（タイプＩ効果）が生じた。実施例９エンハンサーとして４−（１，２，３，４−チアトリアゾール−５−イルアミノ）フェノールおよび有機ホウ素化合物の使用実施例８を繰り返したが、４−アニシジンの代わりに標記のチアトリアゾリルアミノフェノールエンハンサーを使用した。表１１に示す優れた結果が得られ、これは、信号および信号／バックグランド比に対するタイプII効果を含む。実施例１０相乗的に高められた化学発光反応における過ホウ酸塩の酸化剤としての使用４−ビフェニルホウ酸（Ｋ）（１ｍｇ／ｍｌ）および４−ヨードフェノール（ＰＩＰ）（１０ｍｇ／ｍｌ）のストック溶液をＤＭＳＯ中で調製した。ＨＲＰ（１ｍｇ／ｍｌ）は、トリス緩衝液（０．１モル／ｌ，ｐＨ８．６）中で調製した。全ての希釈は、トリス緩衝液で行った。ルミノール−過ホウ酸塩試薬は、１ｍｌのルミノール溶液（１２．５ｍｇのルミノール／５０ｍｌのトリス緩衝液）を１０μｌの過ホウ酸ナトリウム溶液（２７ミリモル／ｌのトリス緩衝溶液）と混合することにより調製した。Ｋ（１０μｌ，１：２０の希釈）、またはＰＩＰ（１０μｌ，１：５０００の希釈）、またはＫおよびＰＩＰを含むルミノール−過ホウ酸塩試薬（１００μｌ）を使用してＨＲＰ（５μｌ，１：５００，０００の希釈）のアッセイを行った。光放射を２０分測定した。表１２に示す良好な結果は、信号および信号／バックグランド比のタイプII効果による増加を示す。実施例１１化学発光反応における、ＤＰＤの代わりの、種々の型の縮合芳香族ジアシル環式ヒドラジドの使用実施例１の方法に従ったが、使用したエンハンサーは４−ビフェニルホウ酸（Ｋ）および４−ヨードフェノール（ＰＩＰ）であり、１０ミリモル／ｌのストック溶液を種々の濃度に希釈し、ナトリウムルミノールの代わりに、「Ｌ−０１２」として知られる式（ＶIII）：［式中、Ｐｈはフェニルである。］の８−アミノ−５−クロロ−７−フェニルピリド〔３，４−ｄ〕ピリダジン−１，４−〔２Ｈ，３Ｈ〕ジオンを同じ重量で使用した。表１３に種々の希釈度における３組の結果を示す。実験ＡおよびＢは典型的な最良の結果を示し、高い信号ならびに信号および信号／バックグランドの両方に対する実質的にタイプIIの効果を生じる希釈度である。実験Ｃは、あまり良くない例の一つであるが、それでも有用な結果を示しており、信号／バックグランド比に対するタイプIIの小さい効果および信号に対するタイプＩの小さい効果が見られた。実施例１２化学発光反応における種々の濃度の縮合芳香族ジアシル環式ヒドラジド（ルミノール）の使用実施例１の方法に従ったが、使用したエンハンサーは４−ビフェニルホウ酸（Ｋ）および４−ヨードフェノール（ＰＩＰ）であり、１０ミリモル／ｌのストック溶液を種々の濃度に希釈し、ナトリウムルミノールの濃度を先の実施例の０．０９６ミリモル／ｌから二つの別々の実験の０．９６および０．４８に増加させた。表１４に示す結果から、ルミノールのこれらの濃度の低い方では、信号／バックグランド比に対するタイプIIの効果が有機ホウ素エンハンサーの濃度が非常に低い実験にまで及ぶことがわかる。一般に、信号およびバックグランドはともに、ルミノール濃度が低いほど低い。これらの結果は、エンハンサーの組み合わせが広範囲のルミノール濃度で有効であり、実施例で使用した範囲（約０．１〜１ミリモル／ｌ）より下および上の範囲でも有効であると考えられることを示す。実施例１３フェノール性エンハンサーの６−ブロモナフトールおよび２，４−ジクロロフェノールの有機ホウ素エンハンサーとの併用実施例１の方法に従ったが、エンハンサー溶液の希釈は、（Ａ）Ｋ＝１：２０、６−ブロモ−２−ナフトール（６−ＢＮ）＝１：５０００；（Ｂ）Ｋ＝１：１０、２，４−ジクロロフェノール（２，４− ＤＣＰ）＝１：１０とし、ＨＲＰストック溶液は、１：５００，０００に希釈し、実験（Ｂ）では、５μｌの希釈ＨＲＰ溶液のみを使用した。（エンハンサーの希釈は、最適化した。）表１５の結果から、これらのあまり良好でないフェノール性エンハンサーでさえも、有機ホウ素化合物（４−ビフェニルホウ酸＝Ｋ）と組み合わせると、バックグランドを有為に減少させ、信号：バックグランド比を増加（タイプII効果）させることが分かる。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９４年１１月２２日【補正内容】実施例７エンハンサーとして４−アセタミドフェノールおよび２種類の有機ホウ素化合物のいずれかの使用４−アセタミドフェノール（４−ＡＰ）、４−ビフェニルホウ酸（Ｋ）および４−ブロモフェニルホウ酸（ＰＢＢＡ）のＤＭＳＯにおけるストック溶液（全て１ｍｇ／ｍｌ）をトリス緩衝液（０．１モル／ｌ，ｐＨ８．６）で希釈した。希釈は次のように行った。４−ＡＰ：０，１：１０，１：１００，１：１０００ＫまたはＰＢＢＡ：０，１：２，１：５，１：１０，１：２０，１：５０，１：１００および１：２００実施例１の方法に従ったが、実施例１に開示したエンハンサー溶液の代わりに、４−ＡＰ、ＫおよびＰＢＢＡ溶液、または４−ＡＰおよびＫ溶液の両方、または４−ＡＰおよびＰＢＢＡ溶液の両方を使用した。Ｋおよび４−ＡＰの組み合わせは、一貫してタイプＩの効果を生じ、下記表８に示すように、Ｋまたは４−ＡＰのいずれか単独の場合よりバックグランド発光が低かった。他方、組み合わせによる信号：バックグランド比がエンハンサーを個々に使用したときの値の和より相乗的に大きくなるタイプII効果は、Ｋの濃度が低い方で、４−ＡＰの濃度が最高である場合のみ認められた。大体同様の結果が、ＰＢＢＡと４−ＡＰとの組み合わせに対して得られた。

Claims

【特許請求の範囲】（１）縮合芳香族ジアシル環式ヒドラジド（ＦＡＤＣＨ）、ペルオキシダーゼ酵素触媒、酸化剤および信号または信号／バックグランド比（「信号」はペルオキシダーゼの存在下での光出力であり、「バックグランド」はペルオキシダーゼを含まない場合の光出力である。）を増加させるエンハンサーの化学発光反応を高める方法であって、該反応を有機ホウ素エンハンサーおよびホウ素を含まない有機エンハンサーの存在下で行うことを含み、それらのエンハンサーの濃度を、使用する各エンハンサーの単独の場合と比較して信号もしくは信号／バックグランド比を増加させ、またはバックグランドを減少させるのに有効な濃度にすることを特徴とする方法。（２）有機ホウ素エンハンサーが式（Ｉ）：［式中、Ｒ基は同一であり、各々は水素、ｎ−ブチル、４’− クロロフェニルおよび３’，５’−ジクロロフェニルから成る群から選択され；または、Ｒが一緒になってＯ，Ｏ−プロピレンを形成し（それによって、ホウ素原子とともに環式エーテルを形成する。）；Ｗは、水素、メチル、メトキシ、ヒドロキシおよび塩素から成る群から選択され；Ｘは、水素、塩素、アミノおよびニトロから成る群から選択され；Ｙは、水素、メチル、カルボキシ、塩素、臭素、ヨウ素、フェニル、フェノキシ、４’−クロロアニリノ、４’−ボロニルフェニル、４’−ブロモフェニル、２’−カルボキシエテニルおよびトリメチルシリルから成る群から選択され；Ｚは、水素、５−クロロ、５−ブロモ、５−（３’ −トリフルオロメチル）フェニルアゾおよび６−クロロから成る群から選択され；あるいは、ＷおよびＸが一緒になって縮合ベンゼン環を表してもよく、ＸおよびＹが一緒になって、ナフタレン環位置番号の６位がヒドロキシで置換された縮合ベンゼン環を表してもよく、ただし、（１）Ｒが水素の場合、（ａ）Ｗ、Ｘ、Ｙ、Ｚは各々水素であるか：または（ｂ）Ｗ、ＸおよびＺは各々水素であり、かつＹはヨウ素、臭素、塩素、トリメチルシリル、フェノキシ、フェニル、４’− クロロアニリノ、メチル、４’−ボロニルフェニルおよび２’ −カルボキシエテニルから成る群から選択されるか；または（ｃ）ＷおよびＺが各々水素であって、かつ（ｉ）ＸおよびＹが一緒になってナフタレン環位置番号の６位がヒドロキシで置換された縮合ベンゼン環を表すか、又は（ii）Ｘがニトロおよび塩素のいずれかで、かつＹが塩素であるか、又は（iii）Ｘがニトロで、かつＹがカルボキシであり；または（ｄ）Ｗ、ＹおよびＺが各々水素であって、かつｘはアミノ、塩素またはニトロであり；または（ｅ）ＷおよびＸが一緒になって縮合ベンゼン環を表し、かつＹおよびＺが各々水素を表すか；または（ｆ）ＸおよびＹが各々水素であって、かつ（ｉ）Ｗがメトキシであり、かつＺが５ −ブロモであるか、又は（ii）Ｗが水素であり、かつＺが５−（３’−トリフルオロメチル）フェニルアゾであるか、又は（iii）Ｗがメチルであり、かつＺが水素であり；または（ｇ）Ｗが塩素であり、Ｘが塩素であって、かつＹおよびＺが各々水素であるか；または（ｈ）ＷおよびＹが各々塩素であり、Ｘがアミノであって、かつＺが６−クロロであり；（２）Ｒが各々ｎ−ブチルである場合、Ｗ、ＸおよびＺは各々水素であって、かつＹは臭素または４’−ブロモフェニルであり；（３）Ｒが各々４’−クロロフェニルである場合、Ｗ、ＸおよびＺは各々水素であって、かつＹはクロロであり；（４）Ｒが各々３’，５’−ジクロロフェニルである場合、ＷおよびＹは各々水素であり、Ｘは塩素であり、かつＺは５−クロロであり；及び（５）Ｒが一緒になってＯ，Ｏ−プロピレンを表す場合、Ｘ、ＹおよびＺは各々水素である。］の化合物ならびにビス（カテコール）ホウ酸塩、ボログリシン、ペンタエリスリトールホウ酸塩、４−（３’−ボロノ −４’−ヒドロキシ−フェニルアゾ）安息香酸、ジフェニルイソブトキシボラン、ジフェニルホウ酸無水物およびジメチルフェニルホウ酸から成る群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。（３）有機ホウ素エンハンサーが、ｐ−ヨードフェニルホウ酸、ｐ−ブロモフェニルホウ酸、４−ビフェニルホウ酸、４−（トリメチルシリル）ベンゼンホウ酸、ボログリシン、２−ヒドロキシ−５−〔（３’−（トリフルオロメチル）フェニルアゾ〕ベンゼンホウ酸、４−クロロ−３−ニトロフェニルホウ酸、４−クロロフェニルホウ酸、トランス−４−（２’−カルボキシエテニル）フェニルホウ酸、４−（４’−ブロモフェニル）フェニル−ジ−ｎ−ブトキシボラン、４− クロロフェニル−ジ−（４’−クロロフェノキシ）ボラン、４，４’−ビス（フェニルホウ酸）、ジフェニルホウ酸無水物、４−（４’−クロロアニリノ）フェニルホウ酸および４−ブロモフェニル−ジ−ｎ−ブトキシボランから成る群から選択されることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。（４）ホウ素を含まないエンハンサーがフェノール性または芳香族アミンエンハンサーであることを特徴とする請求項１、２または３に記載の方法。（５）エンハンサーが、式（ii）：［式中、（ｉ）ＡおよびＱは水素であり、Ｒ₁は（ａ）ハロゲン；（ｂ）フェニル；（ｃ）［式中、Ｒ₂は−ＣＨ₂−、−Ｏ−もしくは−Ｎ＝Ｎ−であって、かつＶは水素であるか、または、Ｒ₂が−Ｏ−、−Ｓ−または−Ｓ−Ｓ−であってかつＶはヒドロキシである。］；（ｄ）（ｅ）（ｆ）−ＣＨ＝ＣＨ−Ｒ₃（Ｒ₃はカルボキシまたは２，４−ジニトロフェニルである。）；（ｇ）−ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＯＯＣ₂Ｈ₅またはＣ₁〜Ｃ₆アルキル；（ｊ）イミダゾール−１−イルまたはベンズイミダゾール−２−イル；（ｋ）４−チアゾリル、４−オキサゾリルまたは４−イミダゾリル（各々、環置換されていてもよい。）；（ｌ）４−アセタミド；および（ｍ）１，２，３，４−チアトリアゾリル−５−アミノであるか；又は（ii）Ａが水素であり；ＱがハロゲンまたはＣ₁ 〜Ｃ₆アルキルであり；Ｒ₁がハロゲンであるか；又は（iii）Ａがハロゲンであり；Ｑが水素であり；Ｒ₁がハロゲンまたはフェニルであるか；あるいは、（iv）Ａが水素またはハロゲンであり；Ｒ₁が−Ｓ（ＣＨ₂）_n−Ｒ₄（ｎは１〜５の整数を表し、Ｒ₄は水素、シアノ、モルホリノ、カルボン酸、炭素数２〜７のアルコキシカルボニル基、金属カルボン酸塩、アミド、アルデヒドまたはアリルを表す。）またはフェニル基（ハロゲン原子で置換されていてもよい。）であるか、又はＲ₁およびＱが一緒になってナフタレン核を完成させる鎖を表し、その鎖は、Ｒ₁からＱの方向に下記式：［式中、Ｒ₅は水素またはハロゲンである。］を有し、その結果、式（II）の化合物は、式（VI）：のβ−ナフトールとなり、上記（ｉ）、（ii）、（iii）および（iv）において「ハロゲン」は、塩素、臭素またはヨウ素を意味する。］の化合物から成る群から選択されるフェノール性エンハンサーであることを特徴とする請求項４に記載の方法。（６）フェノール性エンハンサーが、４−クロロフェノール、４−ブロモフェノール、４−ヨードフェノール、４−ブロモ−２−クロロフェノール、２，４− ジクロロフェノール、３，４−ジクロロフェノール、４−メチルフェノール、４ −ｔ−ブチルフェノール、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸エチル、４−ベンジルフェノール、４−（２’，４’−ジニトロスチリル）フェノール、４−ヒドロキシ桂皮酸、４−フェニルフェノール、２−クロロ−４−フェニルフェノール、４−（４’−ヒドロキシフェニル）ベンゾフェノン、４−（フェニルアゾ）フェノール、４−（２’−カルボキシフェニルアゾ）フェノール、４− フェノキシフェノール、４−（４’−ヒドロキシフェノキシ）フェノール、４− ヒドロキシフェニルスルフィド、４−ヒドロキシフェニルジスルフィド、（４− シアノメチルチオ）フェノール、４−シアノメチルチオ−２−フルオロフェノール、４−シアノメチルチオ−２−クロロフェノール、４−シアノメチルチオ−２−ブロモフェノール、４−イミダゾール−１−イルフェノール、ナフト−２−オール、１−ブロモナフト−２−オール、６−ブロモナフト−２−オールおよび１，６−ジブロモナフト−２−オールの化合物から成る群から選択されることを特徴とする請求項５に記載の方法。（７）有機ホウ素エンハンサーが４−ビフェニルホウ酸、４−ヨードフェニルホウ酸、トランス−４−（２’−カルボキシエテニル）フェニルホウ酸または４ −ブロモフェニルホウ酸であり、フェノール性エンハンサーが４−ヨードフェノール、４−ヒドロキシ桂皮酸、４−イミダゾール−１−イルフェノール、４−フェニルフェノールまたは４−ブロモフェノールであることを特徴とする請求項４に記載の方法。（８）ペルオキシダーゼが遊離形であるかりガンドに結合しており、ペルオキシダーゼの有無または量が光出力の有無または量から測定されることを特徴とする請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。（９）ペルオキシダーゼがホースラディッシュペルオキシダーゼであることを特徴とする請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。（10）酸化剤が過酸化水素であることを特徴とする請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。（11）ＦＡＤＣＨがルミノールであることを特徴とする請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。（12）化学発光反応をｐＨ７．５〜９で行うことを特徴とする請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。（13）診断アッセイで使用するための請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。（14）ペルオキシダーゼに対する診断アッセイで使用するための請求項１３に記載の方法。（15）縮合芳香族ジアシル環式ヒドラジド（ＦＡＤＣＨ）、ペルオキシダーゼ酵素触媒および酸化剤の化学発光反応において、光出力の信号または信号／バックグランド比（「信号」はペルオキシダーゼの存在下での光出力であり、「バックグランド」はペルオキシダーゼを含まない場合の光出力である。）を増加させる第一および第二のエンハンサーを別々の容器に含み、第一のエンハンサーが有機ホウ素化合物であり、第二のエンハンサーがホウ素を含まない有機化合物である、診断アッセイで使用するためのキット。（16）有機ホウ素エンハンサーが請求項２または３に記載した通りであることを特徴とする請求項１５に記載のキット。（17）ホウ素を含まないエンハンサーが請求項４、５または６に記載した通りであることを特徴とする請求項１５または１６に記載のキット。（18）さらにＦＡＤＣＨを含むことを特徴とする請求項１５、１６または１７に記載のキット。（19）さらにペルオキシダーゼ酵素触媒を含むことを特徴とする請求項１５、１６、１７または１８に記載のキット。（20）ペルオキシダーゼがホースラディッシュペルオキシダーゼであることを特徴とする請求項１９に記載のキット。（21）さらに酸化剤を含むことを特徴とする請求項１５、１６、１７、１８、１９または２０に記載のキット。（22）ジヒドロフタラジンジオン（ＤＰＤ）、ペルオキシダーゼ酵素触媒および酸化剤の化学発光反応において、光出力の信号または信号／バックグランド比（「信号」はペルオキシダーゼの存在下での光出力であり、「バックグランド」はペルオキシダーゼを含まない場合の光出力である。）を増加させる第一および第二のエンハンサーを別々の容器に含み、第一のエンハンサーが有機ホウ素化合物であり、第二のエンハンサーがフェノール性エンハンサーである、診断アッセイで使用するためのキット。（23）ＤＰＤがルミノールであることを特徴とする請求項２２に記載のキット。